一、禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析（论文文献综述）
崔嘉琦[1]（2021）在《2014-2018年中国H6亚型禽流感病毒的部分生物学特性研究》文中认为H6亚型是禽流感病毒最丰富的亚型之一,除了可以感染野鸟和家禽外,也可发生跨越种间障碍感染人。近年来,我们除了在活禽交易市场分离到该亚型病毒,也在部分养殖场中分离到了H6亚型禽流感病毒。已有研究表明H6亚型禽流感病毒在进化过程种有部分病毒获得了潜在感染哺乳动物的能力,为了解当前我国H6亚型禽流感病毒的流行情况,并评价其抗原性的变化和对哺乳动物的感染风险,我们测定了2014-2018年期间分离的409株H6亚型禽流感病毒的表面基因序列,根据分离到的时间、地点、宿主及表面基因的进化关系,选择40株（其中28株病毒分离自养殖场,11株分离自活禽交易市场,1株野鸟源）H6亚型禽流感病毒进行部分生物学特性研究。病毒的遗传演化分析结果表明,HA基因差异较大,进化速率最快,为3.569×10-3substitutions/site/year。部分病毒的HA基因发生了第141位（全文皆按H3 numbering）氨基酸的插入,或157-158位氨基酸缺失的现象。分离病毒的NA基因亚型包括N1、N2、N6和N8,N1、N2和N6的进化速率较为接近,N8的进化速率最慢;其中N6亚型为优势的NA亚型。通过对病毒的全基因组序列分析发现,本研究中的40株病毒可以分为36个不同的基因型,这些病毒的内部基因与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H11和H12等多种野鸟来源或者鸭源的禽流感病毒的内部基因具有广泛的重排现象,表明当前我国流行的H6亚型禽流感病毒具有明显的遗传多样性。根据HA基因的氨基酸差异,我们从40株病毒中选择27株进行抗原性分析,病毒尿囊液灭活后,加佐剂免疫6周龄SPF鸡,免疫三周后分离获得抗血清;将这27株病毒与对应的血清进行交叉血凝抑制试验。根据交叉血凝抑制试验的结果,使用抗原作图法进行抗原性分析,发现27株H6亚型禽流感病毒至少可以分为五个抗原群,不同抗原群之间的病毒抗原差异明显。在病毒序列分析和抗原性分析基础上,选择19株病毒进行小鼠的感染性试验,结果表明,所有试验毒株不需要提前适应即可有效地在小鼠的肺脏内复制,有两株病毒不能在小鼠的鼻甲中复制;小鼠感染病毒后体重呈一过性下降,不表现出明显的临床症状,表明H6亚型禽流感病毒对小鼠呈低致病性。值得注意的是,GS/GD/S40190/2017（H6N2）在小鼠（1/3）的脑中出现了滴度为1.25 log10 EID50/ml的复制,对其滴定的鸡胚尿囊液进行测序表明,PB2发生了E677G突变;DK/Hu N/S41299/2017（H6N2）在小鼠（1/3）的肾中出现了1.75log10 EID50/ml的复制,且其PB2发生了R368Q突变。根据小鼠试验的结果及HA的氨基酸特征,我们选择17株病毒进行了受体结合特性试验。结果表明,除CK/AH/S1224/2017（H6N6）和CK/JX/SE2578/2017（H6N6）仅能结合α-2,3链禽源受体外,其余15株病毒均能够同时结合α-2,3链禽源受体和α-2,6链人源受体,尽管大部分毒株结合α-2,3链禽源受体的能力大于结合α-2,6链人源受体的能力,但是一株野鸟源的毒株WB/XJ/S1541/2015（H6N6）和一株HA 157-158位氨基酸缺失的毒株DK/GX/S30803/2017（H6N6）结合α-2,6链人源受体的能力更强,表明当前我国流行的H6亚型禽流感病毒具有感染人类的潜在风险。在2014-2018年H6亚型AIVs中,发现两株病毒CK/He N/S40124/2017（H6N8）和CK/SC/S4230/2016（H6N8）的HA在第141位发生了缬氨酸的插入,由于在之前的监测过程中并未发现该位点出现过氨基酸的插入,并且将其与在NCBI下载到的所有全长（1667条）H6 AIVs的HA序列进行比对,也没有发现参考序列在该位点有缬氨酸存在的现象。为了探究其是否对病毒的生物学特性产生影响,我们利用反向遗传操作技术将其中一株病毒CK/He N/S40124/2017（H6N8）的HA第141位缬氨酸进行删除并拯救了重组病毒r He N124-HAΔ141,进一步试验发现其对小鼠的感染性和病毒的受体结合特性无明显影响,但可降低单抗1D6对病毒CK/He N/S40124/2017（H6N8）的中和活性。综上所述,当前我国流行的H6亚型AIVs具有明显的遗传多样性,不同抗原群之间的毒株抗原性差异较大;近年来在养殖场中分离到的毒株数量逐渐增多,病毒来源呈现多样化和复杂化;同时部分病毒还具有感染哺乳动物甚至人的潜在风险,因此应继续加强对H6亚型禽流感病毒的监测和研究,为我国禽流感的综合防控策略调整和人类健康保护提供理论基础和数据支持。
张醒海[2]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中指出流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
吴颖[3]（2021）在《H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立》文中研究表明犬流感是由犬流感病毒（Canine Influenza Virus,CIV）引起的一种犬的接触性呼吸道传染病,患犬主要表现为发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状。目前,犬群中主要流行H3N2和H3N8亚型CIV。犬作为伴侣动物与人类接触密切,流感病毒很有可能通过犬传染给人。因此,加强对犬流感的监测并建立一种快速诊断犬流感的检测方法具有重要的公共卫生学意义。本研究首先对2018-2020年自黑龙江省、江苏省、浙江省、河北省、云南省和宁夏回族自治区的部分地区采集的3758份犬鼻拭子进行鸡胚接种,成功分离到4株H3N2亚型CIV,对分离的病毒进行系统的遗传演化分析、受体结合特性分析和抗原性分析。病毒遗传演化分析结果表明,各分离毒株与早期韩国和中国H3N2亚型CIV位于同一分支,并与2016年后国内H3N2亚型CIV形成独立分支。4株病毒各基因片段核苷酸同源性均在98%以上,且各毒株NA基因头部均出现2个氨基酸缺失。抗原性分析结果显示,本研究各病毒阳性血清之间具有良好的交叉反应,且与3株H3N2亚型禽流感病毒的阳性血清均出现交叉血凝现象,但是与H3N2亚型猪流感病毒和WHO推荐的H3N2亚型人流感疫苗株的阳性血清均不反应。受体结合特性分析结果显示,4株H3N2亚型CIV可以同时结合α-2,6唾液酸受体和α-2,3唾液酸受体,但仍以结合α-2,3唾液酸受体为主。鉴于部分犬感染CIV后症状不明显或排毒量较少,从而对CIV的临床诊断造成困难。本研究根据国内外各亚型CIV的M基因和H3亚型CIV的HA基因核苷酸序列,设计并合成特异性引物和探针。通过优化反应体系和条件,分别建立了通用型和H3亚型CIV荧光定量PCR检测方法。建立的两种方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便。不仅可以对病毒进行定性分析,还能通过建立标准曲线对病毒进行定量分析。敏感性结果显示,两种方法对质粒标准品的检测限度分别为150copies/μL和19copies/μL;重复性试验结果显示,两种方法的变异系数均小于2%。本研究建立的两种方法与病毒分离结果相比,符合率均在95%以上。综上所述,本研究对分离到的4株H3N2亚型CIV进行了系统的遗传演化分析,并建立了快速检测通用型和H3亚型CIV的荧光定量PCR方法,对有效控制CIV在犬群中的流行,预防人类流感的大流行具有重要意义。
裴宇茹[4]（2021）在《2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响》文中指出H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）自1992年在我国广东省鸡群中发现以来,已蔓延至全国大多数地区,呈地方流行性,难以彻底根除。经过多年的遗传进化,H9N2亚型AIV的致病性和传播性不断增加,给家禽养殖业造成严重的经济损失。此外,H9N2亚型AIV可以突破种间屏障直接感染哺乳动物包括人;并提供内部基因给其他亚型AIV产生如H5NX、H7N9、H10N8等人兽共患的新型AIV。因此,H9N2亚型AIV对公共卫生具有潜在威胁。近年来,虽然我国H9N2亚型AIV优势基因型仍然是G57或S基因型,但已有研究表明H9N2亚型AIV各基因片段发生了适应性变异,导致其跨宿主传播能力以及对哺乳动物的致病性增强。尤其是PB2基因上的一些适应性变异能增强病毒在哺乳动物中的复制和致病性。因此,有必要对H9N2亚型AIV进行定期流行病学监测、遗传进化及PB2基因关键分子标记的分析。本研究对2018年10月至2020年1月期间我国华东地区活禽交易市场和养鸡场的禽类进行每月流行病学监测,对H9N2亚型AIV全基因组进行遗传进化分析,并对PB2基因适应性分子标记对病毒在细胞内复制和聚合酶活性的影响进行分析。1华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查2018年10月至2020年1月,在华东地区活禽市场共采集1291份泄殖腔和喉头样品。通过SPF鸡胚培养和血凝血抑试验鉴定出408份AIV和NDV 阳性样品,病毒阳性样品占总样品数比例为31.58%（408/1291）。其中H9N2亚型AIV阳性样品178份（13.78%,178/1291）。同时,在养鸡场临床样品中分离鉴定105株H9N2亚型AIV,共获得H9N2病毒283株。在活禽市场408份阳性样品中,H9N2亚型AIV占比位居第一（43.63%,178/408）,其次是 H5 亚型（31.86%,130/408）、H3 亚型（15.68%,64/408）、NDV（7.35%,30/408）等。2018.10-2020.1 期间 H9N2 分离率（13.08%-14.5%）明显高于 2011.7-2016.9 期间分离率（0.21%-0.78%）,与 2016.10-2018.9（8.49%-15.12%）分离率没有明显差异。H9N2亚型AIV的主要宿主依旧是鸡（97.19%,173/178）;病毒样品的来源主要是华东地区江苏、山东和安徽等地;H9N2亚型AIV在炎热的夏季平均分离率达11.98%,无明显季节性差异。2华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征从H9N2分离株中选择277株进行HA和NA基因测序,获得277条HA基因、226条NA基因序列,根据HA和NA基因遗传进化结果选择55个代表性分离株进行全基因组测序,并运用MEGA 7.0最大似然法（Maximum Likelihood,ML）绘制全基因遗传发生树。