一、猪圆环病毒研究进展（论文文献综述）
吕茂杰[1]（2021）在《猪圆环病毒2型-猪肺炎支原体-副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的研制》文中研究说明本研究开展PCV2杆状病毒载体表达的Cap蛋白抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌4型和5型抗原制备工艺优化,并确定三联灭活疫苗中各种抗原的最小使用量;进一步开展疫苗安全性和有效性评价,并完成与同类相关产品免疫持续期抗体比较研究。确定PCV2 Cap蛋白制备工艺为:Sf9细胞初始密度3.0×106～4.0×106个/m L,MOI=1.0～5.0,27℃,转速35～50r/min,溶氧30～50%,培养96～120小时,Cap蛋白表达最优;使用终浓度为0.1%的BEI 37℃灭活24小时;灭活病毒液经3～6μm滤板澄清,经50KD膜包浓缩3～4倍,再经层析柱纯化,抗原回收率85%以上,纯度90%以上。测定蛋白浓度后用于疫苗制备。确定猪肺炎支原体菌体抗原制备工艺为:接种量为8%～10%;静置培养,37℃培养4～5日,p H值降至6.8左右收获菌液;发酵罐培养,以50r/min、通氧量10%～20%、37℃培养3～4日,p H值降至6.8左右收获菌液;使用终浓度为0.1%的BEI 37℃灭活24小时;灭活菌液经50KD超滤膜包浓缩10倍,再经4℃10000r/min离心60分钟,收集菌泥沉淀,用PBS（0.01mol/L,p H 7.2）恢复至原体积的1/100,超声5分钟。测定蛋白浓度后用于疫苗制备。确定副猪嗜血杆菌4型RPBS0904-11株发酵工艺为:37℃、p H值为7.0、接种比例为1%,控制通气流速和搅拌速度,溶氧20%以上,选择在8、10、12、14小时进行4次5%体积的流加补料,在16小时收获菌液;确定副猪嗜血杆菌5型RPBS0905-3菌株发酵工艺:37℃、p H值为7.0、接种比例1%,控制通气流速和搅拌速度,溶氧20%以上,选择在6、8、10、12小时进行4次5%体积的流加补料,在14小时收获菌液;采用终浓度0.3%甲醛溶液37℃灭活24小时;灭活菌液采用0.1μm中空纤维柱10倍浓缩,再以4℃6000r/min离心20分钟,沉淀菌体用PBS（0.01mol/L,p H 7.2）重悬至适宜浓度后用于疫苗制备。通过对不同抗原含量疫苗的攻毒保护效果评价,确定制苗标准为:Cap蛋白50μg/头份,Mhp抗原100μg/头份,HPS 4型抗原4.0×109CFU/头份和HPS 5型抗原2.0×109CFU/头份。在安全性检验中,免疫猪精神、采食、呼吸、粪便和行为均未见异常,与对照猪无显着差异,体温呈一过性升高反应,未见局部和全身不良反应。在血清抗体监测中,免疫组PCV2 ELISA抗体、Mhp ELISA抗体、HPS 4型和5型MAT抗体全部转阳。在攻毒保护试验中,免疫猪均获得80%以上的保护率或肺炎病变减少率60%以上。与市售相关产品免疫抗体持续期无明显差异。该疫苗为行业首次报道,免疫保护覆盖范围广,可达到一针同时防控三种影响生猪产业的主要疫病,将弥补该产品在国内的空缺。
曹凤阳[2]（2021）在《猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查》文中研究表明猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）是圆环病毒科圆环病毒属的成员,可引起猪繁殖与呼吸道疾病、断奶仔猪综合征、皮炎及肾炎疾病等症状,给我国养猪业带来巨大经济损失。猪圆环病毒目前分为4个类型:PCV1,PCV2,PCV3和PCV4。其中PCV2和PCV3是在我国猪群流行的主要亚型。而且近年来逐渐出现这两种型混合感染的现象,由于猪感染PCV2和PCV3后在临床表观较难鉴别区分,因此建立针对两种型别PCV的鉴别检测方法,开展分子流行病学调查以进一步了解和揭示病毒的演化和致病机制势在必行。为了解山东省猪群中PCV2和PCV3的感染情况,本研究首先建立了能够区分PCV2和PCV3的Taq Man双重荧光定量PCR检测方法。根据Gen Bank中已经登录的PCV2和PCV3基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。利用棋盘法对引物浓度、探针浓度、退火温度等条件进行了优化,确定最佳反应条件与体系;以标准品质粒为模板绘制标准曲线,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了检验。结果表明,本研究所建立的双重荧光定量PCR方法相关系数R2均大于0.99;该方法对PCV1、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒等病原无扩增;该实验方法对于PCV2和PCV3的检测极限分别为102copies/μL和1copy/μL,相较于普通PCR检测更为敏感;进行的组内和组间重复试验的变异系数均小于3%。上述结果显示,本研究所建立的PCV2和PCV3双重Taq Man荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为后续研究提供了技术支持。随后,应用该方法对77份山东省部分猪场的病料进行检测。结果显示:山东省部分猪场的PCV3阳性率为14.29%（11/77）,PCV2阳性率为32.47%（25/77）,PCV3和PCV2混合感染率为7.79%（6/77）。为进一步了解山东地区PCV2和PCV3的分子生物学特征和遗传变异规律,对所分离到的PCV2和PCV3毒株进行全基因组扩增测序和分析。结果显示,本研究分离的25株PCV2全基因组同源性在96%-99.8%之间,主要亚群是PCV2b和PCV2d;11株PCV3相互之间全基因组序列同源性在98.4%-99.9%之间,在PCV3a亚群、PCV3b亚群、PCV3c亚群均有分布。本研究分离的PCV2和PCV3 Cap蛋白与Rep蛋白位点均发生了突变,相较于PCV3,PCV2的Cap蛋白突变位点较多。上述所获数据为山东地区的PCV2和PCV3的核酸检测、流行病学特征、遗传变异以及防治提供了技术支持和分子生物学依据。鉴于PCV3在世界范围内的广泛流行,建立一种快速、准确的血清学诊断方法对该病的防控具有重大的意义。本研究针对PCV3的Cap蛋白拟建立一个快速检测PCV3抗体的间接ELISA方法。采用PCR方法对PCV3-Cap基因主要抗原区域进行扩增,将扩增产物连接至p ET-28a（+）原核表达载体上,转入大肠杆菌BL21,进行原核表达,成功表达了36.4KDa的蛋白;用包涵体进行纯化,Western blot鉴定表明表达蛋白具有良好的反应活性。对抗原包被浓度、血清稀释比、二抗稀释比等条件进行探索,经反复摸索确定,最适抗原包被浓度为2.5μg/m L,最佳血清稀释比为1:400,最佳羊抗猪酶标记抗体稀释比为1:30000。