一、应加强对干细胞移植治疗心肌梗死的研究(论文文献综述)
李记泉[1](2020)在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中进行了进一步梳理目的:本文以急性心肌缺血(Acute Myocardial Ischemia,AMI)大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只(SPF级,4周龄,体重150-160g),采用7%水合氯醛(5 m L/kg)腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记(CD29、CD73、CD90、CD44、CD45),并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛(5 m L/kg)麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs(2×106个/ml),同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。(1)针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。(2)针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高(P<0.01),而LVEF、LVFS明显降低(P<0.01);与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低(P<0.01),而LVEF、LVFS明显升高(P<0.01);与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异(P>0.05);与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低(P<0.01),而LVEF、LVFS明显升高(P<0.01)。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高(P<0.01),缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低(P<0.01);与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低(P<0.01);与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组(P<0.01)。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高(P<0.01);与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P<0.01);与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P<0.01或P<0.05);与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P<0.01)。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低(P<0.01);与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P<0.01);与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化(P>0.05),针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P<0.01);与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P<0.01)。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高(P<0.01);与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低(P<0.01);针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组(P<0.01)。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低(P<0.01);与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P<0.01);与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化(P>0.05),针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P<0.01);与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P<0.01)。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P<0.01);与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P<0.01);与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P<0.01);与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P<0.01)。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。
张妮[2](2019)在《降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究》文中提出目的:骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)移植治疗心肌梗死被认为是一种有效的治疗方法,然而炎性微环境导致移植的BM-MSCs生存率和分化率低,限制了其疗效,提高BM-MSCs的生存率和分化能力以提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效十分重要。Latifolin是从中药降香中分离出来的单体化合物,研究报道表明latifolin具有抗炎作用,前期研究发现latifolin对心肌细胞具有保护作用,可降低心肌组织炎细胞浸润,提高心功能。因此,推测latifolin可通过改善炎性微环境提高BM-MSCs生存率和增强BM-MSCs定向分化能力,进而提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效。本研究探索latifolin对BM-MSCs生存率和心肌定向分化的作用,以达到增强BM-MSCs移植治疗缺血性心脏病目的,为心肌梗死细胞治疗和心肌再生研究奠定基础。研究方法:1.采用全骨髓提取法收集大鼠BM-MSCs,倒置显微镜观察培养细胞形态;采用流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45。2.采用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium,MTT)法和Annexin V-FITC/PI双染法测定缺血、缺氧和炎性微环境对BM-MSCs活力和凋亡的影响;采用RT-PCR和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子表达和分泌影响;MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法测定latifolin对BM-MSCs的活力和凋亡作用;ELISA测定latifolin对BM-MSCs炎性因子的影响。