一、Agrobacterium-mediated Transformation and Regeneration by Direct Shoot Organogenesis in Cotton (G. hirsutum)（论文文献综述）
桑娜[1]（2021）在《棉花成花素GhFT及受体14-3-3蛋白家族调控开花的功能研究》文中认为开花转变是植物繁殖的重要过程,受到外界环境和内在发育机制的影响。作为“成花素”的FLOWERING LOCUS T（FT）蛋白与其受体14-3-3以及b ZIP转录因子FD在细胞核中形成成花素激活复合物（florigen activation complex,FAC）,影响下游靶基因的表达,从而调控植物开花时间及株型建立。在棉花中,FT基因功能的研究还不深入,而14-3-3基因目前的研究主要集中在纤维细胞的起始和伸长、盐和干旱胁迫以及抗黄萎病等方面。FT和14-3-3蛋白是否也是棉花FAC的组成部分,它们在棉花中调控开花的分子网络还不清楚。本研究通过对棉花GhFT及14-3-3（GENERAL REGULATORY FACTOR,GRF）基因的功能进行研究,明确了Gh GRF蛋白与GhFT的关系,解析了二者在棉花开花和株型调控中的部分分子调控网络,为调控棉花开花和生长时期提供方向,进而为提高棉花产量等育种工作提供理论基础。本论文研究的主要内容和结果如下:1.GhFT基因功能的研究调控序列分析发现亚洲棉、陆地棉和雷蒙德氏棉5.9-kb FT启动子上存在5个插入缺失位点。因重复序列存在于1.0-kb启动子后,将1.8-kb FT启动子截短为1.0-kb,发现均可部分互补ft-10突变体的晚花表型,但1.0-kb FT启动子比1.8-kb恢复突变体ft-10晚花表型的能力更强。利用病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默GhFT基因,导致棉花晚花并且株高增加;进一步构建GhFT第1和第2外显子上的CRISPR/Cas9基因编辑载体,对获得的转基因棉花进行测序发现,编辑类型多样,植株表现出无限生长、顶端成簇和顶端叶片边缘锯齿状。花身份特征基因APETALA1（AP1）和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）的同源基因Gh AP1和Gh SOC1的表达量降低,而“抗花素”TERMINAL FLOWER1（TFL1）的同源基因Gh TFL1基因的表达量升高。以GhFT作为诱饵蛋白,通过酵母双杂（Yeast Two-hybrid,Y2H）技术,初步筛选出39个与GhFT互作的蛋白,这些蛋白参与氧化还原、RNA合成、转录调控、蛋白质折叠和电子转运、生长素应答和多种代谢过程等。此外,克隆了被注释为14-3-3 protein 6的全长CDS序列,命名为Gh GRF。进一步利用Y2H和双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）证明了GhFT和Gh GRF蛋白主要在细胞质和细胞核中互作。2.棉花14-3-3（GRF）基因的功能研究利用全基因组分析从草棉（Gossypium herbaceum）、亚洲棉（G.arboreum）、陆地棉（G.hirsutum）和雷蒙德氏棉（G.raimondii）中分别鉴定出17、17、31和17个GRF基因,确定了文库筛选出的一个与GhFT互作的Gh GRF蛋白为Gh GRF15。对鉴定出的82个GRF的基因结构、基序组成、共线性和复制基因等进行了系统的分析,为该基因家族在棉花中的进化提供了新见解。实时荧光定量PCR证实Gh GRF基因家族成员在不同组织和胁迫应答中表现出不同的表达模式,暗示该基因家族功能的多样性。利用RT-PCR克隆了Gh GRF3/6/9/14/15基因,Y2H和Bi FC实验表明GhFT和Gh GRF3/6/9/14/15在细胞质和细胞核中发生互作,而Gh GRF3/6/9/14/15和Gh FD的互作发生在细胞核中,三者之间相互作用形成不同的FAC。此外,Y2H实验表明其它的Gh GRF蛋白也可与GhFT相互作用。利用VIGS技术发现Gh GRF3/6/9/15沉默植株早花,Gh AP1和Gh SOC1的表达量上调,而沉默Gh GRF14,棉花开花延迟,Gh AP1和Gh SOC1下调表达;在拟南芥中异源过表达Gh GRF3/6/9/15,抑制拟南芥At AP1和At SOC1的表达,从而抑制开花,而Gh GRF14的异源过表达,促进At AP1和At SOC1表达,促进拟南芥开花。综上所述,陆地棉中的GhFT不仅影响棉花开花,还调控棉花株型变化。Gh GRF3/6/9/14/15作为GhFT的受体蛋白,二者可以和Gh FD在细胞核中结合形成GhFT–Gh GRF3/6/9/14/15–Gh FD复合体。FAC的功能受其组成成分Gh GRF的影响,通过调控AP1和SOC1的表达促进或抑制棉花开花,初步阐明了棉花开花调控的分子网络,这为改变棉花开花时间从而改变棉花生长周期提供参考,同时也为棉花新株型的培育提供理论基础和指导。
梁思佳[2]（2020）在《利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质》文中提出棉花害虫种类繁多,而且在整个生育时期均易遭受各种害虫危害。Bt抗虫棉的广泛种植有效的控制了棉铃虫的爆发,但由于杀虫剂使用量的大幅度减少,导致Bt非靶标害虫盲蝽象为害日益加重,并由次要害虫上升为主要害虫。盲蝽寄住范围广、飞行扩散能力强、爆发频率高,给盲蝽的防治带来了巨大的困难。目前喷洒化学杀虫剂是防治盲蝽的主要方法,但化学杀虫剂不但容易诱发盲蝽抗性的产生,而且给人类健康和环境安全带来威胁。因此迫切需要高效安全的盲蝽防治新策略。近年来,植物介导的RNAi技术由于其高效、特异,对环境无污染等特性被广泛应用于害虫的防治研究。本研究利用植物介导的RNAi技术创造了棉花抗盲蝽新种质,为盲蝽的防治提供了新的策略。主要研究内容如下:1.棉花抗中黑盲蝽新种质的创造本研究利用植物介导的RNAi技术,以影响中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）生殖能力的As FAR基因为靶标,创造了能够高量表达As FAR基因ds RNA的转基因棉花。当中黑盲蝽取食该转基因棉花后,可以成功诱发其体内的RNAi效应,导致其内源As FAR基因的表达水平显着下降。田间抗虫鉴定结果显示,As FAR转基因棉花受中黑盲蝽危害较轻,平均每株棉花仅捕获中黑盲蝽12-14头。然而对照组棉花受中黑盲蝽危害非常严重,平均每株棉花捕获中黑盲蝽数量大于20头。以上结果表明As FAR转基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力,导致其种群数量显着下降,有效减少中黑盲蝽的危害。非靶标害虫的抗性鉴定结果显示As FAR转基因棉花只对中黑盲蝽有抗性效果,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的体重以及蚜虫（Aphis gossypii）的种群数量均无不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,As FAR转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不利影响。以上结果表明,As FAR转基因棉花对中黑盲蝽有较高的抗性,对非靶标害虫无不良影响,农艺性状良好且稳定,可以作为防治中黑盲蝽的理想种质资源。该研究为中黑盲蝽的防治提供了新的可替换策略策略。2.棉花抗绿盲蝽新种质的创造本研究选择绿盲蝽（Apolygus lucorum）Al LIM基因作为靶标基因,序列分析表明Al LIM基因具有高度特异性。随后将该基因转入棉花,成功创造了能够高量表达绿盲蝽Al LIM基因ds RNA的转基因棉花材料。室内饲喂结果显示,取食Al LIM转基因棉花后,绿盲蝽内源Al LIM基因的相对表达水平显着下降。在幼虫向成虫转化过程中蜕皮发生严重缺陷,最终因蜕皮失败,变态发育被阻断而死亡,死亡率高达33%-41%。此外有少量绿盲蝽可以羽化为成虫,但其翅膀、后腿出现畸形。对分别注射ds RNA-Al LIM（ds Al LIM）和ds RNA-GFP（ds GFP）的绿盲蝽样品进行转录组测序。数据分析结果显示,总共鉴定到4923个差异表达基因,其中有2484个基因在ds Al LIM处理后上调表达,2439个基因在ds Al LIM处理后下调表达。差异基因KEGG通路分析结果显示,与肌肉生长发育相关的信号通路被显着富集。根据KEGG通路分析结果鉴定到一些参与肌肉生长发育且在ds Al LIM处理后发生显着变化的差异基因。以上结果表明,Al LIM基因在绿盲蝽肌肉发育过程中发挥重要作用。肌肉结构和功能的完整性是昆虫变态发育的关键,因此推测绿盲蝽Al LIM基因的缺失会导致绿盲蝽羽化过程中蜕皮所需肌肉发育缺陷,最终导致蜕皮失败,羽化被阻断,死亡率增加。田间抗虫鉴定结果显示,转基因棉花受绿盲蝽危害较轻,每株转基因棉花平均捕获绿盲蝽8.1-10.1头。然而野生型对照组棉花受绿盲蝽危害却非常严重,每株平均捕获绿盲蝽高达21.5-24.1头。取食转基因棉花导致绿盲蝽死亡率增加,种群数量显着下降。此外,在田间依然观察到少量后腿及翅膀缺陷的绿盲蝽成虫。以上结果表明该转基因棉花对绿盲蝽具有较高的抗性水平。非靶标昆虫的生物测结果显示,Al LIM转基因棉对棉铃和蚜虫的生长发育没有负面影响,对有益昆虫瓢虫（Menochilus sexmaculatus）的生长发育没不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不良影响。以上结果充分表明Al LIM转基因棉花目标抗虫性状效果良好,对非靶标害虫、有益昆虫以及人类安全,农艺性状以及纤维品质良好,可以作为防治绿盲蝽的理想种质资源。
赵亚楠[3]（2020）在《转GNA、ACA、NhaD、HEWL和CP4-EPSPS基因棉花新材料的创制》文中认为棉花是我国重要的经济作物,棉花的生产过程中会受到虫害、病害、除草剂和盐碱化土地等因素的影响。为了获得具有抗虫、抗逆、抗病和耐除草剂的多抗性转基因棉花新品种,本实验选取了雪花莲凝集素基因（Galanthus nivals agglutinin,GNA）、苋菜凝集素基因（Amaranthus caudatus agglutinin,ACA）、抗旱耐盐碱基因Na+/H+逆向转运蛋白（NhaD）、抗病基因鸡蛋清溶菌酶基因（Hen Egg White Lysozyme,HEWL）和耐除草剂基因（CP4-EPSPS）,构建具有多功能的多基因植物表达载体,农杆菌介导法转化棉花,以期获得具有抗蚜虫、抗黄萎病、抗旱耐盐碱以及耐除草剂的多功能转基因棉花新材料。本研究构建了含有GNA、ACA、NhaD、HEWL及CP4-EPSPS 5个外源基因的植物表达载体,其中GNA与ACA通过2A多肽连接,由35S启动子和NOS终止子介导;NhaD、HEWL及CP4-EPSPS也分别由2A多肽连接,由质体蓝素启动子与质体蓝素终止子控制表达。通过农杆菌介导法,将外源基因转入棉花基因组中,获得含有5个外源基因的转基因株系5g-1和5g-4。PCR反应证明外源基因整合到棉花染色体上,通过Genome Walking的方法确定了5g-1和5g-4转基因株系T-DNA的准确插入位点:5g-1中T-DNA正向插入在陆地棉A02（11664124-11664203）处,5g-4中T-DNA反向插入A06（95514261-95514281）处。通过qRT-PCR、Western blot和ELISA等方法,确定外源基因在棉花中进行了表达。对获得的转基因植株进行蚜虫接种实验,表明转基因植株对蚜虫具有一定的抑制作用,抑制率为36%～55.50%,明显优于对照植株。由于市面上购买的凝集素抗体针对转基因植株的特异性不高,本论文利用商品化的雪花莲凝集素和苋菜凝集素蛋白,采用皮下多点注射的方式,免疫10只KM小鼠,通过Western blot和ELISA证实所获得的小鼠抗血清符合检测转基因棉花目标蛋白质的要求。在转基因植株qRT-PCR和Western blot检测过程中,发现质体蓝素启动子介导外源基因在棉花中的表达量优于35S启动子,在考虑提高表达量的时候可以考虑更换为质体蓝素启动子。本研究获得了具有5个外源基因且外源基因都进行表达的转基因棉花新材料,为培育多抗性棉花新品种提供了思路与技术支持。研究发现质体蓝素启动子介导外源基因的表达量优于35S启动子,为外源基因在棉花中进行高表达提供了研究思路和研究基础。