该方法中PCV3阳性血清的最低检出效价可达1:25600;对PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV等病毒阳性血清测定结果为阴性;批内和批间重复实验变异系数均小于3%;依照优化后的ELISA方法检测了1299份血清,PCV3阳性率为11%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性。此外,我们同时将纯化后的PCV3 Cap蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,三免后两周内采血分离血清,经检测确认所制备的多抗可以特异性识别PCV3Cap真核表达蛋白。使用PK-15细胞对PCV3毒株进行了分离培养,将PCV3核酸检测结果为阳性的病料研磨液进行小鼠攻毒实验,结果表明:本研究所分离的PCV3病毒无法感染PK-15细胞和BALB/c小鼠。随后,为了进一步了解PCV3的致病机理,本研究预构建PCV3感染性克隆质粒。先以PCV2为模板,设计引物扩增PCV2全基因组,将两个拷贝的PCV2全长基因序列通过酶切位点诱导突变的方式顺次地插入到Blunt质粒,其结果表明转染重组质粒能产生具有感染性的子代病毒,表明PCV2感染性克隆质粒构建成功。参考构建PCV2双拷贝感染性克隆质粒构建方法扩增PCV3的全基因组,将两个拷贝的PCV3全长基因组序列通过Eco R I/Bam H I和Bam H I/Sac I顺次插入到Blunt质粒,构建双拷贝的PCV3感染性克隆质粒Blunt-2PCV3。将构建好的质粒转染PK-15细胞,以鼠抗PCV3 Cap多抗进行IFA鉴定,可见明显的绿色荧光,证明PCV3双拷贝质粒能成功表达病毒蛋白。但在电镜下观察未见病毒粒子,表明本实验所构建的双拷贝PCV3质粒不能拯救出病毒粒子,只是能表达出病毒的部分蛋白。本研究成功构建了双拷贝的PCV3全基因组质粒和具有感染性双拷贝的PCV2的全基因组质粒,为研究PCV2和PCV3分子特性与致病机理提供了参考。
高磊[3]（2021）在《嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗（C1-233株）的临床试验》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）2型感染引起的猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated diseases,PCVAD）,是影响养猪业的重要疾病之一。猪圆环病毒现有4种基因型,即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4,其中,已知PCV2危害最为严重。PCV2可引起包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）、猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis nephropathy syndrome,PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex,PRDC）和母猪繁殖障碍综合征（Swine reproductive disorder syndrome,SRDS）等多种疾病,同时,PCV2 还可与多种病原共同感染或混合感染,加重疾病严重程度,对养猪业造成的经济损失巨大,已成为各国关注的重要病原之一。目前,PCVAD有效防控措施之一是疫苗接种。PCV2疫苗种类较多,主要包括全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。其中,美国硕腾公司的嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗已在国内上市,但国内迄今尚无该产品研制的报道。本研究是在实验室完成实验室试制、中间试验的基础上,进行该疫苗的临床试验。本实验室与扬州优邦生物药品有限公司先后在江西、上海、江苏三个猪场进行了嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗（C1-233株）安全性试验和免疫效力试验。临床试验结果表明,中试疫苗具有良好的安全性和有效性,断奶仔猪、怀孕母猪和后备母猪对该疫苗均无不良反应,且免疫后的试验猪均能产生较高水平的抗体。在本次临床试验中,我们采用了主动免疫效果和被动免疫效果相结合的评价方法,通过临床观察和回收临床免疫猪进行攻毒试验评价疫苗的安全性和有效性。主动免疫保护试验结果表明,5批嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗（C1-233株）免疫后对断奶仔猪提供100%的攻毒保护。被动免疫保护试验结果表明,上述5批疫苗对免疫母猪所产2周龄哺乳仔猪提供100%的攻毒保护,但仔猪4周龄时攻毒已不能完全保护。此外,还进行了疫苗免疫保护持续期试验,通过监测仔猪免疫后的抗体水平及回收临床免疫猪进行攻毒试验的方式评价其免疫效果,结果显示,免疫后6个月所有免疫猪的间接免疫荧光抗体水平均在1:800以上,且免疫后6个月的架子猪均能抵抗强毒攻击,而非免疫攻毒组的发病率为80%。以上结果证明中试疫苗具有较好的安全性和免疫保护效果。
孙仁杰[4]（2021）在《猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制》文中研究表明猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）的重要病原,给全球养猪业造成重大经济损失。但PCV2单独感染的致病力不强,共感染或继发感染或环境应激,可以触发PCVAD。受限于自身基因组大小和编码能力,PCV2复制在很大程度上依赖于宿主细胞,因此易引起内质网应激、氧化应激和自噬等细胞应激反应。本实验室研究表明,PCV2能通过与相关宿主因子的相互作用,调控宿主细胞的应激反应从而促进自身复制。高迁移率族蛋白1（High mobility group box 1protein,HMGB1）是高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,在细胞中的功能取决于其在细胞内的位置,在核内主要起DNA分子伴侣作用。研究表明,氧化应激或一些病毒感染可以引起HMGB1在细胞中重新分布,并在病毒感染过程中发挥重要作用。那么,PCV2感染引起的内质网应激是否诱导氧化应激?通过何种机制诱导?由此产生的氧化应激是否影响HMGB1在细胞内的分布?HMGB1是否影响PCV2复制?通过何种机制影响病毒复制?本论文针对这些科学问题展开了系统研究,目的是解明PCV2利用宿主细胞应激反应,促进其自身复制的分子机制。