3.将BM-MSCs分为正常组、5氮杂胞苷(5-azacytidine,5Aza)诱导组、5Aza+latifolin诱导组和latifolin诱导组,显微镜下观察BM-MSCs向心肌细胞分化的形态学变化;RT-PCR检测心脏特异性基因转录因子GATA4、NKX2.5和肌细胞增强因子-2C(myocyte enhancer factor2C,MEF2C)的表达;免疫荧光染色检测心脏特异性蛋白α-肌动蛋白(alpha sarcomeric actin,a-actinin)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的表达;透射电镜观察各组骨髓间充质干细胞分化的超微结构。4.(1)体外建立BM-MSCs和H9c2共培养体系,实验分组分别为:H9c2正常组;H9c2模型组;H9c2+MSC共培养组;H9c2+MSC共培养+药物(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)组,对共培养体系进行缺血缺氧和炎症造模处理,经latifolin干预后,采用Annexin V/PI测定H9c2凋亡情况;(2)冠状动脉左前降支结扎建立急性心肌梗死模型,实验共分成9组:假手术组、MI模型组、MSC移植组、MSC移植+latifolin(25,50,100 mg/kg)组、latifolin(25,50,100 mg/kg)组,PowerLab监测冠状动脉左前降支结扎前后心电图ST段变化以评价造模情况;检测给药7d血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB)含量以评价心肌损伤情况;心脏超声评价心功能;TTC染色法测定梗死面积;HE染色评价心肌病理损伤;Masson染色评价心肌胶原纤维化;免疫荧光法检测BM-MSCs生存率和分化情况;免疫组化测定CD68和MPO阳性表达数量;WB检测心肌组织中IL-6、p-NF-κB、β-catenin和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达情况。结果:1.倒置显微镜观察BM-MSCs呈纺锤形,放射性及螺旋生长;流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45表达率分别为:99.8%、99.5%、0.2%、4.7%。2.(1)MTT和Annexin V-FITC/PI检测结果显示,氧糖剥夺6h和12h后细胞活力明显增强,氧糖剥夺24h后细胞活力显着降低,在氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)及内毒素(lipopolysaccharide,LPS)条件下6、12、24h细胞活力显着降低;(2)ELISA和RT-PCR结果显示,氧糖剥夺6、12 h降低上清中白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)水平和细胞中IL-6、IL-10、TNF-α、核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)基因表达;氧糖剥夺+TNF-α及LPS条件6、12 h显着升高上清中IL-6、TNF-α水平和细胞中IL-6、TNF-α、NF-κB基因表达;(3)MTT和Annexin V/PI结果显示,10μg/mL剂量下latifolin显着增加氧糖剥夺+TNF-α条件下BM-MSCs活力,显着降低其凋亡,latifolin显着降低氧糖剥夺+TNF-α条件的BM-MSCs分泌的IL-6、TNF-α水平。3.(1)BM-MSCs在单独用5Aza诱导和latifolin联合5Aza诱导2周后表现出形态上变化,其细胞膨大凸起,在第3周和第4周细胞间出现连接,形成肌管样结构;(2)RT-PCR结果显示,5μg/mL latifolin联合5Aza诱导组显着升高BM-MSCs特异性基因GATA4,NKX2.5和MEF2C表达;(3)免疫荧光染色的结果显示,5Aza诱导组及latifolin联合5Aza诱导组存在明显的心脏特异性蛋白质a-actinin和cTnI的表达;(4)透射电镜结果显示,latifolin联合5Aza诱导组的BM-MSCs分化后细胞质中有明显的心房颗粒、肌丝、丰富的线粒体和粗面内质网。4.(1)latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用:Annexin V/PI测定结果显示,与正常组比,H9c2模型组细胞凋亡比例显着性升高;与模型组比较,H9c2+MSC共培养组、H9c2与MSC共培养+药物(10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL)组均能显着性降低H9c2凋亡比例;与H9c2+MSC共培养组比较,H9c2+MSC+10μg/mL给药组能显着降低H9c2凋亡。(2)latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究:(1)PowerLab检测结果显示,心肌梗死后心电图有ST段明显抬高表现;(2)给药7d后,MSC+latifolin高剂量组显着降低LDH含量,显着降低CK-MB含量;(3)超声结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着升高左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(Left ventricular shortening fraction,LVFS)和心输出量(Cardiac output,CO),显着提高心功能;(4)TTC染色结果显示,模型组梗死面积达到39%,单独MSC组及MSC与latifolin联合组均能显着性降低梗死面积;(5)HE染色结果显示,MSC+latifolin高剂量组明显改善梗死周边炎症细胞浸润和肌丝溶解情况;(6)Masson染色结果显示,MI造模后梗死区呈大面积蓝色染色,胶原纤维化明显,MSC+latifolin中、高剂量组显着减少心肌胶原纤维化面积;(7)免疫荧光检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着增加BM-MSCs在心肌组织中的生存率和分化率;(8)免疫组化测定结果显示,MSC移植组+latifolin低、中、高剂量组和latifolin低、中、高剂量组均能显着降低CD68阳性表达数量,对MPO阳性表达数量无显着影响;(9)WB检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着降低心肌组织中IL-6、p-NF-κB和HIF-1α蛋白表达,显着升高β-catenin蛋白表达。结论:采用全骨髓提取法获得的细胞为纯度较高的BM-MSCs,降香新黄酮latifolin通过改变炎症微环境显着提高BM-MSCs生存率,latifolin显着促进BM-MSCs向心肌细胞分化,latifolin显着促进BM-MSCs修复受损心肌细胞;经动物实验证实,latifolin通过降低炎性巨噬细胞浸润改善心肌组织中炎性微环境,显着提高在体BM-MSCs移植生存率和心肌细胞分化率,使受损心肌组织明显得到修复,latifolin有效增强BM-MSCs移植治疗心肌梗死效果,其作用机制可能与HIF-1α/NF-κB/β-catenin通路有关。
