一、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)的克隆与序列分析（论文文献综述）
王钰佳[1]（2021）在《鲢鱼基质金属蛋白酶2及其内源性抑制剂的研究》文中指出内源性蛋白酶及其抑制剂与鱼类肌肉蛋白的新陈代谢密切相关,也影响鱼类死后肌肉蛋白的降解。研究与鱼类死后肌肉降解有关的蛋白酶及其抑制剂对于水产加工与利用有重要的理论意义和应用价值。本文以淡水鱼鲢鱼为研究对象,对鱼死后参与降解胶原蛋白的关键酶基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2,MMP2）及其内源性抑制剂进行研究,分析二者的理化性质并探究相互作用机制。鲢鱼肌肉中,天然MMP2酶活力高,但含量极低,难以纯化获得天然酶。为筛选和分离鲢鱼MMP2内源性抑制剂,本研究对鲢鱼MMP2催化结构域（rHm-MMP2c）进行了分子克隆和表达,得到有活性并高产量的重组蛋白酶,为筛选内源性抑制剂提供了条件。本论文首先利用分子克隆技术得到rHm-MMP2催化结构域序列,c DNA全长为996 bp,编码332个氨基酸。DNAMAN分析显示rHm-MMP2c的理论分子量为37 k Da,等电点为4.38。荧光定量PCR结果显示,鲢鱼MMP2在血液中表达量最高,其次是大脑和肌肉,而在鳃中表达量最低。rHm-MMP2c在大肠杆菌系统中进行原核表达,得到的重组蛋白可溶且活性较高,能够有效分解I型胶原蛋白和明胶。用Ni柱亲和层析进行分离。酶学性质分析表明,rHm-MMP2c反应的最适温度为37°C,最适p H为9.0。EDTA、EGTA和1,10-phenanthroline对该酶有较强的抑制作用,说明其为典型的金属蛋白酶。圆二色谱分析结果显示,rHm-MMP2c二级结构以β-折叠为主,其变性温度为50.1±0.1℃。rHm-MMP2c能有效分解I型胶原蛋白。酶动力学显示,rHm-MMP2c的米氏常数Km为26 nmol/L,催化常数kcat为54.7/s。以rHm-MMP2c为靶标,从鲢鱼肌肉中筛选和分离MMP2的内源性抑制剂。采用60℃加热、50-90%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、Phenyl-Sepharose和Superdex 200/300连续柱层析方法对抑制剂进行分离纯化。SDS-PAGE显示,该抑制剂的分子量为30 k Da,对rHm-MMP2c具有较高的抑制活性,半抑制浓度为3.33μmol/L。质谱分析鉴定为载脂蛋白A-Ⅰ（Apolipoprotein A-Ⅰ,Apo A-Ⅰ）。Apo A-Ⅰ在20-70℃间具有较好的稳定性,在p H6.0-11.0间比较稳定。该蛋白质具有载脂蛋白典型的二级结构特征,α-螺旋占48.6%,其变性温度为75.3±0.3℃。抑制动力学显示,Apo A-Ⅰ对rHm-MMP2c呈现竞争型抑制,抑制常数Ki为1.31μmol/L。Western blot显示,二者在溶液中会形成复合物,并且Apo A-Ⅰ可以抑制rHm-MMP2c对明胶的降解。为进一步阐明Apo A-Ⅰ对rHm-MMP2c的抑制机制,对rHm-MMP2c与其底物和Apo A-Ⅰ进行分子对接和分子动力学（MD）模拟。对接结果显示,Apo A-Ⅰ以可逆的竞争性抑制方式抑制rHm-MMP2c的活性,与抑制动力学的结果相一致,抑制原因可能为抑制剂形成了空间位阻阻碍底物与酶的结合。MD模拟分析表明,Apo A-Ⅰ在100 ns中与rHm-MMP2c的紧密结合,氢键在结合中起主导作用。本研究高效表达了可溶并具有生物活性的鲢鱼MMP2催化结构域,并以此为靶标,筛选了一种新型的MMP2内源性抑制剂,证实其为Apo A-Ⅰ。通过对rHm-MMP2c和Apo A-Ⅰ二者的相互作用机制及作用力研究,为酶和抑制剂的进一步研究奠定了基础。
张明辉[2]（2021）在《皱纹盘鲍基质金属蛋白酶1及组织抑制剂的研究》文中研究指明自溶（autolysis）,是指当机体受到物理、化学和生物因素等刺激后,诱发自身酶系破坏自身组织结构,最终导致肌肉软化发生的过程,细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的降解是肌肉软化的重要因素。ECM的主要成分是胶原蛋白,其中I型胶原蛋白占总胶原蛋白的80-90%。由于基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）能特异性降解胶原蛋白,且MMPs的活性受到金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs）的精准调控,表明它们在自溶过程中发挥重要作用。本研究以皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）为研究对象,利用基因工程手段获取MMP-1和TIMP重组蛋白,分析它们的理化性质以及二者之间的相互作用关系,探索它们在I型胶原蛋白降解过程中的功能,并揭示它们参与鲍鱼自溶的机理。首先,检测了皱纹盘鲍死后不同时间肌肉匀浆液对I型胶原蛋白的降解情况,结果表明MMPs家族中的胶原酶参与了皱纹盘鲍死后的肌肉自溶过程。利用大肠杆菌原核表达系统表达重组MMP1催化结构域（recombinant MMP1c,rMMP1c）蛋白,通过尿素梯度法成功从包涵体中复性得到高纯度和高酶活力的rMMP1c。rMMP1c的最适温度和p H分别为37℃和7.0,具有良好的热稳定性和p H稳定性,热变性温度（Tm）为67.0±0.9℃。低浓度下,金属蛋白酶抑制剂（EDTA,1,10-phenanthroline）能完全抑制rMMP1c的活性;金属离子Ba2+、Ca2+、Mg2+都对rMMP1c蛋白酶的活性有明显的激活作用,其中,Ca2+的激活作用最显着。利用人胚胎肾HEK 293F悬浮细胞表达重组TIMP（rTIMP）蛋白,其对rMMP1c有较好的抑制活性。rTIMP具有良好热稳定性和p H稳定性,其Tm值为73.1±0.6℃。通过PAS染色证明rTIMP是糖蛋白。其次,通过抑制动力学分析了rTIMP对rMMP1c的抑制类型,结果显示其为竞争型/非竞争型混合型抑制剂。生物膜干涉法（Biolayer Interferometry Technology,Blitz）分析蛋白-蛋白相互作用结果表明,rMMP1c与rTIMP存在明显的相互作用,二者的亲和力常数KD值为0.2628μM。将rMMP1c与I型胶原蛋白共孵育,随着时间的延长,rMMP1c能够依次完全降解I型胶原蛋白的γ链、β链和α链,表明rMMP1c具有显着的胶原蛋白降解能力和胶原酶特征。利用反相高效液相色谱（Reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）分析I型胶原蛋白降解产物的分子量分布情况,结果显示rMMP1c能将大分子的I型胶原蛋白降解为小分子蛋白和多肽。此外,rTIMP能显着抑制rMMP1c降解I型胶原蛋白的生物活性。本研究内容不仅为理解鲍鱼自溶过程提供理论依据,对鲍鱼的贮藏加工也具有一定的指导意义。
洪磊,敖叶,周志楠,唐文,阮涌,倪萌萌,陈祥[3]（2020）在《黔北麻羊TIMP1基因编码区的克隆、表达及生物信息学分析》文中进行了进一步梳理为探究黔北麻羊基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）基因的表达水平和蛋白结构功能。本研究选取3岁两胎次的单、多羔健康黔北麻羊母羊各3只,采集子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5个组织并提取组织中的总RNA反转录为第一链cDNA,克隆了黔北麻羊TIMP1基因CDS区全长序列,对TIMP1蛋白的理化性质、蛋白质结构等进行预测分析,并进行同源性分析和系统进化树构建;同时采用qRT-PCR检测TIMP1基因mRNA在不同产羔性状的黔北麻羊性腺轴组织中的表达水平。结果发现:T-克隆的黔北麻羊TIMP1基因CDS区为624 bp,编码207个氨基酸,与NCBI上山羊mRNA序列相同;蛋白预测分析结果显示:黔北麻羊TIMP1蛋白的分子式为C1020H1581N283O291S19,相对分子质量为23.073 64 ku,等电点为8.62,不稳定系数为64.5;遗传进化树分析得出,与其他9个物种相比较,黔北麻羊TIMP1基因与绵羊和牛的遗传距离最近;qRT-PCR结果显示,垂体、卵巢和输卵管在多羔组中的表达高于单羔组（P<0.01）。本研究揭示了TIMP1基因在单、多羔黔北麻羊5个组织中的表达差异性,对TIMP1基因的T-克隆和蛋白的结构功能预测也丰富了相关研究数据,为进一步探索黔北麻羊产羔性状的分子机制提供参考。
于医萍[4]（2020）在《双调蛋白调控人黄素化颗粒细胞激素生成和滋养层细胞浸润的机制研究》文中认为双调蛋白是重要的局部调控因子,在卵巢颗粒细胞与滋养层细胞高表达,是LH/hCG峰后卵泡液及早孕期羊水中表达量最高的表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）家族因子。既往研究显示,双调蛋白介导着LH/hCG的促卵丘复合体扩张、卵子成熟和颗粒细胞内孕激素合成的作用,并且双调蛋白上调合体滋养层细胞hCG的表达及分泌。关于双调蛋白在女性生殖系统调控作用的研究尚不完善,本研究从以下三个部分研究双调蛋白对黄素化颗粒细胞激素生成和滋养层细胞浸润的调控作用:1.双调蛋白对人黄素化颗粒细胞内芳香化酶表达和雌激素合成的调控作用及机制;2.双调蛋白对人黄素化颗粒细胞内VEGF表达的调控作用;3.双调蛋白对人滋养层细胞浸润的调控作用及机制。第一部分 双调蛋白上调人黄素化颗粒细胞内芳香化酶表达和雌激素生成的机制研究目的研究双调蛋白是否调控人黄素化颗粒细胞内芳香化酶表达及其下游雌激素生成。方法收集行辅助生殖技术助孕治疗女性的颗粒细胞进行原代体外培养,研究双调蛋白对雌激素生成的调控作用和机制。小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）特异性敲低双调蛋白、StAR、EGFR和LHR mRNA的内源性表达,RT-qPCR方法检测mRNA水平,Western-blot方法检测蛋白水平。收集血清、卵泡液和颗粒细胞培养液,ELISA方法检测双调蛋白和雌激素浓度,并进行相关性分析。结果双调蛋白通过活化AKT信号通路上调颗粒细胞内芳香化酶mRNA及其下游雌激素生成。使用EGF受体（EGF receptor,EGFR）抑制剂和EGFR siRNA阻断EGFR通路,LH/hCG对芳香化酶表达和雌激素生成的上调作用也被阻断。相关性分析显示,卵泡液内双调蛋白浓度与卵泡液雌激素浓度、取卵术后第2天血清雌激素浓度显着正相关。结论双调蛋白通过与人颗粒细胞表面EGFR结合活化细胞内AKT信号通路上调芳香化酶mRNA和蛋白水平,促进其下游雌激素合成;双调蛋白介导着LH/hCG的促雌激素生成作用。第二部分 双调蛋白上调人黄素化颗粒细胞内VEGF表达目的研究双调蛋白对人颗粒细胞内血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的调控作用。方法收集行辅助生殖技术助孕治疗女性的颗粒细胞进行原代体外培养,研究双调蛋白对VEGF生成的调控作用。siRNA特异性敲低双调蛋白和EGFR mRNA的内源性表达,RT-qPCR方法检测mRNA水平。