主要研究内容和结果如下:1.核内HMGB1负调控PCV2复制通过免疫印迹、免疫荧光等技术分析HMGB1蛋白在PCV2感染的PK-15细胞或3D4/31细胞（猪肺泡巨噬细胞）中的表达和分布情况,发现PCV2感染可以诱导HMGB1向核外转移至细胞质,但不影响HMGB1的转录和表达。利用过表达或基因沉默技术调节HMGB1在细胞内的水平,并分析其对PCV2复制的影响。结果显示,过表达HMGB1能够抑制PCV2复制,细胞内病毒DNA拷贝数、m RNA水平以及病毒衣壳蛋白（Cap）表达水平均下降;而下调HMGB1表达,可以显着促进PCV2的复制,表明HMGB1负调控PCV2复制。为探究是否是核内HMGB1调控PCV2复制,我们将PCV2感染细胞进行HMGB1出核抑制剂处理,发现丙酮酸乙酯可以有效抑制PCV2诱导的HMGB1出核,并抑制PCV2在细胞中的复制;而用甘草酸抑制胞外HMGB1活性（直接与其结合）并不影响病毒复制。以上结果表明,细胞核内HMGB1可抑制病毒复制,而PCV2感染可以促使HMGB1向核外转移。那么,核内HMGB1如何影响PCV2复制?2.核内HMGB1通过与病毒基因组DNA复制起始区茎环结构结合影响PCV2复制为探明HMGB1是否与病毒基因组DNA互作?互作过程涉及哪个区域?我们制备了PCV2基因组全长和包含或不包含复制起始区（Ori）的不同DNA片段（orf1、orf2、Ori-orf1和Ori-orf2）,并构建了表达HMGB1全长或不同结构域截短蛋白（A box、AB box和B box CT）的载体,通过凝胶阻滞或DNA结合蛋白免疫共沉淀分析HMGB1蛋白-病毒DNA互作,结合病毒复制水平检测,发现只有携带B box的区域与全长HMGB1一样可以抑制病毒在PK-15细胞中的复制,且只有携带复制起始区茎环结构的病毒DNA片段与HMGB1互作才能阻滞蛋白-DNA复合物在凝胶中的迁移。表明HMGB1中的B box结构域是影响PCV2复制的关键区域,核内HMGB1通过与病毒DNA的复制起始区茎环结构结合抑制病毒复制。3.PCV2通过提高胞内活性氧水平促进HMGB1出核和自身复制应用流式细胞术检测PCV2感染PK-15细胞中的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平变化,抗氧化剂乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）和过氧化氢（H2O2）处理PCV2感染细胞,结合分析HMGB1在细胞核内外的分布。我们发现PCV2感染可以显着提高细胞内ROS水平和核内HMGB1向核外转移;用NAC处理PCV2感染细胞,可抑制HMGB1向核外转移,并抑制病毒复制;用H2O2处理PCV2感染细胞,则在促进HMGB1出核的同时,增强PCV2复制。以上结果表明,PCV2感染可增加细胞中ROS水平,引起氧化应激并促进HMGB1向核外转移,降低了核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制,有利于PCV2复制。4.PCV2感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1向核外转移本实验室前期研究表明,PCV2感染可激活PK-15或3D4/31细胞内质网应激的PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路;已知ERO1α（内质网氧化还原酶1α）受CHOP调控,参与内质网新生蛋白的氧化折叠,并将电子传递给氧分子,最后形成H2O2。我们通过RNA干扰下调PERK蛋白表达、GSK2606414抑制PERK磷酸化或用EN460抑制ERO1α活性,结合细胞内ROS、HMGB1核内外分布以及病毒复制水平的检测,发现PERK或ERO1α抑制均能下调PCV2感染细胞中的ROS水平,抑制HMGB1向核外转移,且PCV2复制受到显着抑制。表明PCV2诱导的内质网应激可以伴随氧化应激,且内质网应激引起的ROS水平增加足以促进HMGB1向核外转移,进而降低核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制。5.PCV2诱导内质网氧化还原稳态失衡和HMGB1出核的分子基础在PK-15细胞中过表达PCV2的ORF1（Rep）、ORF2（Cap）、ORF3、ORF4和ORF5蛋白,发现只有Rep和Cap促进ERO1α表达、ROS产生以及HMGB1向核外转移。通过对Rep和Cap中半胱氨酸残基分析,构建了Cap C108S以及RepC107S和Rep C305S的突变蛋白,与野生型蛋白相比,半胱氨酸置换均显着降低它们对PERK和ERO1α的激活作用,下调ROS水平,抑制HMGB1出核。为进一步探究这三个半胱氨酸残基在PCV2感染过程中的作用,通过反向遗传技术构建携带Rep和Cap中半胱氨酸残基单突变和三突变的重组病毒PCV2Rep1（C107S）、PCV2Rep2（C305S）、PCV2Cap1（C108S）和PCV2Rep1/2-Cap1。结果表明,只有三突变的重组病毒(PCV2Rep1/2-Cap1)对PERK和ERO1α的激活作用减弱,并显着降低胞内ROS水平、减少HMGB1向核外转移,病毒复制及增殖水平也显着下降。提示内质网中半胱氨酸介导的蛋白氧化折叠和ROS产生量在单一蛋白水平和全病毒水平之间存在差别,可能与单一蛋白过表达和全病毒水平相关蛋白的表达量存在一定差异有关,也可能是全病毒水平半胱氨酸残基的协同作用所致。综上所述,本研究首次报道了宿主蛋白HMGB1与PCV2基因组DNA之间的相互作用及其对PCV2复制的影响:核内HMGB1通过与病毒基因组DNA的复制起始区茎环结构结合,起到抑制病毒复制的作用,是一种抗PCV2复制的宿主因子。阐明了PCV2通过诱导细胞应激逃避宿主抗病毒反应的新机制:PCV2通过激活PERK-ERO1α系统,在发生内质网应激的同时伴随氧化应激,产生的ROS足以促使核内HMGB1向胞质转移,降低核内HMGB1对病毒基因组DNA的“劫持”,进而有利于PCV2复制。研究结果为猪场通过抗氧化辅助手段防治PCVAD提供借鉴,为深入探索PCV2在宿主体内的相关应激激活机制奠定重要基础。