分析结果显示,所有分离株的HA基因和NA基因均由病毒A/Duck/HongKong/Y280/97演化而来,分别分布在calde 15和calde 2;内部基因PB2基因和M基因由病毒A/Quail/HongKong/G 1/97演化而来,分别分布在clade 8和calde 3;PB1基因、PA基因、NP基因和NS基因由A/Chicken/Shanghai/F98/98演化而来,分别分布在clade 5、clade 7、clade 6和calde 7,因此分离到的H9N2亚型AIV毒株均属于S或G57基因型。其中HA基因已出现一个新的分支Group 3,该分支仅包含2018年末和2019年的毒株。所有毒株的HA蛋白均发生了影响病毒受体结合特性的第226位谷氨酰胺（Gln,Q）突变为亮氨酸（Leu,L）。大多数分离株（61.5%,139/226）NA基因与WJ57/12相似具有5个潜在糖基化位点,其余分离株有4个（25.67%,58/226）或6个（12.83%,29/226）潜在糖基化位点。聚合酶蛋白复合体发生多个与哺乳动物宿主适应性相关氨基酸位点,如 PB2 V147I（54/55）、A184T（50/55）、I292V（40/55）、A588V（53/55）,PB1 M317V（36/55）,PAK356R（50/55）、S409N（54/55）等,说明近两年H9N2病毒对哺乳动物宿主适应性不断增强的趋势。3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究根据NCBI数据库下载和实验室测序获得的PB2基因,比较H和S基因型毒株PB2基因序列,筛选出8个适应性变异位点（H→S）:V147I、A184T、R353K、R389K、S590G、T598V、L648V和V661A。基于H9N2/S代表株AH320反向遗传平台,分别对PB2不同结构域进行组合突变,检测其聚合酶活性。结果显示,AH320PB2 I147V、T184A两个位点组合突变和单点突变模式下的聚合酶活性和病毒复制滴度均降低,其中AH320-I147V+T184A组合突变导致的聚合酶活性降低最为显着。同时,与母本毒AH320 相比,在病毒感染 24h,AH320-I147V、AH320-T184A 和 AH320-I147V+T184A突变毒显着降低PB2基因的mRNA、vRNA、cRNA表达量以及PB2蛋白、NP蛋白的表达水平。结果表明,PB2蛋白适应性变异147、184是影响S基因型H9N2毒株在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸。在2018-2020年期间,S（或G57）基因型的H9N2病毒仍然是华东地区活禽市场中AIV的主要亚型。HA蛋白和聚合酶复合体蛋白PB2,PB1和PA均显示出更多的哺乳动物适应性分子标记。此外,研究表明PB2蛋白147、184是影响S基因型H9N2病毒在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸位点。
李培东[5]（2021）在《艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定》文中指出目的:多项研究表明,野生鸟类携带多种病原微生物,对禽流感而言野鸟的迁徙以及市场活禽的交易促进了不同地域、不同禽类、不同亚型流感病毒的相互重组。对艾比湖湿地自然保护区野生鸟类禽流感病毒的检测对新疆地区的畜牧业、疫病防制起到预警作用。方法:本研究对采集自新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子上清液使用禽流感特异性引物M229对样品做禽流感病毒的检测,对禽流感阳性样品使用HA通用引物进行PCR扩增、测序、分析。序列分析后使用9日龄的普通鸡胚进行禽流感病毒的分离,对分离得到的鸡胚尿囊液使用禽流感病毒通用引物对病毒的基因型进行鉴定;又对分离株的血凝素和神经氨酸酶的生物信息学信息进行了预测分析并对这两株毒株的全基因组序列进行分析。获得病毒后分别对分离毒株进行了全基因组序列扩增,连接T载体后转化至DH5α感受态细胞中,涂布平板后挑取单个菌落摇菌、测序;最后分别感染雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡,观察、测定分离株致病力。结果:本研究共采集样品拭子80份,检测到禽流感阳性率为18.75%,分离出两株代表性低致病性禽流感病毒,分别命名为A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）和A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）。分离株的血凝素裂解位点都不包含有任何一种连续碱性氨基酸,并且都符合低致病禽流感氨基酸序列的特点。分离株的血凝素与神经氨酸酶均具有亲水性。A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）血凝素蛋白信号肽剪切位点为SKA-DT,连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共12个,具有25个抗原决定簇和59个肽段。A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）神经氨酸酶连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共9个,具有15个抗原决定簇和55个肽段。A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）血凝素蛋白信号肽剪切位点为AFS-QD,连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共12个,具有17个抗原决定簇和51个肽段。A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）神经氨酸酶连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位共9个,具有16个抗原决定簇和46个肽段。两株分离株均可以在雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡体内进行复制,且对雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡均无致死作用,A/Wide Bird/Ebinur Lake/40/2017（H1N2）静脉接种指数为0.11,A/Wide Bird/Ebinur Lake/47/2017（H3N8）静脉接种指数为0.08,均小于1.2,进一步证实其为低致病性禽流感病毒。且在感染第14天对每只鸡分离血清进行血凝抑制试验,其血清阳性率分别为:H1N2（点眼、滴鼻感染）为70%、H1N2（同群感染）为40%、H3N8（点眼、滴鼻感染）为40%、H3N8（同群感染）为20%,但各组血凝抑制效价均很低。结论:本研究成功的从艾比湖野鸟粪便拭子中分离出两株禽流感病毒,且粪便拭子禽流感阳性率为18.75%,证实艾比湖野鸟中存在禽流感病毒。经全基因组序列分析、毒株对雌性balb/c小鼠以及四周龄无免疫鸡的致病性及对分离株进行生物信息学分析研究,证实分离出的两株病毒均为低致病性禽流感病毒;分离株存在多种亚型病毒重组现象,可以感染雌性balb/c小鼠以及可以在四周龄无免疫鸡中复制和传播。
才天宇[6]（2020）在《2017-2019年华东地区H3亚型禽流感病毒流行病学调查分析及生物学特性鉴定》文中研究表明在A型流感病毒中,H3亚型宿主广泛,不仅感染禽类,还感染猪、马、犬等哺乳动物甚至人类,对畜牧业生产和公共卫生安全均构成重要威胁,有必要进行持续的流行病学监测。本研究基于2017年～2019年华东地区活禽交易市场（live poultry market,LPM）的低致病性禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）流行病学调查,对其中分离鉴定的H3亚型AIV进行了全基因组遗传进化分析与HA基因的密码子使用偏好性分析,并挑选代表毒株进行了部分生物学特性的测定。研究结果将丰富我国低致病性AIV的基础数据资源,并为AIV的跨种传播机制研究提供一定参考。1.2017-2019年华东地区低致病性禽流感病毒流行病学调查及H3亚型禽流感病毒的分离鉴定2017年9月至2019年6月,对华东地区LPM进行低致病性AIV流行病学监测,共采集源自江苏、安徽、山东等省份的家禽泄殖腔、喉头棉拭样品及LPM环境水样1866份。经鉴定,共有346份阳性样品,分布于109个禽群;总的阳性率为18.54%,群阳性率为44.67%。从阳性样品中HA亚型分布来看:阳性率最高的为H9（72.83%,252/346）,其次为H3（26.59%,92/346）,还各有1株H1与H10病毒。从不同宿主中各亚型AIV阳性样品数量来看:鸡中H9亚型阳性率最高,为96.80%（242/250）,剩余均为H3亚型;鸭中H3亚型阳性率最高,为91.76%（78/85）,其次是H9亚型,为5.88%（5/85）,另各有1.17%（1/85）的H1与H10亚型;鹅中检测到H3与H9亚型,两者阳性率相同,均为（50%,5/10）;环境水样中仅分离到1株H3亚型AIV。从不同月份AIV的阳性数量来看,夏秋季也有较多的低致病性AIV,未表现出明显的季节性。进一步地,对共分布于28个群的H3亚型阳性样品进行了病毒纯化及HA与NA基因的PCR鉴定,结果显示,28株H3亚型AIV全部为H3N2亚型。表明,华东地区禽群中广泛存在有H9、H3等亚型低致病性AIV,其中H3亚型在鸭群中优势明显且均为H3N2亚型。2.H3N2亚型禽流感病毒遗传进化分析根据时空、宿主差异,我们从第一章分离的H3N2亚型AIV中选取19株代表性病毒进行全基因组测序与遗传进化分析。经分析,PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因的系统发生树中,19株H3N2病毒均位于欧亚谱系,与野禽中的流感病毒高度同源,而与猪、马、犬等哺乳动物来源以及人源流感病毒的遗传距离均较远,提示H3N2病毒从禽直接传播到哺乳动物的风险较低。此外,部分H3N2亚型AIV的PB1基因与H5N6亚型流感病毒聚类成簇,提示两者之间可能发生了重配。