陈荣珠[4]（2020）在《龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析》文中指出龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国华南地区具有较高经济价值的热带亚热带果树。龙眼果实质量和产量与其胚胎发育息息相关。植物体细胞胚胎与合子胚在发育过程基本相似,可作为研究植物胚胎发生机制的优良替代体系。植物体胚发生过程不仅受特异基因的调控,还受表观遗传调控,尤其是DNA甲基化,一定水平的DNA甲基化对植物体胚的正常发育是必须的。mi RNA能够介导DNA的甲基化,该过程与mi RNA加工合成途径中的相关蛋白有关,AGO作为mi RNA加工合成途径中的关键蛋白,参与介导DNA的甲基化,因此,AGO基因可能参与调控植物的体胚发生过程,但是具体作用机制尚不清楚,目前,关于龙眼AGO表达调控和功能特异性研究仍有大量空白。因此,本研究首先从三代测序的龙眼基因组数据库中鉴定出AGO基因家族,对Dl AGOs家族的表达模式进行了分析,利用异位表达的方法对龙眼AGO基因及启动子功能进行研究。最后,进行了龙眼胚性愈伤组织去甲基化的转录组学分析。以此来探究AGO在龙眼体胚发生早期的甲基化调控机制。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1 c DNA的克隆从龙眼基因组数据库中共鉴定出AGO家族10个成员,并根据注释到拟南芥或水稻中的成员进行命名。这些Dl AGOs基因分布于龙眼1、4、8、10、12、13、14和15号染色体,编码794-1064个氨基酸,含有AGO典型的保守结构域,且该家族的蛋白质均为亲水的碱性蛋白。系统进化树分析表明,不同物种的AGO可被分成4个分支,龙眼AGO与甜橙AGO亲缘关系最近。RT-PCR结合RACE法从龙眼EC中克隆获得了Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1基因的c DNA全长序列,其长度分别为3425 bp、3418 bp、3775 bp和3289 bp。Dl AGOs基因家族成员的氨基酸序列同源性较低,可能与其功能的多样性有直接的关系。2龙眼Dl AGOs启动子的克隆与生物信息学分析克隆获得了Dl AGOs基因5’端侧翼序列长度分别为1437 bp、1809bp、1514 bp、1807 bp、1707 bp、1722 bp、1784 bp、1746 bp、1794 bp和1512 bp。生物信息学分析表明,Dl AGO1、Dl AGO4和Dl AGO5-2启动子含有Cp G岛区域;Dl AGOs启动子序列除了含有大量的核心元件TATA-box和CAAT-box外,还含有多种光响应、激素应答、环境胁迫响应等元件,说明龙眼AGO基因在激素响应、光响应及抗逆等方面可能具有调控作用。3龙眼Dl AGOs家族的表达模式分析Dl AGOs不同成员在龙眼体胚发生早期阶段及合子胚发育阶段均有表达,尤其在胚胎发生的早中期具有较高的表达,不同成员具有一定功能的分工和互补,可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程。Dl AGOs在龙眼不同组织部位中的时空表达具有特异性,可能参与龙眼种子、花、幼果和茎的发育调控。Dl AGOs基因在激素处理、不同光质处理、高温和低温处理、盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫以及ABA处理下均有响应,说明它们广泛参与了激素应答、光响应及非生物胁迫应答,但是不同成员具有不同的表达模式,这也体现了AGO基因家族成员之间功能的多样性。4龙眼Dl AGOs启动子的功能验证构建龙眼Dl AGOs启动子表达载体瞬时转化烟草叶片和龙眼胚性愈伤组织EC,利用组织化学染色、GUS基因的瞬时表达及启动子激素应答分析。结果显示,Dl AGOs启动子均具有驱动GUS基因表达的活性,其中pro AGO5-1的驱动能力最强,ABA诱导Dl AGOs启动子的转录活性,部分启动子受Me JA、SA和GA3的诱导,推测龙眼Dl AGOs启动子为激素诱导型启动子。5 Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1的亚细胞定位研究构建融合表达载体,瞬时转化洋葱内表皮细胞,以GFP为报告基因,利用激光共聚焦显微镜观察表达情况,亚细胞定位结果表明,龙眼Dl AGO7主要定位于细胞核中,而Dl AGO10和Dl AGOMEL1主要定位于细胞质中。6 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及Dl AGOs表达的影响2,4-D和5-azac均会影响植物体胚的发生,本研究用2,4-D（0.1、0.5、1.0 mg/L）与5-氮胞苷（5-azac:0、5、25、50、100 uM）配合处理龙眼胚性愈伤组织。显微观察发现,5 uM 5-azac与0.1 mg/L或0.5 mg/L 2,4-D配合使用,有利于球形胚产生;定量结果表明,Dl AGOs响应2,4-D和5-azac的处理,其中Dl AGO4在5 uM 5-azac处理下呈上调表达。在MS培养基中添加0、2.5、5 uM 5-azac处理龙眼EC 1、3、6、9和12 d,显微观察发现,培养第9 d,对照组未出现球形胚,而处理组中的龙眼胚性愈伤组织均发育至球形胚阶段;培养到第12 d,对照组和处理组均出现了球形胚;定量结果表明,低浓度5-azac处理9d促进Dl AGO4基因的表达。7 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析用2.5 uM 5-azac处理龙眼EC 9 d,以不加5-azac为对照组,采用BGISEQ-500测序平台进行RNA高通量测序。测序结果表明,对照组与处理组相比总共有1,617个差异表达的基因,主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢、C5-支化二元酸代谢、硫代谢、硒代化合物代谢等代谢通路。5-azac处理后,龙眼DNA甲基化水平降低,促进与龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因上调表达,从而促进龙眼早期体胚的发生。因此,5-azac处理促进龙眼Dl AGO4基因的表达,Dl AGO4与24-nt lmi RNA结合抑制DNA甲基化,促进龙眼体胚发生;5-azac抑制组蛋白乙酰化促进龙眼体胚发生;丁酸盐促进组蛋白丁酰化促进龙眼体胚发生,同时,丁酸盐代谢还参与植物抗逆。
邓晋武[5]（2020）在《棉花GhCIPK6的功能鉴定及其参与调控植物糖稳态的机制解析》文中认为钙离子作为第二信使,在植物生长发育及对环境响应的过程中发挥了至关重要的作用。不同的环境条件及生理状态会引起植物体内产生不同的钙信号,而植物可以通过一系列钙离子感受器及下游蛋白来实现对钙信号的解码。已有研究表明,CBL-CIPK介导的钙信号转导参与了多种生物学过程,特别是对离子稳态的调控。然而由于CBL和CIPK家族成员在功能上的冗余,其众多潜在的功能还有待进一步发掘。糖作为植物最重要的代谢产物,其分配和利用受到严格的调控,但植物对糖稳态的精细调控机制还不是很清楚。本研究在棉花中鉴定到GhCBL2-GhCIPK6参与了植物对糖稳态的调控并对其机制进行了解析,结果如下:1.陆地棉GhCIPK家族的鉴定及表达分析本研究通过将拟南芥中的At CIPK蛋白序列与棉花参考基因组TM-1数据库进行比对,在棉花中共鉴定到79个GhCIPK成员并进行进化树分析。绝大多数GhCIPK在A亚基因组和D亚基因组中均存在对应的同源拷贝,其中A和D亚基因组中分别有4个成员属于GhCIPK6亚家族,而GhCIPK6A3/D3在整个家族叶片表达分析中具有最高表达量,在本研究中用GhCIPK6表示。此外,GhCIPK6被鉴定为节律基因且在棉花不同组织中均有较高的表达。2.GhCIPK6参与调控植物糖稳态、生长发育及逆境耐性GhCIPK6影响了棉花可溶性糖的含量和组分。GhCIPK6超表达植株叶片中积累大量的葡萄糖和果糖,而蔗糖含量降低,最终造成可溶性总糖含量显着增加。RNAi植株中GhCIPK6及同源基因表达均下调,葡萄糖含量显着降低,但对总糖含量没有显着影响,而GhCIPK6A3/D3敲除突变体中葡萄糖含量不受影响,说明GhCIPK6调控糖稳态与其它同源蛋白具有功能冗余性。超表达GhCIPK6引起可溶性糖积累的同时显着抑制了植株生长发育。此外,GhCIPK6提高了棉花对饥饿及高浓度葡萄糖胁迫的耐性。3.GhCBL2作为GhCIPK6上游的钙受体参与了糖稳态的调控通过酵母双杂交实验筛选到与GhCIPK6互作的GhCBL2。通过Pull-down,Bi FC及荧光素酶互补成像（LCI）技术对GhCIPK6与GhCBL2在体外及体内互作进行了验证。超表达GhCBL2能显着提高棉花可溶性糖及葡萄糖的积累,CRISPR-Cas9介导的GhCBL2敲除突变能显着抑制GhCIPK6介导的可溶性糖及葡萄糖积累,说明GhCBL2参与了GhCIPK6介导的糖稳态调节。4.Gh TST2作为GhCIPK6下游的靶标参与了糖稳态的调控对GhCIPK6转基因植株磷酸化蛋白质组学分析鉴定到GhCIPK6下游潜在靶标蛋白液泡糖转运子Gh TST2,通过酵母双杂交,Pull-down及Bi FC证实了GhCIPK6与Gh TST2在体外及体内的互作。超表达Gh TST2能显着提高棉花可溶性糖及葡萄糖含量,而Gh TST2敲除突变体中葡萄糖含量显着降低。此外,GhCIPK6超表达棉花中可溶性糖及葡萄糖含量在Gh TST2突变背景下显着降低,说明GhCIPK6介导的糖稳态调节依赖于Gh TST2。5.GhCIPK6参与糖稳态调控的机制在不同物种中具有保守性在拟南芥中异源表达GhCIPK6能引起葡萄糖及可溶性糖含量的显着升高。在GhCIPK6异源表达的拟南芥中同时突变At TST1及At TST2能将可溶性糖及葡萄糖含量恢复到野生型水平,说明GhCIPK6调控糖稳态的机制在不同物种中具有保守性。6.GhCIPK6具有多重生物学功能GhCIPK6平行参与了其它的生物学过程,这些过程独立于GhCIPK6参与的糖稳态。其中,GhCIPK6超表达棉花叶片中多种矿质元素含量显着降低。此外,超表达GhCIPK6显着促进了离体叶片失水速率但降低了叶片蒸腾速率,并显着提高了植株对水分的利用效率。由于GhCIPK6家族成员在调控以上生物学过程中可能存在功能冗余,因此没有在GhCIPK6 RNAi及突变体植株中检测到与野生型相比的显着差异。对于以上生物学功能的进一步鉴定和解析还需要进行GhCIPK6家族多个成员敲除突变体的创建和深入研究。根据以上结论,本研究在棉花中鉴定到GhCBL2-GhCIPK6-Gh TST2通路参与了植物糖稳态的调控,为改良作物品质和逆境抗性提供了新的基因资源。
黄坤勇[6]（2020）在《苎麻纤维细度全基因组关联分析及候选基因筛选》文中提出纤维细度是衡量苎麻纤维物理品质的重要指标,直接关系到纤维的纺织价值。挖掘苎麻纤维细度QTLs,对培育高纤维细度苎麻品种具有重要的意义。本研究利用319份苎麻优质种质构成关联群体,利用全基因组重测序技术开发覆盖全基因组的SNPs;基于2点多年的田间种植试验鉴定得到的表型数据,进行表型与基因型的GWAS研究及候选基因的筛选,并对候选基因Marker09783进行了表达载体的构建和转基因的研究。主要研究结果如下:1.鉴定了319份苎麻种质的纤维细度和纤维直径的表型性状。结果表明该319份苎麻种质纤维细度和纤维直径变异广泛,遗传多样性丰富。环境之间纤维细度及纤维直径相关性和广义遗传力分析表明,苎麻纤维细度和纤维直径表型主要受基因型的影响。2.过滤后获得3,494,975个高质量的群体SNPs用于亲缘关系和群体结构的分析。进一步过滤后得到用于GWAS分析的1,336,689个SNPs,平均间距为246.80 bp,远小于苎麻LD衰减的平均距离1.27 Kb。利用SPAGeDi软件计算的亲缘关系值表明,大多数苎麻种质亲缘关系在0.3-0.4之间。系统发育分析显示,该群体可以分为4组,不同组间无明显的地域分布特征。主成分分析显示,前四个主成分因子仅解释了13.60%的表型变异,种质间没有明显的块状聚集;群体结构分析表明,该苎麻群体无明显的群体分层。3.基于GLM+Q模型分析方法,3个环境分别检测到与纤维细度显着相关的SNPs位点82个（2017Lb）、361个（2018Lb）和18个（2018La）;与纤维直径显着关联的SNPs位点227个（2018Lb）和28个（2018La）;结合本实验室中苎1号与合江苎麻杂交F1群体定位的结果,检测到4个稳定的纤维细度QTLs区段（Chr.9:16.16-16.50 Mb,Chr.9:3.13-3.61Mb,Chr.8:13.90-14.17 Mb,Chr.8:15.62-15.86 Mb）。4.利用两个纤维细度差异品种,5个时期茎皮的转录组基因表达量数据,对QTLs区段内基因进行了初步筛选分析,并结合荧光定量PCR验证。最终筛选得到6个候选基因,其中基因Marker00009591为1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶,乙烯可能在纤维细度调控中起着重要的作用。5.通过对两个纤维细度显着差异苎麻品种,5个时期的石蜡切片。发现苎麻纤维细胞是由多个纤维细胞两端逐渐溶解形成一个长的纤维细胞,细胞数量随着发育时间的增长而逐渐增加。川苎2号（低纤维细度）纤维细胞的直径在5个时期都要大于衢县苎麻（高纤维细度）,表明苎麻纤维细度在纤维发育的初期已经形成。6.川苎2号叶片组培体系研究发现,愈伤诱导最适培养基为MS+0.5 mg/L TDZ+0.03 mg/L2,4-D+0.01 mg/L IAA,最适愈伤分化培养基为MS+0.3 mg/L TDZ+0.03 mg/L 2,4-D+0.03 mg/L IAA。对候选基因Marker09783构建pBI121-Marker09783过表达载体,农杆菌介导转化川苎2号苎麻叶片获得转基因株系8株。7.qRT-PCR分析发现3个转基因株系Marker09783基因表达量高于对照,并进一步通过石蜡切片发现转基因株系纤维直径要小于野生型植株。