宋健颖[5]（2021）在《规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整》文中认为随着我国养猪业的规模化发展,猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和猪伪狂犬五种主要疾病防控尤为重要,一旦发病就会造成重大经济损失。本研究通过对新疆南疆某地区3个规模化母猪场母猪群的猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬和口蹄疫等五种主要疫病进行抗体水平监测、病原检查,了解规模化母猪场抗体水平、是否存在野毒感染、野毒基因型,更好地评价免疫程序是否合理,以期提高免疫效果。1.2018年至2020年,对新疆南疆某地区3个规模猪场（A～C）采集的1604份血液进行了猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和圆环病毒2型的抗体检测。检测结果显示,猪瘟抗体阳性率分别为:A场92.30%（2018）、97.74%（2019）和89.22%（2020）;B场95.27%（2018）、93.04%（2019）和86.81%（2020）;C场91.67%（2018）、86.50%（2019）和90.80%（2020）;伪狂犬病抗体分阳性率别为:A场100.00%（2018）、99.25%（2019）和97.06%（2020）;B场98.82%（2018）、93.67%（2019）和94.44%（2020）;C场98.12%（2018）、84.00%（2019）和96.55%（2020）;猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率分别为:A场86.15%（2018）、75.19%（2019）和55.88%（2020）;B场86.39%（2018）、88.61%（2019）和88.89%（2020）;C场91.94%（2018）、96.50%（2019）和95.40%（2020）。口蹄疫抗体阳性率分别为:A场90.77%（2018）、100%（2019）和98.04%（2020）;B场100%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场95.97%（2018）、97.50%（2019）和96.55%（2020）;圆环病毒2型抗体阳性率分别为:A场80.00%（2018）、100.00%（2019）和92.16%（2020）;B场95.27%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场97.04%（2018）、97.50%（2019）和98.85%（2020）。2.以“发现疫病或证明无疫”的抽样策略采集A规模化母猪场血清样本,采用圆环病毒2型抗原ELISA检测,检测结果阳性率为4.4%,证明A场存在圆环病毒2型感染。3.对A规模化母猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪的样本,采用猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因序列特异性引物经RT-PCR扩增、测序、核苷酸同源性比较、系统进化树分析,结果证明,该样本测序结果与NADC30毒株同源性最高,为93.5%,属于类NADC30毒株。4.猪繁殖与呼吸综合征免疫程序进行调整初探,调整后母猪每年普免3次,每次免疫间隔4个月,采集调整后试验的猪群50份血清,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测,抗体阳性率达到96%以上。
汪孟航[6]（2021）在《PCV3的分子流行病学调查及分离株的致病性研究》文中研究表明猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）为新发病原体。我国不同地区的研究报道的PCV3阳性率存在差异,其主流基因型还不明确。虽然国内外学者已经进行很多PCV3的研究和报道,但是关于PCV3致病性的信息很少,主要是因为PCV3分离株很难获得,而且实验室感染临床表现差异极大且存在争议。本研究针对现有PCV3研究存在的问题,就PCV3的流行情况、主流基因型、分离鉴定以及致病性方面进行了研究与探讨。本研究对2020～2021年采样自黑龙江、河南、河北、湖北、新疆5省中6个不同养殖集团1201份样本进行PCR检测并测序,结果显示PCV3在所有样本中的感染率为26.3%,PCV3和PCV2混合感染率达18.6%,目前不存在绝对优势PCV3基因型。分子流行病学调查表明我国黑龙江、河南、河北、新疆和湖北的养殖场中猪群PCV2和PCV3的流行情况,PCV2感染率为分别为80.5%、94.6%、86.2%、30.9%和51.9%,总感染率为72.1%;PCV3感染率为分别为21.4%、28.6%、37.9%、21.6%和32.7%,总感染率为26.3%;所有样本中PCV3和PCV2共感染率达18.6%。利用MEGA等生物信息学软件比对PCV2和PCV3的Cap基因,结果表明:PCV2d基因型已经成为主要流行基因型;黑龙江和河北养殖场以PCV3a基因型为主要流行基因型;新疆养殖场以PCV3b基因型为主要流行毒株;河南和湖北养殖场以PCV3c基因型为主要流行毒株。本研究初步掌握我国5省份PCV2和PCV3的流行情况和主流基因型分布,将为PCV2和PCV3的诊断和防控提供一定的理论依据。利用特异性PCR检测呈PCV3阳性病料,接种PK-15细胞有限传代并分离到一株PCV3b型毒株,命名为PCV3-DB-1,并对其生物学特性进行鉴定。PCR全基因组测序明确PCV3-DB-1的基因组大小为2000 bp,并基于ORF2序列的系统发育分析显示PCV3-DB-1毒株属于PCV3b分支。特异性qPCR检测体外原代细胞和传代细胞系中PCV3-DB-1的可传代性,结果显示无法获得连续传代病毒,PK-15细胞系可将PCV3-DB-1分离株最高传至第6代。通过透射电子显微镜和RNAscope原位杂交确认了传代获得的PCV3-DB-1分离株的病毒复制与繁殖。不同时间点q PCR检测并绘制PCV3-DB-1分离株在PK-15细胞中的生长动力学曲线,并采用氯化铯等密度梯度离心法测定PCV3的浮密度为1.37 g/cm3。PCV3-DB-1分离毒株Cap蛋白含有24A和27K分子特征,该类型的PCV3相关生物学特性至今为止首次报道。为探讨PCV3感染在动物体内的致病性,本研究成功建立PCV3-DB-1细胞分离毒和肺脏组织毒动物感染试验,受感染仔猪的临床表现不明显。本研究共进行两批PCV3-DB-1感染3周龄剖宫产无初乳（Cesarean-derived,colostrum-deprived,CDCD）仔猪动物试验,PCV3感染仔猪未出现明显的临床症状和肉眼可见病变。qPCR证实PCV3具有广泛的组织嗜性,且肺脏和淋巴结的病毒含量最高。基于PCV3-rCap-VLPs的间接ELISA检测显示接种PCV3-DB-1细胞毒7 DPI后诱导仔猪产生较弱的IgG抗体应答。然而,流式细胞术检测显示PCV3-DB-1感染没有引起外周血中T淋巴细胞的动态改变。组织学病理学H&E染色显示接种PCV3-DB-1仔猪出现淋巴结淋巴细胞减少和肺泡隔增宽,以及少量炎性细胞浸润的病理学损伤。本研究首次报道Cap蛋白含有24A和27K分子特征的PCV3-DB-1分离株的体内致病性研究,为PCV3的临床相关性提供了一定的理论基础与有益数据。