尤云颖[3](2019)在《5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化》文中指出目的:本实验体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并用5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,为骨髓间充质干细胞移植治疗心肌纤维化提供良好的种子细胞。方法:(1)通过全骨髓贴壁培养法从wistar大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,在37℃5%CO2培养箱内培养,当贴壁细胞接近大部分融合时反复传代扩增,在倒置显微镜下观察细胞情况,通过MTT法检测第2代骨髓间充质干细胞的吸光度值并绘制生长曲线,同时通过流式细胞仪测定第3代细胞表面CD29和CD45的表达。(2)取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞使用不同浓度的5-氮胞苷(对照组、5umol/l、10umol/l、15umol/l)诱导24h后换液,在CO2培养箱内培养,倒置显微镜下观察细胞形态变化,在第28天行免疫细胞化学染色检测肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白-43(CX-43)、ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)的表达。结果:1.在倒置显微镜下观察原代细胞呈多边形,有集落生长的趋势,约7-10天长满至80%-90%。传代细胞逐代伸展呈长梭形,排列具有方向性,呈漩涡状生长,约4-5天传代一次。2.通过MTT法绘制第2代骨髓间充质干细胞生长曲线发现,细胞在第3-5天增殖速度最快,第6天开始生长趋于平缓甚至有下降趋势,因此最佳传代时间为第4-5天。3.流式细胞仪检测示:第3代骨髓间充质干细胞表面CD29阳性率为99.4%,CD45阳性率为1.4%,表明实验用的第三代骨髓间充质干细胞是纯化的细胞。4.在倒置显微镜及HE染色下观察,对照组细胞形态呈细长梭形,排列具有极性。诱导组在7天开始部分细胞体积变大、形态各异,呈不规则形、三角形、长梭形等,且细胞极性消失,排列不规则;部分细胞伸出粗大突起,彼此融合。5.第28天不同浓度5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞通过细胞免疫化学法鉴定胞浆内肌钙蛋白T(cTnT)的阳性表达率分别为13.66±3.21%、44.33±4.04%、32.33±1.15%(P≤0.01),连接蛋白-43(CX-43)的阳性表达率分别为6.00±2.00%、31.00±4.00%、11.00±1.73%(P≤0.05),ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)的阳性表达率分别为13.00±4.35%、43.00±4.00%、26.33±1.53%(P≤0.01),均显着高于对照组。结论:1.全骨髓培养法是一种简单、快速、高效的体外获得纯度较高的骨髓间充质干细胞培养方法。2.10umol/l的5-氮胞苷可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,诱导后阳性表达率最高。
具星爱[4](2018)在《梓醇促进骨髓间充质干细胞的存活和VEGF分泌、以及在心肌梗死大鼠的心肌修复中的作用》文中研究表明目的:骨髓间充质干细胞移植被认为是一种安全有效的缺血性心脏病的治疗方法。越来越多的证据显示BMSCs移植对心肌梗死有疗效。但缺血、缺氧、炎症等导致移植细胞的存活率低,从而限制了其疗效。因此,促进骨髓间充质干细胞的增殖和存活对于提高骨髓间充质干细胞移植疗效具有重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管生成因子,促进血管内皮细胞的增殖、迁移和存活。有研究表明,VEGF在心肌梗死后可增加血流,改善心功能。而且,VEGF在心肌梗死后BMSCs移植中也起着关键作用。因此,调节VEGF的分泌可能会影响BMSCs移植的疗效。梓醇(Catalpol)是从中药地黄中分离出来的一种活性化合物,据报道具有广泛的生物学活性,包括降血糖、神经保护、抗衰老、抗肿瘤作用。此外,之前的一项研究表明梓醇可促进大鼠脑卒中模型中VEGF介导的血管生成。研究还表明,梓醇能促进多种细胞的存活和抑制细胞凋亡。根据上述背景,我们推测梓醇在心肌梗死中可能提高BMSCs的生存和VEGF的分泌、提高移植疗效。在这项研究中,我们探索梓醇能否保护BMSCs对抗缺氧缺血性损伤,以及移植到心肌梗死大鼠后,是否促进心肌梗死大鼠的疗效。研究方法:1、BMSCs的分离培养和鉴定从4周大的Wistar大鼠的胫骨和股骨中分离出BMSCs。培养至P3代后,分别与CD44、CD90、CD45、CD34抗体孵育,流式细胞仪鉴定。2、梓醇预处理氧糖剥夺(OGD)条件下的BMSCsBMSCs与不同浓度12.25μg/毫升(L),24.5μg/毫升(M),或49μg/毫升(H))的梓醇预处理24小时。之后,将BMSCs氧糖剥夺12小时。氧糖剥夺条件:在不含血清,葡萄糖及丙酮酸钠的DMEM/F12培养基中培养于95%N2和5%CO2气体条件下。正常对照组细胞在完整的DMEM/F12中正常条件下培养。3、CCK-8检测CCK-8检测梓醇对氧糖剥夺的BMSCs的存活的影响。按实验分组将细胞接种于96孔培养板中。之后进行24小时梓醇预处理和12小时氧糖剥夺培养,每孔10μl CCK-8,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h,在酶标仪上测定其在450 nm处OD值,进行数据分析。4、膜联蛋白V/PI测定细胞凋亡采用膜联蛋白V/PI试剂盒测定细胞凋亡。不同分组(BMSCs、BMSCs+OGD、BMSCs+OGD+梓醇低组、BMSCs+OGD+梓醇中组、BMSCs+OGD+梓醇高组)的细胞,按细胞凋亡检测试剂盒说明书要求,加入5μl膜联蛋白V-FITC和加入10μl Propidium Iodide混匀,室温避光温育15 min,随即进行流式检测。5、ELISA检测根据大鼠血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒说明书,对BMSCs上清液中VEGF、或大鼠心肌中的VEGF水平进行评估。6、免疫印迹分析测定在4℃下用含有1%PMSF的RIPA裂解BMSCs和心肌组织。首先测定蛋白浓度,之后SDG-PAGE电泳中加入提取的蛋白样品,然后转印至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭后,对应的膜分别与一抗VEGF-A抗体、HIF-1α抗体、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3抗体、在4℃孵育1夜。孵育一抗后的PVDF膜用二抗羊抗兔IgG-HRP在37℃孵育45分钟,用BeyoECL Plus底物发光。用凝胶图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer)分析条带的密度。7、动物实验200g220g健康雄性Wistar大鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。随机分为4组(每组12只):Sham组、心梗组、心梗+BMSCs组、心梗+BMSCs+梓醇组。移植组在心肌梗死周围区域注射BMSCs(加上或不加49μg/ml梓醇预处理24小时)细胞,心梗组注射相等量的培养基。造模4周后,将大鼠安乐死,取心肌组织,用于后续实验的检测。8、移植后的BMSCs活性检测为了检测BMSCs在体内的活性,移植细胞前,按照试剂盒步骤PKH26细胞标记。收集到的心脏组织在移植后4周切成5μm薄片,细胞核予以DAPI染色。然后用荧光显微镜检测存活的红色荧光的BMSCs。