收集卵泡液和培养液,ELISA方法检测双调蛋白和VEGF浓度,并与卵巢过度刺激综合征（Ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS）发生的危险预测因子进行相关性分析。结果双调蛋白可显着上调颗粒细胞VEGF mRNA表达,卵泡液内双调蛋白浓度与卵泡液VEGF浓度正相关。SiRNA敲低双调蛋白和EGFR的内源性表达可阻断hCG对颗粒细胞内VEGF mRNA和蛋白的上调作用。hCG对OHSS患者颗粒细胞内双调蛋白和VEGF mRNA的上调作用显着于正常对照组。OHSS组颗粒细胞内双调蛋白、VEGF、EGFR和ErbB2 mRNA表达水平和卵泡液内双调蛋白、VEGF浓度均高于正常对照组。卵泡液内双调蛋白浓度与OHSS发生的危险因子如基础窦卵泡数（AFC）、获得卵子数、MII卵子数和hCG日、取卵（oocyte pick-up,OPU）日、OPU术后2天血清雌激素水平存在正相关关系。结论双调蛋白介导着hCG对人黄素化颗粒细胞内VEGF表达的上调作用。第三部分 双调蛋白上调滋养层细胞MMP9活性增加细胞浸润目的探究双调蛋白是否参与调控滋养层细胞浸润及其中的机制。方法使用人永生化滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞进行实验,研究双调蛋白对滋养层细胞浸润活动的调控作用。siRNA特异性敲低相应因子的表达,化学性抑制剂阻断相应信号通路,RT-qPCR和western-blot的方法检测相应mRNA和蛋白表达情况。MTT实验检测细胞活性,Matrigel实验评价细胞浸润活动,明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）活性。结果双调蛋白可显着上调MMP9和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases-1,TIMP-1）mRNA 表达水平,且对MMP9 mRNA的上调幅度显着于TIMP-1 mRNA。双调蛋白增加HTR-8/SVneo细胞浸润。EGFR、AKT和ERK1/2信号通路抑制剂特异性阻断通路后,HTR-8/SVneo细胞浸润活动显着减弱。ERK1/2和AKT信号通路介导双调蛋白上调的MMP9 mRNA表达和酶活性。AKT信号通路介导双调蛋白上调的TIMP-1 mRNA表达。结论双调蛋白通过激活ERK1/2和AKT信号通路上调MMP9活性增加HTR-8/SVneo细胞浸润。
颜欣欣[5]（2019）在《锡兰钩虫金属蛋白酶组织抑制剂基因的克隆表达与特性分析》文中研究指明锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）是一种人畜共患的动物源性钩虫。金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是基质金属蛋白酶（metarix metalloproteinases）的特异性抑制剂,广泛存在于脊椎动物与无脊椎动物体内,具有增强红细胞活性以及促进细胞生长等重要功能。鉴于TIMP对于各种生物的重要性,本研究对犬源锡兰钩虫TIMP基因进行了克隆、原核表达以及部分生物学特性的分析。首先采用“T”形滤纸法和双玻皿培养法培养钩蚴,于培养7天后收集虫体,结果显示“T”形滤纸法富集的幼虫多于双玻皿培养法,说明“T”形滤纸法的钩蚴培养效果优于双玻皿培养法。根据NCBI数据库中注释的锡兰钩虫TIMP（Ace-TIMP）基因序列设计引物,以该虫成虫c DNA为模板,RT-PCR扩增Ace-TIMP基因,利用在线软件分析其序列。结果显示,Ace-TIMP基因的ORF序列长648 bp,编码215个氨基酸;其中信号肽序列为48 bp,编码16个氨基酸。该蛋白为亲水性蛋白,有信号肽,无跨膜结构域,由1个α螺旋和7个β链折叠而成。选用pET32a表达质粒作为原核表达载体,用Eco R I与Hind III双酶切测序正确的成熟肽序列与表达载体,构建重组表达质粒p ET32a-TIMP-MP,转化至大肠杆菌E.coli Transetta（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,采用离子亲和层析柱纯化目的蛋白并测定蛋白浓度。结果显示该蛋白为可溶性蛋白,主要在上清中表达,其分子质量约为42 k Da;该重组蛋白能与His标签鼠源单克隆抗体发生特异性结合,在20 m M咪唑洗脱液中可获得较纯的重组蛋白,经BCA法测定该融合蛋白浓度为0.9 mg/m L。利用纯化的Ace-TIMP重组蛋白免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,采用间接ELISA测定其抗体滴度,Western blot分析多克隆抗体的特异性,底物酶谱法分析Ace-TIMP蛋白对MMP-2的抑制活性。结果显示抗该重组蛋白的血清效价高达1:51200,制备的多克隆抗体可与His标签抗体特异性结合,底物酶谱法显示在含有锡兰钩虫TIMP的泳道中出现蓝色条带,说明锡兰钩虫TIMP可抑制MMP-2对明胶的降解活性。本研究首次从犬源锡兰钩虫成虫中克隆TIMP基因,构建其原核表达载体并进行了体外表达,对其序列进行了多重比对和遗传进化分析,并分析了其抗原性和对MMP的抑制活性,为深入研究锡兰钩虫TIMP的生物学功能及其免疫潜能奠定了基础。
易霈霈[6]（2019）在《TGF-β及其Ⅰ型受体在三角帆蚌免疫应答和创伤修复中的作用》文中认为三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国重要的淡水养殖贝类之一,TGF-β介导的信号通路在胚胎发育、组织和器官的形成、创伤修复及免疫应答调节等方面发挥重要的作用。本研究克隆了三角帆蚌的TGF-β及其I型受体（TGF-βRI）基因的cDNA全长序列。结果表明:三角帆蚌TGF-β基因cDNA序列全长2850bp,其中5’非编码区（UTR）长度为211bp;3’UTR为1457bp;开放阅读框（ORF）为1182bp,编码393个氨基酸。预测的TGF-β蛋白包含1个25aa的信号肽,1个TGF-β结构域（294-393）。TGF-βRI基因的cDNA全长序列为2017bp,其中5’UTR为80bp;3’UTR为383bp;ORF长度为1554bp,编码517个氨基酸。预测的TGF-βRI蛋白包含信号肽（1-22aa）,膜外区（23-127aa）、跨膜区（128-150aa）以及胞内区（151-517）。胞内区含有TGF-β受体特征序列GS结构域和丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域。序列比对分析显示:三角帆蚌TGF-β与哺乳动物TGF-β1同源性为25%。预测的TGF-β成熟蛋白由18个β折叠片和5个α螺旋组成,与人TGF-β1具有相似的空间结构。TGF-βRI与马氏珠母贝（Pinctada martensii）、斑马鱼（Danio rerio）,鼠（Mus musculus）等物种的同源性均为63%。实时定量结果表明:TGF-βRI基因在健康蚌血液、外套膜、肌肉、鳃和肝胰脏中均有表达,其在鳃中表达量最高,血液中表达量最低。嗜水气单胞菌刺激后的3和6h,TGF-βRI在血液中表达量显着性上调（p<0.05）;6,12,24 h后,在肝胰脏中表达量显着性上调（p<0.05）。肽聚糖刺激后,TGF-βRI分别在3h的血细胞及24h的肝胰腺中表达上调（p<0.05）,48h后恢复至初始水平。在三角帆蚌外套膜创伤修复模型中,创伤后的第1,3,5,10d,TGF-βRI基因表达均显着上调（p<0.05）,至第15d恢复至初始水平。将编码TGF-β成熟肽的cDNA序列插入到pET-30a中转化大肠杆菌Top10,筛选重组质粒,然后转入BL21（DE3）表达菌株中,IPTG诱导,亲和层析（Ni-IDA树脂）纯化,采用Bradford法测定重组TGF-β蛋白浓度为0.318 mg/ml。将编码TGF-βRI胞内段cDNA序列插入pET-32a载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）,IPTG诱导得到的重组蛋白以包涵体形式存在,纯化的重组蛋白浓度为0.5mg/mL。将获得的重组TGF-β和TGF-βRI分别注射入新西兰大白兔体内,制备了多克隆抗体,western blot检测表明获得了高特异性的抗TGF-β和TGF-βRI多克隆抗体。利用多克隆抗体检测TGF-βRI蛋白在三角帆蚌中肝、血、鳃、肌肉、外套膜中的分布及创伤状态下在外套膜组织中的表达情况变化,表明其主要表达于肝胰脏、鳃和肌肉中,创伤后,TGF-βRI随着创伤时间变化表达量增加。抑制剂SB431542处理后,与健康组相比,TGF-β信号通路下游基因Smad3,Smad4,Smad5在大部分时间点均上调,少数时间点下调,而MMP1基因在处理后第3天和第5天显着下调,MMP19基因在第10天显着下调,TIMP1呈下调趋势,但与健康组相比差异不显着,TIMP2在第1天和第3天均显着下调,15d后恢复至创伤组水平。
刘太行[7]（2017）在《家蚕基质金属蛋白酶家族MMPs及组织金属蛋白酶抑制剂TIMP在家蚕中的功能研究》文中进行了进一步梳理昆虫在长期的进化过程中对多变的环境具备了高度的适应能力,这与其神奇的变态发育过程和高效的先天性免疫体系密不可分。加强昆虫变态发育及免疫机制的研究,对拓展昆虫资源的利用和害虫的绿色防控等有重要的现实意义。同时,可为研究人类干细胞分化、组织器官的形成及免疫机制提供重要线索。基质金属蛋白酶家族（Matrix metalloproteinase family,MMPs）是参与昆虫变态发育调节和先天性免疫应答的一类重要的锌依赖性内肽酶。该家族成员几乎能够降解所有种类的细胞外基质,在生物体多种生理和病理过程中起重要作用,如组织重塑、器官发育、炎症调节、免疫应答、细胞凋亡、创伤修复及肿瘤的侵袭和转移等。组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是MMPs内源性的蛋白抑制因子,能够结合MMPs并抑制其降解活性,在维持细胞外基质稳态中起重要作用。然而,对果蝇以外其它昆虫的MMPs和TIMPs功能研究较少。同时,在不同昆虫中MMPs和TIMPs的数目和功能也存在极大差异。因此,全面、深入解析这两个家族在昆虫中的作用具有重要意义。鉴于此,本研究以家蚕（Bombyx mori）为模式,研究了家蚕BmMMPs家族和BmTIMP表达特征;在体内和体外利用基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除技术,探究了BmMMPs家族和BmTIMP在家蚕抵抗家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus,BmNPV）和家蚕变态发育中的作用;通过对BmMMPs家族的转录调控研究及互作蛋白的鉴定,阐明BmMMPs家族作用的分子机制。通过该研究,可为揭示BmMMPs和BmTIMP在家蚕变态发育及先天性免疫中的作用提供实验依据和理论支撑。论文的主要实验结果和结论如下:1.BmMMPs和Bm TIMP基因的鉴定及表达特征分析本研究在家蚕基因组中鉴定出3个mmps家族基因,其中一个基因包含两种剪切体,分别命名为bmmmp1a、bmmmp1b、bmmmp2和bmmmp3。