HA蛋白的裂解位点模式均为PEKQTR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;与受体嗜性相关的第226和228位均分别为Q和G,可能仍主要结合禽类受体,但1株病毒（180138）出现G225D突变,值得后续深入研究。内部基因的关键氨基酸位点分析中,并未出现诸如PB2的E627K、D701N等对哺乳动物致病性增强的分子标记。为了探究H3N2亚型AIV是否可能与跨宿主感染相关,我们从密码子使用偏好性的角度,对已测序的19株分离株以及NCBI数据库中检索的人源（n=60）、犬源（n=55）、猪源（n=54）、马源（n=21）等不同宿主来源H3病毒进行HA基因的相关分析。核苷酸成分及相对同义密码子使用性分析表明,各宿主来源H3病毒的HA基因中AU均含量高于GC,偏好使用A/U结尾的密码子。HA基因的有效密码子数在不同宿主中的平均值范围为47.10±1.64～53.22±0.33,表明密码子的使用模式存在一定偏好性,但偏好性较低。中性分析结果提示,HA基因形成密码子偏好性的过程中,各宿主来源H3病毒受到自然选择的作用均大于突变压力,分别为:禽源,95.65%&4.35%;人源,68.75%&31.25%;犬源,73.17%&26.83%;猪源,60.74%&39.26%;马源,63.57%&36.43%。对应性分析中,HA基因总体呈现按宿主聚类的趋势,但禽源H3与哺乳动物来源的病毒差异较明显,一定程度表明H3N2亚型AIV从禽直接跨种感染其他哺乳动物的可能性较低。3.6株H3N2亚型AIV的生物学特性分析根据第二章全基因测序的19株H3N2亚型AIV在系统发生树中的不同分支分布,进一步选取 171029、180133、180562、181222、190566 和 180138（HA-G225D）共6株病毒,对其体内/外感染性、热/酸稳定性等部分生物学特性进行测定。6株病毒的EID50为107.000～108.500,表明在鸡胚上均能较好地繁殖。不同细胞上的TCID50数值显示,6株病毒在MDCK（104.769～106.000）上的复制性能均高于A549（101.500～102.571）和CEF（103.289～104500）细胞;但MDCK细胞上形成空斑的数量与大小在6株病毒间存在差异。热稳定性试验中,180133为热不稳定性、180562为中等热稳定性,其余病毒均为热稳定性;但经56℃热处理10min后,除190566之外,5株病毒均丧失了对MDCK细胞的感染性。酸稳定性试验中,待测病毒经pH 4.0～7.0缓冲液处理后,均仍具有对MDCK细胞的感染能力。以106.0EID50病毒量滴鼻接种6周龄BALB/c小鼠,14天观察期内所有小鼠均存活且体重总体呈增长趋势,仅171029、180133、180562这3株病毒可在攻毒后第5天小鼠肺脏中检测到有限的病毒复制,表明测定的6株H3N2亚型AIV对小鼠均为低致病性。综上所述,H3N2亚型AIV目前在活禽市场鸭群中的阳性率较高,其PB1基因可能参与了同期H5N6病毒的基因重配;各基因的遗传进化分析与HA基因密码子偏好性分析均提示其跨种感染其它哺乳动物的潜能较低;禽源H3N2病毒尚未表现出对哺乳动物模型小鼠的高致病力,但病毒热稳定性的增加可能促进其进一步传播与变异,仍需继续加强监测工作。
庄忻雨[7]（2020）在《流感病毒mRNA疫苗的构建、制备与实验免疫研究》文中指出机体被流感病毒感染后可引起呼吸系统不同程度的损伤。根据世界卫生组织的数据显示,季节性流感病毒（A型H1N1和H3N2流感病毒,以及B型流感病毒）每年在全球范围内造成大约300万至500万例重症病例和29万至65万人死亡。此外,禽流感病毒H5N1和H7N9,已具备了人畜共患特征。随着季节变化和生态改变,常引起跨物种传播,最终导致新型流感病毒株的大流行,造成无数人感染。世界卫生组织每年召开两次流感疫苗组份推荐会（一次针对北半球,另一次针对南半球）,试图根据流行病毒的基因和抗原特征以及各国的流行病学信息来选择正确的疫苗。由于疫苗株是在每个流行季之前6个月左右确定的,偶尔会出现候选疫苗株和流行毒株之间抗原不匹配。因此,需要做好准备应对新型流感病毒。m RNA疫苗可以用作一种应对新发突发传染病的应急疫苗,而且相比传统灭活疫苗和减毒活疫苗等其他类型疫苗具有许多优势。为此,本文主要开展流感病毒m RNA疫苗的制备与实验免疫研究。1. 季节性流感病毒的分离与鉴定由于季节性流感病毒的持续进化,使它们能够逃脱先前感染或接种疫苗引起的免疫。因此,本研究选择在流感病毒流行季节的高峰期2018.12.28～2019.1.31和2019.11.20～2019.12.31期间,采集156份咽拭子样本并对拭子中可能含有的流感病毒进行PCR鉴定,共检测出9份H1N1亚型流感病毒,36份H3N2亚型流感病毒和6份B型流感病毒。通过接种SPF级鸡胚来分离流感病毒,共分离出1株A型H1N1流感病毒,抗原血凝效价为1:512,对11周龄雌性C57BL/6小鼠的半数致死剂量(LD50)为10-3.625/0.1m L,将其命名为A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）;同时,分离出4株A型H3N2流感病毒,将其分别命名为A/Jilin/15/2019（H3N2）、A/Jilin/37/2019（H3N2）、A/Jilin/43/2019（H3N2）和A/Jilin/73/2019（H3N2）。将所有分离株的HA基因与同年WHO推荐的同型候选疫苗株的HA基因进行对比,发现关键抗原表位处的氨基酸均有多处发生改变。2. m RNA候选疫苗体外转录系统的构建与筛选为了构建高效表达外源目的基因的m RNA疫苗,需要对m RNA疫苗的体外转录（IVT）表达系统进行优化。本研究主要分析5’和3’非编码区（UTR）元件对m RNA翻译效率的影响,共设计三种模式的5’UTR-MCS-3’UTR-poly A（120）,区别在于UTRs序列不同,分别命名为IVT-m RNA-n1、IVT-m RNA-n2和IVT-m RNA-n3。在IVT-m RNA-n1中5’与3’UTR均源自人-α球蛋白;IVT-m RNA-n2和IVT-m RNA-n3中5’与3’UTR均源自人-β球蛋白,但在IVT-m RNA-n3中5’UTR序列前端又添加一段调控序列。选用EGFP和H3N2-HA基因作为筛选最佳体外转录系统的工具基因,利用流式细胞术测定EGFP阳性细胞率,利用Western Blot验证HA蛋白的表达量差异,最终筛选出最优的系统:IVT-m RNA-n3。而且,利用该系统在6种不同细胞系中均能成功表达EGFP,证实该系统具有在多种细胞系中应用的可能性。3. m RNA候选疫苗脂质体纳米材料的制备及功能验证为了防止m RNA被降解,人们构建了大量的纳米级生物材料来递送m RNA。阳离子脂质纳米粒能够通过静电吸附作用结合m RNA,同时保护m RNA免受核酸酶的降解,并通过膜融合方式将m RNA递送到细胞内。在脂质体纳米颗粒的基础上,可以对其表面进行修饰,使纳米颗粒具有一定的靶向性,更精准地发挥作用。甘露糖受体表达在抗原递呈细胞表面,尤其是巨噬细胞和树突状细胞。树突状细胞在免疫系统中发挥关键作用,可以连接固有免疫和适应性免疫应答。本研究制备了两种阳离子脂质体纳米颗粒（LNP）和LNP-Man（甘露糖修饰）,对其形态、粒子直径、电位、细胞毒性和结合m RNA的能力进行了测定。通过体外细胞转染和动物体内转染实验对其功能进行评价。体外细胞实验表明,LNP和LNP-Man能够保护m EGFP不被降解并可以将其递送到细胞内完成翻译。小鼠体内递送编码萤火虫荧光素酶的m RNA,无论采取腿部肌肉注射还是滴鼻途径,均能够在给药部位看到荧光,说明制备的LNP和LNP-Man能够将m RNA递送到体内细胞,并有效表达目的蛋白。通过对比分析荧光值的强度,LNP-Man组均高于LNP组,说明经过甘露糖配体修饰的脂质体纳米颗粒能够有效增强体内细胞对m RNA的摄取。4. A型H1N1、H5N1和B型流感病毒m RNA候选疫苗构建及实验免疫研究通过将前期分离的流感病毒与同年WHO推荐的疫苗株比对后发现,HA基因的多处关键抗原位点的氨基酸存在差异,推测可能分离株的抗原性发生了变化,与疫苗株不匹配。因此,有必要重新制备疫苗来预防和控制新型流感病毒。本研究除了对分离株:A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）进行研究外,还对实验室现有保存株:A/chicken/Jilin/9/2004（H5N1）和B/Beijing/1112/563进行研究,以各株的HA基因作为抗原基因,分别构建每株流感病毒特异性的LNP/m HA和LNP-Man/m HA疫苗,并在动物模型C57BL/6小鼠上进行实验免疫研究和攻毒保护评价。结果表明,三组疫苗均具有良好的免疫原性,能诱导小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫应答;三株流感病毒分别以10×LD50剂量对小鼠进行滴鼻攻毒,疫苗组LNP/m HA和LNP-Man/m HA的保护率分别为:H1N1组（100%和100%）;H5N1组（66.7%和66.7%）;B型流感病毒组（83.3%和100%）。本研究为m RNA疫苗的设计和免疫策略的制定提供了实验和理论依据。
范威峰[8]（2020）在《我国部分地区2014-2016年H6亚型禽流感病毒的遗传进化及小鼠致病性分析》文中研究表明2013年,我国台湾报道了首例人感染H6N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）病例,表明H6亚型AIV具有感染人的潜在风险。在家禽AIV流行病学调查过程中,也经常会分离到H6亚型AIV。为了进一步了解我国H6亚型AIV的遗传演化规律及其相关生物学特性,本研究对2014-2016年我国部分地区分离的105株H6亚型AIV进行了表面基因序列的测定,并选择18株进行全基因组序列分析及抗原性差异分析,并对病毒感染哺乳动物的风险进行评估,为禽流感防控提供数据支持。1.H6亚型AIV 2014-2016年分离株的遗传演化分析为了研究H6亚型AIV的遗传进化情况,对我国部分地区2014-2016年分离的105株H6亚型AIV的HA和NA基因进行序列测定,根据毒株不同的分离时间、地点、宿主、HA基因的同源性以及HA和NA亚型组合不同等,选择18株H6亚型AIV进行纯化和全基因组序列测定。结果显示,我国2014-2016年H6亚型AIV以H6N6亚型组合为主,H6N2、H6N1、H6N4和H6N8多种亚型共存。18株H6亚型AIV的八个基因片段在进化树上呈现多个分支,不同分支之间毒株的基因差异较大,呈现出明显的遗传多样性;不同病毒的内部基因来源复杂多样,与多个其他亚型AIV存在基因重排现象,以基因核苷酸同源性≥95%为基因型划分标准,可将18株病毒株划分成15种基因型。结果表明,我国2014-2016年H6亚型AIV存在遗传进化的多样性和复杂性。