郑雷[7]（2020）在《GhPRE1基因在陆地棉株型调控中的功能分析及作用机制研究》文中提出棉花是世界上最重要的纤维作物,是我国重要的战略物资。株型是棉花的重要农艺性状,不仅影响产量,还是影响机械化采收的关键指标。油菜素甾体类化合物（Brassinosteroids,BRs）参与调控包括植株营养生长、生殖生长等广泛的生命过程,对株型构建发挥关键作用。本研究通过FOX-hunting（Full-length c DNA over-expressing gene hunting system）系统发掘棉花BR信号途径株型调控基因,获得了可以显着促进油菜素内酯受体突变体bri1-5株型变化的Gh PRE1基因,证明Gh PRE1基因参与油菜素内酯信号受体蛋白BRI1（Brassinosteroid insensitive 1）下游的信号转导途径并对植株生长有调控作用。利用PRE基因隐马尔可夫模型在陆地棉全基因组中鉴定到26个Gh PRE基因,分入PRE-a至PRE-d四个亚群中。结合陆地棉RNA-seq数据分析发现Gh PRE1基因所属的PRE-a亚群在棉花各组织中有最高的表达水平。通过Gh PRE1启动子驱动GUS基因(ProGh PRE1::Gus)检测显示Gh PRE1基因在根尖区域有优势表达,而在根尖上部细胞增殖区内表达量下降,根据植物根部各组织细胞生长状态推测Gh PRE1基因表达与细胞分裂调控可能存在关联。同时,使用油菜素内酯（BL）和油菜素内酯抑制剂芸苔素唑（BRZ）处理ProGh PRE1::Gus转基因拟南芥,证明Gh PRE1基因的表达受到BR信号诱导。在拟南芥中,过量表达Gh PRE1基因植株各组织均表现显着的增长趋势,结合扫描电镜观察发现过量表达Gh PRE1基因的拟南芥下胚轴伸长源自Gh PRE1基因对细胞的伸长生长的促进作用。病毒诱导Gh PRE1基因沉默（VIGS）试验发现沉默Gh PRE1基因促使棉花株高及各组织显着缩小,并且同时沉默PRE-a亚群多个同源基因植株矮化效果更加明显,证明Gh PRE1基因具有促进棉花组织生长作用,并且PRE-a亚群基因间存在功能冗余性。另一方面,沉默Gh PRE1基因植株促进叶片和茎节数量显着增加,表明Gh PRE1基因在调控细胞伸长生长的同时可能对细胞分裂和组织分化存在抑制效果。GhPRE1转录因子缺失典型b HLH（Basic helix-loop-helix）转录因子的DNA结合域,因此需要借助与其他转录因子结合形成二聚体结构来实现转录调控功能。通过酵母双杂交筛库获得与Gh PRE1蛋白互作的ERF转录因子Gh＿A12G0216和Gh＿D02G2086。进化分析发现Gh＿A12G0216和Gh＿D02G2086及其亲缘关系最近Gh ERF转录因子同属于B4和B2亚群,包含41个家族成员。从其成员各分支中选择4个基因（Gh＿D12G1915、Gh＿A12G1761、Gh＿A10G0471和Gh＿D12G0658）,并通过酵母双杂交试验和双分子荧光互补试验证明其编码蛋白均与Gh PRE1蛋白存在互作关系。加权共表达网络分析发现41个Gh ERF转录因子与Gh PRE1（Gh＿A09G0192、Gh＿D09G0182）基因存在表达关联关系,并且在共表达网络中与Gh PRE1基因存在相同和相反两个方向的共表达基因,说明Gh PRE1基因与41个Gh ERF转录因子成员的互作可能存在促进和抑制两种互作模式。选择酵母双杂交互作效果明显且与Gh PRE1基因具有相同和相反两个方向共表达基因的Gh ERF基因（Gh＿D02G2086和Gh＿A12G1761）构建过表达转基因拟南芥。表型观察发现过表达Gh＿D02G2086基因拟南芥显着增加莲座叶和分枝数量。过表达Gh＿A12G1761基因拟南芥植株却表现株高显着增加,茎秆增粗,茎部切片发现过表达Gh＿A12G1761基因拟南芥细胞有变小的趋势,说明转基因拟南芥茎部变粗源自细胞数量的增加。两种转基因材料不同的表型变化预示与Gh PRE1具有相同和相反共表达基因的Gh ERF转录因子对植株的生长调控分为细胞增殖和细胞分化两个相反的方向。拟南芥B4亚群中ERF109和ERF114、ERF115转录因子被证明共同参与调控植物磺肽素（Phytosulfokine,PSKs）基因的表达,从而影响拟南芥根部细胞分裂。通过荧光素酶基因瞬时表达检测和VIGS沉默植株的PSKs基因表达检测证明棉花中Gh PRE1蛋白与Gh＿A12G1761（Gh ERF115）转录因子互作并参与调控PSKs基因的表达从而影响细胞分裂。果胶是细胞壁重要组成成分,对植物细胞的生长和分裂发挥重要作用。Gh PRE1基因沉默棉花植株中果胶含量显着上调。在Gh PRE1和其互作的Gh ERF转录因子相反共表达基因中包含多个与果胶合成相关的半乳糖醛酸转移酶Gh GATL基因。过表达Gh GATL基因拟南芥和沉默Gh GATL基因棉花的株型观察和果胶检测试验证明Gh GATL基因可以通过增加果胶含量,促进植株的生长。同时,过表达Gh GATL基因拟南芥植株茎粗显着增加,而切片观察发现茎内细胞存在缩小趋势。结合Gh GATL基因启动区包含大量的ERF转录因子结合位点,证明Gh GATL基因可能是Gh PRE1蛋白与Gh ERF转录因子互作对细胞分裂调控的关键下游基因。
张奇艳[8]（2020）在《陆地棉扩展蛋白基因家族特征分析与功能验证》文中研究表明棉花作为重要的经济作物,为纺织业提供了重要的原材料。目前,人们的生活质量和纺织水平日渐提高,故而对棉纤维品质的要求日益严苛。棉纤维作为研究细胞伸长及细胞壁结构的重要模型,是由胚珠外表皮细胞发育而来的单细胞表皮毛,具有高度伸长、无分支且增厚的特点。扩展蛋白是一种细胞壁相关蛋白,对纤维细胞的起始、伸长具有积极的促进作用;除此之外,细胞壁的特性对成熟棉纤维品质的好坏起关键作用。本研究主要通过生物信息学鉴定陆地棉Expansin基因家族并分析其进化特征,利用转录组测序（RNA-seq）数据研究其表达的时空特征,并利用qRT-PCR对表达谱进行验证。基于表达谱数据,选择四个基因进行克隆和功能验证:在拟南芥中进行Expansin基因的过表达,在棉花中进行VIGS（基因沉默）,最后通过农杆菌菌液浸种将过表达载体转移到棉花中。主要结果如下:1、根据拟南芥和水稻扩展蛋白的氨基酸序列（作为query）,进行BLAST比对,在陆地棉中共鉴定出98个扩展蛋白基因家族成员,其中71个属于EXPA亚家族,8个属于EXPB亚家族,6个属于EXLA亚家族,13个属于EXLB亚家族。陆地棉的大部分染色体上均有3-5个Expansin基因,且部分基因出现串联重复（tandem duplication）的现象。2、同线性分析显示,大多数Expansin基因位于同线性染色体区段内,表明扩展蛋白家族的扩张（多达98个）主要是由于进化过程中染色体片段重复（segmental duplications）造成的,因而亚基因组内Expansin基因之间存在一定的平行同源关系（paralogous）;AA与DD两个物种的杂交加倍进化形成At At Dt Dt的陆地棉后,促进了Expansin基因成员数的加倍（尽管少数基因发生了丢失）。系统发育树中,末端分支由二倍体棉与四倍体陆地棉的4个基因构成,表明四倍体陆地棉的两个亚基因组（At与Dt）与二倍体棉基因组（A与D）的Expansin成员的氨基酸序列的进化关系较近;同线性分析、基因结构分析和模体结构分析进一步确认了其进化关系。3、陆地棉98个扩展蛋白的基酸序列长度平均为248个aa,分子量平均为27.00 k D,等电点平均为8.48（大部分属于偏碱性蛋白）。Expansin蛋白不稳定指数在20.03-46.80之间,大部分蛋白稳定性好;脂溶指数平均为70.83,总平均疏水性（GRAVY）在-0.392-0.140之间,属于两性蛋白。72个扩展蛋白中有长度不等的信号肽,均定位于细胞外,Expansin基因具有一定的密码子偏好性。4、RNA-seq数据显示,Expansin基因具有各自特异的时空表达模式。具有部分同源关系的基因对（homeologous gene-pair）,其表达模式也不尽相同,表明多倍化后的进化过程中家族成员间基因功能的异化（多样化）与互补。通过实时荧光定量PCR对RNA-seq数据进行了验证,结果表明两种方法的表达谱数据,吻合度较高;各扩展蛋白基因在不同的时空条件下表达丰度各异,各司其职。5、基于RNA-seq和qRT-PCR的表达谱数据,选择Gh EXLA3A、Gh EXPA03A、Gh EXPA24D和Gh EXPA27D四个基因进行克隆,通过“花絮浸染法”转化拟南芥。结果表明,过表达基因Gh EXPA27D会促进拟南芥的根系发育,提前抽薹,分支数增多,果荚数及种子产量也有所增加。利用VIGS基因沉默技术对棉花植株进行基因Gh EXLA3A表达的干扰,结果显示,两周后的幼苗根系及植株较小（和对照相比）;对被VIGS处理的植株进行qRT-PCR,发现Gh EXLA3A基因的表达量变化不大。通过农杆菌菌液浸种,将基因Gh EXPA27D的过表达载体转移到棉花中,结果显示T0代植株叶片出现部分卷曲,植物瘦小,成熟期棉桃较小。
沈丽[9]（2020）在《基于陆地棉ms1突变体转录组的育性基因挖掘和调控机理研究》文中研究说明棉花是重要的纤维和油料作物,能提供天然纺织纤维材料,丰富蛋白质和油料。棉花具有明显的杂种优势,杂交后代在生长活力、生物量和纤维产量等方面都强于双亲,杂种优势的利用能显着提高棉花产量和纤维品质。目前棉花育种方式主要是通过三系（不育系、恢复系、保持系）配套系统利用杂种优势进行育种。然而在杂种优势利用研究中,棉花育性相关功能基因的研究比较缓慢,育性相关基因功能和分子机理尚不清楚。本文以陆地棉（Gossypium hirsutium L.）雄性不育突变体ms1和陆地棉野生型C312（ms1的背景植株）为硏究对象,对其花药发育早期、中期和晚期三个不同发育时期进行转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）,基于转录组数据,系统挖掘突变体不育性形成的相关差异表达基因。然后应用生物信息学、遗传学和分子生物学等方法,解析棉花雄性不育相关基因的功能和调控机理。具体包括运用q RT-PCR技术对转录组和差异表达极其显着的育性相关基因进行验证,筛选与育性相关的候选基因;利用生物信息学分析候选基因Gh OLE9编码蛋白（Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase）的性质、结构、功能;基于病毒介导遗传转化体系CLCr V载体系统构建病毒干涉载体p CLCr VA-Gh OLE9,利用农杆菌侵染法沉默陆地棉内源Gh OLE9基因,并对转基因干涉株系进行表型分析（花粉活性检测,花药发育组织观察,自花授粉结铃性等）,基因表达分析;同时构建PK7GWIWG2（I）-Gh OLE9干涉载体,通过农杆菌介导侵染棉花下胚轴及胚性愈伤,建立棉花转基因再生体系,获得再生Gh OLE9干涉转基因植株,进行Gh OLE9功能分析和不育材料的创制。主要研究结果如下:（1）对陆地棉野生型C312和雄性不育突变体ms1的花器官表型分析,发现在花药发育早期,花器官形态几乎没有差异;但在花药发育后期,突变体的柱头明显长于野生型,柱头裸露,花药未开裂时就表现出萎缩、干瘪、畸形,花丝短;在开花当天突变体花药干瘪不开裂,无花粉散出。（2）对陆地棉野生型C312和雄性不育突变体ms1不同发育时期花药的转录组进行分析,在发育早期、中期和晚期,分别鉴定了3355,7002,7415个差异表达基因。对差异基因进行GO功能分类和KEGG通路富集,多涉及在碳水化合物代谢,氨基酸代谢、类黄酮代谢、脂肪酸代谢、信号转导等代谢途径。（3）对转录组进行q RT-PCR验证,结果显示q RT-PCR数据与转录组数据相一致,表明转录组数据是可靠的。同时在q RT-PCR和转录组中验证了关于果胶裂解酶和果胶酯酶基因的表达量,发现在雄性不育突变体中均显着下调,推测这些基因的下调表达影响果胶的降解,进而影响花粉发育。（4）对Gh OLE9基因进行生物信息学分析,Gh OLE9基因为405 bp,编码134个氨基酸,在第49位至133位氨基酸序列之间有一个X8结构域,该结构域能识别并结合β-1,3-葡聚糖的碳水化合物,是糖基水解酶家族GH-17的保守结构域。推测编码的蛋白属于糖基水解酶第17家族,是β-1,3-葡聚糖酶,具有水解β-1,3-葡聚糖的功能。前期研究表明β-1,3-葡聚糖酶在花药发育中通过胼胝质代谢途径来调控花粉发育,或是参与花粉萌发过程中花粉壁的重组。因此,我们对Gh OLE9基因在棉花花粉发育中的功能展开研究。（5）对Gh OLE9基因的表达模式进行分析,发现该基因在陆地棉XC20和C312的雄蕊、柱头等生殖器官中特异表达,且在突变体ms1花药中的表达量明显低于C312,推测该基因在棉花花药发育过程中起着重要作用。（6）利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默基因Gh OLE9,发现10株阳性植株,6株Gh OLE9干涉株系开花当天棉花花药干瘪,数量少,不散粉;花粉稀少,畸形无活力,四分体时期小孢子发育异常,胼胝质增厚。利用q RT-PCR技术,对其中4株表型明显且稳定的干涉株系进行检测,发现在干涉株系（开花当天）雄蕊中的表达量显着甚至极显着降低。Gh OLE9干涉株系的其他表型与对照植株相比没有明显差别,Gh OLE9基因沉默并不影响棉花植株除育性外其它的农艺性状。研究结果初步表明:Gh OLE9基因在棉花花药发育过程中发挥重要的作用。（7）构建PK7GWIWG2（I）-Gh OLE9干涉载体,通过农杆菌介导侵染陆地棉YZ1和S1下胚轴及胚性愈伤组织,已获得转基因胚性愈伤组织及植株,正在进行分子生物学鉴定和农艺性状分析。结果表明:陆地棉野生型C312和雄性不育突变体ms1不同时期花药的差异表达基因主要集中在碳水化合物代谢,氨基酸代谢,类黄酮代谢等途径中,表明这些代谢途径参与棉花花药的发育,调控棉花育性。同时发现陆地棉Gh OLE9基因表达量的下调,将导致棉花四分体时期胼胝质增厚,小孢子发育异常,其通过胼胝质代谢来影响植株育性,其具体功能还需进一步深入开展。