9、心脏超声心动图移植BMSCs4周后,处死大鼠前,麻醉下超声检测心脏功能:包括左室收缩末期内径(LVESD),左室舒张末期内径(LVEDD),计算左室射血分数(LVEF),左室缩短率(LVFS)。10、组织学检查心肌组织切片进行常规的HE和Masson染色,以评估病理改变和心肌纤维化。于光学显微镜下观察染色效果。11、TUNEL为了评估心脏组织的凋亡,我们使用TUNEL法检测细胞凋亡检测试剂盒的步骤进行TUNEL染色。凋亡细胞的细胞核被绿色荧光染色。12、免疫荧光染色按照试剂盒步骤,用免疫荧光染色法检测心脏组织中CD31和Myosin的表达。用DAPI染细胞核后,在荧光显微镜下观察。13、统计学分析:统计分析用GraphPad Prism 5软件处理。采用one-way ANOVA比较总体和组间差异。数据以平均数±标准差表示。P值小于0.05视为有统计学差异。结果:1、BMSCs的鉴定流式细胞术检测BMSCs表面标志物的表达。CD44和CD90阳性的百分比分别为92.1%和75.7%,CD34和CD45阳性细胞分别为1.7%和2.3%,说明成功分离出BMSCs。2、梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外VEGF分泌的影响ELISA检测BMSCs分泌VEGF的情况。氧糖剥夺处理后BMSCs培养液上清中VEGF水平略有升高,但无统计学差异。在氧糖剥夺条件下,梓醇预处理可剂量依赖性地增强BMSCs分泌VEGF。此外,免疫印迹分析评估BMSCs的VEGF-A和HIF-1α蛋白质表达。BMSCs在氧糖剥夺处理后VEGF-A的水平、核的HIF-1α和总HIF-1α上升,梓醇预处理后则显着上调。3、梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外存活和凋亡的影响为了评估梓醇对氧糖剥夺的BMSCs的存活的影响,我们进行了CCK-8检测。氧糖剥夺处理后的BMSCs存活能力明显下降,而梓醇预处理可以有效改善这一点。而且,梓醇对氧糖剥夺的BMSCs的凋亡有明显的抑制作用。为了进一步评价梓醇调控BMSCs的机制,我们采用Western Blot检测对凋亡相关蛋白的表达进行了评估。结果在氧糖剥夺条件下,BMSCs促进抗凋亡蛋白Bcl-2水平下调,促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3水平上调,而梓醇预处理可以显着逆转上述变化。4、梓醇对BMSCs体内移植后存活的影响移植到心脏组织中的存活的BMSCs被标记为PKH26,一种红色荧光染料。结果显示,梓醇预处理明显改善了BMSCs移植后的存活。5、梓醇对BMSCs移植治疗心肌梗死大鼠的疗效HE和Masson染色显示,病理改变和心肌纤维化在心梗组中变化明显。BMSCs移植能有效地减轻心肌梗死所致的病理改变和心肌纤维化,而梓醇预处理可增强BMSCs移植的作用。进一步实验TUNEL和Myosin染色结果表明,心肌梗死导致心梗边界区心肌细胞凋亡增加。然而,BMSCs移植抑制了心肌梗死所致的细胞凋亡,而当使用梓醇预处理BMSCs时,这种抑制作用更为明显。超声心动图检查心脏功能显示,心梗组LVEF、LVFS明显降低。而BMSCs移植可改善LVEF和LVFS,而采用梓醇对BMSCs进行预处理可进一步增强LVEF和LVFS。此外,BMSCs移植抑制了心肌梗死后LVESD和LVEDD的升高。如预期的那样,梓醇预处理BMSCs可以进一步降低LVESD和LVEDD。这些结果表明,梓醇预处理进一步提高了BMSCs在心肌梗死中的疗效。6、梓醇预处理的BMSCs移植心肌梗死大鼠对VEGF分泌的影响CD31在BMSCs移植的缺血心肌细胞中表达明显增强,梓醇预处理后表达更加强。通过Western Blot检测心肌组织中VEGF-A表达,梓醇预处理促进了心肌组织BMSCs移植后VEGF-A的水平。ELISA的结果进一步证明了移植梓醇预处理的BMSCs可以提高VEGF水平。结论:我们的实验表明,梓醇预处理可显着促进BMSCs的存活,增加VEGF的分泌,从而加强心肌梗死大鼠的移植疗效。
李慧娅[5](2017)在《Adropin增强骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制》文中提出背景:通过移植干细胞修复梗死心肌已成为当前的研究热点。但干细胞移植面临种子细胞自身存活能力弱及宿主微环境恶劣的双重困境,导致移植细胞大量死亡,影响疗效,目前尚无同时应对这双重挑战的有效方法。目的:内源性生物活性物质Adropin具有促细胞生存作用。我们前期研究发现,Adropin能减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤。本研究旨在明确Adropin改良宿主心肌受损微环境基础上移植经Adropin预处理的干细胞,即对种子细胞及微环境进行双重调控,是否可以促进移植细胞的存活,从而增强疗效,并探讨其机制。方法:1、采用全骨髓贴壁培养法培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)。体外应用H2O2诱导建立MSCs凋亡损伤模型,分别应用10?25?50ng/ml Adropin预处理MSCs 24h。使用细胞计数法检测细胞活性,流式细胞法检测凋亡率,确定体外Adropin干细胞保护作用的最佳剂量,用于后续体外及在体实验。Western blot检测磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白及抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及BclXL表达,应用PI3K抑制剂LY294002、ERK1/2抑制剂PD98059明确Adropin发挥保护作用的可能分子机制。2、应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)体外标记MSCs。SD大鼠给予持续结扎左主冠状动脉(LCA)建立心肌梗死模型,随机分为4组(n=16):(1)假手术组(Sham组):只穿线不结扎;(2)对照组(MI组);(3)单纯干细胞移植组(MSCs组):心肌缺血10min时于缺血区周围共注射50μl未经Adropin预处理的MSCs(1.0×106cells);(4)Adropin预处理MSCs移植联合Adropin后处理组(Adropin组):心肌缺血10min时经尾静脉注射0.2mg/kg的Adropin,随即于缺血区周围共注射50μl经Adropin预处理(移植前予Adropin预处理24h,终浓度25ng/ml)的MSCs(1.0×106cells)。每组分别8只动物于移植72h、28d行心脏彩超检查及静脉采血2ml后处死。移植72h及28d:免疫组化法检测心肌组织干细胞移植区域存活的BrdU阳性MSCs,超声心动图法检测心功能。移植72h:酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测血清炎症因子白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α,抗炎因子IL-10的表达。移植28d:Masson染色检测心肌纤维化程度;免疫组化法检测血管再生;Western-blot及Real-time PCR法分别检测旁分泌因子碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA表达。结果:1、采用100μmol/L H2O2作用4h成功构建体外MSCs凋亡模型。与10ng/ml组比较,25ng/ml Adropin预处理MSCs 24h,细胞存活数增加,早期细胞凋亡比例显着降低,50ng/ml组未能进一步促进细胞存活。