石超群[7]（2021）在《基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究》文中认为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是一种引起仔猪先天性震颤和多器官衰竭综合征的病毒,给养猪业带来严重的经济损失。如何降低PCV2给养猪业造成的损失变得越来越重要。近几年CRISPR/Cas9系统在遗传育种、基因治疗方面不断得到应用,利用CRISPR/Cas9系统生产具PCV2抗性猪对于猪产业具有重要意义。病毒抗性蛋白A（Mx1）是干扰素（IFN）诱导蛋白之一,该蛋白具有抗多种病毒的活性。本课题组前期的研究,莱芜猪Mx1基因启动子区在-547 bp处存在275 bp的插入,与莱芜猪对PCV2不敏感有关。该研究利用CRISPR/Cas 9和Cre-Lox P系统对PK15细胞进行了Mx1基因启动子区275bp的定点敲入,并验证了其对Mx1表达及抑制PCV2复制的能力。主要结果如下:（1）猪Mx1基因CRISPR/Cas9同源重组载体和打靶载体的构建。以PLV-m Cherry载体为骨架,依据猪Mx1基因启动子区275bp插入位点的差别设计同源臂,并引入绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因,并在两端加入同向的Lox P序列,获得CRISPR/Cas9同源重组载体。利用Lenti CRISPR v2慢病毒载体构建出针对莱芜猪的Mx1基因启动子区的打靶载体,并通过酶切测定出了打靶载体的活性。（2）猪PK-15细胞同源重组单克隆细胞的鉴定。利用同源重组载体和打靶载体的慢病毒液感染猪PK-15细胞,通过细胞的绿色荧光的表达情况,同时利用嘌呤霉素进行筛选,挑取了12组单克隆细胞,进一步经PCR鉴定得到两个发生同源重组的单克隆细胞群。（3）标记基因的去除。通过向发绿色荧光的单克隆细胞中转染表达Cre酶的载体,在荧光显微镜下发现发光的细胞明显减少,流式细胞术分析证明绿色荧光的发光比例下降（16.3%）,证明了Cre-Lox P系统同向切割功能,并去除了细胞中的筛选抗性基因。（4）单克隆细胞Mx1的表达及对PCV2复制的抑制。对Mx1启动子区275bp插入的单克隆细胞,在接种PCV2后48h Mx1的表达水平显着升高,而PCV2的病毒拷贝数显着降低。说明猪Mx1启动子区275bp的插入具有促进Mx1表达和抑制PCV2复制的功能。
钱雯娴[8]（2021）在《藏猪猪圆环病毒2型分离、鉴定与遗传特性研究》文中指出猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）在引起猪的相关疾病综合征中起到重要作用,是最小的哺乳动物病毒。目前,对西藏地区的猪圆环病毒2型相关报道较少。本研究通过流行病学调查、多重荧光定量PCV2分型方法的建立和感染性克隆构建与遗传特性研究,旨在了解西藏林芝地区PCV2流行情况并建立起快速及定量的PCV2分型方法,深入研究藏猪PCV2分离毒株遗传变异的意义与作用。1.为了解西藏林芝市猪圆环病毒2型的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况,采用聚合酶链反应技术,对2018～2019年在西藏林芝不同猪场采集的95份样本进行了PCV2的检测,扩增并克隆阳性样本的全基因组序列进行测序,获得9株PCV2全长基因组序列。藏猪阳性病料经无菌处理后接种PK-15细胞,经PCR检测及测序鉴定成功分离得到1株藏猪来源的PCV2毒株,命名为ZZ2毒株。对阳性样本的全基因组序列进行遗传变异分析,发现9株PCV2阳性毒株中有6株为PCV2b基因型,3株为PCV2d基因型,其中2株藏猪分离株为PCV2b亚型,但全长仅有1756 bp,在复制起始区域有11 bp长度的核苷酸序列缺失。2.为建立一种检测猪圆环病毒2型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种基因型PCV2a、PCV2b、PCV2d检出并分型。基于PCV2的ORF2基因保守序列区设计通用引物,并依据不同的基因型分别设计Taqman探针,3条探针分别标记不同的荧光基团,建立和优化多重荧光定量PCR方法的反应体系,检测其灵敏性、重复性和特异性。结果显示建立的多重荧光定量PCR方法最低检测的拷贝数为PCV2a 100 copies/μL、PCV2b 57 copies/μL和PCV2d 100 copies/μL。通过该方法检测227份PCV2阳性临床样本,结果显示PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型的混合感染较为严重,检出率为55.95%,PCV2b、PCV2d两种基因型共同感染检出率次之,为17.62%。选取部分样本测序鉴定,结果测序分型与多重荧光定量PCR分型的结果具有较高的一致性,西藏9例检测为阳性的样本均为PCV2单一基因型感染且分型结果一致。3.为进一步研究分离得到的ZZ2毒株缺失的11 bp核苷酸序列是否对PCV2的复制能力和致病性有影响,应用反向遗传技术构建了核苷酸缺失的ZZ2全长感染性克隆质粒和基因型为PCV2b正常序列的5123毒株全长感染性克隆质粒,同时利用基因重组技术构建了核苷酸回补后的ZZ2（1767 bp）全长感染性克隆质粒和核苷酸敲除后的5123（1756 bp）核苷酸缺失感染性克隆质粒,核苷酸回补与核苷酸敲除序列为藏猪分离毒株上相对应的缺失核苷酸片段。在构建的四种感染性克隆质粒转染PK-15细胞后,通过PCR、q PCR、IFA和Western blot等方法检测PCV2 ZZ2毒株、ZZ2核苷酸回补毒株（ZZ2-HB）、5123毒株和5123核苷酸敲除毒株（5123-QC）病毒拯救成功,传代至第10代病毒增殖趋于稳定,但ZZ2拯救毒株拷贝数低于其他三株。通过检测相关免疫因子、自噬标志因子和凋亡因子的转录水平,发现核苷酸缺失株抑制IFN-α1转录,在感染后期促进IL-8表达,在感染早期抑制细胞自噬,并对细胞凋亡有抑制作用。