徐俊雄[10]（2020）在《棉纤维特异性启动子的克隆和遗传转化研究》文中研究指明研究发现,棉纤维组织中有大量基因活跃的表达,这些基因严格控制着棉纤维的生长发育过程。构建由棉纤维特异启动子驱动色素基因的植物表达载体转化棉花来改变棉纤维颜色,该途径或可培育出彩色棉新品种。因此,该研究首先从棉花中克隆出棉纤维发育特异基因Gh GRPL1（alpha-1,4-glucan-protein synthase UDP-forming 2-like）的启动子并验证了启动子的活性,运用组织培养技术初步建立了棉花“创075”品种的高效遗传转化体系,为该品种的基因功能研究奠定基础。已取得的实验结果如下:1. 棉纤维特异基因Gh GRPL1启动子的克隆、生物信息学分析和活性分析以高产、抗虫的陆地棉荆州主栽品种“创075”为研究材料,提取该品种基因组DNA,通过PCR技术扩增棉纤维特异基因Gh GRPL1启动子片段,经测序显示启动子长为2078 bp;生物信息学分析Gh GRPL1基因启动子包含多个启动子必须的核心元件TATA-box与CAAT-box,含有多个光响应元件（ATC-motif、Box4与G-Box）、3个脱落酸响应元件（ABRE）、1个水杨酸响应元件（TCA-element）、1个生长素响应元件（TGA-element）以及3个与厌氧诱导所必需的的顺式元件（ARE）和少数DRE core、MYB等功能未知元件。构建由启动子5′端缺失片段驱动GUS基因表达的融合载体,通过发根农杆菌ATCC15834侵染棉花叶片获得转基因棉花毛状根,GUS染色结果发现转基因的毛状根均被染上蓝色,说明Gh GRPL1的启动子具有活性。2. 棉花离体再生体系的初步研究为建立由细胞途径发生的棉花再生体系,以11个棉花品种的下胚轴为研究材料,经筛选,在0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT诱导条件下,荆州主栽品种“创075”愈伤组织状态最好,出愈率可达到100%。经分化基础培养基诱导,愈伤组织能分化出米黄色颗粒状的胚性愈伤组织;在分化培养基中添加0.2 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA,胚性愈伤组织能够分化出较为完整的根系。为建立由器官途径发生的棉花再生体系,以7 d龄棉花“创075”茎尖为研究材料,在分化基础培养基中添加0.5 mg/L6-BA能够诱导茎尖芽的发生,芽的诱导率高达96.67%;在1/2MS培养基中添加1.0 mg/L左右的NAA或0.8 mg/L左右的IBA能够诱导茎尖根的发生,根的诱导率在30-40%之间。3. 棉花遗传转化体系的初步建立为建立高效稳定的棉花离体遗传转化体系,以荆州主栽棉花品种“创075”下胚轴为外植体,以含p CAMBIA1300G载体的EHA105菌株为转化菌株,研究不同激素浓度配比,不同抗生素的浓度,农杆菌侵染时间和共培养时间对愈伤组织诱导的影响,筛选出抗性愈伤组织发生的最适培养条件。棉花“创075”下胚轴的遗传转化体系为:侵染液添加100μmol/L AS、菌液OD600为0.6、侵染时间为15 min、共培养48 h。进行棉花下胚轴的筛选剂敏感性实验,结果表明在选择培养基中加入80 mg/L Kana或15 mg/L hyg或8 mg/L PPT均能够抑制愈伤组织的发生。4. 遗传转化棉花材料的获得为获得含转化基因的棉花细胞团,以含p CAMBIA1300G载体的EHA105菌株为转化菌株,在最适遗传转化条件下侵染棉花下胚轴,60个外植体用潮霉素初步筛选出26个阳性愈伤组织,转化率为43.33%;以分别含p CAMBIA1300-p GRPL1-At3GT与p CAMBIA1301-p GRPL1-Gh DFR重组载体的EHA105菌株为转化菌株,在最适遗传转化条件下侵染棉花下胚轴。经潮霉素与草丁膦初步筛选,60个共转化下胚轴中获得5团出愈的愈伤组织,提取基因组DNA进行PCR检测,同时含有目标条带的细胞团有3块,因此获得了3团共转化的细胞团,共转化率为5%。综上,该研究成功分离了棉纤维特异表达基因Gh GRPL1启动子,通过构建GUS融合表达载体验证了该启动子的活性。通过组织培养技术,初步建立了陆地棉“创075”品种的再生体系,同时,建立了较为完善的“创075”棉花品种的遗传转化体系,为“创075”棉花品种的遗传转化研究奠定了基础。
二、Agrobacterium-mediated Transformation and Regeneration by Direct Shoot Organogenesis in Cotton (G. hirsutum)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Agrobacterium-mediated Transformation and Regeneration by Direct Shoot Organogenesis in Cotton (G. hirsutum)（论文提纲范文）
（1）棉花成花素GhFT及受体14-3-3蛋白家族调控开花的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物成花素基因FT的研究进展 |
| 1.1.1 “成花素”的提出和证明 |
| 1.1.2 植物成花素蛋白FT的作用机制 |
| 1.1.2.1 FT互作蛋白的研究 |
| 1.1.2.2 FAC的形成机制及功能 |
| 1.1.3 FT基因的功能 |
| 1.1.3.1 FT基因功能的多样性 |
| 1.1.3.2 FT启动子的研究进展 |
| 1.2 植物14-3-3蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 植物14-3-3蛋白概述 |
| 1.2.2 14-3-3蛋白的功能及机制 |
| 1.2.3 14-3-3蛋白在棉花中的研究 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究进展 |
| 1.3.1 棉花基因组研究 |
| 1.3.2 PEBP基因家族在棉花中的研究进展 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9技术的概述 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9技术在棉花中的应用 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 菌株 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.2.2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) |
| 2.2.3 CTAB法提取植物的DNA |
| 2.2.4 棉花14-3-3(GRF)基因的全基因组查找与生物信息学分析 |
| 2.2.5 陆地棉GRF基因家族的表达分析 |
| 2.2.6 目的基因的扩增与回收 |
| 2.2.7 大肠杆菌DH5α超级感受态的制备与转化 |
| 2.2.8 质粒提取 |
| 2.2.9 农杆菌LB4404和GV3101感受态的制备与转化 |
| 2.2.10 载体的构建 |
| 2.2.11 Y2H实验 |
| 2.2.12 BiFC实验 |
| 2.2.13 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 |
| 2.2.14 Y2H文库的构建与筛选 |
| 2.2.15 转基因拟南芥的筛选与鉴定 |
| 2.2.16 棉花VIGS实验 |
| 2.2.17 农杆菌介导的棉花遗传转化 |
| 第三章 陆地棉成花素基因GhFT调控棉花开花的功能分析 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 棉花FT启动子启动GhFT的表达,可部分互补ft-10晚花突变体的表型 |
| 3.1.2 沉默GhFT导致棉花开花延迟并使株高增加 |
| 3.1.3 利用CRISPR/Cas9技术编辑GhFT基因导致棉花开花延迟并改变株型 |
| 3.1.3.1 基因编辑载体35S:Cas9-GhFT构建成功 |
| 3.1.3.2 棉花的遗传转化及鉴定 |
| 3.1.4 GhFT互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 3.1.4.1 诱饵质粒pGBKT7:GhFT成功构建 |
| 3.1.4.2 诱饵质粒pGBKT7:GhFT的对酵母菌株无毒性 |
| 3.1.4.3 诱饵质粒pGBKT7:GhFT在酵母菌株中无自激活现象 |
| 3.1.4.4 cDNA文库的筛选 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 棉花FT启动子活性随长度而变化 |
| 3.2.2 陆地棉GhFT基因调控棉花的开花时间和株型变化 |
| 3.2.3 陆地棉GhFT互作蛋白种类的多样性 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 棉花14-3-3(GRF)基因家族的鉴定及调控棉花开花的功能分析 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 棉花GRF蛋白的鉴定、特征和染色体定位 |
| 4.1.2 棉花GRF基因家族的氨基酸比对及进化分析 |
| 4.1.3 棉花GRF基因结构及motif分析 |
| 4.1.4 棉花GRF基因的共线性和重复基因分析 |
| 4.1.5 棉花GRF启动子顺式作用元件的预测 |
| 4.1.6 陆地棉GhGRF基因的组织表达多样性 |
| 4.1.7 GhGRF基因家族响应4℃、37℃、盐和PEG6000模拟干旱条件下的胁迫应答 |
| 4.1.8 陆地棉GhGRF3/6/9/14/15蛋白与GhFT和 Gh FD相互作用 |
| 4.1.9 沉默陆地棉GhGRF3/6/9/14/15影响棉花的开花时间 |
| 4.1.10 异位过表达GhGRF3/6/9/14/15基因影响拟南芥开花 |
| 4.1.11 获得Gh GRF15 基因编辑和过表达转基因棉花植株 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 棉花GRF基因家族的功能存在保守性和多样性 |
| 4.2.2 棉花中GhGRF3/6/9/14/15与GhFT和GhFD蛋白形成的多种FAC |
| 4.2.3 通过GhGRF3/6/9/14/15形成的FAC促进或抑制棉花开花 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结论、创新点及展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.1.1 形态抗虫育种 |
| 1.1.2 生化抗虫育种 |
| 1.1.3 分子标记辅助选择抗虫育种 |
| 1.1.4 转外源抗虫基因抗虫育种 |
| 1.1.5 利用RNAi技术沉默昆虫靶标基因抗虫育种 |
| 1.2 盲蝽的危害特点及抗盲蝽研究的必要性 |
| 1.2.1 盲蝽的种类及形态特征 |
| 1.2.2 盲蝽的生活习性以及危害特点 |
| 1.2.3 开展棉花抗盲蝽研究的重要性和必要性 |
| 1.3 RNAi的研究进展及在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.3.1 RNAi现象的发现及定义 |
| 1.3.2 RNAi的作用机理及特点 |
| 1.3.3 RNAi的种类 |
| 1.3.4 昆虫摄取dsRNA的方式 |
| 1.3.5 植物介导的RNAi技术在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.4 FAR基因研究进展 |
| 1.5 LIM基因研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 本研究的目的与意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 植物表达载体 |
| 2.1.3 基因的来源 |
| 2.1.4 供试的昆虫材料 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 棉花遗传转化 |
| 2.2.3 棉花DNA提取与Southern杂交 |
| 2.2.4 棉花RNA提取,表达量分析以及Northern杂交 |
| 2.2.5 盲蝽RNA提取,反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 盲蝽的田间抗虫鉴定 |
| 2.2.7 转基因棉花大田农艺性状评价 |
| 2.2.8 非靶标昆虫的室内抗性鉴定 |
| 2.2.9 绿盲蝽的室内抗性鉴定 |
| 2.2.10 dsAl LIM和 dsGFP处理后绿盲蝽的转录组分析 |
| 第三章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 AsFAR转基因棉花的获得与分子检测 |
| 3.1.2 AsFAR转基因棉花的表达量检测 |
| 3.1.3 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽种群数量的影响 |
| 3.1.4 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 3.1.5 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽的抗性显着增强 |