2.H6亚型AIV 2014-2016年分离株的抗原差异性分析将18株H6亚型AIV用β-丙内酯进行灭活后,超滤管浓缩病毒,使其血凝效价≥28。浓缩后的病毒与佐剂按9:1的比例混合,震荡乳化后制备灭活疫苗,以1ml/只的剂量对6周龄SPF鸡进行肌肉多点注射免疫,免疫后28天采血进行血清分离,免疫血清与18株病毒进行交叉血凝抑制试验。结果显示,病毒之间交叉反应性和抗原性与病毒的HA基因同源性有关,HA基因同源性越高,病毒之间的交叉反应性越好,抗原性差异也越小,而不同HA基因分支内的病毒之间交叉反应性较差,抗原性差异显着,有些病毒之间甚至无反应性。因此,我国2014-2016年H6亚型AIV存在抗原多样性,共分为4个抗原群。3.H6亚型AIV 2014-2016年分离株的小鼠致病性研究6周龄BALB/c雌性小鼠用干冰轻微麻醉后,将18株H6亚型AIV以106EID50/50μL剂量经鼻腔进行感染,每株病毒感染8只小鼠,对照组5只小鼠用相同方式接种50μL PBS。接种后3天对感染组小鼠随机挑选3只剖杀,无菌采集其脑、鼻甲、脾脏、肾脏和肺脏,脏器匀浆后取上清接种10日龄鸡胚进行病毒滴度测定,对照组和感染组剩余小鼠连续观察14天,每天记录体重变化情况。结果显示,我国H6亚型AIV 2014-2016年分离株对小鼠呈低致病力,大多数病毒感染小鼠后3-5天出现一过性体重下降后,体重逐渐恢复正常,脏器病毒滴定结果显示,大多数病毒在没有预先适应的情况下可在小鼠肺脏中有效复制,个别病毒在小鼠鼻甲中也能进行高效复制,表明H6亚型AIV具有一定的感染哺乳动物的潜在风险。
李云燕[9]（2020）在《广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立》文中研究指明禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科,A型流感病毒属。H9亚型AIV感染通常会使家禽表现出产蛋量下降、生长缓慢及呼吸道症状,严重危害家禽产业的健康发展。该亚型病毒不仅能感染家禽和鸟类,也能直接感染人类,还能为新的感染人的重组病毒如H5N6、H7N9、和H10N8等提供部分或全部内部基因,严重危害人类公共卫生安全。广西地理位置特殊,加强该地区H9亚型AIV生态进化的研究对禽流感的有效防控具有重要意义为了解广西地区野鸟源H9亚型AIV遗传进化情况,本研究对2017-2019年间从不同活禽市场采集的斑鸠、鸽子和山鸡等野鸟咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离和纯化,用RT-PCR方法扩增分离株全基因并克隆测序,同时对测序结果进行遗传进化分析。结果表明成功分离鉴定出15株H9亚型AIV,均符合低致病性禽流感的分子特征,遗传进化分析发现其全基因来源较为复杂,一共出现3种不同的基因组合形式。为了建立快速检测不同亚型禽流感病毒方法,本研究利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法快速、敏感和成本低的优点,从NCBI下载不同HA和NA基因序列,利用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/）在线软件设计多对HA（H9和H5）和NA（N2）LAMP特异性引物,同时又设计了四组使用不同荧光标记的探针（HA-H9-探针和NA-N2-探针组合,HA-H9-探针和HA-H5-探针组合）,成功建立了快速检测H9和N2亚型AIV和区分H9、H5亚型AIV的二重荧光RT-LAMP检测方法。
高如一[10]（2020）在《H5N6禽流感病毒HA基因158位糖基化位点修饰的生物学效应与宿主免疫应答机制》文中研究表明Clade 2.3.4.4基因型是2008年出现的H5亚型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）新型分支,并且这一分支包含 H5N2、H5N3、H5N5、H5N6和H5N8等多个血清亚型。最新的流行病学调查数据表明,clade 2.3.4.4已经成为我国H5亚型HPAIV的主要流行分支,同时H5N6亚型已经取代H5N1亚型成为优势流行血清亚型。H5N6亚型HPAIV宿主范围广,除水禽、野鸟和陆生家禽外,还能从猪和猫体内分离到,并且是目前除H5N1之外唯一能够感染人的H5亚型病毒,截至2020年3月,共报告24例人感染病例,其中8例死亡。AIV能够跨越种间屏障涉及的关键因素之一是病毒受体结合特异性的改变,后者主要取决于病毒血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白。我们发现绝大多数 clade 2.3.4.4 H5NX 亚型 HPAIV 在 HA蛋白中具有T160A氨基酸突变,这一突变导致其158位的糖基化位点缺失。因此,探究这一位点的改变是否为H5N6亚型HPAIV的跨种间传播的关键因素及其对病毒的生物学特性的影响,将深化人们对于HPAIV跨种传播分子机制的理解,并为防控HPAIV引发的公共卫生风险提供理论支持。本研究针对158位糖基化位点存在差异的H5NX野毒株进行了受体结合分析,同时,构建了 160A/T两种模式的重组病毒对其受体结合特性以及生物学特性进行研究。首先评价模式病毒在不同来源细胞中的增殖能力和对小鼠的致病力,然后分析上述病毒在小鼠呼吸道的分布与复制情况,最后利用高通量测序技术解析158位糖基化位点存在差异的模式病毒感染细胞后基因的差异表达情况。1.Clade 2.3.4.4 H5NX HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对受体结合特性的影响我们对实验室从活禽市场分离到的clade 2.3.4.4分支的HPAIV H5N2（QD7）,H5N5（031）,H5N6（HX,Y6）和H5N8（WF1）病毒进行受体结合特性的分析,发现上述5株病毒的受体结合特性并不一致。进一步对其HA基因进行遗传进化分析发现031,Y6和WF1与大多数人源H5N6病毒一致,其HA蛋白呈T160A突变,造成158位糖基化位点缺失,这3株病毒均表现为双受体结合特性,而HX和QD7未缺失158位糖基化位点,表现为完全的α-2,3禽源受体亲和性。但是,这一单位点突变对clade 2.3.4.4 H5NX病毒HA骨架的影响尚不清楚。因此,我们针对母本病毒Y6和HX构建了 4株重组病毒,命名为 Y6-P-160A,RY6-P-160T,HX-P-160T 和 RHX-P-160A,分别保留母本病毒的外部基因HA和NA,内部基因盒由PR8（H1N1）提供。对4株重组病毒进行受体结合特性分析,发现Y6-P-160A和RHX-P-160A均表现为双受体类型的结合特性,而RY6-P-160T和HX-P-160T仅能与α-2,3禽源受体结合。此外,4株重组病毒在不同来源细胞中增殖能力测定结果表明,在禽源CEF细胞中,RHX-P-160A的复制能力最弱,而RY6-P-160T的复制能力最强,但4株重组病毒的复制滴度峰值差异不显着。在哺乳动物细胞中,以Y6为母本病毒构建的重组病毒的复制能力强于以HX为母本病毒构建的重组病毒,但模式病毒Y6-P-160A与RY6-P-160T之间,HX-P-160T与RHX-P-160A之间复制能力的差异不大。在小鼠致病模型中,母本病毒Y6和HX均为低致病性,而4株重组病毒均表现为中等致病性,但与重组病毒RY6-P-160T和HX-P-160T相比,Y6-P-160A和RHX-P-160A能够以更低接种量、更短时间内致死小鼠,上述结果与受体结合特性测定结果吻合。我们进一步构建了 HPAIVH5N2,H5N5和H5N8毒株的类似重组病毒,证实了 158位糖基化位点的缺失同样是其获得α-2,6人源受体的关键分子标记。因此,我们得出结论,HA基因中T160A突变导致158位糖基化位点的缺失是clade2.3.4.4 H5NX亚型病毒的双受体结合特性的决定因素。这一分子标记可能有助于预测、管控H5NX重组病毒跨种传播的风险。2.H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒生物学特性的影响为了进一步探究158位糖基化位点在H5N6亚型原病毒骨架中的作用,我们继续构建了 4株重组病毒,分别命名为RY6、RY6-160T、RHX和RHX-160A;其中,RY6-160T和RHX-160A均在HA蛋白的160位进行了突变;而RY6和RHX则在母本病毒Y6、HX骨架基础上进行了重组病毒的拯救。对小鼠的致病性分析发现,重组病毒RY6-160T和RHX的致病性显着高于RY6和RHX-160A,这与上一章以H1N1内部片段构建的重组病毒的致病性测定结果不同,后者的致病性分析结果提示,4株病毒的MLD50值由高到低分别为RY6-160T（105.17EID50）、RHX（106.5 EID50）、RY6（106.67 EID50）、RHX-160A（>107.0 EID50）。因此,我们进一步分析了 RY6和RY6-160T重组病毒在小鼠脏器中的分布情况,与重组病毒RY6相比,RY6-160T在小鼠体内的分布更加广泛,在多种受检脏器内均可检测到病毒,而RY6只能在肺脏和心脏中检测到,上述结果与小鼠致病力测定结果一致。不同细胞中的生长动力曲线也表明,RY6-160T在受检的不同来源细胞中的复制效率高于RY6。以上结果清楚地表明,HA蛋白160位糖基化位点的修饰显着影响病毒的毒力,该修饰是否影响病毒的抗原性?我们将4株重组病毒与针对clade 2.3.4.4 H5NX病毒的Re-8疫苗株的阳性血清进行反应,发现上述血清与重组病毒反应的滴度接近,提示重组病毒的抗原性并未发生明显改变。进一步对重组病毒的热稳定性进行测定,发现虽然4株重组病毒都属于中等热稳定性毒株,但RY6和RHX-160A在56℃水浴60分钟后仍然能够感染细胞,而RY6-160T和RHX在同样条件下已失去感染性,暗示158位糖基化缺失的野毒株在热稳定性方面占优势。尽管RY6-160T和RHX在宿主体内均表现出更强的毒力,但通过豚鼠红细胞解凝试验和A549细胞吸附试验,我们发现RY6和RHX-160A与上述细胞受体的结合能力更强,能优先结合受试细胞。上述结果表明,H5N6 HPAIVHA蛋白158位糖基化位点缺失并不能显着提高病毒对小鼠的致病力,需要依赖于HA蛋白的其他突变位点和/或病毒的内部基因间的协同作用;但158位糖基化位点的缺失使得病毒更耐受高温环境且与宿主细胞的结合能力更强,这些优势提高了 158位糖基化位点缺失的clade 2.3.4.4 H5NX在自然界的生存能力,最终使得这些毒株的流行面更广。