冯全文[9]（2021）在《猪圆环病毒2型ORF5基因突变毒株的构建及感染特性研究》文中认为猪圆环病毒2型（PCV2）是单股负链环状DNA病毒,基因组长度1 767～1 768 bp,病毒粒子呈二十面体对称结构,无囊膜,病毒粒子大小约17 nm。PCV2导致猪免疫系统损害和抑制,严重损害猪的健康,并常继发或混合感染其他病原体,造成更为严重的损害。对PCV2的致病机制的揭示有助于更好的做好防控工作,对病毒编码产物的鉴定和功能研究是揭示PCV2致病机制的基础。生物信息学分析发现,PCV2的基因组中至少包含11个潜在的开放阅读框（ORF）,目前报道的有6个（ORF1-6）,其中ORF5是本研究团队发现和鉴定的一个PCV2新编码蛋白。前期研究结果表明,ORF5蛋白可引起宿主细胞周期阻滞,诱导内质网应激反应和细胞自噬,促进病毒复制等,以上结果主要是以ORF5蛋白为研究对象获得的,在ORF5在病毒水平的作用还需要深入研究。本研究克隆获得了PCV2全基因组序列,通过点突变技术将ORF5基因的起始密码子（ATG）突变,拯救获得了PCV2克隆毒株（rPCV2）和ORF5基因突变毒株(PCV2△ORF5)。进一步研究了ORF5对病毒生长特性、细胞感染作用,实验动物感染方面的作用,在病毒水平明确了ORF5的作用,为PCV2致病机制的揭示提供了新的资料。本研究获得了以下结果:（1）获得了PCV2克隆毒株和ORF5基因突变毒株克隆获得PCV2全基因,分别构建插入PCV2全基因序列的重组质粒PUC57-rPCV2和突变ORF5基因的重组质粒PUC57-PCV2△ORF5,经单酶切、体外自环化连接、连接产物转染细胞、盲传等实验操作,分别获得了rPCV2和PCV2△ORF5毒株。（2）ORF5基因突变降低了病毒复制增殖及诱导细胞内质网应激、细胞自噬的作用以rPCV2、PCV2△ORF5毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,分别用透射电镜观察法、RT-PCR、western blot、流式细胞术等方法对病毒复制增殖、对细胞功能的影响进行分析。结果表明,rPCV2、PCV2△ORF5毒株在细胞中的复制增殖具有一致性,但ORF5基因突变在36h时显着降低了病毒的复制增殖能力（P<0.05）;rPCV2、PCV2△ORF5毒株均诱导了细胞内质网应激、细胞自噬和细胞凋亡,但是ORF5基因的突变使感染细胞的内质网应激、细胞自噬、细胞晚期凋亡和细胞周期阻滞作用显着降低（P<0.05或P<0.01）。研究结果从病毒水平证实了ORF5蛋白在病毒感染中具有诱导宿主细胞内质网应激、细胞自噬和细胞周期阻滞的作用。（3）ORF5基因突变降低了病毒在实验动物体内的复制增殖、诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用分别用PCV2、rPCV2、PCV2△ORF5病毒液通过腹腔注射途径接种昆明系小鼠4次,每天1次,4此接种后每隔7 d尾静脉采血,荧光定量PCR方法检测血液中的病毒载量;当感染小鼠血液中出现高滴度病毒载量时（感染后28 d）麻醉处死各组小鼠,无菌操作分别采取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等组织器官,RT-PCR和western blot检测各组织中的病毒载量、内质网应激和细胞自噬标志因子的表达;将各组织器官分别制成电镜和普通病理切片,进行观察。结果显示,三种病毒感染小鼠的肝、脾、肾、肺中病毒载量均较高,但PCV2△ORF5组感染小鼠相同组织中的病毒载量低于PCV2和rPCV2组（P<0.01或P<0.05）,说明ORF5基因突变降低了病毒在动物体内的复制增殖能力;病毒载量与组织中内质网应激和细胞自噬标志因子的表达呈正相关性,肝、脾、肾和肺中GRP78、Beclin1和LC3Ⅰ/Ⅱ的表达高于其他组织（P<0.01或P<0.05）,但PCV2△ORF5组感染小鼠相同组织中的标志因子表达显着低于PCV2和rPCV2感染组,说明ORF5基因突变降低了病毒诱导细胞内质网应激和细胞自噬的作用。通过病理组织学观察结果显示,三种病毒感染的小鼠组织中出现炎性细胞浸润、淋巴细胞减少、细胞凋亡、细胞变性等病理变化,但各组之间无显着差异。研究结果表明,ORF5基因突变对病毒感染性和病理变化无显着影响,但是降低了病毒的复制增殖、诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用。本研究构建了突变ORF5基因的PCV2毒株,ORF5的突变降低了病毒在体内外的复制增殖水平,降低了病毒在体内外诱导细胞内质网应激和细胞自噬作用,但对病毒的感染性和病理损伤无显着影响。本研究从病毒和体内外进一步明确了ORF5在PCV2感染中的作用,为PCV2感染和致病机制的阐明提供了新的资料,具有理论和潜在的应用价值。
朱家平,周赛赛,钱雯娴,李天娇,何孔旺,索朗斯珠[10]（2021）在《基于我国猪圆环病毒研究的文献分析》文中认为为了了解我国猪圆环病毒的研究现况,笔者采用文献计量学等相关统计方法对2009—2019年中国知网中收录的2 290篇关于我国猪圆环病毒文献的期刊分布、发表时间、不同作者发文量、作者所在机构、研究内容、研究对象进行统计分析并做可视化处理。结果表明:发表文献达100篇以上的期刊有4本,共发表文献433篇,以《黑龙江畜牧兽医》与《中国兽医学报》等期刊为主;不同年份的发文量整体呈平稳趋势;发文量不少于40篇的作者有3位,共发表文献142篇;有8个机构在此期间发表的文献数不少于50篇,共发表文献481篇,且大部分机构是高校;在研究内容上,分子水平和检测技术方面的文献最多,分别有370篇和393篇;在研究对象上,猪圆环病毒2型方面的文献占94.98%。说明在我国猪圆环病毒研究一直受到很大重视。
二、猪圆环病毒研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪圆环病毒研究进展（论文提纲范文）
（1）猪圆环病毒2型-猪肺炎支原体-副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 指导教师对博士论文的评阅意见 |
| 评阅小组对博士论文的评阅意见 |
| 答辩决议书 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪圆环病毒病及其疫苗研究进展 |
| 1.1 猪圆环病毒病概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状与病理变化 |
| 1.5 诊断 |
| 1.6 PCV2疫苗研究与进展 |
| 第2章 猪支原体肺炎及其疫苗研究进展 |
| 2.1 猪支原体肺炎病概述 |
| 2.2 病原学 |
| 2.3 流行病学 |
| 2.4 临床症状与病理变化 |
| 2.5 诊断 |
| 2.6 Mhp疫苗研究与进展 |
| 第3章 格拉瑟氏病及其疫苗研究进展 |
| 3.1 格拉瑟氏病概述 |
| 3.2 病原学 |
| 3.3 流行病学 |
| 3.4 临床症状与病理变化 |
| 3.5 诊断 |
| 3.6 HPS疫苗研究与进展 |