同时鉴定到1个timp基因,命名为bmtimp。通过序列分析发现,家蚕mmp家族基因均包含mmp家族典型的结构特征,前肽区（pro-peptide）、催化结构域（catalyticdomain）、铰链区（hingeregion）及血红素蛋白类似区域（hemopexin-likec-terminaldomain）。系统发生分析发现家蚕mmp家族聚类于昆虫mmps家族一支。bmtimp包含timp家族典型的ntr结构域,且系统发生分析显示其同样与昆虫timp家族聚为一支。家蚕各发育时期的表达特征分析发现,bmmmps和bmtimp在化蛹第一天有高量表达;在五龄三天,bmmmp1、bmmmp3和bmtimp在中肠和脂肪体中高量表达,bmmmp2在血液有高量表达。通过免疫荧光和蛋白截短实验对家蚕mmps家族和timp的亚细胞定位模式进行分析发现,bmmmp1a&b和bmmmp2的全蛋白及预测跨膜区域的截短蛋白均定位于细胞质中;bmmmp3的全蛋白定位于细胞质中,预测的核定位信号区域定位于细胞核中,bmmmp3催化结构域的n端影响了其核定位信号正常行使功能;bmtimp具有信号肽区域,其蛋白部分定位于细胞质中,部分分泌到细胞外。探究了家蚕mmps家族基因和timp在不同抗原刺激下的表达模式,结果显示,在bmnpv病毒感染家蚕体外细胞系和体内中肠、血液、脂肪体的过程中,bmmmps和bmtimp在bmnpv病毒感染前期均出现显着上调表达,随后表达量下调,在感染后期出现极高量表达;在利用lps和大肠杆菌刺激家蚕体外细胞系或体内中肠、血液、脂肪体的过程中,bmmmps和bmtimp均有显着诱导上调表达趋势。上述结果表明,bmmmps和bmtimp在表达模式上具有一定的协同性;bmmmps和bmtimp可能参与调控家蚕的变态发育及先天性免疫。2.bmmmps和bmtimp的相互作用鉴定本部分通过双荧光共定位、荧光双分子互补实验（bifc）及免疫共沉淀实验（co-ip）,分析了bmmmp1a、bmmmp2和bmmmp3三个蛋白与bmtimp蛋白之间的相互作用关系。双荧光共定位结果显示,bmmmps均能分别与bmtimp共定位于细胞质中;bifc结果显示,bmmmps都能与bmtimp发生相互作用,并且都聚集于细胞质中;co-ip实验结果显示,bmmmp1s分别与bmtimp之间同样存在特异性的相互作用。上述结果表明,家蚕mmps家族三个蛋白与timp都具有相互作用,推测bmtimp可能通过直接结合bmmmps抑制其活性。3.bmmmps和bmtimp对bmnpv侵染的影响本部分通过在体外家蚕细胞系bmns-swu1中分别创制bmmmps和bmtimp基因的过表达及crispr/cas9基因敲除模型,在体外水平探索bmmmps和bmtimp对bmnpv侵染的影响。结果显示,bmmmps基因过表达和bmtimp基因敲除可以显着增强bmnpv的增殖复制;bmmmps基因敲除和bmtimp基因过表达可以显着抑制bmnpv的增殖复制。同时,利用iv型胶原（collagen-iv）降解实验、mmps的广谱性抑制剂bb-94、gm6001和bmmmps蛋白活性区域截短实验,进一步探究了家蚕mmps活性对bmnpv病毒侵染的影响。结果显示,过表达bmmmp1a、bmmmp2和bmmmp3的截短活性区域均能够增强家蚕细胞对collagen-iv的降解;bb-94和gm6001能够显着抑制bmnpv的增殖复制;相对于bmmmps全蛋白,其截短活性区域能显着增强bmnpv的在家蚕细胞中的增殖复制。上述结果表明,bmmmps可能以活性形式参与调控bmnpv病毒的增殖复制。4.转基因过表达bmmmp3和bmtimp对bmnpv增殖及家蚕变态发育的影响利用显微注射技术创制了bmmmp3和bmtimp过表达家蚕品系,在体内水平探究bmmmp3和bmtimp对bmnpv增殖及家蚕变态发育的影响。通过对转基因品系的表型统计和bmnpv感染后的致死率和病毒关键基因分析,发现bmmmp3过表达品系相对于正常品系表现为体型增大、体重增加,且bmnpv在bmmmp3-oe品系中的感染能力被显着增强;bmtimp过表达品系具有发育迟缓、幼虫期全部致死及不能正常上簇等表型。这些结果表明,bmmmp3和bmtimp能够参与调控家蚕的生长发育;在体内过表达bmmmp3能够显着增强bmnpv的增殖复制。5.转基因敲除bmmmps家族基因对bmnpv增殖及家蚕变态发育的影响利用crispr/cas9的基因编辑技术和转基因技术相结合的方法,创制了单独过表达cas9蛋白的转基因家蚕品系cas9-oe,以及单独过表达sgrna靶标序列的转基因家蚕品系bmmmp1-sgrna、bmmmp2-sgrna和bmmmp3-sgrna共4种转基因品系。随后,利用cas9-oe与bmmmps-sgrna杂交敲除目的基因的方法,获得mmps基因特异性敲除的三个杂交敲除品系bmmmp1-ko、bmmmp2-ko和bmmm3-ko。通过对bmmmps-ko品系生长发育过程的表型统计分析,结果发现,bmmmp1-ko出现发育迟缓、幼虫和蛹期致死,影响气管的延伸和分枝。bmmmp2-ko具有发育迟缓、蛾期生存活力不高、不能正常交配,雌蛾下颚和侧胞保持凸出、被毛易脱落、腹部积水、卵发育异常及马氏管发育异常等多种表型,雄蛾除不具有侧胞保持凸出和卵发育异常外,其它与雌蛾表型一致。bmmmp3-ko品系具有发育迟缓、幼虫期致死、蛾期活力不高、雌蛾不能产卵等表型。同时,将bmnpv病毒利用口服和注射的方法感染家蚕bmmmps-ko杂交敲除品系和正常品系,结果发现,bmmmps-ko杂交敲除品系能够显着抑制vp39基因的转录。上述结果进一步表明,BmMMPs在家蚕的变态发育和调控BmNPV侵染中起重要作用。6.BmMMPs和BmTIMP作用机制的探究及相互作用蛋白的鉴定通过在家蚕细胞中单独过表达BmNPV增殖关键基因IE1、FGF、GP64和VP39,检测对BmMMPs和BmTIMP的转录水平的影响。结果发现,除VP39未检测到显着诱导外,IE1、FGF、GP64都对BmMMPs和BmTIMP具有一定的诱导活性。基于BmMMPs和BmTIMP在表达模式上具有很高的一致性,通过在家蚕细胞中单独过表达BmMMPs和BmTIMP各个基因,探究其是否存在相互调控关系,结果发现,BmMMPs和BmTIMP之间均具有相互诱导活性。同时发现在家蚕细胞中过表达BmMMPs可以显着诱导Caspase3、7和9的活性,敲除BmMMPs可以抑制Caspase3、7和9的活性。上述结果进一步暗示了,BmMMPs和BmTIMP参与家蚕抵御BmNPV侵染的调控;BmMMPs和Bm TIMP之间可能存在相互调控关系。通过免疫共沉淀的方法,并借助质谱分析技术,分别以BmMMP1a和BmMMP3为诱饵蛋白,从家蚕BmN-SWU1细胞中筛选并鉴定到6个与BmMMP1a互作的蛋白,6个与BmMMP3互作的蛋白。经初步验证发现,ATP synthase与BmMMP1a存在相互作用;PP6与BmMMP3存在相互作用。这些结果暗示了,BmMMPs可能与能量代谢息息相关,BmMMP3可能与PP6互作共同参与调控细胞生理活动。综上所述,BmMMPs和BmTIMP同时在家蚕抵御BmNPV病毒侵染的先天性免疫中和家蚕的变态发育过程中起着重要的作用,此研究不仅为全面解析家蚕BmMMPs和BmTIMP基因功能奠定了坚实的基础,同时也为家蚕先天性免疫及变态发育研究提供了新的线索。
杨淑芬[8]（2017）在《新疆地区IgA肾病尿液蛋白质组学研究》文中研究表明目的:通过回顾性分析新疆地区维吾尔族IgA肾病临床与病理特点,探讨Ig A肾病临床与病理的异质性;通过探索iTRAQ标记与Label free在Ig A肾病尿液蛋白质组学中的应用,优化尿液蛋白质组学实验方案;通过i TRAQ标记后,应用液质联用、数据库检索,比较维吾尔族与汉族健康人群尿液蛋白质组谱图探讨种族间差异尿液蛋白质;比较维吾尔族健康人群与Ig A肾病患者的尿液蛋白质组,探讨新疆地区IgA肾病尿液相关差异蛋白质谱,应用蛋白质数据库进行检索分析,理解Ig A肾病发病机制;通过对四种尿液差异蛋白的验证,筛选新疆地区IgA肾病的候选生物标志物。方法:1)回顾性分析新疆地区354例维吾尔族、汉族肾肾活检诊断为原发性Ig A肾病患者的临床与病理特点,分析比较维吾尔族、汉族IgA肾病患者临床与病理表现的异同,以及维吾尔族、汉族IgA肾病患者临床表现为蛋白尿、血尿、血肌酐、肾小球滤过率等与病理表现内在联系的不一致性,以及通过对临床干预治疗后效果不佳,并重复肾活检的22例维吾尔族患者临床指标、病理指标与肾脏存活的分析,了解疾病的发生、发展、干预治疗效果及转归,再次了解IgA肾病的临床表现与病理表现的不一致性;2)通过iTRAQ标记定量蛋白质组学与Label free非标记的定量蛋白质组学在IgA肾病尿液差异蛋白质组学中的研究,比较二者的优缺点,优化尿液蛋白质组学研究的实验方案,依据研究目的不同选择蛋白质组学的研究方法;3)本研以新疆地区经肾活检确诊的维吾尔族、汉族健康人群、IgA肾病患者尿液为研究对象,采用联合白蛋白/IgG抗体清除和同位素相对标记与绝对定量技术标记的二维液相色谱与串联质谱联用技术,对尿液蛋白质组学检测方法,建立新疆地区Ig AN尿液蛋白质图谱分析方法,进行种族及疾病差异尿蛋白质组分析,获取差异表达蛋白,对鉴定蛋白和差异蛋白进行Gene ontology（GO）分析,寻找肾脏种族间与疾病间的尿液差异蛋白质组的富集蛋白,将筛选到的健康人群与IgA肾病间的差异尿蛋白定义为新疆维吾尔族Ig A肾病相关差异蛋白,探讨新疆地区IgA肾病相关尿蛋白质谱;将6例维吾尔族经肾活检病理诊断为原发性IgA患者、6例特发性膜性肾病患者、6例健康对照者的尿液,依据IgA肾病可能的发病机制、差异蛋白富集的情况,筛选出四种尿液差异蛋白,采用免疫印迹法验证差异表达蛋白,寻找新疆地区诊断IgA肾病的尿液候选生物标志物。结果:1)汉族、维吾尔族Ig A肾病临床、病理特点,总结提示维吾尔族IgA肾病患者在临床表现方面二者无特殊不同,但在病理表现方面维吾尔族IgA肾病患者在内皮细胞增生、小管-间质病变,以及血管病变方面较汉族患者更重。通过对22例维吾尔族患者重复肾活检后相关临床及病理指标的分析,发现新疆地区的Ig A肾病的维吾尔族患者两次肾活检前后除较少患者病理指标发生进展,小管-间质病变、球形硬化比例、小动脉病变外,无显着转型;2)iTRAQ和Label free研究了Ig A肾病尿液蛋白组学,在技术重复变异和生物学个体变异等方面,iTRAQ能检测到更多的蛋白、技术重复较好,依据实验目的,i TRAQ定量蛋白质组学对寻找新疆地区Ig A肾病的尿液蛋白质组无创生物标志物更合适,以此为基础初步构建新疆地区IgA肾病的尿液蛋白质组学谱图优化实验方案;3)维吾尔族Ig A肾病尿蛋白质组经过液质联用分析,共鉴定出蛋白640种,其中差异蛋白219种,通过IPA功能分析发现,急性应激反应和NO相关通路功能下调,维生素C抗氧化通路功能上调,通路变化反映肾脏功能处理失代偿状态。通过功能分析提示细胞免疫反应和脂质代谢异常、凝血系统功能障碍、补体系统激活在维吾尔族Ig A肾病的发生、发展中起着至关重要的作用。蛋白相互作用网络分析发现与上述通路发现一致,其中ADIPOQ、ICAM1、SERPINC-1、TIMP1可以作为备选蛋白进行进一步功能验证和分析。在差异尿液蛋白质中遴选出四个候选的生物标志物,并对四个可能的生物标志物进行了验证,它们分别是参与炎症反应的ADIPOQ、肾小管间质损伤ADIPOQ和ICAM1、参与影响凝血过程的SERPINC-1以及影响细胞外基质的形成的TIMP1。通过Westen-bolt验证对四个遴选出的候选的生物标志物进行验证,提示ADIPOQ和TIMP1的AUC面积提示这两种生物标志物诊断价值较高,可能可以作为诊断Ig AN的候选无创生物标志物。结论:本文首次通过蛋白质组学技术研究了维吾尔族、汉族尿液蛋白质的种族差异;首次研究了维吾尔族IgAN患者与健康人群的尿液差异蛋白质组。通过维吾尔族IgA肾病临床表现与病理无确定内在联系,表现出异质性,迫切需要寻找能够代替有创肾活检的无创生物指标,而优化后的iTRAQ标记定量尿蛋白质组的差异蛋白组分析对新疆维吾尔族Ig A肾病寻找无创尿液生物标志物成为可能,而差异蛋白信号转导通路、功能分析提示细胞免疫反应和脂质代谢异常、凝血系统功能障碍、补体系统激活在维吾尔族Ig A肾病的发生、发展中起着至关重要的作用。而ADIPOQ和TIMP1A可能可以作为诊断Ig AN的候选无创生物标志物,尿液蛋白质谱在不同IgA肾病临床表现与病理指标间,通过检测尿液差异蛋白来判断肾间质纤维化程度、肾小球硬化病变程度等,为诊断、评价IgA肾病,寻找新的无创生物学标记物成为可能,以期将来以尿液蛋白质组学分析替代有创的肾活检穿刺术,广泛地应用于临床实践。