3.H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒复制与宿主免疫应答的影响由于哺乳动物呼吸道α-2,3受体的分布不同于家禽,因此AIV通常更适合在哺乳动物的下呼吸道有效复制,而HPAIVHA蛋白158位糖基化位点直接影响病毒的受体结合特性,我们进一步检测了重组病毒RY6和RY6-160T感染小鼠的鼻甲骨、气管和肺脏三种脏器中的病毒含量,发现在鼻甲骨中RY6的含量显着高于RY6-160T,说明RY6在上呼吸道也能够有效复制。同时,我们分析了两株病毒感染后不同时间刺激宿主产生细胞因子的水平,RY6入侵宿主后在更短时间内刺激了炎性细胞因子HMGB1,IL-10和TNF α的产生,且其表达量也高于RY6-160T感染鼠;随着感染时间的延长,细胞因子的表达量逐渐下降,而RY6-160T在感染后期刺激产生的细胞因子水平显着高于RY6,过量的炎性因子最终可能导致了其对小鼠的致病性更强。我们使用高剂量重组病毒RY6、RY6-160T感染A549细胞,发现RY6在感染后3h和6h检测到的病毒滴度更高,但至感染后期9h后不再表现出复制优势。可能的原因:一方面,RY6结合A549细胞的能力更强;另一方面,病毒样颗粒形成试验结果表明,RY6-160T组装病毒粒子以及出芽的效率显着高于RY6,同时RY6-160T诱导细胞凋亡的能力也强于后者。两株病毒感染A549细胞的差异转录组学分析结果显示,RY6刺激宿主细胞表达的差异基因数量远远高于RY6-160T,说明RY6感染后启动了机体更广泛的调控机制。进一步的生物学功能分析发现,RY6感染A549细胞后引起了一系列负调控病毒复制的差异基因表达,干扰了病毒的入侵、复制与转录。KEGG通路分析证实了这一结论,即RY6感染细胞后激活了 NOD-like受体通路、p53信号通路和NFκB通路等相关通路。此外,我们发现两种宿主蛋白EGFR和MYH9可能在病毒结合细胞表面唾液酸受体后进一步协助病毒入侵细胞。因此158位糖基化位点缺失的RY6重组病毒能够在感染后启动宿主的免疫应答机制拮抗病毒,最终使得病毒的致病性趋于温和,从而有利于病毒的传播,而158位糖基化位点未缺失的RY6-160T重组病毒则刺激宿主表达过量的炎性因子,使其对宿主的致病性更强,与我们在小鼠模型中致病性试验中观察到的结果一致。综上所述,通过本文研究,主要得出以下结论:（1）Clade2.3.4.4H5NXHPAIVHA基因中T160A突变导致158位糖基化位点的缺失是该亚型病毒的双受体结合特性的决定因素;（2）Clade2.3.4.4 H5N6 HPAIVHA基因158位糖基化位点缺失不能显着提高病毒对小鼠的致病力,但该位点的缺失使得病毒更耐受高温环境,且与宿主细胞的结合能力更强;（3）H5N6HPAIVHA基因158位糖基化位点缺失的重组病毒能够在感染后启动宿主的免疫应答机制,使得病毒对小鼠的致病性趋于温和;而该位点未缺失的重组病毒则通过刺激宿主表达过量的炎性因子,导致病毒对小鼠的致病性更强。
二、禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析（论文提纲范文）
（1）2014-2018年中国H6亚型禽流感病毒的部分生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 禽流感病毒概述 |
| 1.2.1 禽流感病毒的毒力因子 |
| 1.2.2 禽流感病毒的传播 |
| 1.3 历史上流感大流行与禽流感病毒的关系 |
| 1.4 H6亚型禽流感病毒的流行与监测 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂、载体、菌株和细胞 |
| 2.2 2014-2018年部分H6亚型AIVs的表面基因测序及HA基因的遗传演化分析 |
| 2.2.1 RT-PCR扩增 |
| 2.2.2 序列的测定 |
| 2.2.3 HA基因的遗传演化分析 |
| 2.3 H6亚型AIVs的纯化 |
| 2.4 H6亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 2.4.1 RT-PCR扩增 |
| 2.4.2 序列的测定 |
| 2.4.3 H6亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 2.5 H6亚型AIVs的贝叶斯进化分析 |
| 2.6 H6亚型AIVs的抗原性分析 |
| 2.6.1 病毒特异性血清的制备 |
| 2.6.2 交叉血凝抑制试验 |
| 2.7 H6亚型AIVs对小鼠的感染性评价 |
| 2.7.1 H6亚型AIVs的 EID50测定 |
| 2.7.2 H6亚型AIVs对小鼠的感染性试验 |
| 2.8 H6亚型AIVs的受体结合特性分析 |
| 2.8.1 蔗糖密度梯度离心浓缩纯化H6亚型AIVs |
| 2.8.2 固相结合ELISA试验检测H6亚型AIVs的受体结合特性 |
| 2.9 探究HA第141位缬氨酸的插入对病毒生物学特性的影响 |
| 2.9.1 重组病毒r He N124与r He N124-HAΔ141的拯救 |
| 2.9.2 针对He N124-HA和 He N124-HAΔ141单克隆抗体的制备 |
| 2.9.3 HA第141位缬氨酸的插入对抗原性的影响 |
| 2.9.4 HA第141位缬氨酸的插入对小鼠感染性的影响 |
| 2.9.5 HA第141位缬氨酸的插入对受体结合特性的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 2014-2018年H6亚型AIVs部分HA 基因的遗传演化分析结果及NA 基因各亚型的数量统计 |
| 3.2 H6亚型AIVs的分子特征 |
| 3.3 H6亚型AIVs的遗传演化分析结果 |
| 3.3.1 HA基因的遗传演化分析 |
| 3.3.2 NA基因的遗传演化分析 |
| 3.3.3 PB2基因的遗传演化分析 |
| 3.3.4 PB1基因的遗传演化分析 |
| 3.3.5 PA基因的遗传演化分析 |
| 3.3.6 NP基因的遗传演化分析 |
| 3.3.7 M基因的遗传演化分析 |
| 3.3.8 NS基因的遗传演化分析 |
| 3.3.9 H6亚型AIVs的基因型划分结果 |
| 3.4 H6亚型AIVs的贝叶斯分析结果 |
| 3.5 H6亚型AIVs的抗原性分析结果 |
| 3.6 H6亚型AIVs对小鼠的感染性试验结果 |
| 3.7 H6亚型AIVs的受体结合特性分析结果 |
| 3.8 HA第141位缬氨酸的插入对病毒生物学特性的影响 |
| 3.8.1 HA第141位缬氨酸的插入对病毒抗原性的影响 |
| 3.8.2 HA第141位缬氨酸的插入小鼠感染性的影响 |
| 3.8.3 HA第141位缬氨酸的插入对病毒受体结合特性的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 H6亚型AIVs基因来源的复杂多样性 |
| 4.2 H6亚型AIVs的抗原性 |
| 4.3 H6亚型AIVs与公共卫生安全 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型流感病毒基本特征 |
| 1.2 A型流感病毒的抗原变异 |
| 1.2.1 抗原漂移 |
| 1.2.2 抗原转移 |
| 1.3 流感病毒的受体结合特性 |
| 1.3.1 HA蛋白受体结合位点 |
| 1.3.2 HA蛋白的受体结合特异性 |
| 1.4 犬流感病毒的流行病学 |
| 1.4.1 CIV概述 |
| 1.4.2 H3N8亚型CIV |
| 1.4.3 H3N2亚型CIV |
| 1.4.4 H5N1亚型CIV |
| 1.4.5 H5N2亚型CIV |
| 1.4.6 H1N1亚型CIV |
| 1.4.7 H3N1亚型CIV |
| 1.4.8 H9N2亚型CIV |
| 1.4.9 H6N1亚型CIV |
| 1.4.10 CIV的发病机理 |
| 1.5 犬流感病毒的诊断 |
| 1.5.1 病毒的分离培养 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 RT-LAMP检测 |
| 1.5.4 RT-PCR试验 |
| 1.5.5 荧光定量RT-PCR |
| 1.5.6 SYBR GreenⅠ荧光染料法 |
| 1.5.7 Taq Man探针法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 犬流感病毒的分离鉴定及遗传演化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1 病料的采集与接种 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 病毒RNA反转录与PCR |
| 2.2.5 病毒全基因组序列测定 |
| 2.2.6 病毒遗传演化分析 |
| 2.2.7 抗原性分析 |
| 2.2.8 受体结合特性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬流感病毒的分离鉴定 |
| 2.3.2 病毒核苷酸同源性比较 |
| 2.3.3 HA基因遗传演化分析 |
| 2.3.4 NA基因遗传演化分析 |
| 2.3.5 PB2基因遗传演化分析 |
| 2.3.6 PB1基因遗传演化分析 |
| 2.3.7 PA基因遗传演化分析 |
| 2.3.8 NP基因遗传演化分析 |
| 2.3.9 M基因遗传演化分析 |
| 2.3.10 NS基因遗传演化分析 |
| 2.3.11 抗原性分析 |
| 2.3.12 受体结合特性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 通用型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株和核酸样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 3.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 3.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.1.6 特异性试验 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 重复性试验 |
| 3.1.9 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 3.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.2.3 特异性试验结果 |
| 3.2.4 敏感性试验结果 |