与模型组比较,25ng/ml Adropin预处理24h组MSCs磷酸化Akt(p-Akt)/总Akt(t-Akt)、磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)/总ERKl/2(t-ERKl/2)比值显着升高,Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达增加。LY294002、PD98059分别抑制Adropin引起的Akt及ERK1/2磷酸化,同时均降低Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达。2、Adropin组无论是移植72h还是28d,BrdU阳性细胞数均显着高于单纯干细胞移植组(72h,(100±16)/mm2 vs.(63±14)/mm2,P<0.05;28d,(51±11)/mm2 vs.(17±4)/mm2,P<0.05),存活干细胞数量随时间推移而逐渐减少,与移植72h组相比,移植28d后两组BrdU阳性细胞数均显着减少。移植28d后,与对照组比较,MSCs组、Adropin组心功能显着提高(左室射血分数,35%±5%vs.46%±4%,57%±4%,P<0.05;左室短轴缩短率,14%±4%vs.20%±1%,26%±2%,P<0.05),Adropin组较MSCs组心功能改善更为明显(P<0.05);移植72h,MSCs组、Adropin组降低炎症因子IL-1β、TNF-α表达,增强抗炎因子IL-10表达,Adropin组的有益作用强于MSCs组(P<0.05)。移植28d后,与对照组比较,Adropin组及MSCs组梗死区VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05),新生血管增加[(23±2)/0.06mm2 vs.(50±8)/0.06mm2,(88±10)/0.06mm2,P<0.05],Adropin组VEGF、bFGF mRNA和蛋白表达、新生血管密度显着高于MSCs组(P<0.05);移植28d,Masson染色提示MSCs组及Adropin组心肌纤维化程度较MI组均有不同程度的减轻,尤以Adropin组最为明显。结论:1、Adropin通过激活PI3K/Akt及ERK1/2通路减轻体外培养MSCs凋亡,促进其存活;2、Adropin预处理MSCs移植联合Adropin后处理组可以促进移植干细胞存活,提高心功能,其机制可能与抑制早期炎症反应,促进VEGF、bFGF等旁分泌因子表达及血管新生,减少心肌纤维化相关。
李雅婧[6](2016)在《研究丹参通络解毒汤对急性心肌缺血骨髓干细胞移植大鼠的影响》文中认为目的探讨丹参通络解毒汤对AMI骨髓干细胞移植大鼠TLR4/NF-κB信号通路及下游因子的影响。方法采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法分离、培养BMSCs。经结扎冠状动脉的左前降支(LAD)建立心梗模型。成功后,随机分为SH(假手术组)、AMI组(模型组)、BMSCs组(BMSCs移植组)、DSTLJD组(丹参通络解毒汤组)、DSTLJD+BMSCs组(丹参通络解毒汤+BMSCs移植组),每组10只。BMSCs细胞悬液直接注入梗死区边缘心肌组织;中药或生理盐水经灌胃给予。4周后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、可溶性细胞黏附因子-1(sICAM-1)的含量,苏木素-伊红染色(HE)观察心肌组织形态病理变化,免疫组化法观察心肌核因子-κB(NF-κB)蛋白表达,蛋白印迹法(WestNern Blotting)测定心肌Toll样受体4(TLR4)蛋白的表达水平。结果1.与模型组组比较,BMSCs移植组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+BMSCs移植组大鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1、sICAM-1水平均显着降低,差异具有统计学意义(P<0.05、0.01);其中,丹参通络解毒汤组优于BMSCs移植组,丹参通络解毒汤+BMSCs移植组优于单纯BMSCs移植组、单纯丹参通络解毒汤组,差异具有统计学意义(P<0.05、0.01)。2.与模型组组比较,BMSCs移植组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+BMSCs移植组大鼠心肌损伤程度明显改善,心肌TLR4、NF-κB蛋白表达均显着降低,差异具有统计学意义(P<0.05、0.01);而且,丹参通络解毒汤组优于BMSCs移植组,丹参通络解毒汤+BMSCs移植组优于单纯BMSCs移植组、单纯丹参通络解毒汤组,差异具有统计学意义(P<0.05、0.01)。结论1.丹参通络解毒汤对急性心肌梗死大鼠的保护作用可能与抑制炎症反应有关,其作用机制可能与调节TLR4/NF-κB信号转导通路下游TNF-α、IL-6、sICAM-1以及MCP-1有关;2.丹参通络解毒汤联合骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠的保护作用优于单纯丹参通络解毒汤与单纯干细胞移植,其机制可能与调节TLR4/NF-KB炎症信号有关。
李卫东[7](2015)在《经冠状动脉自体骨髓造血干细胞移植对急性心肌梗死的疗效》文中认为目的研究急性心肌梗死患者采用经冠状动脉自体骨髓造血干细胞移植的临床效果。方法选取2010年9月2013年9月期间收治的急性心肌梗死患者64例,所有患者在心肌梗死后2周行经皮冠状动脉介入治疗。将所有患者随机分为观察组和对照组,各32例。其中,对照组患者使用经皮冠状动脉介入治疗,观察组患者则在对照组治疗基础上外加自体骨髓造血干细胞移植术,比较两组患者的临床治疗效果和不良反应情况。结果术前两组患者左室射血分数无统计学差异(P>0.05),而治疗6个月后随访发现,观察组左室射血分数明显高于对照组患者,组间差异具有统计学意义(P<0.05);对照组患者术中及术后无不良反应发生,而观察组仅1例患者出现轻微心律失常,不良反应发生率为3.13%,两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论经冠状动脉自体骨髓造血干细胞移植术对于治疗急性心肌梗死效果显着,安全性高。
余洪松,凌琳,谢峻,姜宏,施广飞[8](2013)在《丹参注射液对小鼠急性心肌梗死后心脏成体干细胞移植的影响》文中提出目的研究联合应用丹参注射液对心脏成体干细胞移植治疗小鼠急性心肌梗死的影响。方法将30只小鼠随机分为3组,每组10只,分别为丹参注射液高剂量组[5 g/(kg·d)],丹参注射液低剂量组[0.5 g/(kg·d)]和模型对照组。所有小鼠均通过结扎冠状动脉左前降支构建小鼠急性心肌梗死模型,造模成功后立即在梗死周围区域心肌内注射体外培养的小鼠心脏干细胞约2×106个3×106个。在心肌梗死前1周及心肌梗死后1周连续给予丹参注射液灌胃。心肌梗死后1周处死小鼠,对心脏组织进行免疫染色,采用CD31检测微血管密度,Ki67染色检测细胞增殖,Masson染色检测心肌纤维化程度,TUNEL法检测梗死周围区域细胞凋亡,Western blot方法检测小鼠心脏内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)及磷酸化Akt表达情况。结果丹参注射液高剂量组微血管密度及Ki67阳性细胞数较低剂量组及模型对照组显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。丹参注射液高剂量组心肌纤维化程度及心肌梗死周围区域细胞凋亡较低剂量组和模型对照组显着降低,差异有统计学意义(P<0.05)。丹参注射液高剂量组磷酸化Akt蛋白表达水平较其他两组显着升高,各组间差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,丹参注射液高剂量和低剂量组总Akt水平显着升高(P<0.05),但高、低剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论心脏成体干细胞移植联合丹参注射液治疗急性心肌梗死时,可以增加微血管密度及细胞增殖,减少细胞凋亡及纤维化程度,从而提高成体干细胞移植效率。
