一、乙型肝炎病毒感染者DNA检测分析（论文文献综述）
王松姣[1]（2021）在《PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用》文中研究说明慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响全世界约2.57亿人,并且是引起乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病的主要原因。临床上常使用核苷（酸）类似物（NAs）)来抑制病毒复制,但是耐药性病毒株的选择常常会导致治疗失败和疾病的进展。而且,耐药性的发展始于HBV聚合酶基因的突变,随后数周至数月后病毒载量和血清丙氨酸氨基转移酶水平升高。因此,抗HBV耐药性突变的检测对于迅速制定新的治疗方案至关重要。第一部分乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价目的本研究探讨建立一种检测HBV逆转录酶区10个经典耐药位点的PCR产物直接测序方法。方法1建立检测HBV逆转录酶区耐药突变的PCR产物直接测序方法根据HBV逆转录酶区常见的突变位点,采用Primer Premier 6.0软件设计了覆盖HBV基因型B和基因型C的逆转录酶区rt169至rt250位点的通用引物。以慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA作为模板进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析PCR产物,以验证目的基因是否被扩增成功。2包含HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的标准质粒的构建通过掺入Eco RI和Hind III限制性酶切位点的引物扩增HBV DNA模板,然后分别用限制性内切酶Eco RI和Hind III消化纯化的PCR产物和p UC19克隆载体。在使用T4 DNA连接酶将这两个酶切后的DNA片段的磷酸二酯键连接在一起之后,下一步是将重组质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。然后进行菌落PCR筛选和质粒DNA测序分析,以确定重组质粒标准模板是否构建成功。3 PCR产物直接测序法的评价将得到的重组菌株扩大培养,并对提取的质粒DNA进行定量和倍比稀释。以各浓度梯度的标准质粒作为DNA模板,重复PCR扩增3次。然后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,以目的条带检出率为100%时的最高和最低模板浓度分别作为该方法的检测上限和下限。通过建立的PCR方法对经Sanger测序验证的rt M204I突变标本连续重复检测10天,分析该耐药位点的突变检出率,以评价该方法的重复性。依据分子克隆方法构建rt M204I突变型重组质粒,将突变型质粒DNA按一定比例混合到野生型质粒中;对混合DNA模板进行PCR扩增,然后应用Mutation Surveyor软件对测序结果进行比对分析,以评价该方法对耐药突变株的检测灵敏度。分别对感染了人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体患者和正常受试者的血清DNA样品以及用作空白对照和阳性对照的蒸馏水和质粒标准品进行PCR扩增和目的条带的检测,以评价该方法的特异性。结果（1）通过优化PCR扩增体系和条件,建立了一个标准化的PCR方案以检测HBV逆转录酶区的耐药突变位点。50μL PCR扩增体系为:蒸馏水33μL,20 mmol/L 10×扩增缓冲液（Mg2+plus）5μL,4种d NTP混合物（每种浓度为2.5 mmol/L）4μL,Ex Taq聚合酶（5 U/μL）1μL,上游引物（10μmol/L）1μL,下游引物（10μmol/L）1μL,模板DNA 5μL（<500 ng）。PCR扩增条件为95℃预变性5 min;94℃变性10 s,55℃退火20 s,72℃延伸1 min;循环40次;最后72℃延伸5 min。（2）通过分子克隆技术成功构建了包含有HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的野生型标准质粒。（3）该方法对血清HBV DNA的检测范围为0.36 copies/μL至2.88×1011 copies/μL,联合应用Mutation Surveyor软件可检测出含量低至5%的耐药突变株。同一样本重复10次PCR扩增和测序分析,rt M204I的突变检出率为100%。在空白对照和HBV DNA阴性标本中均未检出目的条带。结论本课题所建立的PCR产物直接测序法能够同时检测HBV逆转录酶区rt169至rt250间的耐药突变位点,具有检测下限低、重复性好、特异性高、简单快捷的特点,联合应用Mutation Surveyor软件可提高对低含量耐药变异株检测的灵敏度。第二部分PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用目的HBV耐药源于长期使用核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗过程中HBV逆转录酶（RT）发生突变。到目前为止,这些突变在治疗过程中如何分布和进化的特征还没有被阐明。因此,本研究旨在通过上述建立的PCR产物直接测序法对未接受过治疗和接受过NAs治疗的CHB患者中HBV耐药变异和基因型进行检测,以分析CHB患者RT区突变是否受不同基因型的影响。方法应用PCR产物直接测序法对450例慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区耐药性突变进行分析,并通过系统进化树鉴定相应的HBV基因型。