| 3.2.5 重复性试验结果 |
| 3.2.6 临床样品检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 H3 亚型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株和核酸样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 4.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 4.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.1.6 特异性试验 |
| 4.1.7 敏感性试验 |
| 4.1.8 重复性试验 |
| 4.1.9 临床样品检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 4.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.2.3 特异性试验结果 |
| 4.2.4 敏感性试验结果 |
| 4.2.5 重复性试验结果 |
| 4.2.6 临床样品检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒流行病学 |
| 1.1 H9N2亚型禽流感在我国的暴发和流行 |
| 1.2 H9N2亚型AIV的进化和重组 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒蛋白研究进展 |
| 2.1 血凝素蛋白(Hemagglutinin Proteins,HA) |
| 2.2 神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase Proteins,NA) |
| 2.3 聚合酶复合体蛋白(Polymerase Complex Proteins) |
| 2.4 核蛋白(Nucleoprotein,NP) |
| 2.5 基质蛋白(Matrix Proteins,M) |
| 2.6 非结构蛋白(Nonstructural Proteins,NS) |
| 3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究进展 |
| 3.1 PB2蛋白的功能结构域 |
| 3.2 PB2蛋白关键氨基酸位点对病毒复制影响 |
| 4 结语 |
| 第一章 华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒与阳性血清 |
| 1.2 病毒运输液 |
| 1.3 SPF鸡胚和SPF鸡红细胞 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 其它材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 病毒分离 |
| 2.3 病毒亚型鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒亚型鉴定结果 |
| 3.2 近十年来活禽交易市场H9N2亚型AIV分离率 |
| 3.3 H9N2亚型AIV的分布特点 |
| 3.4 养鸡场H9N2亚型AIV的鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 SPF鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 数据库和分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒RNA的提取与反转录 |
| 2.2 RT PCR扩增及电泳检测 |
| 2.3 PCR胶块产物回收纯化 |
| 2.4 DNA测序与序列处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HA基因 |
| 3.2 NA基因 |
| 3.3 M基因 |
| 3.4 NP基因 |
| 3.5 NS基因 |
| 3.6 PB2基因 |
| 3.7 PB1基因 |
| 3.8 PA基因 |
| 4 讨论 |
| 第三章 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 细胞系与鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 数据库和分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 PB2蛋白适应性变异位点分析 |
| 2.2 构建单点和多点突变质粒 |
| 2.3 测定聚合酶活性 |
| 2.4 拯救病毒和生长动力学测定 |
| 2.5 相对荧光定量法检测PB2基因的mRNA、vRNA和cRNA表达 |
| 2.6 Wersten-blot检测蛋白表达水平 |
| 3 结果 |
| 3.1 组合位点突变对聚合酶活性的影响 |
| 3.2 组合突变毒株生长动力学 |
| 3.3 单点突变毒株聚合酶活性 |
| 3.4 单点突变毒株的生长动力学 |
| 3.5 单点突变毒株mRNA,cRNA,vRNA的表达水平 |
| 3.6 单点突变毒株的蛋白表达水平 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录: H9N2亚型禽流感病毒背景信息 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 引言 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 禽流感病毒的病原学 |
| 1.3 禽流感的流行病学 |
| 2.选题目的意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定及分离株血凝素与神经氨酸酶的生物信息学分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 样品初鉴定结果 |
| 2.2 样品HA分析结果 |
| 2.3 病毒增殖结果 |
| 2.4 病毒HA/NA鉴定结果 |
| 2.5 序列测序结果 |
| 2.6 血凝素与神经氨酸酶生物信息学分析结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验二 不同分离株全基因组测序分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 内部基因扩增结果 |
| 2.2 病毒全基因组序列比对结果 |
| 2.3 HA基因分子表征 |
| 2.4 NA基因分子表征 |
| 2.5 内部基因分子表征 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验三 分离株的致病性及生物特性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 受体结合特异性研究 |
| 2.2 分离株对小鼠的致病性 |
| 2.3 分离株对四周龄雏鸡的致病性 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.总RNA急速抽提试剂盒并根据其说明书步骤 |
| 2.SMART MMLV Reverse Transcriptase说明书步骤 |
| 3.普通琼脂糖DNA回收试剂盒试验步骤 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 附件 |
（6）2017-2019年华东地区H3亚型禽流感病毒流行病学调查分析及生物学特性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 H3亚型流感病毒的病原学及流行病学研究进展 |
| 1 A型流感病毒病原学 |
| 2 活禽市场在新型A型流感病毒产生中的作用 |
| 3 H3亚型流感病毒在不同宿主中的流行情况 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 2017-2019年华东地区低致病性禽流感病毒流行病学调查及H3亚型禽流感病毒的分离鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 H3N2亚型禽流感病毒遗传进化分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 6株H3N2亚型禽流感病毒的生物学特性鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）流感病毒mRNA疫苗的构建、制备与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 季节性流感病毒的分离与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 咽拭子样本 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 SPF级鸡胚 |
| 1.1.5 引物合成 |
| 1.1.6 分子生物学分析软件 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 咽拭子样本处理 |
| 1.2.2 流感病毒RT-PCR鉴定 |
| 1.2.3 目的基因的纯化与克隆 |
| 1.2.4 SPF级鸡胚接种与尿囊液收取 |
| 1.2.5 鸡血红细胞凝集试验 |
| 1.2.6 分离株半数致死量(LD_(50))测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 咽拭子样本分类 |
| 1.3.2 流感病毒PCR鉴定 |
| 1.3.3 流感病毒的分离 |
| 1.3.4 分离株与同年WHO推荐候选疫苗株HA基因比对分析 |
| 1.3.5 分离株A/Jilin/JYT-01/2018(H1N1)半数致死量(LD_(50))测定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 RNA候选疫苗体外转录系统的构建与筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌、质粒、细胞与流感病毒株 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 分子生物学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 三种体外转录系统的构建及功能验证 |