黎金浓,陈旭征,李美德,廖联明[9](2012)在《国内干细胞移植相关临床研究文献评析》文中提出目的回顾并分析国内有关干细胞移植临床研究方面的文献质量。方法检索2002年至2011年收录于CNKI文献数据库中有关干细胞的临床研究文献,参考2010年版报告随机临床试验的CONSORT声明中对照检查清单上的条目,对检索结果进行分析。结果检索到符合要求的文献55篇,文献质量呈逐年上升趋势;治疗病症由最初的血液病向心脏病等其它疾病延伸,其中治疗心脏病的文献占23.6﹪,研究设计方面,平行试验占49.1﹪,随机试验占21.8﹪,对病人入选标准进行说明的占49.1﹪,有预先设计结局指标的占60﹪,研究病例在30例以上的占50.9﹪,所有研究均没有样本量的预先设定。结论我国干细胞临床研究科研设计及论文撰写质量有待进一步提高,尤其是样本量的预先设定。对纳入及排除标准和干预措施的说明应详细,以做到可重复性,对结果的分析应包括利与弊两方面。
余洪松[10](2013)在《丹参注射液联合心脏干细胞移植治疗对急性心肌梗死小鼠的影响》文中研究说明目的:通过分别对体外、体内小鼠心肌细胞和心脏干细胞的研究,了解丹参注射液联合心脏干细胞移植治疗对小鼠急性心肌梗死的影响。方法:(1)给予小鼠心肌细胞缺氧培养的同时,给予不同剂量丹参注射液干预,并以空白对照,检测Annex in V-PI、Caspase-3、CCK-8,通过Real-Time PCR检测Akt、BAD、FGF的基因表达。(2)体外小鼠心脏干细胞培养,并行Sca-1+鉴定,给予缺氧培养,同时给予不同剂量丹参注射液干预,并以空白对照,检测Caspase-3、CCK-8, Edu检测心脏干细胞DNA的合成。(3)以不同剂量丹参注射液喂养小鼠1周,并以空白对照,检测小鼠血常规和肝肾功能指标;将小鼠心脏组织切片检查,荧光检测Sca-1+细胞数量;Real-Time PCR检测VEGF、IL-6、BAD的基因表达。(4)结扎小鼠冠状动脉前降支制作小鼠急性心肌梗死模型,并在心肌梗死周围区域心肌内注射体外培养的小鼠心脏干细胞,以不同剂量的丹参注射液喂养1周,并以空白对照。取小鼠心脏组织,予CD31检测、Ki-67染色、Masson检测、TUNEL检测,采用Western blot方法检测小鼠心脏内的Akt表达。结果:(1)小鼠心肌细胞缺氧培养后,丹参注射液高剂量组的Annexin Ⅴ-PI与其它两组相比显着性降低;丹参注射液低剂量和高剂量组的Caspase-3与对照组相比显着降低;CCK-8OD值丹参注射液高剂量组最高,对照组最低,各组间有显着性差异;FGF基因表达在丹参注射液高剂量组最高,对照组最低,各组之间均有显着性差异;BAD基因表达在丹参注射液高剂量组最低,对照组最高,各组之间均有显着性差异;丹参注射液高剂量和低剂量组的Akt基因表达与对照组相比显着增高,高、低剂量组之间没有显着性差异。(2)体外小鼠心脏干细胞缺氧培养后,丹参注射液高剂量组Caspase-3的0D值与低剂量组和对照组相比显着下降,低剂量组、对照组之间没有显着性差异;丹参注射液高剂量组的CCK-8OD值与低剂量组和对照组相比显着增高,低剂量组和对照组之间没有显着性差异;丹参注射液高剂量和低剂量组的EdU阳性细胞数与对照组相比显着增高,高、低剂量组之间没有显着性差异。(3)丹参注射液喂养一周的小鼠,各组间的血细胞、肝肾功能无显着性差别;心脏组织中的Sca-1+心脏成体干细胞的数量,以丹参注射液高剂量最多,对照组最少,各组间有显着性差异;VEGF和IL-6的基因表达,均以丹参注射液高剂量组最高,对照组最低,各组间有显着性差异;丹参注射液高剂量组的Bad基因表达与低剂量组和对照组相比显着降低,低剂量组和对照组之间没有显着性差异。(4)对小鼠急性心肌梗死给予心脏干细胞移植,并喂养丹参注射液一周后,反映梗死周围区域新生毛细血管密度的CD31,以丹参注射液高剂量最多,对照组最少,各组间有显着性差异;检测细胞核增殖的Ki67染色丹参注射液高剂量组与对照组和低剂量组相比显着升高,对照组、低剂量组之间没有显着性差异:Masson检测反映的纤维化程度,丹参注射液高剂量组与对照组和低剂量组相比显着减轻,对照组、低剂量组之间没有显着性差异;TUNEL检测显示细胞凋亡,丹参注射液高剂量最少,对照组最多,各组间有显着性差异;磷酸化Akt蛋白表达水平上,以丹参注射液高剂量最多,对照组最少,各组间有显着性差异;总Akt水平上,丹参注射液高剂量和低剂量组与对照组相比显着升高,高、低剂量组之间没有显着性差异。结论:本研究通过体内、体外多层次实验证明丹参注射液可以通过Akt通路,有效提高心肌干细胞移植治疗心肌梗死的效率,促进组织血管新生,抑制细胞凋亡及组织纤维化,最终起到抑制心梗后心室重构,保护心功能的作用。
二、应加强对干细胞移植治疗心肌梗死的研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应加强对干细胞移植治疗心肌梗死的研究(论文提纲范文)
(1)针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略词表 |
前言 |
论文一 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
小结 |
论文二 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
小结 |
结论 |
本研究创新性的自我评价 |
参考文献 |
综述 针刺治疗心肌缺血及相关分子机制研究进展 |
参考文献 |
个人简介 |
在学期间科研成绩 |
致谢 |
(2)降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
中文摘要 |
abstract |
缩略词表 |
引言 |
文献综述 |
第一部分 骨髓间充质干细胞提取、培养和鉴定 |
1 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要试剂 |
1.3 实验仪器与材料 |
2 实验方法 |
2.1 相关溶液的配制 |
2.2 BM-MSCs提取、培养和传代 |
2.3 BM-MSCs鉴定 |
3 实验结果 |
3.1 BM-MSCs形态观察 |
3.2 BM-MSCs表面抗原标志物鉴定 |
4 讨论 |
5 小结 |
第二部分 latifolin通过改变炎性微环境对骨髓间充质干细胞的保护作用 |
1 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 受试药物 |
1.3 主要试剂 |
1.4 实验仪器与材料 |
2 实验方法 |
2.1 相关溶液的配制 |
2.2 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs生存率影响 |
2.3 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs凋亡的影响 |
2.4 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子分泌影响 |
2.5 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性基因表达影响 |
2.6 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs活力的影响 |
2.7 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs凋亡的影响 |
2.8 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs炎性因子分泌影响…. |