彭甲银[9]（2016）在《奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3基因的表达调控及功能研究》文中研究表明基质金属蛋白酶（MMPs）在卵泡发生、发育、排卵和黄体形成等生物过程中发挥着重要的功能。TIMP3作为MMPs的抑制剂可能参与卵泡周期中各生命活动间的相互协调,而关于TIMP3在奶山羊卵泡中是否表达,表达规律如何,表达调控信号通路及其表达产物调节卵泡激素合成和颗粒细胞凋亡的分子机制等方面的研究,尚未见报道。本研究以关中奶山羊卵泡及其颗粒细胞为研究对象,在克隆和分析TIMP3基因cDNA序列的基础上,分析TIMP3在卵泡周期中的表达规律,探究LH/hCG和mi RNA对TIMP3基因表达、TIMP3基因表达产物对卵泡激素合成、胞外基质重构和颗粒细胞凋亡等生物过程相关基因表达的分子调控机制,以及TIMP3基因表达产物对颗粒细胞凋亡的影响,阐明TIMP3基因在卵泡周期中的生物功能,主要获得以下研究结果:1.TIMP3基因cDNA的克隆及其序列的生物信息学分析采用RACE技术从奶山羊卵巢中获得TIMP3基因的cDNA,通过测序和序列分析发现:奶山羊TIMP3基因cDNA序列全长2208 bp,其中5’非翻译区（5’UTR）长348 bp,CDS区长636 bp（编码211氨基酸的蛋白）,3’UTR长1224 bp;预测的氨基酸序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和大鼠的序列的相似度分别为100%、99%、100%、99%、97%和96%;蛋白质结构预测发现其蛋白质由一个N端结构域和一个C端结构域构成,其中每个结构域中包含6个保守的半胱氨酸残基。2.TIMP3基因在奶山羊卵泡周期中的表达规律分析通过Real-time PCR分析发现,TIMP3基因在奶山羊各组织中的表达存在差异,其中在输卵管中的相对表达量最高;在卵泡中,TIMP3基因mRNA的丰度随着卵泡的发育成熟逐渐升高,且在黄体中达到最高;比较分析发现,TIMP3在多羔奶山羊（连续3胎每胎产羔3-4只）卵巢组织中的表达量显着高于单羔奶山羊（连续3胎每胎产羔1-2只）,显示TIMP3基因与奶山羊产羔数可能密切相关。3.LH/hCG对TIMP3基因表达的分子调控机制分析采用hCG对培养的颗粒细胞进行处理,Real-time PCR分析发现,TIMP3基因mRNA的丰度分别在处理后4 h和24 h出现峰值;Western Blot分析发现,TIMP3蛋白丰度随着处理时间延长而增加,24 h时达到最大;采用抑制剂进行阻断分析,发现hCG诱导的TIMP3的增加受PKA,PKC,MAPK和PI3K信号通路的影响。进一步对TIMP3基因转录调控区进行分析,发现TIMP3基因上游-1至-122bp的区域内,包含3个Sp1结合位点,定点突变分析,发现-67-58和-74-65的突变明显降低TIMP3的转录;采用cAMP激活剂FSK处理颗粒细胞,促进Sp1表达,发现TIMP3转录增强,该结果与EMSA,ChIP以及Sp1过表达和沉默分析相一致,由此确定cAMP通过调节转录因子Sp1来调节TIMP3表达。4.miRNA对TIMP3基因表达的分子调控机制分析依据生物信息学分析的结果,构建荧光素酶报告载体并与miRNAs共转进颗粒细胞中,发现miR-21,miR-221,miR-222和miR-181b均显着的抑制了荧光素酶的活性;采用Real-time PCR分析发现,与NC组相比miR-21和miR-181b显着减少了颗粒细胞中TIMP3基因mRNA的丰度,而miR-221和miR-222组差异不显着;Western Blot分析发现,与NC组相比miR-21,miR-181b,mi R-221和miR-222都显着减少了TIMP3蛋白的丰度,表明miR-21,miR-221,miR-222和mi R-181b与TIMP3基因3’UTR区特异位点结合,调控TIMP3基因的表达,其中miR-21和miR-181b通过促进mRNA降解调节TIMP3基因表达,而miR-221和mi R-222通过抑制翻译调节TIMP3的表达,且miR-21,miR-221,miR-222和miR-181b可促进颗粒细胞的活力。5.TIMP3基因表达产物对颗粒细胞凋亡和激素合成的分子调控机制分析采用腺病毒介导TIMP3基因过表达和siRNA沉默TIMP3基因表达,发现TIMP3基因过表达可抑制颗粒细胞的活力,促进细胞凋亡;TIMP3下调可抑制hCG诱导类固醇激素合成酶StAR,p450scc,HSD3B基因的表达,降低孕酮水平;同时TIMP3抑制ADAM17基因表达,促进ECM蛋白相关基因FN和DCN基因的表达。以上研究表明,LH/hCG与颗粒细胞上的受体LHR结合,激活cAMP信号通路,促进转录因子Sp1表达,Sp1与TIMP3基因Sp1应答元件结合,促进TIMP3基因表达,TIMP3蛋白通过促进StAR,p450scc,HSD3B基因的表达调节孕酮的合成,促进FN和DCN基因表达调节ECM的重构,抑制ADAM17基因表达,抑制颗粒细胞的活力,促进颗粒细胞凋亡参与卵泡周期的调控。这些研究结果,为进一步阐明TIMP3参与调控卵泡周期的分子机理,揭示卵泡发育成熟和排卵的分子调控机制提供理论和试验依据。
王蔚[10]（2016）在《脑出血急性期中医分阶段治疗方案及蛭龙活血通瘀胶囊的干预作用机制研究》文中提出第一部分：临床观察目的：通过临床观察脑出血急性期应用中医分阶段治疗方案对患者相关指标的影响,研究中医分阶段治疗方案对脑出血急性期治疗的临床疗效,从而制定符合临床实际、规范化且行之有效、易于推广应用的脑出血急性期的临床治疗方案,以期提高该病的临床疗效。方法：采用随机平行对照的临床试验方法,纳入脑出血急性期患者,共60例,随机分为观察组和对照组,每组各30例,其中对照组采用西医常规治疗,包括稳定生命体征、控制血压、血糖、营养神经、改善脑代谢等；观察组在此基础上采用中医分阶段治疗方案,针对急性期不同阶段分别给予中药汤剂辨证施治,中成药、针灸理疗等方法进行治疗,两组均于治疗前及治疗后14d对患者的临床疗效及中医症状分级量表评分、NIHSS评分、Rankin评分、Barthel指数评分讲行检测,并于治疗前、治疗后7d及14天对患者颅内血肿的变化情况以及安全性指标,包括血常规、肝肾功、凝血等进行检测,从而比较两组的临床疗效和对上述指标的影响情况,分析并评价两组的有效性和安全性。结果：1、中医分阶段治疗方案组（观察组）患者的中医症状分级量表评分、NIHSS评分、Rankin评分、Barthel指数评分、颅内血肿体积改善情况均明显优于单纯西医治疗组（对照组）,P<0.05；观察组的中医证候疗效、西医临床疗效、颅内血肿疗效均明显高于对照组,P<0.05；2、两种治疗方案对患者的生命体征、肝肾功、血常规、凝血等指标均未造成不良影响,具有较好的安全性。结论：对脑出血急性期患者采用中医分阶段治疗方案较单纯西医治疗能够更加有效的使患者神经功能得到改善,从而提高患者治愈率,并改善生活质量,安全有效,值得推广。第二部分：动物实验目的：探讨蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠脑水肿、血脑屏障功能的影响,并研究该药脑保护的作用机制,为蛭龙活血通瘀胶囊在脑出血急性期的临床运用提供科学的实验依据。方法：取255只雄性、健康的SD大鼠,采用随机分组法分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊高、中、低剂量组,各组又根据指标检测的时间不同划分为12h、48h、72h三个亚组,采用自体血注入法制备脑出血大鼠模型,各药物组于术后分别给予蛭龙活血通瘀胶囊灌胃,每日量分别为0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg,而模型组和假手术组则灌胃与药物组同等体积的生理盐水,3ml／次,给药次数及时间同药物组。各组进行相应干预后,在各规定的时间点对大鼠神经行为学评分（NSS）进行测定,取出脑组织,检测大鼠脑含水量及脑系数,HE染色对大鼠脑出血血肿周围组织行病理学观察,采用伊文思蓝法检测血脑屏障的通透性,电子显微镜观察血脑屏障的超微结构,Western-blot法检测与脑水肿相关的蛋白AQP-4、MMP-9及TIMP-1的表达,PT-PCR法检测AQP-4、MMP-9及TIMP-1 mRNA表达。结果：1、脑出血模型大鼠在术后12h可见脑组织水肿,48h及72h脑水肿程度逐渐加重,神经功能缺损情况逐渐明显,NSS评分随之升高,脑含水量及脑系数也逐渐升高,HE染色见脑组织明显水肿,间质疏松,血肿周围结构紊乱。蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组在术后12h、48h及72h,大鼠脑水肿情况均较模型组有所改善,神经功能评分较之下降,脑含水量及脑系数也较之下降（P<0.01）,HE染色可见脑组织血肿周围水肿均有不同程度的改善,各药物组之间比较以高剂量组改善最为明显。2、脑出血模型大鼠在术后12h血脑屏障的通透性即可发现有明显改变,脑组织EB含量明显升高,术后48h时升高最为明显,72h时稍有下降。电镜超微结构显示术后48h,整个血管腔形态不规则,基膜厚薄不均,毛细血管周围水肿明显,组织稀疏,电子密度降低,内皮局部膨出,部分与基膜剥离,血脑屏障结构发生破坏。蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组在术后12h、48h及72h,大鼠血脑屏障通透性较模型组均具有不同程度的改善（P<0.01）,脑组织EB含量较之有所下降,电镜超微结构观察发现血管周围水肿程度较为轻微,血脑屏障的结构得到明显改善,以高剂量组改善最为明显。3、脑出血模型大鼠在术后12h、48h及72h脑组织中AQP-4、MMP-9、TIMP-1蛋白及基因的表达均有明显上升,其中,AQP-4蛋白及基因表达呈进行性升高,在72h时升高最为明显,MMP-9、TIMP-1蛋白及基因表达也有明显升高,在48h时上升明显并达到高峰,在72h时略有下降。而蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量组在术后12h、48h及72h时大鼠脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因的相对表达量均有不同程度的下降,TIMP-1蛋白及基因的相对表达量有所升高,与模型组比较,差异均具有显着性（P<0.01）,不同剂量组间比较,高剂量组最为明显（P<0.01）。结论：1、蛭龙活血通瘀胶囊能够明显改善脑出血大鼠神经功能缺损症状,使神经功能缺损评分有所减轻,并降低脑出血大鼠脑含水量及脑系数,从而使脑组织水肿程度得到明显改善。2、蛭龙活血通瘀胶囊能够明显改善脑出血大鼠血脑屏障的通透性,使脑组织EB含量有所减轻,保护血脑屏障的组织结构避免血脑屏障受到破坏,从而减轻脑组织的水肿程度。3、蛭龙活血通瘀胶囊能够明显降低脑出血大鼠脑组织AQP-4、MMP-9蛋白及基因的表达,同时升高TIMP-1蛋白及基因的表达,从而改善血肿周围脑组织水肿。4、蛭龙活血通瘀胶囊上述药理作用存在一定的量效关系,以高剂量组作用最为明显。