| 2.2.2 重组质粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3N2-HA-n1/n2/n3 构建 |
| 2.2.3 重组质粒大量制备 |
| 2.2.4 重组质粒线性化 |
| 2.2.5 体外转录反应 |
| 2.2.6 mRNA加帽反应 |
| 2.2.7 Cap-m RNA纯化 |
| 2.2.8 Cap-m RNA体外细胞转染试验 |
| 2.2.9 流式细胞术测定EGFP阳性细胞率 |
| 2.2.10 免疫印迹试验(Western Blot) |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因EGFP和 H3N2-HA的扩增 |
| 2.3.2 重组质粒p GEM-EGFP-n1/n2/n3及p GEM-H3HA-n1/n2/n3 的线性化处理 |
| 2.3.3 体外转染Cap-m RNA-n1/n2/n3 效果评价 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 mRNA候选疫苗脂质体纳米材料的制备及功能验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 抗体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 脂质体纳米颗粒LNP和 LNP-Man的制备 |
| 3.2.2 透射电子显微镜观察 |
| 3.2.3 LNPs/m RNA的制备 |
| 3.2.4 脂质体纳米颗粒粒径及电位测定 |
| 3.2.5 凝胶阻滞试验 |
| 3.2.6 细胞毒性检测 |
| 3.2.7 体外细胞转染效果评价 |
| 3.2.8 体外刺激小鼠树突状细胞成熟 |
| 3.2.9 重组质粒p GEM-Luc-n3 的构建 |
| 3.2.10 动物体内转染效果评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 脂质体纳米颗粒理化性质测定 |
| 3.3.2 LNPs/m RNA体外细胞转染效果评价 |
| 3.3.3 LNPs/m RNA动物体内转染效果评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 A型 H1N1、H5N1和B型流感病毒m RNA候选疫苗构建及实验免疫研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 抗体 |
| 4.1.2 毒株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 A型 H1N1、H5N1及B型流感病毒m RNA候选疫苗的构建策略 |
| 4.2.2 引物设计与合成 |
| 4.2.3 三株流感病毒HA基因扩增及纯化 |
| 4.2.4 三组重组质粒p GEM-HA-n3 构建与鉴定 |
| 4.2.5 三组Cap-m HA-n3 制备 |
| 4.2.6 三组Cap-m HA-n3 功能验证 |
| 4.2.7 三组流感病毒LNPs/m RNA疫苗的制备及免疫策略 |
| 4.2.8 A型 H5N1和B型流感病毒株半数致死量(LD_(50))测定 |
| 4.2.9 血凝抑制效价测定 |
| 4.2.10 血清中总Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平检测 |
| 4.2.11 血清中IL-4、IFN-γ细胞因子水平检测 |
| 4.2.12 小鼠脾淋巴细胞分离及T细胞亚群鉴定 |
| 4.2.13 小鼠肺组织病理切片制备 |
| 4.2.14 小鼠体重和存活率测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 三组重组质粒p GEM-HA-n3 构建、鉴定及线性化处理 |
| 4.3.2 三组Cap-m HA-n3 制备及功能验证 |
| 4.3.3 攻毒株半数致死量(LD_(50))测定 |
| 4.3.4 血凝抑制效价测定 |
| 4.3.5 血清中总Ig G、Ig G1、Ig G2a抗体水平检测 |
| 4.3.6 血清中IL-4、IFN-γ细胞因子水平检测 |
| 4.3.7 T淋巴细胞亚群检测 |
| 4.3.8 攻毒后小鼠肺组织病理切片观察 |
| 4.3.9 攻毒后小鼠体重和存活率测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（8）我国部分地区2014-2016年H6亚型禽流感病毒的遗传进化及小鼠致病性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstratct |
| 符号说明 |
| 综述: 流感病毒血凝素蛋白的功能及H6亚型禽流感病毒的流行现状 |
| 1 禽流感病毒基本概述 |
| 2 HA蛋白功能 |
| 2.1 HA蛋白与膜融合 |
| 2.2 HA蛋白裂解与流感病毒致病力 |
| 2.3 HA蛋白与唾液酸受体结合特性 |
| 2.4 HA糖基化对受体亲和性的调控作用 |
| 2.5 HA蛋白与病毒的出芽和释放 |
| 3 流感病毒的遗传变异 |
| 4 H6亚型禽流感病毒的流行与现状 |
| 5 本研究的目的意义 |
| 第一章 H6亚型AIV 2014-2016年分离株的遗传演化分析 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 病毒和SPF鸡胚 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 引物及参考序列 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒纯化 |
| 1.2.2 病毒RNA的提取和反转录 |
| 1.2.3 病毒基因片段扩增和纯化 |
| 1.2.4 病毒株全基因组序列测定 |
| 1.2.5 遗传演化分析及基因型划分 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 病毒的分布及HA遗传演化分析 |
| 1.3.2 NA遗传演化分析 |
| 1.3.3 内部基因遗传演化分析 |
| 1.3.4 基因型的划分 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 H6亚型AIV 2014-2016年分离株的抗原差异性分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 SPF鸡胚和SPF鸡 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒特异性血清的制备 |
| 2.2.2 交叉血凝抑制试验 |
| 2.2.3 抗原差异性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 交叉血凝抑制试验结果 |
| 2.3.2 抗原差异性分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 H6亚型AIV 2014-2016年分离株的小鼠致病性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒及实验动物 |
| 3.1.2 病毒鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 3.1.3 小鼠的感染性试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病毒EID_(50)测定结果 |
| 3.2.2 小鼠感染病毒后的体重变化 |
| 3.2.3 小鼠脏器病毒分布滴定结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（9）广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 A型流感病毒简介 |
| 1.2 禽流感病毒病原学特征 |
| 1.2.1 病毒形态结构 |
| 1.2.2 禽流感基因编码的蛋白及其功能 |
| 1.2.3 禽流感病毒的抗原漂移和抗原转变 |
| 1.3 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 1.3.1 H9N2亚型禽流感病毒在中国的爆发和流行 |
| 1.3.2 H9N2亚型禽流感病毒诊断技术 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增检测技术(LAMP)研究进展 |
| 1.4.1 LAMP技术基本原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 与其它技术相结合的LAMP技术 |
| 1.5 本课题研究的意义 |
| 第二章 广西野鸟源H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 鸡胚与标准血清 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.3 分离株生物学特性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定 |
| 2.3.2 分离株HA和NA基因型鉴定及标准命名 |
| 2.3.3 分离株生物学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 15株广西野鸟源H9N2亚型禽流感病毒分离株全基因组序列测定及遗传进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分离株RT-PCR全基因组扩增 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增产物胶回收与连接转化 |
| 3.2.3 阳性菌液的鉴定与测序 |
| 3.2.4 测序结果分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扩增及序列测定结果 |
| 3.3.2 遗传进化分析结果 |