结果408例患者的HBV逆转录酶基因序列扩增成功。系统发育分析显示,HBV基因型B占优势。408例患者的序列分析显示,仅在NAs治疗过的患者中检测到经典的耐药突变位点,且耐药率较高（46.90%,106/226）。HBV基因型B和C患者中仅rt A181T/V突变率存在显着差异,其它经典耐药位点突变率无明显差异。在HBV RT区其它位点的突变率方面,发现了9个基因型相关的氨基酸多态性位点（rt191、rt214、rt221、rt222、rt223、rt224、rt226、rt229和rt238）。其中,大多数位点在未接受治疗的患者中具有较高的突变率（P<0.05）。结论HBV基因型B和C之间存在一定程度的遗传变异,但HBV基因型在抗病毒药物使用过程中驱动耐药性变化的作用有限。
黄志琴[2]（2021）在《乙肝感染孕产妇e抗原与病毒水平及抗病毒治疗对妊娠结局的影响》文中研究指明目的研究乙肝感染孕产妇不同乙肝e抗原（Hepatitis B virus e Antigen,HBe Ag）状态和不同乙肝病毒脱氧核糖核酸（Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV DNA）水平以及孕期是否抗病毒治疗对妊娠结局的影响,探讨HBe Ag状态与HBV DNA水平相关性,为临床实施综合性预防乙肝母婴传播干预策略提供依据。方法收集2019年01月至2020年12月在广东省妇幼保健院产检并住院分娩的乙肝感染孕产妇共2735例,根据入选和排除标准,共有1609例乙肝感染孕产妇及其新生儿纳入本研究。依据孕产妇乙肝两对半中血清HBe Ag状态,分为HBe Ag阴性组（n=1199）和HBe Ag阳性组（n=410）。在410例HBe Ag阳性孕妇中,依据HBV DNA水平,将HBV DNA<2×105IU/ml分为低病载组（n=64）,HBV DNA≥2×105IU/ml分为高病载组（n=346）;依据孕期是否服用富马酸替诺福韦二吡呋酯（Tenofovir disoproxil fumarate,TDF）抗病毒治疗,分为治疗组（n=292）和对照组（n=118）。收集并记录孕产妇基本临床资料、妊娠期相关检验结果、妊娠期并发症和新生儿结局等相关病例资料。运用SPSS 26.0软件和Empower Stats软件对不同分组的各项指标进行统计分析,比较分析对妊娠结局的影响。结果1.乙肝感染孕产妇不同HBe Ag状态对妊娠结局的影响比较HBe Ag阳性组与阴性组孕产妇的基本临床资料,两组孕产妇比较年龄、体重指数（Body mass index,BMI）、孕次、产次、分娩方式、剖宫产史和孕期抗病毒治疗等均具有统计学差异（P<0.05）。单因素分析发现,HBe Ag阳性组孕产妇妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP）发生率高于HBe Ag阴性组（5.37%vs.3.09%,P<0.05）。多因素分析仍提示HBe Ag阳性是ICP的危险因素（OR=1.89,95%CI1.07～3.35）。HBe Ag阳性组新生儿出生体重均值小于阴性组（3.13±0.43 vs.3.20±0.45,P<0.05）,两组比较其他新生儿结局均无统计学差异（P>0.05）。HBe Ag阳性组孕产妇谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）异常率高于阴性组（14.39%vs.5.92%）,谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）异常率高于HBe Ag阴性组（9.02%vs.2.92%）,两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。HBe Ag阳性组乙肝感染孕产妇孕中期检测HBV DNA载量均值高于阴性组(7.01±1.76log10IU/ml vs.2.53±0.98log10IU/ml),HBe Ag阳性组在HBV DNA高载量（≥2×105IU/ml）水平占比高于阴性组（84.39%vs.2.75%）,两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。2.HBe Ag阳性乙肝感染孕产妇不同HBV DNA水平对妊娠结局的影响比较低病载组和高病载组孕产妇的基本临床资料无统计学差异（P>0.05）。低病载组孕产妇妊娠期高血压疾病（Hypertensive disorders of pregnancy,HDP）发生率高于高病载组（9.38%vs.3.18%,P<0.05）。高病载组孕妇中抗病毒治疗比例高于低病载组（77.46%vs.37.50%）,调整孕妇抗病毒治疗等相关变量后分析,显示HBV DNA载量与HBe Ag阳性孕产妇的妊娠结局无统计学关联。比较低病载组与高病载组的新生儿结局均无统计学差异（P>0.05）。高病载组孕产妇检测ALT异常率、AST异常率均高于低病载组,两组比较有统计学差异（P<0.05）。3.HBe Ag阳性乙肝感染孕产妇抗病毒治疗对妊娠结局的影响比较治疗组和对照组孕产妇的基本临床资料无统计学差异（P>0.05）。治疗组的HDP发生率低于对照组（2.74%vs.7.63%,P<0.05）,多因素分析中仍提示抗病毒治疗是HDP的保护因素,抗病毒治疗与HDP风险降低具有统计学关联（OR=0.28,95%CI0.08～0.93）。治疗组与对照组比较,并未增加其他妊娠期并发症和新生儿不良结局风险。比较两组分娩前检测HBV DNA载量,治疗组HBV DNA水平低于对照组,且治疗组的HBV DNA下降水平大于对照组,两组比较具有统计学差异（P<0.05）。