二、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）鲢鱼基质金属蛋白酶2及其内源性抑制剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 基质金属蛋白酶 |
| 1.1.1 基质金属蛋白酶结构和功能 |
| 1.1.2 水产动物MMPs的研究现状 |
| 1.1.3 基质金属蛋白酶2 |
| 1.2 基质金属蛋白酶抑制剂 |
| 1.2.1 TIMPs |
| 1.2.2 α_2-巨球蛋白 |
| 1.2.3 其它内源性抑制剂 |
| 1.2.4 合成抑制剂 |
| 1.3 研究目的和内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 原料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 分析软件及网站 |
| 2.2 实验所用溶液及配制方法 |
| 2.2.1 rHm-MMP2c克隆表达用缓冲液 |
| 2.2.2 抑制剂分离纯化用缓冲液 |
| 2.2.3 rHm-MMP2c酶活力测定用缓冲液 |
| 2.2.4 SDS-PAGE用缓冲液 |
| 2.2.5 明胶酶谱用缓冲液 |
| 2.2.6 Western blot用缓冲液 |
| 2.2.7 不同pH值缓冲液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 rHm-MMP2c的分子克隆 |
| 2.3.2 MMP2 mRNA在不同组织中相对表达量的分析 |
| 2.3.3 rHm-MMP2c的原核表达 |
| 2.3.4 rHm-MMP2c多克隆抗体的制备 |
| 2.3.5 蛋白质浓度测定 |
| 2.3.6 rHm-MMP2c的酶学性质分析 |
| 2.3.7 rHm-MMP2c抑制酶活的测定 |
| 2.3.8 抑制剂的分离纯化 |
| 2.3.9 抑制剂的性质研究 |
| 2.3.10 抑制剂对rHm-MMP2c的抑制作用 |
| 2.3.11 酶和抑制剂相互作用分析 |
| 2.3.12 分子对接 |
| 2.3.13 分子动力学模拟 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 rHm-MMP2c的克隆与表达 |
| 3.1.1 rHm-MMP2c的分子克隆 |
| 3.1.2 rHm-MMP2c的表达及纯化 |
| 3.1.3 rHm-MMP2c三级结构预测 |
| 3.2 MMP2 在鲢鱼各组织中基因水平的表达差异 |
| 3.3 兔抗rHm-MMP2c多克隆抗体的制备及效价检测 |
| 3.4 rHm-MMP2c的酶学性质分析 |
| 3.4.1 rHm-MMP2c二级结构分析 |
| 3.4.2 rHm-MMP2c的热稳定性和pH稳定性分析 |
| 3.4.3 蛋白酶抑制剂对rHm-MMP2c酶活的影响 |
| 3.4.4 rHm-MMP2c降解I型胶原和明胶 |
| 3.4.5 酶动力学参数的测定 |
| 3.5 抑制剂的分离纯化及性质研究 |
| 3.5.1 抑制剂的分离纯化 |
| 3.5.2 抑制剂的性质分析 |
| 3.5.3 抑制动力学分析及抑制活性的测定 |
| 3.5.4 不同鱼Apo A-Ⅰ对不同MMP2c的抑制活性测定 |
| 3.6 相互作用分析 |
| 3.6.1 复合物的形成 |
| 3.6.2 Apo A-Ⅰ对 rHm-MMP2c明胶降解的抑制 |
| 3.7 分子对接和分子动力学模拟 |
| 3.7.1 分子对接 |
| 3.7.2 分子动力学模拟 |
| 第4章 主要结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（2）皱纹盘鲍基质金属蛋白酶1及组织抑制剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 我国鲍鱼养殖现状 |
| 1.2 水产动物自溶 |
| 1.3 基质金属蛋白酶研究进展 |
| 1.3.1 MMPs分类 |
| 1.3.2 MMPs的结构特征 |
| 1.3.3 MMPs的激活 |
| 1.3.4 MMPs的功能 |
| 1.4 金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs) |
| 1.4.1 TIMPs分类 |
| 1.4.2 TIMPs的结构与性质 |
| 1.4.3 TIMPs的作用 |
| 1.5 MMPs与 TIMPs相互作用的研究进展 |
| 1.6 研究目的与内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 皱纹盘鲍基质金属蛋白酶1 的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 实验用仪器和试剂以及菌株和载体 |
| 2.3 实验所用溶液及其配制方法 |
| 2.3.1 rMMP1c克隆表达所用溶液 |
| 2.3.2 rMMP1c酶活力测定所用缓冲液 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 皱纹盘鲍死后肌肉TPA参数测定和MMPs活性验证 |
| 2.4.2 基质金属蛋白酶1 催化结构域(MMP1c)重组表达载体构建 |
| 2.4.3 rMMP1c蛋白的表达与纯化 |
| 2.4.4 rMMP1c蛋白鉴定 |
| 2.4.5 rMMP1c酶学性质分析 |
| 2.4.6 rMMP1c圆二色谱分析 |
| 2.4.7 数据处理 |
| 2.5 实验结果与分析 |
| 2.5.1 皱纹盘鲍肌肉软化研究 |
| 2.5.2 基质金属蛋白酶1 催化结构域(MMP1c)的体外表达与纯化 |
| 2.5.3 rMMP1c蛋白鉴定 |
| 2.5.4 质谱鉴定 |
| 2.5.5 rMMP1c酶学性质分析 |
| 2.5.6 圆二色谱分析rMMP1c二级结构 |
| 第3章 皱纹盘鲍金属蛋白酶组织抑制剂的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验原料 |
| 3.2.2 菌株及载体 |
| 3.2.3 TIMP克隆表达所用溶液 |
| 3.2.4 金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)重组表达载体构建 |
| 3.2.5 质谱鉴定 |
| 3.2.6 rTIMP性质分析 |
| 3.2.7 rTIMP圆二色谱分析 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TIMP重组表达载体的构建 |
| 3.3.2 rTIMP的体外诱导表达与纯化 |
| 3.3.3 质谱鉴定 |
| 3.3.4 rTIMP性质分析 |
| 3.3.5 圆二色谱分析rTIMP二级结构 |
| 第4章 皱纹盘鲍MMP-1和TIMP在 I型胶原蛋白降解中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 蛋白质浓度的测定 |
| 4.2.2 抑制动力学研究 |
| 4.2.3 Blitz蛋白-蛋白相互作用 |
| 4.2.4 鲍鱼I型胶原蛋白的降解实验 |
| 4.2.5 RP-HPLC测定rMMP1c降解I型胶原蛋白的分子量分布 |
| 4.2.6 抑制I型胶原蛋白降解试验 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 rTIMP抑制动力学 |
| 4.3.2 rTIMP与 rMMP1c亲和力测定 |
| 4.3.3 rMMP1c对鲍鱼I型胶原蛋白的降解作用 |
| 4.3.4 rTIMP对 rMMP1c降解I型胶原蛋白的抑制作用 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果情况 |
（3）黔北麻羊TIMP1基因编码区的克隆、表达及生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物及样品采集 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 TIMP1基因引物设计与合成 |
| 1.2.2 黔北麻羊组织总RNA提取及cDNA第一链的合成 |
| 1.2.3 目的片段的合成及回收 |
| 1.2.4 TIMP1基因的连接、转化及菌夜验证 |
| 1.2.5 TIMP1基因在黔北麻羊不同组织表达水平检测 |
| 1.2.6 数据处理及统计分析 |
| 1.2.7 黔北麻羊TIMP1基因生物信息学分析及生物进化树构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黔北麻羊TIMP1基因的扩增 |
| 2.2 黔北麻羊TIMP1基因克隆及测序 |
| 2.3 黔北麻羊TIMP1蛋白序列分析 |
| 2.3.1 蛋白质理化性质分析 |
| 2.3.2 蛋白质疏水性分析 |
| 2.3.3 蛋白质跨膜区域分析 |
| 2.3.4蛋白质信号肽预测 |
| 2.3.5 蛋白质结构域及亚细胞定位分析 |
| 2.4 黔北麻羊TIMP1蛋白的结构预测 |
| 2.4.1 蛋白质二级结构预测 |
| 2.4.2 蛋白质三级结构预测 |
| 2.5 黔北麻羊TIMP1基因在不同组织的表达分析 |
| 2.6 黔北麻羊TIMP1基因的遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（4）双调蛋白调控人黄素化颗粒细胞激素生成和滋养层细胞浸润的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 双调蛋白上调人黄素化颗粒细胞芳香化酶表达和雌激素生成的机制研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 双调蛋白上调人颗粒细胞内VEGF表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 双调蛋白上调滋养层细胞MMP9活性增加细胞浸润 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 创新点 |