| 4 猪圆环病毒病、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病混合感染现状 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 PCV2 Cap蛋白制备工艺研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 猪肺炎支原体菌体抗原制备工艺研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 副猪嗜血杆菌4型和5型菌体抗原制备工艺研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 疫苗最小保护性抗原量的确定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 三联灭活疫苗的制备及安全性和有效性评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原 |
| 1.1.1 PCV的发现 |
| 1.1.2 PCV的结构及生物学特征 |
| 1.1.3 PCV的基因组结构与编码蛋白 |
| 1.2 猪圆环病毒致病性研究 |
| 1.3 猪圆环病毒的流行病学研究 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.4.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR |
| 1.4.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.4 免疫荧光试验(IF) |
| 1.4.5 免疫组化(IHC) |
| 1.4.6 免疫电镜(IEM) |
| 1.4.7 纳米PCR |
| 1.4.8 原位杂交技术(ISH) |
| 1.4.9 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.5 PCV相关疾病的预防与治疗 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及毒株来源 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.2.1 主要仪器 |
| 2.1.2.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2和PCV3 双重Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 病毒DNA的提取 |
| 2.2.1.3 PCV2 Rep 基因和PCV3 Cap 基因的扩增 |
| 2.2.1.4 胶回收 |
| 2.2.1.5 连接转化 |
| 2.2.1.6 质粒提取 |
| 2.2.1.7 双重TaqMan荧光定量PCR方法的建立和优化 |
| 2.2.1.8 建立标准曲线 |
| 2.2.1.9 特异性试验 |
| 2.2.1.10 敏感性试验 |
| 2.2.1.11 重复性试验 |
| 2.2.1.12 临床样本检测 |
| 2.2.2 PCV2和PCV3 的分子流行病学调查 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 病毒DNA的提取和全基因组扩增 |
| 2.2.2.3 分子克隆 |
| 2.2.2.4 序列分析和遗传进化树构建分析 |
| 2.2.3 PCV3 Cap多抗的制备和抗体间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.3.1 引物设计 |
| 2.2.3.2 Cap基因的扩增 |
| 2.2.3.3 原核表达质粒pET28-PCV3-Cap的构建 |
| 2.2.3.4 蛋白的诱导表达 |
| 2.2.3.5 蛋白纯化 |
| 2.2.3.6 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3.7 真核表达质粒pEGFP-PCV3-Cap的构建 |
| 2.2.3.8 多克隆抗体的验证 |
| 2.2.3.9 重组蛋白pET28-PCV3-Cap的 Western blot鉴定 |
| 2.2.3.10 间接ELISA操作方法与最佳反应条件的确定 |
| 2.2.3.11 间接ELISA临界值的确定 |
| 2.2.3.12 间接ELISA敏感性试验 |
| 2.2.3.13 间接ELISA特异性试验 |
| 2.2.3.14 间接ELISA重复性试验 |
| 2.2.3.15 间接ELISA临床样品检测试验 |
| 2.2.4 PCV3 野毒株分离培养的研究 |
| 2.2.4.1 使用PK-15 分离PCV3 野毒株 |
| 2.2.4.2 PCV3 野毒株感染小鼠的研究 |
| 2.2.5 感染性克隆质粒构建的初步研究 |
| 2.2.5.1 引物设计 |
| 2.2.5.2 PCV2 全基因组克隆 |
| 2.2.5.3 PCV2 感染性克隆质粒的构建 |
| 2.2.5.4 重组质粒转染及间接免疫荧光检测 |
| 2.2.5.5 拯救病毒体外感染试验 |
| 2.2.5.6 PCV3 感染性克隆的构建 |
| 2.2.5.7 重组质粒转染及病毒的拯救 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪圆环病毒2 型和3 型双重Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与应用 |
| 3.1.1 PCV2和PCV3 的标准品质粒的构建 |
| 3.1.2 双重Taq Man荧光定量PCR方法的建立和优化 |
| 3.1.3 标准曲线的建立 |
| 3.1.4 特异性检测 |
| 3.1.5 敏感性检测 |
| 3.1.6 重复性检测 |
| 3.1.7 临床检测 |
| 3.2 PCV2和PCV3 的分子流行病学调查 |
| 3.2.1 PCV2和PCV3 全基因组的扩增和序列测定 |
| 3.2.2 PCV2 全基因组序列分析 |
| 3.2.3 PCV2 Cap遗传进化分析 |
| 3.2.4 PCV2 Rep遗传进化分析 |
| 3.2.5 PCV3 全基因组序列分析 |
| 3.2.6 PCV3 Cap遗传进化分析 |
| 3.2.7 PCV3 Rep遗传进化分析 |
| 3.3 PCV3 Cap多抗的制备和抗体间接ELISA方法的建立 |
| 3.3.1 PCV3Cap基因扩增 |
| 3.3.2 原核表达质粒的构建 |
| 3.3.3 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3.5 鼠PCV3 Cap蛋白多克隆抗体的制备和验证 |
| 3.3.6 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 3.3.6.1 抗原最佳包被量和血清最佳稀释度和作用时间的确定 |
| 3.3.6.2 二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定 |
| 3.3.7 间接ELISA临界值的确定 |
| 3.3.8 间接ELISA敏感性试验 |