2.9 数据处理 |
3 实验结果 |
3.1 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs形态的影响 |
3.2 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs活力的影响 |
3.3 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs凋亡的影响 |
3.4 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎症因子基因表达的影响 |
3.5 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子分泌的影响 |
3.6 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs中 NF-κB的影响 |
3.7 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs活力的影响 |
3.8 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs凋亡影响 |
3.9 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs炎性因子分泌的影响 |
4 讨论 |
5 小结 |
第三部分 latifolin促进骨髓间充质干细胞定向心肌分化作用 |
1 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 受试药物 |
1.3 主要试剂 |
1.4 实验仪器与材料 |
2 实验方法 |
2.1 相关溶液的配制 |
2.2 实验分组和诱导分化 |
2.3 倒置显微镜观察分化细胞形态 |
2.4 RT-PCR测定分化细胞心肌特异性基因表达 |
2.5 免疫荧光法检测分化细胞心肌特异性蛋白表达 |
2.6 透射电镜观察分化细胞结构 |
2.7 数据处理 |
3 实验结果 |
3.1 倒置显微镜观察分化细胞形态 |
3.2 RT-PCR测定分化细胞心肌特异性基因表达 |
3.3 免疫荧光法检测分化细胞心肌特异性蛋白表达 |
3.4 透射电镜观察分化细胞结构 |
4 讨论 |
5 小结 |
第四部分 latifolin促进骨髓间充质干细胞修复受损心肌作用及机制研究 |
1 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 受试细胞 |
1.3 受试药物 |
1.4 主要试剂 |
1.5 实验仪器与材料 |
2 实验方法 |
2.1 相关溶液的配制 |
2.2 latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用 |
2.2.1 H9c2 细胞培养 |
2.2.2 BM-MSCs与 H9c2 细胞共培养体系建立 |
2.2.3 细胞处理和实验分组 |
2.2.4 Annexin V/PI法测定共培养条件下H9c2 细胞凋亡 |
2.3 latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究 |
2.3.1 实验分组和给药 |
2.3.2 BM-MSCs标记 |
2.3.3 心肌梗死模型建立 |
2.3.4 BM-MSCs移植 |
2.3.5 大鼠血清中心肌损伤标志物检测 |
2.3.6 超声心动图评价大鼠心功能 |
2.3.7 TTC染色检测大鼠心脏梗死面积 |
2.3.8 HE染色评价大鼠心肌病理损伤情况 |
2.3.9 Masson染色评价大鼠心肌胶原纤维化情况 |
2.3.10 免疫荧光检测BM-MSCs生存率和心肌分化情况 |
2.3.11 免疫组织化学检测组织中炎性细胞情况 |
2.3.12 WB检测组织中炎症和分化通路相关蛋白表达情况 |
2.4 数据处理 |
3 实验结果 |
3.1 latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用 |
3.1.1 Annexin V/PI法测定共培养条件下H9c2 细胞凋亡 |
3.2 latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究 |
3.2.1 MI心电图监测 |
3.2.2 BM-MSCs标记CM-Dil |
3.2.3 实验大鼠死亡情况 |
3.2.4 大鼠血清中LDH、CK-MB含量 |
3.2.5 超声心动图评价大鼠心功能 |
3.2.6 TTC染色评价大鼠心脏面积 |
3.2.7 HE染色评价心肌损伤和炎性细胞情况 |
3.2.8 Masson染色评价心肌胶原纤维化情况 |
3.2.9 免疫荧光检测BM-MSCs生存率和心肌分化情况 |
3.2.10 免疫组织化学检测组织中炎性细胞情况 |
3.2.11 WB检测组织中炎症和分化通路相关蛋白表达情况 |
4 讨论 |
5 小结 |
结论 |
本研究创新点 |
本研究的不足 |
参考文献 |
附录 |
个人简介 |
(3)5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
缩略表 |
攻读学位期间发表文章情况 |
个人简历 |
致谢 |
(4)梓醇促进骨髓间充质干细胞的存活和VEGF分泌、以及在心肌梗死大鼠的心肌修复中的作用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略语 |
第一部分 梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外存活、凋亡和VEGF分泌的影响 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 主要试剂和仪器 |
2.1.1 主要试剂 |
2.1.2 主要试剂的配制 |
2.1.3 主要仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 原代BMSCs的分离培养和鉴定 |
2.2.2 实验分组以及梓醇预处理氧糖剥夺(OGD)条件下的BMSCs |
2.2.3 CCK-8检测BMSCs活性 |
2.2.4 膜联蛋白V/PI测定BMSCs细胞凋亡 |
2.2.5 ELISA检测BMSCs中VEGF的表达 |
2.2.6 Western blot检测BMSCs中VEGF-A、和HIF-1α 的表达 |
2.2.7 统计学方法 |
3 结果 |
3.1 BMSCc的分离和鉴定 |
3.2 梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外VEGF分泌的影响 |
3.3 梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外存活和凋亡的影响 |
4 讨论 |
5 结论 |
第二部分 梓醇预处理对BMSCs体内移植治疗心肌梗死大鼠的影响 |
1 前言 |
2 材料与方法 |
2.1 主要试剂和仪器 |
2.1.1 主要试剂 |
2.1.2 主要试剂的配制 |
2.1.3 主要仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 心肌梗死大鼠建模、实验分组,以及BMSCs移植 |
2.2.2 心肌梗死大鼠移植细胞后BMSCs存活检测 |
2.2.3 心脏超声心动图检测心肌梗死大鼠的心功能 |
2.2.4 心肌组织HE染色 |
2.2.5 心肌组织Masson染色 |
2.2.6 TUNEL染色检测心肌组织的细胞凋亡 |
2.2.7 免疫荧光染色 |
2.2.8 ELISA检测心肌组织中VEGF表达 |