| 综述 双调蛋白在卵巢功能和妊娠进程中的作用 |
| 1 双调蛋白简介 |
| 2 双调蛋白参与调控卵巢功能 |
| 3 双调蛋白在妊娠中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历和发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）锡兰钩虫金属蛋白酶组织抑制剂基因的克隆表达与特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 锡兰钩虫 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 临床症状和诊断 |
| 1.1.5 防治 |
| 1.1.6 钩虫疫苗的研究进展 |
| 1.2 金属蛋白酶组织抑制剂的研究进展 |
| 1.2.1 金属蛋白酶组织抑制剂概述 |
| 1.2.2 金属蛋白酶组织抑制剂的结构 |
| 1.2.3 金属蛋白酶组织抑制剂的功能 |
| 1.2.4 无脊椎动物的金属蛋白酶组织抑制剂 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫体样品 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用溶液的配制 |
| 2.1.5 培养基的制备 |
| 2.1.6 相关生物信息学软件及在线网址 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 钩蚴的培养 |
| 2.2.2 锡兰钩虫的虫种鉴定 |
| 2.2.3 TIMP基因的克隆与测序 |
| 2.2.4 TIMP成熟肽序列的克隆与表达 |
| 2.2.5 TIMP蛋白的特性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 钩蚴培养效果 |
| 3.2 虫种鉴定结果 |
| 3.2.1 形态学特征 |
| 3.2.2 PCR扩增结果 |
| 3.2.3 钩虫ITS序列的同源性分析 |
| 3.2.4 锡兰钩虫ITS序列的遗传进化分析 |
| 3.3 TIMP基因的克隆与序列分析 |
| 3.3.1 TIMP基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 菌液PCR鉴定结果 |
| 3.3.3 TIMP基因测序结果 |
| 3.3.4 TIMP序列比对及遗传进化分析 |
| 3.3.5 TIMP基因的生物信息学分析 |
| 3.4 TIMP-MP序列克隆与表达 |
| 3.4.1 PCR扩增结果 |
| 3.4.2 菌液PCR鉴定结果 |
| 3.4.3 TIMP-MP与 p ET32a表达载体线性化结果 |
| 3.4.4 重组表达质粒的双酶切鉴定结果 |
| 3.4.5 p ET32a-TIMP-MP的诱导表达 |
| 3.4.6 表达产物的Western blot分析 |
| 3.4.7 表达产物的可溶性分析 |
| 3.4.8 TIMP基因的表达时期分析 |
| 3.5 重组蛋白的特性分析 |
| 3.5.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.5.2 抗血清效价的测定 |
| 3.5.3 重组蛋白的抗原性分析结果 |
| 3.5.4 Ace-TIMP对 MMP-2 的抑制活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 两种钩蚴培养方法的比较 |
| 4.2 锡兰钩虫TIMP的基因克隆与原核表达 |
| 4.3 锡兰钩虫TIMP的抗原性及酶活特性分析 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间论文发表和获奖情况 |
（6）TGF-β及其Ⅰ型受体在三角帆蚌免疫应答和创伤修复中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 TGF-β信号通路 |
| 1.1.1 TGF-β亚家族 |
| 1.1.2 TGF-β受体 |
| 1.1.3 TGF-β信号的功能 |
| 1.1.4 TGF-β信号的调节 |
| 1.1.5 TGF-β信号在免疫中的作用 |
| 1.1.6 TGF-β信号在组织损伤修复中的作用 |
| 1.2 本研究的目的和意义 |
| 第2章 三角帆蚌TGF-β及其I型受体基因克隆、原核表达及在创伤修复中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 菌种和ccc DNA |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 实验试剂 |
| 2.2.5 引物表 |
| 2.2.6 微生物刺激及创伤修复试验和抑制阻断实验 |
| 2.2.7 总RNA的提取 |
| 2.2.8 SMART c DNA的合成 |
| 2.2.9 Hc TGF-β和TGF-βRI基因的克隆 |
| 2.2.10 TGF-β基因和TGF-βRI基因的生物学分析 |
| 2.2.11 TGF-β和TGF-βRI基因的原核表达 |
| 2.2.12 TGF-βRI基因胞内段的原核表达 |
| 2.2.13 TGF-β及TGF-βRI的多克隆抗体制备 |
| 2.2.14 TGF-β及TGF-βRI多克隆抗体效价的ELISA检测 |
| 2.2.15 TGF-β及TGF-βRI Western blotting检测 |
| 2.2.16 重组蛋白TGF-β活性测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 三角帆蚌的总RNA |
| 2.3.2 Hc TGF-β基因的RACE实验和Hc TGF-βRI基因片段克隆 |
| 2.3.3 Hc TGF-β和Hc TGF-βRI基因c DNA全长序列及推导的氨基酸序列 |
| 2.3.4 预测的Hc TGF-β和Hc TGF-βRI蛋白序列的生物信息学分析 |
| 2.3.5 推导Hc TGF-β和Hc TGF-βRI氨基酸序列比对 |
| 2.3.6 TGF-β和TGF-βRI基因的系统进化树 |
| 2.3.7 Hc TGF-βRI基因的组织表达 |
| 2.3.8 嗜水气单胞菌和肽聚糖刺激后Hc TGF-βRI基因在肝胰脏、血细胞组织中的表达 |
| 2.3.9 创面组织TGF-βRI基因的表达变化 |
| 2.3.10 SB431542 处理三角帆蚌后TGF-β/Smads信号通路下游基因表达变化 |
| 2.3.11 TGF-β基因在大肠杆菌中的表达及纯化 |
| 2.3.12 TGF-βRI基因在大肠杆菌中的表达及纯化 |
| 2.3.13 多克隆抗体的制备及ELISA检测 |
| 2.3.14 Western blotting检测 |
| 2.3.15 重组蛋白TGF-β活性测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 结论与展望 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（7）家蚕基质金属蛋白酶家族MMPs及组织金属蛋白酶抑制剂TIMP在家蚕中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 MMPs基质金属蛋白酶家族 |
| 1.1.1 MMPs基质金属蛋白酶家族的进化 |
| 1.1.2 MMPs基质金属蛋白酶家族的分类 |
| 1.1.3 MMPs基质金属蛋白酶家族的结构特征 |
| 1.1.4 MMPs基质金属蛋白酶家族的活性调控 |
| 1.1.5 MMPs基质金属蛋白酶家族的功能 |
| 1.2 TIMPs组织金属蛋白酶抑制剂家族 |
| 1.2.1 TIMPs家族的发现及结构 |
| 1.2.2 TIMPs家族的功能 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景和目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 BmMMPs和BmTIMP基因的鉴定及表达特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒与细菌 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕MMPs家族基因和TIMP基因序列分析 |
| 3.2.2 MMPs家族和TIMP的组织和时期表达分析 |
| 3.2.3 MMPs和TIMP的亚细胞定位及与定位相关的结构域鉴定 |
| 3.2.4 不同免疫诱导刺激下MMPs和TIMP的表达模式 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BmMMPs和BmTIMP的相互作用鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 荧光共定位分析MMPs与TIMP的相互作用 |
| 4.2.2 BiFC分析MMPs与TIMP的相互作用 |
| 4.2.3 Co-IP分析MMPs与TIMP的相互作用 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BmMMPs和BmTIMP对BmNPV侵染的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞与病毒 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MMPs与TIMP基因的过表达效果检测 |
| 5.2.2 过表达MMPs与TIMP对BmNPV侵染的影响 |
| 5.2.3 MMPs与TIMP基因的CRISPR/Cas9敲除效果检测 |
| 5.2.4 CRISPR/Cas9敲除MMPs与TIMP对BmNPV侵染的影响 |
| 5.2.5 MMPs的蛋白酶活性对BmNPV侵染的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转基因过表达BmMMP3和BmTIMP对BmNPV增殖及家蚕变态发育影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 家蚕、病毒与载体 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 MMP3-OE与TIMP-OE转基因品系的建立及鉴定 |
| 6.2.2 MMP3-OE转基因品系的表型分析及对BmNPV侵染的影响 |
| 6.2.3 TIMP-OE转基因品系的表型分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 转基因杂交敲除BmMMPs家族基因对BmNPV增殖及家蚕变态发育影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 家蚕、病毒与载体 |