对治疗组检验指标进行组内配对t检验,比较治疗前后肝肾功能,孕产妇治疗后ALT、TBA水平较治疗前下降,且治疗后ALT异常率、AST异常率均低于治疗前,治疗后血清肌酐（creatinine,Cr）、尿素（Urea）、尿酸（uric acid,UA）水平均较治疗前上升,治疗后UA异常率高于治疗前,两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.HBe Ag阳性会增加乙肝感染孕妇ICP发生风险,HBe Ag阳性对孕期ICP的发生有一定预测作用。2.HBe Ag可在一定程度上反映HBV DNA复制水平,尤其是高病毒载量水平,在检测技术有限的基层医院,可通过HBe Ag检测来初步判断HBV复制情况和母婴传播风险,协助评估孕期抗病毒治疗指征。3.孕期TDF抗病毒治疗可降低乙肝感染孕产妇发生HDP的风险,母婴安全性良好,此外,孕期服用TDF抗病毒治疗不仅可显着降低HBV DNA载量,还可改善孕期肝功能。
李茂仕[3]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中进行了进一步梳理背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
徐瑛[4]（2021）在《趋化因子CXCL10基因多态性与慢性乙型肝炎病毒感染的关联研究》文中研究指明背景:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的慢性化感染,是一种由病毒、环境和宿主因素之间相互作用导致的一种高流行率传染病。据统计,全球目前约有2.5亿HBV慢性感染者。HBV感染导致患者的肝脏疾病结局各不相同,有无任何临床症状的HBV携带者或者隐匿型肝炎患者,也有急性肝炎、慢性肝炎,反复纤维化进展成肝硬化甚至是肝癌等不同表型的患者。多项研究表明,宿主遗传因素在慢性感染过程中起着重要的决定作用。因此,寻找并验证疾病相关易感基因的突变位点可能是治疗慢性化感染的潜在靶点。趋化因子配体10（CXCL10）,近年来被证实是参与肝脏炎性疾病的候选基因,可以通过招募效应Th1淋巴细胞介导HBV病毒清除和炎症反应,参与机体的免疫反应过程,因此其单核苷酸多态性可能通过调控CXCL10表达参与慢性乙型肝炎的发病机制及药物治疗应答过程数据。然而,该基因的遗传变异与中国汉族人群,特别是与儿童样本人群中HBV易感性之间的关联尚不清楚,遗传变异参与的疾病发病机制和药物治疗应答的研究甚少。第一部分乙肝易感性基因CXCL10基因启动子区遗传变异与乙型肝炎的关联研究目的:研究趋化因子CXCL10基因启动子区域的遗传变异与成人和儿童慢性HBV易感性的相关性。方法:对CXCL10基因序列变异进行基因分型,并在中国汉族人群中进行包括成人和独立儿童在内的两阶段病例对照研究,评估变异与疾病易感性的关联。结果:1.样本基本特征分析结果显示:第一阶段共纳入1048例成人病例对照样本,其中,病例组518例,对照组530例。样本病例对照组年龄性别相匹配（P>0.05）;第二阶段儿童组样本病例对照组年龄、性别差异具有统计学意义（P<0.001,P=0.004）,并且病例对照组在母亲乙型肝炎表面抗原水平、儿童疫苗接种情况方面差异均具有统计学意义（P<0.05）。SNPs与乙肝发病风险的关联分析结果显示:第一阶段SNP位点与成人持续HBV感染相关联。校正性别年龄后,采用Logistic回归分析结果表明:CXCL10基因遗传变异位点rs4256246 AA基因型的成人较GG基因型HBV感染的风险增加1.58倍（OR=1.58,95%CI:1.04-2.42,P=0.033）。CXCL10基因遗传变异位点rs4508917（A>G）相对风险分析结果发现携带rs4508917 AA基因型的成人较GG基因型HBV感染的风险增加1.51倍（OR=1.51,95%CI:1.03-2.22,P=0.036）。按照年龄和性别分层后,进一步比较了rs4508917和rs4256246两个SNP的基因型频率分布。分层结果表明,与rs4508917 GG基因型相比,AG基因型和AA基因型在较高年龄组（>40岁）HBV感染风险较高（P=0.037,P=0.041）。SNP rs4256246分层分析结果证明,rs4256246AA基因型比GG基因型能显着增加较高年龄组（>40岁）HBV感染风险（OR=1.73,95%CI:1.08-2.78,P=0.024）。遗传变异与HBV病毒载量的相关性分析结果表明,较高年龄组（>40岁）的HBV患者中,rs4508917的AG基因型与HBV病毒载量（病毒复制程度）显着相关（P=0.004）。此外,rs4508917 AA基因型与HBV病毒载量异常的风险增加相关。3.第二阶段共计纳入627例儿童病例对照样本,其中,病例组274例,对照组353例。采用单因素Logistic回归分析SNP位点与儿童HBV感染相关性:CXCL10基因遗传变异位点rs4508917（A>G）相对风险分析结果表明携带rs4508917 AA基因型的儿童较GG基因型能增加HBV感染风险1.81倍（OR=1.81,95%CI:1.13-2.92,P=0.014）。此外,HBV高危儿童携带rs4508917 AA基因型能增加免疫接种后病毒突破感染的风险（0R=4.95,95%CI-1.45-16.90,P=0.011）。考虑混杂因素的影响,采用logistic回归模型调整性别和年龄后,未见显着性差异（P>0.05）。结论:CXCL10基因多态性位点rs4508917可能与成人和儿童持续HBV感染相关,AA基因型是导致HBV感染增加的易感基因型。第二部分乙肝易感性基因CXCL10基因启动子区遗传变异的功能验证目的:针对第一部分关联分析中阳性遗传变异位点初步探索其参与HBV感染发病的分子机制。方法:采用ELISA法检测CXCL10在成人病例对照组血清中的表达水平,并使用双荧光素酶报告基因实验验证阳性遗传变异对CXCL10基因转录活性的影响。