| 3.3.3 15株野鸟源H9N2亚型AIV分离株基因分型 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 H9和N2 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 标准品的制备 |
| 4.2.3 反应体系的优化 |
| 4.2.4 特异性试验 |
| 4.2.5 干扰性试验 |
| 4.2.6 敏感性试验 |
| 4.2.7 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 反应体系 |
| 4.3.2 结果观察 |
| 4.3.3 特异性试验 |
| 4.3.4 干扰性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 临床样品检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 H9和H5 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 标准品的制备 |
| 5.2.3 反应体系的优化 |
| 5.2.4 特异性试验 |
| 5.2.5 干扰性试验 |
| 5.2.6 敏感性试验 |
| 5.2.7 临床样品检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 反应体系 |
| 5.3.2 结果观察 |
| 5.3.3 特异性试验 |
| 5.3.4 干扰性试验 |
| 5.3.5 敏感性试验 |
| 5.3.6 临床样品检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（10）H5N6禽流感病毒HA基因158位糖基化位点修饰的生物学效应与宿主免疫应答机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 流感病毒跨种间传播的潜在机制及其HA蛋白糖基化位点的相关生物学作用 |
| 1 H5亚型禽流感病毒谱系及流行现状 |
| 1.1 H5亚型流感病毒的病原特点及分子流行病学 |
| 1.2 Clade 2.3.4.4新型重组禽流感病毒流行现状 |
| 2 禽流感病毒跨种间传播的潜在机制 |
| 2.1 流感病毒HA蛋白对跨种间传播的影响 |
| 2.2 影响流感病毒跨种间传播的宿主因素 |
| 2.2.1 唾液酸受体 |
| 2.2.2 宿主调控免疫应答影响流感病毒的适应性 |
| 2.3 影响流感病毒跨宿主传播的其他蛋白 |
| 2.4 环境和生理因素 |
| 3 流感病毒HA蛋白糖基化的功能 |
| 3.1 病毒蛋白糖基化 |
| 3.2 糖基化修饰影响蛋白稳定性 |
| 3.3 糖基化修饰影响流感病毒HA蛋白受体结合特性 |
| 3.4 糖基化修饰影响流感病毒的复制以及致病力 |
| 3.5 糖基化修饰影响流感病毒识别免疫细胞相关受体 |
| 3.6 糖基化修饰介导病毒的免疫逃避 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 Clade 2.3.4.4 H5NX HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对受体结合特性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要的试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的纯化与鉴定 |
| 2.1.1 病毒的空斑纯化 |
| 2.1.2 纯化毒株鉴定 |
| 2.2 病毒遗传进化分析 |
| 2.3 重组病毒的构建 |
| 2.3.1 H5NX病毒HA及NA反向遗传质粒的构建 |
| 2.3.2 重组病毒的拯救及鉴定 |
| 2.4 HA蛋白迁移率分析 |
| 2.5 流感病毒的受体结合特性分析 |
| 2.5.1 鹅红细胞血凝试验 |
| 2.5.2 固相ELISA试验 |
| 2.6 重组病毒的生物学特性测定 |
| 2.6.1 SPF鸡胚半数感染量(EIDso)的测定 |
| 2.6.2 细胞半数感染量(TCIDso)的测定 |
| 2.6.3 小鼠的致病性实验 |
| 2.7 病毒体外增殖能力的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 新型重组病毒H5NX的遗传进化 |
| 3.2 新型重组病毒H5NX的受体结合特性 |
| 3.3 新型流感重组病毒的生物学特性 |
| 3.4 新型重组流感病毒HA蛋白的迁移率 |
| 3.5 Y6和HX及其重组病毒的体外增殖能力 |
| 3.6 Y6和HX及其重组病毒对小鼠的致病力 |
| 3.7 H5NX重组病毒的受体结合特性 |
| 3.7.1 鹅红细胞血凝试验 |
| 3.7.2 固相结合ELISA试验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H5N6HPAIVHA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒生物学特性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要的试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 片段构建 |
| 2.2 病毒拯救及传代 |
| 2.3 病毒生物学特性鉴定 |
| 2.4 病毒体外增殖能力的测定 |
| 2.5 小鼠的致病性实验 |
| 2.6 病毒热稳定性测定 |
| 2.7 抗原性差异分析 |
| 2.8 豚鼠红细胞解凝实验 |
| 2.9 细胞吸附实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒的拯救、鉴定结果 |
| 3.2 重组病毒的生物学特性 |
| 3.3 RY6和RY6-160T在不同细胞中的增殖能力 |
| 3.4 重组病毒对小鼠的致病性 |
| 3.5 重组病毒抗原性差异 |
| 3.6 重组病毒豚鼠红细胞解凝实验 |
| 3.7 病毒的热稳定性分析 |
| 3.8 重组病毒吸附A549细胞的能力 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒复制与宿主免疫应答的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要的试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 RY6与RY6-160T HA蛋白三维结构图的生成 |
| 2.2 不同接种剂量下病毒体外增殖能力的测定 |
| 2.3 病毒在小鼠呼吸道复制能力的测定 |
| 2.3.1 小鼠脏器样品的采集与处理 |
| 2.3.2 应用Taqman探针荧光定量PCR方法测定病毒核酸拷贝数 |
| 2.3.3 小鼠肺脏和鼻甲骨中细胞因子的测定 |
| 2.4 病毒噬斑表型观察 |
| 2.5 病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP)形成和出芽分析 |
| 2.5.1 质粒构建与转染 |
| 2.5.2 使用蔗糖梯度离心纯化细胞上清 |
| 2.5.3 病毒HA蛋白免疫印迹分析 |
| 2.6 差异转录组学分析 |
| 2.6.1 采集样品送测 |
| 2.6.2 测序数据验证分析 |
| 2.7 间接免疫荧光和激光共聚焦观察目的蛋白 |
| 2.8 细胞凋亡的检测 |
| 2.9 MYH9蛋白检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 RY6和RY6-160T HA蛋白的三维结构 |
| 3.2 RY6与RY6-160T在不同细胞中的增殖能力 |
| 3.3 重组病毒在小鼠鼻甲骨、气管和肺脏中的复制能力 |
| 3.3.1 感染小鼠鼻甲骨、气管和肺脏中病毒载量的测定 |
| 3.3.2 感染小鼠鼻甲骨、气管和肺脏中相关细胞因子应答的测定 |
| 3.4 RY6和RY6-160T在MDCK细胞中噬斑表型 |
| 3.5 158位糖基化位点的修饰影响VLP的装配和出芽效率 |
| 3.6 A549感染细胞的转录组分析结果 |
| 3.6.1 RY6和RY6-160T重组病毒感染A549细胞的差异表达基因 |
| 3.6.2 差异蛋白GO功能分析及富集结果 |
| 3.6.3 表达差异基因的KEGG分析 |
| 3.7 重组病毒感染A549细胞后病毒复制相关基因的表达 |
| 3.8 重组病毒感染A549后宿主蛋白EGFR的表达模式及其细胞凋亡水平 |
| 3.8.1 重组病毒感染A549细胞后EGFR蛋白表达量分析 |
| 3.8.2 重组病毒感染A549细胞后EGFR蛋白表达对细胞凋亡的影响 |
| 3.9 重组病毒感染A549细胞后宿主蛋白MYH9的表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 A 549细胞中显着差异表达的基因(RY6 vs RY6-160T) |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析（论文参考文献）
- [1]2014-2018年中国H6亚型禽流感病毒的部分生物学特性研究[D]. 崔嘉琦. 东北农业大学, 2021
- [2]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [3]H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 吴颖. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响[D]. 裴宇茹. 扬州大学, 2021
- [5]艾比湖野鸟源低致病性禽流感病毒的分离鉴定[D]. 李培东. 石河子大学, 2021
- [6]2017-2019年华东地区H3亚型禽流感病毒流行病学调查分析及生物学特性鉴定[D]. 才天宇. 扬州大学, 2020
- [7]流感病毒mRNA疫苗的构建、制备与实验免疫研究[D]. 庄忻雨. 军事科学院, 2020(01)
- [8]我国部分地区2014-2016年H6亚型禽流感病毒的遗传进化及小鼠致病性分析[D]. 范威峰. 扬州大学, 2020(04)
- [9]广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李云燕. 广西大学, 2020(02)
- [10]H5N6禽流感病毒HA基因158位糖基化位点修饰的生物学效应与宿主免疫应答机制[D]. 高如一. 扬州大学, 2020(01)