| 3.1.6 AsFAR转基因棉花对非靶标害虫的影响 |
| 3.1.7 不同世代AsFAR转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗绿盲蝽新种质 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 基因序列分析及载体构建 |
| 4.1.2 AlLIM转基因棉花的获得 |
| 4.1.3 AlLIM转基因棉花的阳性检测及拷贝数分析 |
| 4.1.4 AlLIM转基因棉花的表达量检测 |
| 4.1.5 AlLIM转基因棉花对绿盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 4.1.6 AlLIM转基因棉花的室内饲喂效果检测 |
| 4.1.7 ds Al LIM处理后绿盲蝽转录组分析 |
| 4.1.8 AlLIM转基因棉花的田间抗绿盲蝽效果检测 |
| 4.1.9 不同世代AlLIM转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 4.1.10 AlLIM转基因棉花对非靶标昆虫的影响 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 AlLIM转基因棉花的抗虫性研究 |
| 4.2.2 绿盲蝽AlLIM基因的功能研究 |
| 4.2.3 AlLIM转基因棉花的环境安全性评价 |
| 4.2.4 RNAi转基因作物与Bt转基因作物的叠加是未来抗虫育种发展的新方向 |
| 4.2.5 植物介导的RNAi技术面临的挑战 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录5 棉花RNA提取 |
| 附录6 Northern杂交(地高辛标记法) |
| 附录7 AsFARDNA序列 |
| 附录8 AlLIMDNA序列 |
| 附表 |
| 附表1 本研究所用的引物序列 |
| 已发表和待发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（3）转GNA、ACA、NhaD、HEWL和CP4-EPSPS基因棉花新材料的创制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 转基因棉花的研究现状 |
| 1.2 蚜虫的发展现状 |
| 1.3 抗蚜虫基因的分类 |
| 1.3.1 蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.2 凝集素 |
| 1.3.3 其他抗蚜虫的基因 |
| 1.4 几种重要的凝集素 |
| 1.4.1 雪花莲凝集素 |
| 1.4.2 尾穗苋凝集素 |
| 1.4.3 刀豆凝集素 |
| 1.4.4 半夏凝集素 |
| 1.4.5 大蒜凝集素 |
| 1.5 植物基因工程的前景展望 |
| 1.6 耐盐碱基因的选择 |
| 1.6.1 Na~+/H~+逆向转运蛋白的生物学功能 |
| 1.6.2 Na~+/H~+逆向转运蛋白的应用 |
| 1.7 黄萎病的危害及应对策略 |
| 1.7.1 抗黄萎病基因的选择 |
| 1.7.2 溶菌酶的生物学功能 |
| 1.8 杂草的危害及应对策略 |
| 1.8.1 抗除草剂基因的选择 |
| 1.8.2 抗除草剂基因的应用 |
| 1.9 创新点和立项依据 |
| 1.10 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 转化植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 培养基配制 |
| 2.1.6 相关缓冲液的配制 |
| 2.1.7 相关引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pBI-5g载体的构建 |
| 2.2.2 质粒提取 |
| 2.2.3 pBI-5g质粒转入农杆菌 |
| 2.2.4 菌落PCR反应鉴定阳性单菌落 |
| 2.2.5 棉花转化 |
| 2.2.6 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.7 转基因棉花分子水平的鉴定 |
| 2.2.8 边界序列的测定 |
| 2.2.9 不同启动子间基因表达水平的差异 |
| 2.2.10 转基因棉花的抗虫性分析 |
| 第三章 结果分析 |
| 3.1 转入外源基因生物安全性的评估 |
| 3.1.1 外源基因理化性质及结构预测 |
| 3.1.2 外源基因与毒蛋白的比对分析 |
| 3.1.3 外源基因与抗营养因子的比对分析 |
| 3.1.4 外源基因与过敏原的比对分析 |
| 3.2 pBI-5g植物表达的载体的获得 |
| 3.3 菌落PCR鉴定阳性菌株 |
| 3.4 农杆菌介导法转化棉花 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 蛋白电泳检测抗原质量 |
| 3.5.2 ELISA鉴定抗体的质量 |
| 3.5.3 小鼠抗血清的Western blot检测 |
| 3.6 转基因棉花分子水平的鉴定 |
| 3.6.1 试纸条初筛阳性植株 |
| 3.6.2 PCR检测阳性植株内的基因 |
| 3.6.3 qRT-PCR检测植株基因在RNA水平上的表达 |
| 3.6.4 Western blot检测植株基因外源蛋白质的表达 |
| 3.6.5 转基因植株的ELISA检测 |
| 3.7 外源基因侧翼序列的分析 |
| 3.8 启动子对外源基因表达的影响 |
| 3.8.1 RNA表达水平上的分析 |
| 3.8.2 蛋白质表达水平比对 |
| 3.9 转基因棉花抗蚜实验 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 植物AGO蛋白研究进展 |
| 1.1 植物AGO蛋白的结构研究 |
| 1.2 AGO蛋白参与植物micro RNA(mi RNA)的生物合成 |
| 1.3 植物AGO蛋白的功能研究 |
| 1.3.1 AGO蛋白参与植物生长发育 |
| 1.3.2 AGO蛋白参与植物生物和非生物胁迫 |
| 1.4 AGO蛋白的分类研究 |
| 2 植物体胚发生研究进展 |
| 2.1 植物激素对体胚发育的影响 |
| 2.2 植物体胚发生过程的基因表达调控 |
| 2.3 植物体胚发生过程的转录组学研究 |
| 3 龙眼体胚发生的研究进展 |
| 3.1 龙眼体胚发生与植株再生 |
| 3.2 龙眼体胚发生过程的生理生化研究 |
| 3.3 龙眼体胚发生相关基因的克隆及表达分析 |
| 4 植物DNA甲基化的研究进展 |
| 4.1 DNA甲基化概述及DNA甲基化的维持 |
| 4.2 植物中DNA甲基化的特征及分布 |
| 4.3 RNA介导的DNA甲基化途径 |
| 4.4 植物DNA甲基化的作用 |
| 4.4.1 DNA甲基化在植物胁迫中的作用 |
| 4.4.2 DNA甲基化与植物生长发育的关系 |
| 4.4.3 DNA甲基化对植物体胚发生的影响 |
| 5 植物启动子的研究进展 |
| 5.1 植物启动子克隆技术的研究 |
| 5.2 植物启动子功能分析方法 |
| 6 本研究的意义及主要内容 |
| 6.1 研究意义 |
| 6.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 c DNA的克隆 |
| 第一节 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 龙眼AGO家族成员的鉴定 |
| 1.2.2 龙眼AGO蛋白理化特性分析 |
| 1.2.3 龙眼AGO蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测 |
| 1.2.4 龙眼AGO蛋白二级、三级结构预测 |
| 1.2.5 龙眼AGO基因的染色体定位、蛋白保守基序及基因结构分析 |
| 1.2.6 AGO家族氨基酸序列系统进化树的构建 |
| 1.2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 1.2.8 龙眼AGO蛋白互作预测分析 |
| 1.2.9 调控DlAGOs的 miRNA预测 |
| 1.2.10 DlAGOs在龙眼体胚发生早期的FPKM值分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定 |
| 2.2 龙眼AGO蛋白特性分析 |
| 2.3 DlAGOs蛋白二级、三级结构预测分析 |
| 2.4 DlAGOs蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测分析 |
| 2.5 龙眼AGO基因家族染色体定位及基因结构分析 |
| 2.6 龙眼AGO家族的系统进化树分析 |
| 2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 2.8 DlAGOs蛋白互作网络预测分析 |
| 2.9 调控DlAGOs的 mi RNA预测分析 |
| 2.10 DlAGOs在体胚发生早期的特异表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利用生物信息学推测DlAGOs在龙眼体胚中的可能作用机理 |
| 3.2 AGO蛋白生物学功能多样性的研究 |
| 第二节 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL cDNA全长的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 1.2.2 引物的设计 |
| 1.2.3 cDNA全长序列的扩增 |
| 1.2.4 目的基因PCR扩增产物的回收和测序 |
| 1.2.5 龙眼DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼EC总RNA的提取 |
| 2.2 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 cDNA全长序列的克隆和分析 |
| 2.3 龙眼DlAGOs氨基酸序列及亲缘关系分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼胚性愈伤组织AGO基因克隆的意义 |
| 3.2 龙眼DlAGOs UTR对龙眼体胚发生过程可能起着调控作用 |
| 第三章 龙眼DlAGOs启动子的克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA的提取 |
| 1.2.2 龙眼EC中 DlAGOs启动子的克隆 |
| 1.2.3 DlAGOs启动子的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼DlAGOs启动子序列的克隆 |
| 2.2 龙眼DlAGOs启动子CpG岛的预测 |
| 2.3 龙眼DlAGOs启动子转录起始位点和核心启动子区域的预测 |
| 2.4 龙眼DlAGOs启动子功能元件分析 |
| 2.4.1 龙眼DlAGOs启动子序列含有激素响应元件 |
| 2.4.2 龙眼DlAGOs启动子序列中含有光反应元件 |
| 2.4.3 龙眼DlAGOs启动子含有逆境响应元件 |
| 2.4.4 龙眼DlAGOs启动子含有参与分生组织表达、胚乳表达和昼夜节律调控的响应元件 |
| 2.4.5 龙眼DlAGOs启动子序列含有大量功能未知的特异元件 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼DlAGOs可能参与激素信号转导 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与不同逆境及其它响应调控 |
| 3.3 龙眼DlAGOs启动子“CpG”岛的潜在功能 |
| 第四章 龙眼DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 龙眼材料 |
| 1.1.2 龙眼胚性愈伤组织EC的不同激素处理 |
| 1.1.3 龙眼胚性愈伤组织EC的不同非生物胁迫处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.2 DlAGOs家族实时荧光定量PCR引物的合成及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs家族在龙眼体胚发生早期阶段的表达分析 |
| 2.2 DlAGOs家族在龙眼合子胚发育过程中的表达分析 |
| 2.3 DlAGOs家族在龙眼不同组织部位的特异性表达分析 |