| 7.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 Cas9-OE与MMPs-sgRNA转基因品系的建立及鉴定 |
| 7.2.2 MMP1-KO转基因杂交敲除品系的鉴定及表型分析 |
| 7.2.3 MMP2-KO转基因杂交敲除品系的鉴定及表型分析 |
| 7.2.4 MMP3-KO转基因杂交敲除品系的鉴定及表型分析 |
| 7.2.5 MMPs-KO品系对BmNPV侵染活力的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 BmMMPs和BmTIMP作用机制的探究及相互作用蛋白的鉴定 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 家蚕、病毒与载体 |
| 8.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 BmNPV的关键基因对MMPs家族基因的诱导调控 |
| 8.2.2 MMPs与TIMP之间的的诱导调控 |
| 8.2.3 MMPs调控Caspase的活性 |
| 8.2.4 MMP1a和MMP3互作蛋白的钓取 |
| 8.2.5 MMP1a和MMP3互作蛋白的克隆及初步鉴定 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 全文总结与展望 |
| 9.1 全文总结 |
| 9.2 展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表学术论文及参研课题情况 |
| 致谢 |
（8）新疆地区IgA肾病尿液蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新疆地区IgA肾病临床与病理特点 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 基线资料及随访变量 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 iTRAQ标记与label-free蛋白质组学技术在IgA肾病尿液蛋白质组学中的探索 |
| 1 Label-Free技术在IgA肾病尿液蛋白质组的研究 |
| 1.1 研究内容与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验步骤 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 2 iTRAQ技术在IgA肾病尿液蛋白质组学的研究 |
| 2.1 研究内容与方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 小结 |
| 第三部分 新疆地区IgA肾病尿液蛋白质组学研究 |
| 1 新疆地区IgA肾病尿液差异蛋白质组研究 |
| 1.1 研究内容与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试验方法 |
| 1.1.3 实验步骤 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 2 新疆地区IgA肾病尿液差异蛋白验证 |
| 2.1 研究内容与方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 尿液蛋白质组学在肾疾病中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3基因的表达调控及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 LH调节基因表达的信号通路研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 LH诱导的信号转导通路 |
| 1.2.1 cAMP/PKA和MAPK信号通路 |
| 1.2.2 PKC信号通路 |
| 1.2.3 PI3K/Akt信号通路 |
| 1.2.4 EGFR信号通路 |
| 1.2.5 LH通过信号通路诱导基因表达的研究进展 |
| 第二章 TIMP3基因研究进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 基质金属蛋白酶（MMPS）和基质蛋白酶组织抑制因子（TIMPS） |
| 2.2.1 MMPs |
| 2.2.2 TIMPs |
| 2.3 TIMP3的结构 |
| 2.4 TIMP3基因的组织表达谱分析 |
| 2.5 TIMP3的表达调控 |
| 2.5.1 激素对TIMP3表达的调节 |
| 2.5.2 细胞或生长因子对TIMP3表达的调节 |
| 2.5.3 miRNA对TIMP3表达的调节 |
| 2.6 TIMP3的生物学功能 |
| 2.6.1 TIMP3对细胞凋亡的作用 |
| 2.6.2 TIMP3对血管生成的影响 |
| 2.6.3 TIMP3与组织重塑和疾病的关系 |
| 2.6.4 TIMP3对肿瘤的抑制作用 |
| 2.7 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 奶山羊TIMP3基因的克隆及表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验动物 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 卵泡及卵泡细胞的分离 |
| 3.2.5 RNA提取和反转录 |
| 3.2.6 TIMP3基因全长cDNA的克隆及生物信息学分析 |
| 3.2.7 Real-time PCR分析 |
| 3.2.8 免疫组织化学分析 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 提取的奶山羊总RNA检测 |
| 3.3.2 TIMP3 mRNA序列的克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.3 TIMP3在山羊各组织中的表达分析 |
| 3.3.4 TIMP3在不同产羔数奶山羊卵巢中的表达分析 |
| 3.3.5 TIMP3在不同大小卵泡及卵泡细胞中的表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 hCG对奶山羊卵巢颗粒细胞TIMP3表达调节的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验动物 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 奶山羊卵巢GCs的分离培养及鉴定 |
| 4.2.5 Western blot分析蛋白水平 |
| 4.2.6 奶山羊TIMP3启动子的克隆与生物信息学分析 |
| 4.2.7 奶山羊TIMP3启动子 5'缺失片段的克隆及载体构建 |
| 4.2.8 细胞转染及相对荧光素酶活性测定 |
| 4.2.9 TIMP3基因启动子转录因子结合位点突变分析。 |
| 4.2.10 核蛋白提取和电泳迁移率实验（EMSA） |
| 4.2.11 染色质免疫共沉淀（ChIP） |
| 4.2.12 pcDNA3.1 过表达载体构建及干扰siRNA的合成 |
| 4.2.13 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 奶山羊卵巢GCs的鉴定 |
| 4.3.2 hCG处理对奶山羊卵巢GCs中TIMP3表达的影响 |
| 4.3.3 hCG诱导的细胞信号通路对TIMP3表达的影响 |
| 4.3.4 TIMP3启动子的克隆与分析 |
| 4.3.5 TIMP3启动子不同大小片段的克隆及载体构建 |
| 4.3.6 TIMP3启动子活性分析 |
| 4.3.7 TIMP3启动子活性区转录因子结合位点突变分析 |
| 4.3.8 EMSA和ChIP鉴定转录因子结合 |
| 4.3.9 Sp1过表达载体构建 |
| 4.3.10 过表达和干扰效率验证 |
| 4.3.11 Sp1过表达和干扰对TIMP3的调节作用。 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 miR-221/222，miR-21和miR-181b对奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3表达调节的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验动物 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 奶山羊卵巢GCs的分离培养 |
| 5.2.5 奶山羊TIMP3基因 3'UTR区miRNA靶结合位点的预测 |
| 5.2.6 miRNA靶结合位点及位点突变双荧光素酶报告载体的构建 |
| 5.2.7 miRNA模拟物的化学合成 |
| 5.2.8 细胞转染和荧光素酶检测 |
| 5.2.9 Real-time PCR和Western Blot检测 |
| 5.2.10 细胞活力检测（MTT） |
| 5.2.11 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 TIMP3基因 3’UTR区mi RNA靶位点的预测 |
| 5.3.2 双荧光素酶报告载体的构建 |
| 5.3.3 靶位点突变双荧光素酶报告载体的构建 |
| 5.3.4 荧光素酶活性检测 |
| 5.3.5 Real-time PCR和Western Blot检测miRNA对TIMP3 m RNA和蛋白水平的影响 |
| 5.3.6 miR-21，miR-221，miR-222和miR-181b对奶山羊卵巢GCs活力的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 TIMP3在奶山羊卵巢颗粒细胞中潜在功能研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验动物 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 奶山羊卵巢GCs的分离培养 |
| 6.2.5 RNA提取和反转录 |
| 6.2.6 腺病毒介导的TIMP3过表达载体的构建 |
| 6.2.7 重组腺病毒的包装及纯化 |
| 6.2.8 重组腺病毒的扩增和滴度测定 |
| 6.2.9 TIMP3 siRNA的设计和合成 |
| 6.2.10 Real-time PCR和western blot蛋白水平检测 |
| 6.2.11 细胞活力和细胞凋亡检测 |
| 6.2.12 ELSIA检测孕酮浓度 |
| 6.2.13 统计学分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组腺病毒Ad-TIMP3的构建、包装及滴度测定 |
| 6.3.2 重组腺病毒介导的过表达效率验证 |