结果:1.ELISA分析结果显示慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）成人患者血清CXCL10表达水平高于对照组（P=0.014）,且随着A等位基因剂量的增加,CXCL10血清表达水平呈递增趋势,且差异具有统计学意义（P=0.013）.2.双荧光素酶报告基因实验结果表明,rs4508917 A等位基因可能直接影响CXCL10的启动子活性。结论:本研究中,荧光素酶报告基因rs4508917位点的转录活性表明该位点可能调控CXCL10基因的表达。此外,我们还发现CHB患者血清中CXCL10蛋白水平升高,而rs4508917 AA基因型与CXCL10转录水平较高相关,从而提供了该风险变异的体内功能证据。第三部分乙肝易感性基因CXCL10基因单核苷酸多态性rs4508917与核苷类似物治疗应答的关联目的:探讨乙肝易感性基因CXCL10单核苷酸多态性是否影响机体对核苷类似物（Nucleotide analogs,NAs）的应答反应。方法:本研究对62例CHB成人患者在抗病毒治疗的第3、6和9周进行了HBV病毒载量的动态变化分析。结果:携带rs4508917 AA或AG基因型患者与rs4508917 GG基因型患者相比,对NAs治疗的反应中HBV病毒载量的清除速率有一定程度的抑制作用。rs4256246 AA或GA基因型对NAs处理的反应也有类似的趋势。结论:CXCL10基因多态性位点rs4508917能影响成人乙肝患者对NAs恩替卡韦药物治疗的应答效果。
蒋菲菲[5]（2021）在《安徽省HBsAg和抗-TP单试剂反应性无偿献血者归队情况分析及效果评估》文中研究表明目的对2018年至2019年安徽省HBs Ag和抗-TP单试剂反应性献血者归队检测及再次献血情况进行统计分析,以验证安徽省献血者归队策略的可行性与合理性,进一步完善献血者归队工作,维护献血者权益、保障血液安全。方法HBs Ag和抗-TP单试剂反应性献血者经屏蔽6个月后,可向屏蔽单位申请归队。屏蔽单位采集样本后先进行双试剂ELISA筛查实验,筛查阴性者既符合归队要求,可将标本送至安徽省血液中心进行归队检测。HBV归队标本需进行HBV DNA核酸检测、HBs Ag伯乐、万泰/丽珠试剂检测、HBc Ab万泰试剂检测、丽珠试剂HBs Ag中和试验;TP归队标本需进行抗-TP丽珠、万泰试剂检测、日本富士试剂TPPA颗粒凝集确证实验。所有结果均合格者可允许归队。结果2018年至2019年,收到全省采供血系统HBs Ag和抗-TP归队标本188人,149人归队检测合格,归队率达79.26%。TP项目归队成功率高于HBV项目（χ2=23.78,P<0.05）。合肥、阜阳、芜湖、六安地区献血者归队人数较多,高学历中青年献血者归队意愿较强烈。合肥地区归队合格的42位献血者中,24人再次献血,共捐献全血11500ml,血小板70U。结论安徽省单试剂反应性献血者归队策略有效可行,但在跟踪随访、宣传沟通方面还有不足之处,归队工作还需进一步完善。
刘晓红[6]（2021）在《血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究》文中研究说明目的探讨乙肝表面抗原（HBs Ag）及乙型肝炎e抗原（HBe Ag）阴性,伴表面抗体（HBs Ab）、e抗体（HBe Ab）、核心抗体（HBc Ab）至少一项阳性的血清中,检测HBV DNA含量对隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的检出价值,及探讨OBI的发生机制。方法采用化学发光免疫分析法（CLIA）检测乙肝五项病毒血清标志物（HBV-M）,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）进行HBV-DNA含量复筛,对OBI检出情况进行分析。采用湿化学法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（BILT3）,分析受检患者肝损伤情况。采用CLIA方法检测丙型肝炎病毒抗体（HCV-Ab）、梅毒抗体（TP-Ab）、人类获得性免疫缺陷病毒抗体（HIV-Ab）,分析是否合并其他病毒感染及宿主免疫应答有无明显差异。测序法进一步检测HBV病毒是否存在基因突变,分析OBI发生机制。结果本次论文实验期间收集HBsAg及HBeAg阴性,伴HBs Ab、HBe Ab、HBc Ab至少一项阳性的血清共计1138份,PCR共检出35份HBV-DNA阳性,OBI检出率3.08%,其中HBc Ab、HBs Ab阳性和HBc Ab阳性HBV-M模式的检出率最高,分别为4.11%、4.04%。HBc Ab随着样本吸光度/临界值（S/Co值）升高,HBV-DNA阳性检出率依次显着升高（P<0.05）。596例患者接受肝功能检查,肝损伤占22.99%,肝损伤组HBV-DNA阳性率、HBc Ab高反应性（S/Co值≥10.0）均显着高于肝正常组（P<0.05）。35例HBV-DNA阳性标本接受HCV、TP、HIV检测,HCV阳性占11.43%,TP阳性占2.86%,HIV阳性为0,合并HCV病毒感染组与合并TP或HIV病毒感染组存在明显差异（P<0.05）。乙型肝炎病毒基因变异检测S区145位点、S区127位点、C区,未发现基因突变。结论常规检测HBsAg及HBeAg阴性伴HBcAb阳性提示存在OBI可能,且OBI发生风险随HBc Ab反应性S/Co值升高而明显升高。同时参考肝损伤指标,提示应当进一步行HBV DNA含量检测,为临床诊断OBI和降低OBI所致乙肝病毒传播风险提供参考。