| 2.4 不同激素处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.1 不同浓度2,4-D处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.2 不同浓度KT处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.3 茉莉酸甲酯(Me JA)处理下龙眼DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.4 水杨酸(SA)处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.5 非生物胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.1 不同光质处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.2 不同温度处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.3 盐胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.4 甘露醇处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.5 聚乙二醇-4000 处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.6 脱落酸处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGOs在龙眼体胚与合子胚发育可能发挥相同的作用 |
| 3.2 DlAGOs可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程 |
| 3.3 DlAGOs可能参与龙眼种子、叶片和花器官的发育 |
| 3.4 DlAGOs可能响应多种激素的应答 |
| 3.5 DlAGOs可能参与非生物胁迫应答机制 |
| 第五章 龙眼DlAGOs启动子的功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要载体和试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 龙眼DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 1.3.2 重组质粒转化农杆菌和PCR验证 |
| 1.3.3 DlAGOs启动子瞬时转化本氏烟烟草叶片 |
| 1.3.4 DlAGOs启动子瞬时转化烟草叶片的不同激素处理 |
| 1.3.5 GUS活性检测 |
| 1.3.6 DlAGOs启动子瞬时转化龙眼EC |
| 1.3.7 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 1.3.8 GUS基因相对表达水平的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 2.2 瞬时转化烟草叶片的GUS组织化学染色 |
| 2.3 DlAGOs启动子转化烟草叶片驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 2.4 不同激素处理下转化烟草叶片的GUS活性测定 |
| 2.5 DlAGOs启动子转化龙眼EC驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高等植物启动子的基本结构和作用 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与激素调控 |
| 3.3 龙眼遗传转化体系的研究 |
| 第六章 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 菌种和载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 瞬时表达载体构建引物的设计 |
| 1.4.2 目的片段的克隆 |
| 1.4.3 亚细胞定位表达载体的构建 |
| 1.4.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 1.4.5 农杆菌侵染转化洋葱内表皮细胞 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼AGO蛋白信号肽和亚细胞定位预测分析 |
| 2.2 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 亚细胞定位融合表达载体的构建 |
| 2.3 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 3.1 亚细胞定位的研究进展 |
| 3.2 AGO蛋白在植物细胞中亚细胞定位的研究进展 |
| 第七章 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及DlAGOs表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度5-azac的配置 |
| 1.2.2 材料的处理 |
| 1.2.3 龙眼体胚发生早期阶段的形态观察 |
| 1.2.4 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚发生早期和DlAGOs表达的影响 |
| 2.1.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚生长状态的影响 |
| 2.1.2 5-azac与2,4-D处理对龙眼早期体胚发生的影响 |
| 2.1.3 5-azac与2,4-D处理对DlAGOs表达的影响 |
| 2.2 低浓度5-azac对龙眼体胚发生的影响和DlAGOs的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA甲基化水平对龙眼体胚发生的影响 |
| 3.2 2,4-D与5-azac处理对植物体胚发生的影响 |
| 3.3 龙眼AGO基因可能参与DNA甲基化机制 |
| 第八章 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 总RNA的提取、cDNA文库构建与高通量测序 |
| 1.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 1.3.1 转录组分析 |
| 1.3.2 基因聚类分析 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序数据分析 |
| 2.2 基因表达量水平的分析和差异表达基因的筛选 |
| 2.3 转录因子及植物抗病基因结构域分析 |
| 2.4 差异表达基因的功能富集分析 |
| 2.4.1 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.2 差异表达基因KEGG富集途径分析 |
| 2.5 5-azac处理下丁酸盐代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.6 5-azac处理下硫代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.7 5-azac处理下硒代化合物代谢途径相关基因的差异表达分析 |
| 2.8 5-azac处理下龙眼体胚发生早期差异表达基因的q PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGO4基因在龙眼早期体胚发生的作用 |
| 3.2 DNA甲基化水平降低促进龙眼体胚发生相关基因的表达 |
| 3.3 丁酸盐代谢对植物体胚发育的影响 |
| 3.4 硫代谢对龙眼体胚发生早期的重要作用 |
| 第九章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）棉花GhCIPK6的功能鉴定及其参与调控植物糖稳态的机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 钙信号及其解码 |
| 1.1.1 钙信号产生的基础及特征 |
| 1.1.2 钙感受器与钙信号转导 |
| 1.2 CBL-CIPK研究进展 |
| 1.2.1 CBL-CIPK的由来及互作基础 |
| 1.2.2 CBL-CIPK参与调控植物离子稳态的研究 |
| 1.2.3 CBL-CIPK参与的其它生物学功能 |
| 1.3 植物中的糖转运子研究进展 |
| 1.3.1 单糖转运子参与的植物糖转运 |
| 1.3.2 蔗糖转运子参与的植物糖转运 |
| 1.3.3 SWEET转运子参与的植物糖转运 |
| 1.3.4 糖转运子的调控 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物材料培养条件 |
| 2.2.2 基因家族进化分析及其在叶片中的表达量分析 |
| 2.2.3 载体构建及遗传转化 |
| 2.2.4 转基因植株阳性检测和拷贝数鉴定 |
| 2.2.5 基因表达量检测:RT-PCR,q RT-PCR和 Nothern杂交 |
| 2.2.6 可溶性糖和淀粉含量测定 |
| 2.2.7 磷酸化蛋白质组分析 |
| 2.2.8 转录组分析 |
| 2.2.9 酵母双杂交文库构建及筛选 |
| 2.2.10 病毒诱导的基因沉默实验(VIGS) |
| 2.2.11 荧光素酶互补成像(LCI)分析 |
| 2.2.12 亚细胞定位 |
| 2.2.13 双荧光互补(BiFC)实验 |
| 2.2.14 蛋白原核表达和Pull-down实验 |
| 2.2.15 离子组分析 |
| 2.2.16 植物嫁接 |
| 2.2.17 基因编辑检测 |
| 2.2.18 植物饥饿及葡萄糖胁迫处理 |
| 2.2.19 缺素及不同营养水平处理 |
| 2.2.20 蒸腾及离体失水分析 |
| 2.2.21 水分利用效率分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 陆地棉GhCIPK家族蛋白鉴定及基因表达分析 |
| 3.1.1 GhCIPK家族蛋白鉴定和进化树分析 |
| 3.1.2 GhCIPK家族在叶片中的表达量及GhCIPK6 表达模式分析 |
| 3.2 GhCIPK6 转基因材料分子鉴定 |
| 3.2.1 从多拷贝GhCIPK6 超表达棉花中分离单拷贝植株 |
| 3.2.2 GhCIPK6 转基因超表达及RNAi棉花分子鉴定 |
| 3.2.3 GhCIPK6 敲除突变体阳性检测及突变序列分析 |
| 3.2.4 GhCIPK6 转基因超表达拟南芥阳性检测及表达量分析 |
| 3.3 GhCIPK6 负调控植物生长发育 |
| 3.3.1 GhCIPK6 转基因棉花表型分析 |
| 3.3.2 GhCIPK6 转基因拟南芥表型分析 |
| 3.4 GhCIPK6 正调控植物可溶性糖积累 |
| 3.4.1 GhCIPK6 转基因棉花成株期叶片糖含量分析 |
| 3.4.2 GhCIPK6 转基因棉花不同组织可溶性糖含量分析 |
| 3.4.3 GhCIPK6 促进棉花糖分积累随着植物的发育进程而增加 |
| 3.4.4 GhCIPK6 促进棉花糖分积累依赖GhCIPK6 的表达量 |
| 3.4.5 GhCIPK6 在促进棉花糖分积累中与同源基因存在功能冗余 |
| 3.4.6 GhCIPK6 调控糖分积累在不同物种中具有保守性 |
| 3.4.7 GhCIPK6 不影响糖酵解路径基因的表达 |
| 3.4.8 GhCIPK6 削弱了可溶性糖的长距离运输 |
| 3.5 GhCIPK6 正调控植株对饥饿及高浓度葡萄糖的耐性 |
| 3.6 酵母双杂交筛选GhCIPK6 互作靶标蛋白 |
| 3.6.1 酵母双杂交文库的构建及GhCIPK6 互作蛋白筛选 |
| 3.6.2 酵母双杂交候选互作蛋白VIGS功能验证 |
| 3.6.3 GhCBL家族分析及GhCIPK6-GhCBL点对点酵母双杂交筛选 |
| 3.6.4 VIGS对候选GhCBL进行功能验证 |
| 3.7 GhCBL2 参与了GhCIPK6 介导的可溶性糖积累 |
| 3.7.1 GhCBL2与GhCIPK6 体外互作 |
| 3.7.2 GhCBL2与GhCIPK6 体内互作并招募GhCIPK6 到液泡膜 |
| 3.7.3 GhCBL2超表达棉花阳性检测及表达量分析 |
| 3.7.4 GhCBL2敲除突变体序列分析 |
| 3.7.5 GhCBL2正调控棉花可溶性糖积累 |
| 3.7.6 GhCBL2 突变削弱了GhCIPK6 介导的葡萄糖积累 |
| 3.8 磷酸化蛋白质组学筛选GhCIPK6 潜在下游靶标 |
| 3.8.1 差异磷酸化蛋白分析 |
| 3.8.2 磷酸化候选蛋白VIGS功能验证 |
| 3.9 Gh TST2 参与了GhCIPK6 介导的可溶性糖积累 |
| 3.9.1 GhTST家族分析 |
| 3.9.2 Gh TST2与GhCIPK6 酵母双杂交及Pull-down分析 |
| 3.9.3 Gh TST2与GhCIPK6 Bi FC体内互作实验 |
| 3.9.4 棉花GhTST2超表达植株阳性检测及表达量分析 |
| 3.9.5 棉花GhTST2敲除突变体突变序列分析及表达量检测 |
| 3.9.6 拟南芥AtTST1/2敲除突变体创建及突变序列分析 |
| 3.9.7 GhTST2正调控棉花可溶性糖含量 |
| 3.9.8 Gh TST2 突变削弱了GhCIPK6 介导的棉花可溶性糖积累 |
| 3.9.9 At TST1/2 突变阻断了GhCIPK6 在拟南芥中介导的可溶性糖积累 |
| 3.10 GhCIPK6 的其他生物学功能 |
| 3.10.1 GhCIPK6 负调控植株矿质营养的含量 |
| 3.10.2 超表达GhCIPK6 加速离体条件下叶片失水速率 |
| 3.10.3 超表达GhCIPK6 降低植株蒸腾作用并提高水分利用效率 |