| 6.3.3 合成的TIMP3特异性siRNA干扰效率验证 |
| 6.3.4 重组腺病毒介导的TIMP3过表达对GCs活性及凋亡的影响 |
| 6.3.5 TIMP3下调对hCG诱导的孕酮合成及类固醇激素酶表达的影响 |
| 6.3.6 hCG处理对奶山羊卵巢GCs中ADAM7，DCN和FN表达的影响 |
| 6.3.7 TIMP3下调对奶山羊卵巢GCs中ADAM7，DCN和FN表达的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）脑出血急性期中医分阶段治疗方案及蛭龙活血通瘀胶囊的干预作用机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 临床观察 |
| 引言 |
| 临床观察技术路线 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 病例选择 |
| 1.2.1 西医诊断标准 |
| 1.2.2 中医诊断标准 |
| 1.2.2.1 疾病诊断 |
| 1.2.2.2 证候诊断 |
| 1.2.3 疾病分期诊断 |
| 1.2.4 病情严重程度划分 |
| 1.2.5 纳入标准 |
| 1.2.6 排除标准 |
| 1.2.7 剔除及脱漏标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 分组情况 |
| 2.2 急性期病程阶段的划分 |
| 2.3 治疗方法 |
| 2.3.1 对照组 |
| 2.3.2 观察组 |
| 2.4 观察指标 |
| 2.4.1 各组一般情况 |
| 2.4.2 疗效性观察指标 |
| 2.4.2.1 中医证候学的观察 |
| 2.4.2.2 卒中相关量表的观察 |
| 2.4.2.3 血肿体积(出血量)的观察 |
| 2.4.3 疗效判定标准 |
| 2.4.3.1 中医证候疗效判定 |
| 2.4.3.2 西医临床疗效评定分级标准 |
| 2.4.3.3 颅内血肿的判定标准 |
| 2.4.4 安全性指标 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 两组一般情况比较 |
| 3.1.1 两组性别分布比较 |
| 3.1.2 两组年龄(岁)比较 |
| 3.1.3 两组身高(cm)比较 |
| 3.1.4 两组体重(kg)比较 |
| 3.1.5 两组发病时间(h)比较 |
| 3.1.6 两组出血部位比较 |
| 3.1.7 两组病情严重程度比较 |
| 3.1.8 两组中医证候分布比较 |
| 3.1.9 两组合并症比较 |
| 3.2 两组疗效性观察指标比较 |
| 3.2.1 两组治疗前后中医症状量化评分比较 |
| 3.2.2 两组NIHSS量表评分前后比较 |
| 3.2.3 两组Barthel指数评分前后比较 |
| 3.2.4 两组改良Rankin量表评分前后比较 |
| 3.2.5 两组血肿体积(cm~3)治疗前后比较 |
| 3.3 两组临床疗效比较 |
| 3.3.1 两组中医证候疗效比较 |
| 3.3.2 两组西医临床疗效评定比较 |
| 3.3.3 两组颅内血肿疗效比较 |
| 3.4 两组安全性指标及不良反应情况比较 |
| 3.4.1 两组治疗前后生命体征情况比较 |
| 3.4.2 两组治疗前后血常规检验比较 |
| 3.4.3 两组治疗前后肝肾功能、凝血功能检验情况比较 |
| 3.4.4 两组治疗前后大小便检验情况 |
| 3.4.5 不良反应发生情况 |
| 3.4.6 两组不良反应发生情况比较 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 中医对脑出血急性期的认识及诊治思路 |
| 5.2 关于脑出血临床疗效评判指标的选择 |
| 5.3 蛭龙活血通瘀胶囊治疗脑出血急性期的理论依据 |
| 第二部分 动物实验 |
| 引言 |
| 动物实验技术路线 |
| 实验一：蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑水肿的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物和试剂 |
| 1.3 实验仪器及耗材 |
| 1.4 动物分组 |
| 1.5 模型制备 |
| 1.6 模型评估 |
| 1.7 给药方法 |
| 1.8 检测指标 |
| 1.8.1 神经行为学功能检测 |
| 1.8.2 脑含水量及脑系数检测 |
| 1.8.3 脑组织HE染色病理组织学检测 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠神经行为学的影响 |
| 2.2 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑含水量的影响 |
| 2.3 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑系数的影响 |
| 2.4 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑组织病理学的影响 |
| 3 小结 |
| 4 讨论：脑出血动物模型制备 |
| 实验二：蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠血脑屏障功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及试剂 |
| 1.3 实验仪器及耗材 |
| 1.4 动物分组 |
| 1.5 模型制备及评定 |
| 1.6 给药方法 |
| 1.7 检测指标 |
| 1.7.1 血脑屏障通透性检测 |
| 1.7.2 血脑屏障超微结构观察 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠血脑屏障通透性的影响 |
| 2.2 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠血脑屏障超微结构的影响 |
| 3 小结 |
| 4 讨论：脑出血后脑水肿与血脑屏障通透性的关系 |
| 实验三：蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠AQP-4、MMP-9、TIMP-1蛋白和基因的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及试剂 |
| 1.3 实验仪器及耗材 |
| 1.4 动物分组 |
| 1.5 模型制备及评定 |
| 1.6 给药方法 |
| 1.7 检测指标 |
| 1.7.1 待检样品制备 |
| 1.7.2 AQP-4、MMP-9、TIMP-1蛋白检测 |
| 1.7.2.1 蛋白提取及检验 |
| 1.7.2.2 Western blot操作步骤 |
| 1.7.3 AQP-4、MMP-9、TIMP-1 mRNA检测 |
| 1.7.3.1 引物设计 |
| 1.7.3.2 RNA的提取 |
| 1.7.3.3 合成cDNA |
| 1.7.3.4 RT-PCR扩增 |
| 1.7.3.5 RNA电泳及检测 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠AQP-4、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的影响 |
| 2.1.1 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠AQP-4蛋白表达的影响 |
| 2.1.2 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠MMP-9蛋白表达的影响 |
| 2.1.3 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠TIMP-1蛋白表达的影响 |
| 2.2 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠AQP-4、MMP-9、TIMP-1 mRNA表达的影响 |
| 2.2.1 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠AQP-4 mRNA表达的影响 |
| 2.2.2 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠MMP-9 mRNA表达的影响 |
| 2.2.3 蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠TIMP-1 mRNA表达的影响 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AQP-4与脑出血后脑水肿的关系 |
| 4.2 MMP-9与脑出血后脑水肿的关系 |
| 4.3 TIMP-1与脑出血后脑水肿的关系 |
| 参考文献 |
| 第三部分：文献综述 |
| 1 活血化瘀法在脑出血急性期的应用及研究现状 |
| 2 蛭龙活血通瘀胶囊治疗脑血管疾病的研究现状分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件1:中风病证候诊断量表 |
| 附件2:中风病症状分级量化评分表 |
| 附件3:美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS) |
| 附件4:改良Rankin量表（MRS评分） |
| 附件5: Barthel指数(Bl评分） |
| 附件6:安全性监测指标及血肿体积监测信息表 |
| 附件7:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]鲢鱼基质金属蛋白酶2及其内源性抑制剂的研究[D]. 王钰佳. 集美大学, 2021(01)
- [2]皱纹盘鲍基质金属蛋白酶1及组织抑制剂的研究[D]. 张明辉. 集美大学, 2021
- [3]黔北麻羊TIMP1基因编码区的克隆、表达及生物信息学分析[J]. 洪磊,敖叶,周志楠,唐文,阮涌,倪萌萌,陈祥. 中国畜牧杂志, 2020(07)
- [4]双调蛋白调控人黄素化颗粒细胞激素生成和滋养层细胞浸润的机制研究[D]. 于医萍. 郑州大学, 2020(02)
- [5]锡兰钩虫金属蛋白酶组织抑制剂基因的克隆表达与特性分析[D]. 颜欣欣. 华南农业大学, 2019
- [6]TGF-β及其Ⅰ型受体在三角帆蚌免疫应答和创伤修复中的作用[D]. 易霈霈. 南昌大学, 2019(02)
- [7]家蚕基质金属蛋白酶家族MMPs及组织金属蛋白酶抑制剂TIMP在家蚕中的功能研究[D]. 刘太行. 西南大学, 2017(10)
- [8]新疆地区IgA肾病尿液蛋白质组学研究[D]. 杨淑芬. 新疆医科大学, 2017(12)
- [9]奶山羊卵巢颗粒细胞中TIMP3基因的表达调控及功能研究[D]. 彭甲银. 西北农林科技大学, 2016(08)
- [10]脑出血急性期中医分阶段治疗方案及蛭龙活血通瘀胶囊的干预作用机制研究[D]. 王蔚. 成都中医药大学, 2016(05)