杜婷[7]（2021）在《血清高尔基体蛋白73对ALT正常或轻度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者肝脏病变的预测价值》文中进行了进一步梳理目的分析丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常与轻度升高（≤2ULN,ULN=40U/L）的慢性乙型肝炎病毒感染者肝功能、肝组织的病理改变,进一步研究血清GP73对不同程度ALT水平的慢性乙型肝炎病毒感染者肝脏炎症分级及纤维化分期的相关性及预测价值。方法（1）收集2017年12月至2020年12月在宁夏医科大学总医院肝病门诊及住院的ALT正常或轻度升高的慢性乙型肝炎感染者320例为研究对象,ALT轻度升高100例;ALT正常220例,其中年龄>30岁为184例,年龄≤30岁为36例,有家族史且年龄>30岁82例,年龄≤30岁16例,无家族史且年龄>30岁102例,年龄≤30岁20例。所有入组病人均行肝穿刺术。（2）采用ELISA双抗体夹心法检测血清GP73水平,分析GP73水平与肝组织病理分级、分期的相关性及预测价值。（3）使用SPSS 25.0统计软件对两组患者肝功能、血清GP73水平等指标进行统计学分析,观察有无差异性;探讨血清GP73水平与肝脏炎症分级、纤维化分期之间的相互关系;采用ROC分析血清GP73对ALT正常与轻度升高的患者肝脏炎症分级及纤维化分期的预测价值。结果（1）ALT正常组（≤ULN）患者的血清GP73（57.35±21.82）ng/ml明显低于ALT轻度升高组（1-2ULN）患者血清GP73（69.30±33.3）ng/ml,p<0.05。（2）不同ALT水平分组中,发生炎症（≥G2）:ALT（1-2ULN）组的发生率69%（69/100）,ALT（≤ULN）组发生率51.8%（114/220）,ALT（1-2ULN）组比ALT（≤ULN）组显着升高,p<0.05;发生纤维化（≥S2）:ALT（1-2ULN）组的发生率51%（51/100）,ALT（≤ULN）组的发生率43.6%（96/220）,统计学分析结果提示p>0.05。（3）ALT（1-2ULN）组患者血清GP73水平与肝脏炎症分级（G1～G4）和纤维化分期（S1～S4）的严重程度呈正相关（r1=0.923,r2=0.734,p<0.05）;肝脏炎症坏死（≥G2）和纤维化（≥S2）的患者血清GP73水平明显高于肝炎症坏死（<G2）和肝纤维化（<S2）的患者,p<0.05;血清GP73对肝脏炎症坏死程度（≥G2）患者诊断的敏感性和特异性分别为94.2%和64.5%;对肝纤维化程度（≥S2）患者诊断的敏感性和特异性分别为88%和86%。（4）ALT（≤ULN）组患者血清GP73水平与肝脏炎症分级（G1～G4）和纤维化分期（S1～S4）的严重程度呈正相关（r1=0.825,r2=0.731,p<0.05）;肝脏炎症坏死（≥G2）和纤维化（≥S2）的患者血清GP73水平分别显着高于肝脏炎症（<G2）和肝纤维化（<S2）的患者,p<0.05;血清GP73对肝脏炎症坏死（≥G2）患者诊断的敏感性和特异性分别为93.9%和64.2%;对肝纤维化（≥S2）患者诊断的敏感性和特异性分别为82.5%和79.3%。结论ALT正常的慢性乙型肝炎感染者发生肝脏炎症（≥G2）及纤维化（≥S2）的比例仍较高,需要密切随访患者转氨酶情况,必要时积极予以抗病毒治疗;随着肝脏炎症坏死及纤维化程度加重,血清GP73的表达水平也随之增长,具有良好的相关性,血清GP73可反映慢性乙型肝炎病毒感染者肝组织病变损伤程度,有望替代肝穿刺活检来预测ALT（≤2ULN,ULN=40U/L）的患者是否进行抗病毒治疗。
王素华[8]（2020）在《HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨》文中研究表明目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）宫内感染机制较为复杂,有研究表明,载脂蛋白H（apolipoprotein H,Apoh）参与并介导了HBV感染肝细胞,在病毒复制期与乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen,HBsAg）的结合力更强。本研究通过检测HBsAg阳性孕妇血液和早期流产绒毛组织的乙肝标志物水平,明确HBsAg阳性孕妇早期胎儿的乙肝感染情况,调查HBV宫内感染的风险因素,并探讨Apoh的表达与宫内感染的关系。方法选取2017年1月至2018年5月在深圳市第三人民行早期流产的41例HBsAg阳性孕妇为研究对象,留取孕妇绒毛组织和血液样本。应用荧光探针法检测绒毛组织和血浆中的HBV DNA水平及HBV血清学标记物,通过免疫组化方法检测绒毛组织中神经胶质细胞缺失蛋白1（glial cells missing 1,GCM1）、HBsAg、Apoh的表达,所得数据采用统计软件进行比较分析。结果绒毛组织HBV DNA的阳性率为29.27%（12/41）,显着低于血液中HBV DNA的阳性率（53.66%,22/41）,差异具有统计学意义（X2=5.025,P=0.043）;绒毛组织HBV DNA阳性孕妇血液中的HBsAg、HBe Ag和HBV DNA含量均显着高于绒毛组织HBV DNA阴性组的孕妇,差异均具有统计学意义（P值分别为0.002、0.001、0.000）;绒毛组织中,HBsAg和Apoh阳性率分别为17.07%（7/41）和19.51%（8/41）;Apoh在绒毛组织HBsAg阳性组的表达率显着高于HBsAg阴性组,差异具有统计学意义（X2=14.487,P=0.000）,但Apoh在绒毛组织HBV DNA阳性组的表达率与HBV DNA阴性组差异不显着（X2=0.325,P=0.568）;Apoh在血浆HBV DNA阳性孕妇中的表达率显着高于血浆HBV DNA阴性组,差异具有统计学意义（X2=4.578,P=0.032）,但Apoh在血浆HBe Ag阳性和血浆HBe Ag阴性孕妇中的表达率差异不显着（X2=0.577,P=0.448）。结论HBsAg阳性孕妇早期流产的绒毛组织可检测出HBV DNA、HBsAg和Apoh的表达;Apoh的表达与绒毛组织HBsAg阳性和血浆HBV DNA阳性密切相关;绒毛组织HBV DNA阳性孕妇血液中的HBsAg、HBe Ag和HBV DNA含量显着升高。