| 3.10.4 矿质元素与植物可溶性糖含量及蒸腾的关系 |
| 3.10.5 GhCIPK6 参与对糖含量和水分利用的调控是独立的 |
| 3.10.6 GhCIPK6 转基因材料转录组分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GhCIPK6 参与调节植物糖稳态 |
| 4.2 GhCIPK6 调控糖稳态的路径存在功能冗余 |
| 4.3 糖在植物生长发育和逆境抗性中的作用 |
| 4.4 CIPK6功能多样性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间已发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（6）苎麻纤维细度全基因组关联分析及候选基因筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 苎麻产量与纤维品质性状的研究概述 |
| 1.2.1 我国苎麻的生产现状及存在的问题 |
| 1.2.2 苎麻育种研究进展 |
| 1.2.3 苎麻分子标记的开发 |
| 1.2.4 苎麻QTL作图 |
| 1.3 全基因组关联分析 |
| 1.3.1 连锁不平衡 |
| 1.3.2 全基因组关联分析原理 |
| 1.3.3 全基因组关联分析影响因素 |
| 1.3.4 全基因组关联分析步骤 |
| 1.3.5 全基因组关联分析在苎麻QTLs定位的研究进展 |
| 1.4 苎麻基因工程 |
| 1.4.1 苎麻组培体系研究 |
| 1.4.2 苎麻转基因体系研究进展 |
| 1.5 苎麻纤维细度 |
| 1.5.1 苎麻纤维细度的定义及测定方法 |
| 1.5.2 苎麻韧皮部纤维发育的研究 |
| 1.5.3 苎麻韧皮部纤维发育调控基因的研究 |
| 1.5.4 苎麻纤维细度QTLs定位 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 苎麻SNP标记开发、群体结构及连锁不平衡分析 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 苎麻基因组DNA提取 |
| 2.1.3 测序文库的构建和样品DNA重测序 |
| 2.1.4 重测序数据分析和SNP标记的开发 |
| 2.1.5 系统进化树和群体结构分析 |
| 2.1.6 群体连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)分析 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 测序结果分析 |
| 2.2.2 SNP检测、过滤和统计 |
| 2.2.3 Indel检测、过滤和统计 |
| 2.2.4 亲缘关系评估 |
| 2.2.5 系统进化树 |
| 2.2.6 主成分分析 |
| 2.2.7 群体结构分析 |
| 2.2.8 连锁不平衡分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 苎麻纤维细度全基因组关联分析 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 田间试验设计 |
| 3.1.3 苎麻纤维细度和纤维直径的测定 |
| 3.1.4 表型数据统计与分析及遗传力计算 |
| 3.1.5 GWAS和单倍型分析 |
| 3.1.6 候选基因筛选 |
| 3.1.7 候选基因Marker09783和Marker00009591 功能预测 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 纤维细度与直径表型分析 |
| 3.2.2 苎麻纤维细度和纤维直径全基因组关联分析 |
| 3.2.3 单倍型分析 |
| 3.2.4 纤维细度候选基因分析 |
| 3.2.5 候选基因荧光定量分析 |
| 3.2.6 候选基因Marker09783和Marker0009591 功能预测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 苎麻组培体系及候选基因Marker09783 转基因探索 |
| 4.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 苎麻无菌苗制备 |
| 4.2.2 苎麻叶片组织培养再生植株的研究 |
| 4.2.3 农杆菌介导苎麻叶片愈伤转基因体系的研究 |
| 4.2.4 农杆菌介导苎麻p BI121-Marker09783 载体转化苎麻研究 |
| 4.2.5 转Marker09783 株系q RT-PCR分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 苎麻叶片愈伤体系探索 |
| 4.3.2 农杆菌介导川苎2号苎麻叶片转基因体系探索 |
| 4.3.3 农杆菌介导p BI121-Marker09783 表达载体转化川苎2 号苎麻 |
| 4.3.4 转Marker09783 株系q RT-PCR分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 苎麻韧皮纤维发育特性研究 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）GhPRE1基因在陆地棉株型调控中的功能分析及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花株型 |
| 1.1.1 棉花株型结构研究 |
| 1.1.2 棉花株型调控分子机制研究进展 |
| 1.2 植物激素对株型的影响 |
| 1.2.1 油菜素内酯 |
| 1.2.2 赤霉素 |
| 1.2.3 乙烯 |
| 1.2.4 激素信号互作参与植物株型调控 |
| 1.3 棉花突变体在棉花基因研究中的应用 |
| 1.3.1 功能缺失型突变体 |
| 1.3.2 功能获得型突变体 |
| 1.4 PRE转录因子研究 |
| 1.4.1 bHLH转录因子 |
| 1.4.2 PRE基因研究进展 |
| 1.4.3 PRE基因家族结构特点及作用模式 |
| 1.5 半乳糖醛酸转移酶(GATL)基因 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 GhPRE1基因功能分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料和处理 |
| 2.1.2 FOX-hunting体系筛选棉花BR途径调控基因 |
| 2.1.3 无缝克隆 |
| 2.1.4 过表达GhPRE1基因载体构建及浸花法拟南芥转化 |
| 2.1.5 棉花全基因组PRE基因鉴定及进化分析 |
| 2.1.6 转录组数据分析和GhPRE基因表达图谱构建 |
| 2.1.7 基因表达水平检验 |
| 2.1.8 GhPRE1基因启动子驱动GUS基因载体构建及GUS化学染色 |
| 2.1.9 GUS活性定量检测 |
| 2.1.10 病毒介导GhPRE1基因沉默 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 FOX-hunting系统发掘BR途径植物株型调控基因 |
| 2.2.2 全基因组PRE基因鉴定及进化分析 |
| 2.2.3 陆地棉GhPRE基因表达模式分析 |
| 2.2.4 GhPRE1基因表达分析 |
| 2.2.5 GhPRE1基因功能分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 FOX-hunting系统发掘棉花BR途径调控基因 |
| 2.3.2 GhPRE1基因在各组织优势表达 |
| 2.3.3 GhPRE1基因在生长调控中的复杂作用效果 |
| 第三章 GhPRE1基因作用机制解析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料和处理 |
| 3.1.2 酵母感受态细胞的制备 |
| 3.1.3 酵母感受态转化 |
| 3.1.4 酵母双杂交诱饵载体毒性和自激活检测 |
| 3.1.5 酵母双杂交筛库(Clontech系统) |
| 3.1.6 酵母双杂交点对点互作验证 |
| 3.1.7 双分子荧光互补实验(BIFC) |
| 3.1.8 陆地棉全基因组ERF转录因子鉴定 |
| 3.1.9 棉花转录因子加权基因共表达网络分析 |
| 3.1.10 荧光素酶报告基因瞬时表达检测 |
| 3.1.11 转录组数据分析和GhERF基因表达图谱构建 |
| 3.1.12 浸种法病毒诱导基因沉默 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
| 3.2.2 GhPRE1互作蛋白验证 |
| 3.2.3 陆地棉全基因组GhERF转录因子鉴定及分析 |
| 3.2.4 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子成员互作验证 |
| 3.2.5 陆地棉GhPRE基因与GhERF转录因子共表达网络分析 |
| 3.2.6 乙烯合成前体ACC处理过表达GhPRE1基因拟南芥 |
| 3.2.7 陆地棉GhERF基因表达模式分析 |
| 3.2.8 GhERF基因功能分析 |
| 3.2.9 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作调控PSKs基因验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作并参与共同调控途径 |
| 3.3.2 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作并参与细胞增殖和分化 |
| 3.3.3 GhPRE1蛋白与GhERF转录因子互作参与BR对细胞分裂调控 |
| 第四章 GhPRE1基因下游调控GhGATL基因分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料和处理 |
| 4.1.2 棉花全基因组GATL基因鉴定及进化分析 |
| 4.1.3 陆地棉GhGATL基因染色体定位及线性化分析 |
| 4.1.4 棉花GhGATL基因选择压力分析 |
| 4.1.5 棉花GhGATL基因结构分析和蛋白基序分析 |
| 4.1.6 GhGATL基因转录组数据分析和基因表达图谱构建 |
| 4.1.7 陆地棉基因启动区分析 |
| 4.1.8 石蜡切片和果胶染色 |
| 4.1.9 果胶含量测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 GATL基因的鉴定分析 |
| 4.2.2 GATL基因系统发育树分析 |
| 4.2.3 陆地棉GhGATL基因分布和进化分析 |
| 4.2.4 GhGATL基因结构和基因基序分析 |
| 4.2.5 GhGATL基因在不同组织和不同胁迫下的表达模式分析 |
| 4.2.6 陆地棉GhGATL基因启动区分析 |
| 4.2.7 过表达GhGATL基因拟南芥基因功能分析 |
| 4.2.8 病毒诱导陆地棉GhGATL15基因沉默 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 棉花GhGATL基因家族在进化过程中不断扩大 |
| 4.3.2 棉花GhGATL基因在进化过程中高度保守 |
| 4.3.3 陆地棉GhGATL基因通过控制果胶含量影响植株生长 |
| 4.3.4 陆地棉GhPRE1基因与GhERF转录因子参与GhGATL基因的调控 |
| 第五章 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 A 所用引物序列 |
| 附录 B 棉花PRE基因鉴定 |
| 附录 C 陆地棉GhERF基因的系统发生树 |
| 附录 D Gh_A09G0192与GhERF转录因子相反正共表达基因注释 |
| 附录 E Gh_A09G0192与GhERF转录因子相反负共表达基因注释 |
| 附录 F Gh_D08G0182与GhERF转录因子相反正共表达基因注释 |
| 附录 G Gh_D08G0182与GhERF转录因子相反负共表达基因注释 |
| 附录 H GhPRE1与GhERF转录因子相同共表达基因GO和KEGG富集分析 |
| 附录 I 陆地棉NAU和HAU数据库鉴定GhGATL基因 |
| 附录 J 雷蒙德氏棉和亚洲棉数据库鉴定GATL基因 |
| 附录 K MEME网站预测GhGATL基因基序 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）陆地棉扩展蛋白基因家族特征分析与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花简述 |
| 1.1.1 棉属的分类 |
| 1.1.2 棉花纤维及发育过程 |
| 1.2 扩展蛋白 |
| 1.2.1 扩展蛋白的机制 |
| 1.2.2 扩展蛋白家族成员的进化分析 |
| 1.2.3 扩展蛋白家族成员的功能 |
| 1.3 棉花中扩展蛋白的研究进展 |
| 1.4 本试验的研究目的和意义 |
| 第二章 陆地棉扩展蛋白基因家族分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 材料处理及取样 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 扩展蛋白家族成员的鉴定 |