2.2.9 Western blot检测心肌组织VEGF-A的表达 |
2.2.10 统计学方法 |
3 结果 |
3.1 梓醇对BMSCs体内移植治疗心梗大鼠后存活的影响 |
3.2 梓醇预处理对BMSCs体内移植治疗大鼠心肌梗死的疗效 |
3.3 超声心动图检测心肌梗死大鼠的心功能变化 |
3.4 梓醇预处理对BMSCs移植心肌梗死大鼠VEGF分泌的影响 |
4 讨论 |
5 结论 |
本研究创新性的自我评价 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位论文期间取得的成果 |
致谢 |
个人简历 |
(5)Adropin增强骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
第一部分 Adropin抗大鼠骨髓间充质干细胞凋亡及其机制研究 |
引言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第二部分 Adropin增强骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制 |
引言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
致谢 |
(6)研究丹参通络解毒汤对急性心肌缺血骨髓干细胞移植大鼠的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略词对照表 |
前言 |
第一部分 材料与方法 |
1 实验材料 |
1.1 动物 |
1.2 药物与主要试剂 |
1.3 仪器 |
2 实验方法 |
2.1 BMSCs的提取与培养 |
2.2 细胞计数 |
2.3 BMSCs的传代纯化及细胞悬液配制方法 |
2.4 BMSCs的鉴定 |
2.5 急性心肌梗死模型建立方法 |
2.6 动物死亡情况及原因分析 |
2.7 实验分组及处理 |
2.8 指标检测 |
3 统计学分析 |
第二部分 结果与分析 |
1 大鼠BMSCs体外培养形态特征与鉴定 |
2 丹参通络解毒汤对大鼠血清TNF-α、IL-6 的影响 |
3 丹参通络解毒汤对大鼠血清MCP-1、sICAM-1 的影响 |
4 对心肌组织形态学观察结果 |
5 丹参通络解毒汤对心肌NF-κB蛋白表达的影响 |
6 丹参通络解毒汤对心肌TLR-4 蛋白表达的影响 |
第三部分 讨论 |
1 中医理论研究 |
1.1 中医对急性心肌梗死的认识 |
1.2 丹参通络解毒汤治疗胸痹心痛的理论基础及方解 |
2 现代理论研究 |
2.1 现代医学对急性心肌梗死的治疗方法 |
2.2 TLR4/NF-κB信号通路与急性心肌梗死 |
2.3 BMSCs治疗急性心肌梗死及中医药干预研究进展 |
3 本实验BMSCs移植对AMI大鼠TLR4/NF-κB信号通路及下游因子的影响 |
4 本实验丹参通络解毒汤对AMI大鼠TLR4/NF-κB信号通路及下游因子的影响26 |
5 本实验丹参通络解毒汤对AMI骨髓干细胞移植大鼠TLR4/NF-κB信号通路及下游因子的影响 |
第四部分 结论 |
参考文献 |
致谢 |
附录1 图片 |
附录2 文献综述 中医药调控骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的作用与机制 |
参考文献 |
附录3 攻读硕士学位期间的主要成果 |
(7)经冠状动脉自体骨髓造血干细胞移植对急性心肌梗死的疗效(论文提纲范文)
1 资料与方法 |
1.1 一般资料 |
1.2 方法 |
1.3 观察指标 |
1.4 统计学处理 |
2 结果 |
2.1 手术前后LVEF分数 |
2.2 不良反应 |
3 讨论 |
(8)丹参注射液对小鼠急性心肌梗死后心脏成体干细胞移植的影响(论文提纲范文)
材料与方法 |
1 动物 |
2 药物、试剂与仪器 |
3 分组 |
4 小鼠心脏成体干细胞分离培养 |
5 小鼠心肌梗死模型构建及细胞移植 |
6 观察指标及方法 |
6.1 CD31染色观察毛细血管密度 |
6.2 Ki 67染色观察细胞增殖情况 |
6.3 Masson染色观察梗死周围区域细胞间质纤维化程度 |
6.4 Td T介导的d UTP缺口末端标记技术 |
6.5 Western blot法检测磷酸化Akt以及总Akt蛋白表达 |
7 统计学方法 |
结果 |
1各组毛细血管密度比较(图1,表1) |
2各组心肌梗死周围区域的细胞核增殖情况比较(图2,表1) |
3各组心肌梗死周围区域的组织纤维化程度比较(图3,表1) |
4各组心肌梗死周围区域的细胞凋亡情况比较(图4,表1) |
5各组磷酸化Akt及总Akt蛋白表达比较(图5,表2) |
讨论 |
(9)国内干细胞移植相关临床研究文献评析(论文提纲范文)
资料与方法 |
一、资料的收集与整理?? |
二、纳入和排除标准 |
三、资料的鉴定标准 |
结??果 |
一、国内干细胞临床研究概况: |
二、国内干细胞文献存在的问题: |
讨??论 |
(10)丹参注射液联合心脏干细胞移植治疗对急性心肌梗死小鼠的影响(论文提纲范文)
目录 |
摘要 |
Abstract |
中英文全称及缩写一览表 |
前言 |
参考文献 |
第一部分 丹参注射液对体外缺氧小鼠心肌细胞的影响 |
引言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 丹参注射液对体外缺氧小鼠心脏干细胞的影响 |
引言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 丹参注射液喂养对小鼠,心肌组织旁分泌的影响 |
引言 |
材料和方法 |
实验结果 |
讨论 |
参考文献 |
第四部分 丹参注射液对小鼠急性心肌梗死心脏干细胞移植治疗的影响 |
引言 |
材料和方法 |
实验结果 |
讨论 |
参考文献 |
干细胞治疗急性心肌梗死的策略和中药影响 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
四、应加强对干细胞移植治疗心肌梗死的研究(论文参考文献)
- [1]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [2]降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究[D]. 张妮. 江西中医药大学, 2019(06)
- [3]5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[D]. 尤云颖. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [4]梓醇促进骨髓间充质干细胞的存活和VEGF分泌、以及在心肌梗死大鼠的心肌修复中的作用[D]. 具星爱. 中国医科大学, 2018(03)
- [5]Adropin增强骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制[D]. 李慧娅. 福建医科大学, 2017(07)
- [6]研究丹参通络解毒汤对急性心肌缺血骨髓干细胞移植大鼠的影响[D]. 李雅婧. 湖南中医药大学, 2016(03)
- [7]经冠状动脉自体骨髓造血干细胞移植对急性心肌梗死的疗效[J]. 李卫东. 中国处方药, 2015(08)
- [8]丹参注射液对小鼠急性心肌梗死后心脏成体干细胞移植的影响[J]. 余洪松,凌琳,谢峻,姜宏,施广飞. 中国中西医结合杂志, 2013(11)
- [9]国内干细胞移植相关临床研究文献评析[J]. 黎金浓,陈旭征,李美德,廖联明. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2012(04)
- [10]丹参注射液联合心脏干细胞移植治疗对急性心肌梗死小鼠的影响[D]. 余洪松. 南京中医药大学, 2013(02)