刘贺[9]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中研究表明目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
江诗怡[10]（2020）在《温阳法对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响》文中进行了进一步梳理目的观察温阳法治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,对患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和Treg细胞、Th17细胞水平以及e抗原血清转换情况的影响。并与单用核苷（酸）类似物抗病毒药比较,探讨温阳法对治疗慢性乙型肝炎患者细胞免疫的功能影响及作用机制,为中药抗乙肝病毒治疗的有效性提供循证医学依据。方法将符合入选标准的70例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者随机分为温阳组与对照组,对照组使用恩替卡韦0.5mg/次,1次/天,温阳组在对照组治疗基础上加用温阳方,两组疗程均为24周。两组患者分别在治疗前后检测肝功能（ALT、AST、TBIL、ALB）、乙肝两对半、HBV DNA、T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）、肝脏硬度（LSM）,以及使用流式细胞仪检测Treg细胞及Th17细胞,并在治疗第12周时加查一次乙肝两对半。同时分别在治疗前后对两组患者进行生命体征、血常规、尿常规、肾功能及心电图检测,评估安全性。使用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析。结果1.肝功能:治疗后温阳组与对照组组内比较,除TBIL外,指标均明显改善（P<0.05）;两组间对比,温阳组ALB升高更明显（P<0.05）,而ALT、AST、TBIL指标差距均无统计学意义（P>0.05）。肝硬度值:治疗后温阳组与对照组组内比较,肝硬度值下降,前后差距有统计学意义（P<0.05）;两组间肝硬度值对比,差距无统计学意义（P>0.05）。e抗原水平:治疗第12周温阳组与对照组组内对比,HBeAg水平下降明显（P<0.05）,但两组间对比差距无统计学意义（P>0.05）;治疗24周后与治疗第12周后两组内比较,HBeAg水平下降显着（P<0.05）,且两组间对比差距有统计学意义（P<0.05）。治疗结束后两组间HBeAg阴转率对比,温阳组（14.29%）与对照组（8.6%）相比差异不明显（P>0.05）,但温阳组上升趋势更明显。病毒学:治疗后温阳组与对照组组内比较,HBV DNA水平均明显下降（P<0.05）,但两组间差距无统计学意义（P>0.05）。两组间HBV DNA阴转率对比,温阳组（69.23%）与对照组（58.33%）相比也无明显统计学意义（P>0.05）,但温阳组有更明显的上升趋势。T淋巴细胞亚群:治疗后温阳组与对照组组内比较,温阳组CD3+T细胞、CD4+T细胞水平上升明显（P<0.05）,对照组上升不明显（P>0.05）;两组CD8+T细胞水平均较治疗前下降明显（P<0.05）,但两组间对比差距无统计学意义（P>0.05）;两组CD4+/CD8+比值均较治疗前明显上升（P<0.05）,且温阳组上升更明显（P<0.05）。Treg/Th17细胞:治疗后温阳组与对照组组内比较,Treg细胞数量明显下降（P<0.05）,但两组间差距不明显（P>0.05）。治疗后两组Th17细胞与治疗前相比,对照组Th17细胞下降不明显（P>0.05）,温阳组Th17细胞下降明显（P<0.05）。两组Treg/Th17比值组内比较,温阳组Treg/Th17比值上升,对照组比值下降,但两组前后对比变化不明显（P>0.05）,且两组间差距无统计学意义（P>0.05）。结论1.温阳法联合核苷（酸）类药物治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,与单独使用核苷（酸）类药物相比,可以更好的减轻肝细胞炎症,改善肝细胞功能,减少病毒复制,促进e抗原阴转。2.温阳法可能是通过调节机体外周血内CD4+/CD8+平衡与Treg/Th17平衡,调节细胞免疫状态,影响HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能,改善机体免疫抑制情况,从而增强机体对HBV病毒的清除能力。
二、乙型肝炎病毒感染者DNA检测分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒感染者DNA检测分析（论文提纲范文）
（1）PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR检测HBV耐药突变方法的建立 |
| 2.1.1 引物的合成 |
| 2.1.2 HBV DNA阳性患者血清中模板的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增HBV RT基因 |
| 2.1.4 PCR产物检测 |
| 2.1.5 PCR产物测序分析和基因型鉴定 |