| 2.2.2 扩展蛋白基因的命名与系统发育分析 |
| 2.2.3 基因家族成员的进化关系与同线性分析 |
| 2.2.4 理化性质、模体结构、信号肽分析与亚细胞定位 |
| 2.2.5 密码子偏好性与基因结构的分析 |
| 2.2.6 基因表达模式分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 扩展蛋白基因家族成员的鉴定 |
| 2.3.2 系统进化树的构建与同线性分析 |
| 2.3.3 理化性质、信号肽、模体结构分析与亚细胞定位 |
| 2.3.4 基因结构与密码子偏好性分析 |
| 2.3.5 RNA-seq数据分析 |
| 2.3.6 RNA的检测 |
| 2.3.7 q RT-PCR表达模式分析 |
| 2.3.8 部分同源基因间的表达丰度 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 扩展蛋白家族成员的鉴定与进化分析 |
| 2.4.2 扩展蛋白家族基因的表达与功能 |
| 第三章 陆地棉Gh EXLA3A、Gh EXPA03A、Gh EXPA24D和 Gh EXPA27D基因的克隆及功能验证 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 Gh EXLA3A、Gh EXPA03A、Gh EXPA24D和 Gh EXPA27D基因的分离 |
| 3.2.2 拟南芥的遗传转化及检测 |
| 3.2.3 基因沉默(VIGS) |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因CDS序列的PCR扩增 |
| 3.3.2 Gateway重组反应 |
| 3.3.3 拟南芥的转化及筛选 |
| 3.3.4 转基因拟南芥的表型鉴定 |
| 3.3.5 基因沉默 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 农杆菌浸种的遗传转化 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 种子预处理 |
| 4.2.2 农杆菌菌液准备 |
| 4.2.3 农杆菌菌液浸种 |
| 4.2.4 转基因棉花的鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转基因棉花的性状 |
| 4.3.2 转基因棉花的PCR检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 附录 |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于陆地棉ms1突变体转录组的育性基因挖掘和调控机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物雄性不育概念 |
| 1.1.1 棉花细胞质雄性不育研究 |
| 1.1.2 棉花细胞核雄性不育研究 |
| 1.1.3 棉花生态敏感型雄性不育研究 |
| 1.2 植物花药发育 |
| 1.2.1 花药构成 |
| 1.2.2 花药发育过程 |
| 1.2.3 花粉壁发育 |
| 1.2.4 花药开裂 |
| 1.3 植物β-1,3-葡聚糖酶 |
| 1.3.1 β-1,3-葡聚糖酶的分类 |
| 1.3.2 β-1,3-葡聚糖酶基因功能研究 |
| 1.4 转录组学在植物雄性不育上的应用 |
| 1.5 实验方案设计 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 实验技术路线 |
| 第二章 陆地棉雄性不育突变体ms1花器官表型分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 花药观察 |
| 2.3.2 花粉观察 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 陆地棉雄性不育突变体ms1转录组分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 测序建库 |
| 3.2.2 基因表达分析 |
| 3.2.3 差异基因生物信息学分析 |
| 3.2.4 筛选qRT-PCR基因及引物设计 |
| 3.2.5 RNA的提取及qRT-PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 差异基因表达分析 |
| 3.3.2 不同时期差异基因分析 |
| 3.3.3 差异基因功能富集分析 |
| 3.3.4 qRT-PCR分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 GhOLE9基因的克隆与功能分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验中用到的载体 |
| 4.1.2 CTAB提取液的配制 |
| 4.1.3 培养基的配制 |
| 4.1.4 抗生素的配制 |
| 4.1.5 农杆菌侵染液的配制 |
| 4.1.6 染色液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 生物信息学分析 |
| 4.2.2 目的基因克隆及VIGS载体的构建 |
| 4.2.3 农杆菌介导的遗传转化----注射侵染棉花子叶 |
| 4.2.4 CTAB法提取DNA |
| 4.2.5 四分体时期花药染色观察 |
| 4.2.6 RNA提取及qRT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 GhOLE9基因保守性分析 |
| 4.3.2 GhOLE9蛋白生物信息学分析 |
| 4.3.3 GhOLE9蛋白同源分析 |
| 4.3.4 GhOLE9基因组织特异性分析 |
| 4.3.5 GhOLE9基因干涉株系鉴定 |
| 4.3.6 GhOLE9基因干涉株表型 |
| 4.3.7 干涉株基因表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 农杆菌介导GhOLE9遗传转化及转基因植株再生体系建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 母液的配制 |
| 5.1.3 培养基的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 胚性愈伤的培养 |
| 5.2.2 RNAi载体的构建 |
| 5.2.3 棉花胚性愈伤遗传转化 |
| 5.2.4 CTAB法提取DNA |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 YZ1和S1植株再生培养 |
| 5.3.2 转基因植株再生培养及鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）棉纤维特异性启动子的克隆和遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 棉纤维启动子的研究进展 |
| 1.3 棉纤维发育基因的研究进展 |
| 1.3.1 转录因子基因 |
| 1.3.2 棉纤维伸长基因 |
| 1.3.3 激素合成与代谢基因 |
| 1.4 棉花的遗传转化研究 |
| 1.4.1 器官发生途径的植株再生 |
| 1.4.2 体细胞胚胎发生途径 |
| 1.4.3 棉花的遗传转化研究 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 棉纤维特异性启动子的克隆和分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 主要药品与试剂 |
| 2.1.4 主要溶液和培养基配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 棉花GhGRPL1 基因启动子的克隆 |
| 2.2.2 棉花GhGRPL1 基因启动子的序列分析 |
| 2.2.3 棉花GhGRPL1 基因启动子GUS融合表达载体的构建 |
| 2.2.4 棉花GhGRPL1 基因启动子的活性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 棉花GhGRPL1 基因启动子的克隆 |
| 2.3.2 棉花GhGRPL1 基因启动子的序列分析 |
| 2.3.3 棉花GhGRPL1 基因启动子GUS融合表达载体的鉴定 |
| 2.3.4 棉花GhGRPL1 基因启动子的活性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 棉花GhGRPL1 基因启动子的分离 |
| 2.4.2 棉花GhGRPL1 基因启动子的活性鉴定 |
| 本章小结 |
| 第3章 棉花品种“创075”再生体系的建立 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 主要药品与试剂 |
| 3.1.3 主要溶液和培养基配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 棉花无菌苗的培养 |
| 3.2.2 不同棉花品种的愈伤组织诱导 |
| 3.2.3 不同激素诱导棉花“创075”愈伤组织的分化 |
| 3.2.4 6-BA对棉花“创075”茎尖丛生芽的诱导 |
| 3.2.5 IBA/NAA对棉花“创075”丛生芽根的诱导 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同消毒方式对棉花无菌苗生长的影响 |
| 3.3.2 不同棉花品种对愈伤组织诱导率的影响 |
| 3.3.3 不同激素处理对愈伤组织分化的影响 |
| 3.3.4 6-BA对茎尖丛生芽诱导率的影响 |
| 3.3.5 IBA/NAA对茎尖生根率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 细胞发生途径的棉花再生体系建立 |
| 3.4.2 茎尖发生途径的棉花再生体系的建立 |
| 本章小结 |
| 第4章 棉花品种“创075”遗传转化体系的建立 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 主要药品与试剂 |
| 4.1.3 质粒载体及菌株 |
| 4.1.4 主要溶液和培养基配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 棉花种子消毒灭菌和预处理 |
| 4.2.2 筛选剂选择压的确定 |
| 4.2.3 农杆菌侵染棉花下胚轴过程 |
| 4.2.4 遗传转化过程中乙酰丁香酮合适浓度的确定 |
| 4.2.5 农杆菌菌液浓度的确定 |
| 4.2.6 遗传转化最适侵染时间的确定 |
| 4.2.7 遗传转化共培养时间的确定 |
| 4.2.8 双载体的共转化过程 |
| 4.2.9 转基因愈伤组织的鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 愈伤组织对筛选剂的敏感性试验 |
| 4.3.2 乙酰丁香酮对遗传转化的影响 |
| 4.3.3 农杆菌菌液浓度对遗传转化的影响 |
| 4.3.4 农杆菌侵染时间对遗传转化的影响 |
| 4.3.5 共培养时间对遗传转化的影响 |
| 4.3.6 转基因愈伤组织的分子鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
四、Agrobacterium-mediated Transformation and Regeneration by Direct Shoot Organogenesis in Cotton (G. hirsutum)（论文参考文献）
- [1]棉花成花素GhFT及受体14-3-3蛋白家族调控开花的功能研究[D]. 桑娜. 石河子大学, 2021(01)
- [2]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质[D]. 梁思佳. 华中农业大学, 2020(01)
- [3]转GNA、ACA、NhaD、HEWL和CP4-EPSPS基因棉花新材料的创制[D]. 赵亚楠. 中国农业科学院, 2020(01)
- [4]龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析[D]. 陈荣珠. 福建农林大学, 2020
- [5]棉花GhCIPK6的功能鉴定及其参与调控植物糖稳态的机制解析[D]. 邓晋武. 华中农业大学, 2020(01)
- [6]苎麻纤维细度全基因组关联分析及候选基因筛选[D]. 黄坤勇. 中国农业科学院, 2020
- [7]GhPRE1基因在陆地棉株型调控中的功能分析及作用机制研究[D]. 郑雷. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [8]陆地棉扩展蛋白基因家族特征分析与功能验证[D]. 张奇艳. 西北农林科技大学, 2020
- [9]基于陆地棉ms1突变体转录组的育性基因挖掘和调控机理研究[D]. 沈丽. 浙江理工大学, 2020(06)
- [10]棉纤维特异性启动子的克隆和遗传转化研究[D]. 徐俊雄. 长江大学, 2020(02)