| 2.2 重组质粒标准模板的构建 |
| 2.2.1 引物合成 |
| 2.2.2 基因片段的PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物纯化 |
| 2.2.4 PCR产物和质粒载体的限制性内切酶消化 |
| 2.2.5 酶切消化物的连接 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 菌落PCR鉴定 |
| 2.2.9 阳性转化子质粒DNA的提取和检测 |
| 2.2.10 重组质粒DNA的测序鉴定 |
| 2.3 PCR产物直接测序检测HBV耐药突变方法的评价 |
| 2.3.1 重组质粒的大量提取及浓度检测 |
| 2.3.2 PCR产物直接测序法的检测限分析 |
| 2.3.3 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的重复性 |
| 2.3.4 PCR产物直接测序法的对耐药突变株检测的灵敏度 |
| 2.3.5 PCR产物直接测序法的特异性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PCR检测HBV耐药突变方法的建立 |
| 3.1.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.1.2 PCR产物测序分析和基因型鉴定 |
| 3.2 重组质粒标准模板的构建 |
| 3.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.2.2 目的基因和质粒DNA酶切产物鉴定 |
| 3.2.3 连接产物的转化分析 |
| 3.2.4 菌落PCR鉴定 |
| 3.2.5 阳性转化子质粒DNA的鉴定 |
| 3.2.6 阳性克隆测序分析 |
| 3.3 PCR产物直接测序检测HBV耐药突变方法的评价 |
| 3.3.1 PCR产物直接测序法的检测限分析 |
| 3.3.2 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的重复性 |
| 3.3.3 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的灵敏度 |
| 3.3.4 PCR产物直接测序法的特异性分析 |
| 4 小结 |
| 第二部分:PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用 |
| 引言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 仪器与材料 |
| 1.2.1 实验主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 患者血清免疫标志物和肝功能指标的检测 |
| 1.3.2 HBV DNA定量检测 |
| 1.3.3 HBV DNA的提取 |
| 1.3.4 HBV逆转录酶区基因扩增 |
| 1.3.5 测序分析 |
| 1.3.6 HBV基因型分析 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2 PCR产物测序分析 |
| 2.3 HBV基因型分析 |
| 2.4 临床资料比较 |
| 2.5 HBV逆转录酶区基因耐药突变分析 |
| 2.6 HBV耐药突变模式分析 |
| 2.7 HBV RT区非经典耐药位点突变分析 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1 综述:慢性HBV感染者逆转录酶基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 附录2 攻读硕士学位期间的科研论文及学术交流获奖情况 |
| 致谢 |
（2）乙肝感染孕产妇e抗原与病毒水平及抗病毒治疗对妊娠结局的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 5.不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙型肝炎病毒母婴传播机制及阻断技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（4）趋化因子CXCL10基因多态性与慢性乙型肝炎病毒感染的关联研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 乙肝易感性基因CXCL10 基因启动子区遗传变异与乙型肝炎的关联研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 流行病学资料收集 |
| 1.3 SNP的选择 |
| 1.4 DNA提取和基因分型 |
| 1.4.1 Sequenom Mass Array系统基因分析步骤 |
| 1.5 血清学检测 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 研究对象的基本情况 |
| 2.2 SNP多态性与成人持续HBV感染风险的关联分析 |
| 2.3 SNP多态性与成人持续HBV感染风险的分层分析 |
| 2.4 SNP多态性与成人持续HBV感染风险的单倍型分析 |
| 2.5 CXCL10 基因与慢性乙型肝炎患者临床特征的关联分析 |
| 2.6 CXCL10 rs4508917 基因型与儿童 HBV感染风险和乙肝高危儿童 HBV突破感染的关联分析 |
| 2.7 CXCL10 基因SNP与儿童HBV感染风险的分层分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 乙肝易感性基因CXCL10 基因启动子区遗传变异的功能验证实验 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血清CXCL10 浓度检测 |
| 1.2 质粒构建与双荧光素酶检测 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 慢性乙型肝炎患者和对照组血清CXCL10 水平 |
| 2.2 CXCL10 基因启动子区变异的功能分析 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 乙肝易感性基因CXCL10 基因单核苷酸多态性rs4508917 与核苷类药物治疗应答的关联 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CXC趋化因子配体10在慢性乙型肝炎中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）安徽省HBsAg和抗-TP单试剂反应性无偿献血者归队情况分析及效果评估（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 隐匿性乙型肝炎感染与输血安全 |
| 参考文献 |
（6）血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）血清高尔基体蛋白73对ALT正常或轻度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者肝脏病变的预测价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.主要实验试剂和仪器 |
| 3.研究方案 |
| 4.统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血清GP73与肝病关系的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（8）HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 研究方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 HBV DNA定量检测标准曲线图的建立 |
| 3.2 绒毛组织和血液中HBV DNA的比较分析 |
| 3.3 绒毛组织HBV DNA与血液HBV标志物的关系分析 |
| 3.4 绒毛组织中抗原表达的检测 |
| 3.5 Apoh与孕妇血液HBV标志物的相关性分析 |
| 3.6 Apoh与绒毛组织中HBV标志物的相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 国内外文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录二 攻读研究生期间发表的学术论文 |
| 附录三 绒毛中HBsAg阳性表达免疫组化图 |
| 附录四 个人简介 |
| 致谢 |
（9）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）温阳法对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1.临床资料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 结语 |
| 1.结论 |
| 2.不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒感染者DNA检测分析（论文参考文献）
- [1]PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用[D]. 王松姣. 湖北中医药大学, 2021(10)
- [2]乙肝感染孕产妇e抗原与病毒水平及抗病毒治疗对妊娠结局的影响[D]. 黄志琴. 广州医科大学, 2021(02)
- [3]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]趋化因子CXCL10基因多态性与慢性乙型肝炎病毒感染的关联研究[D]. 徐瑛. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]安徽省HBsAg和抗-TP单试剂反应性无偿献血者归队情况分析及效果评估[D]. 蒋菲菲. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究[D]. 刘晓红. 锦州医科大学, 2021(01)
- [7]血清高尔基体蛋白73对ALT正常或轻度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者肝脏病变的预测价值[D]. 杜婷. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [8]HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨[D]. 王素华. 汕头大学, 2020(02)
- [9]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [10]温阳法对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响[D]. 江诗怡. 湖北中医药大学, 2020(09)
标签：基因型论文; 乙肝表面抗原阳性论文; 乙肝阴性论文; 两对半论文; dna提取论文;