| 3.3.9 间接ELISA特异性试验 |
| 3.3.10 间接ELISA重复性试验 |
| 3.3.10.1 批内重复性试验 |
| 3.3.10.2 批间重复性试验 |
| 3.3.11 间接ELISA临床样品检测试验 |
| 3.4 PCV3 野毒株分离的研究 |
| 3.5 感染性克隆质粒的构建 |
| 3.5.1 PCV2 全基因扩增 |
| 3.5.2 双拷贝PCV2 重组质粒转染检测结果 |
| 3.5.3 PCV2 拯救病毒体外感染试验 |
| 3.5.4 单拷贝PCV3 全基因组的扩增 |
| 3.5.5 Blunt-2PCV3 重组质粒构建 |
| 3.5.6 双拷贝PCV3 重组质粒转染检测结果 |
| 3.5.7 电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗（C1-233株）的临床试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 猪圆环病毒流行现况概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 形态结构与理化特征 |
| 1.1.3 病毒的培养特性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 易感动物 |
| 1.3 致病性 |
| 1.3.1 猪圆环病毒1型 |
| 1.3.2 猪圆环病毒2型 |
| 1.3.3 猪圆环病毒3型 |
| 1.3.4 猪圆环病毒4型 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.4.1 PCV2感染猪常见临床表现 |
| 1.4.2 PCV2感染不同阶段猪的症状 |
| 1.4.3 PCV3感染的临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.5.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS) |
| 1.5.2 猪皮炎肾病综合征(PDNS) |
| 1.5.3 其他病理变化 |
| 1.6 诊断 |
| 1.6.1 病原学诊断 |
| 1.6.2 血清学检测 |
| 1.6.3 综合诊断 |
| 1.6.4 抗体检测 |
| 1.7 防治措施 |
| 1.7.1 PCV2疫苗研究进展 |
| 1.7.2 集约化猪场防治措施 |
| 1.7.3 药物治疗 |
| 1.7.4 对症治疗 |
| 1.8 总结 |
| 参考文献 |
| 第2章 嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗(C1-233株)安全性试验 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 单倍剂量接种安全性试验 |
| 2.2.2 加倍剂量接种安全性试验 |
| 2.2.3 单倍剂量重复接种安全性试验 |
| 2.2.4 组织切片制作方法 |
| 2.2.5 苏木素-伊红染色方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 单倍剂量接种安全试验 |
| 2.3.2 加倍剂量接种安全性试验结果 |
| 2.3.3 单倍剂量重复接种安全性试验结果 |
| 2.3.4 免疫部位的组织切片 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗(C1-233株)免疫效力试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 疫苗 |
| 3.1.2 试验猪 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 断奶仔猪免疫效力试验 |
| 3.2.2 哺乳仔猪被动免疫效力试验 |
| 3.2.3 组织切片制作方法 |
| 3.2.4 苏木素-伊红染色方法 |
| 3.2.5 免疫保护标准 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 断奶仔猪免疫效力试验结果 |
| 3.3.2 哺乳仔猪被动免疫效力试验结果 |
| 3.3.3 免疫效力试验组织切片 |
| 3.3.4 免疫持续期试验组织切片 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（4）猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2 型研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的分类 |
| 2 猪圆环病毒2 型基因组结构及其编码产物功能 |
| 3 猪圆环病毒2 型基因组的复制 |
| 4 猪圆环病毒2 型与细胞应激反应 |
| 第二章 HMGB1 蛋白的研究进展 |
| 1 HMGB1 蛋白的发现与分类 |
| 2 HMGB1 蛋白的基本结构 |
| 3 HMGB1 蛋白的功能 |
| 4 HMGB1 蛋白的核-质穿梭和释放 |
| 5 HMGB1 与病毒感染 |
| 第三章 内质网应激与活性氧的相关研究进展 |
| 1 内质网应激及未折叠蛋白反应的信号通路 |
| 2 蛋白质氧化折叠与内质网活性氧的生成 |
| 3 内质网和线粒体与氧化应激之间的联系 |
| 第四章 本研究拟探索的科学问题 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 PCV2 与宿主蛋白HMGB1 的相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 病毒感染及药物处理 |
| 2.4 细胞转染 |
| 2.5 细胞核-质组分分离 |
| 2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.7 病毒基因组DNA提取 |
| 2.8 免疫印迹 |
| 2.9 免疫荧光 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 感染影响HMGB1 蛋白的核内外分布 |
| 3.2 PCV2 感染不影响HMGB1 蛋白的转录和翻译 |
| 3.3 核内HMGB1 负调控PCV2 复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 第二章 HMGB1 蛋白通过与病毒基因组DNA结合抑制 PCV2 复制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 HMGB1 蛋白不同截短片段的真核表达载体构建 |
| 2.3 病毒感染与质粒转染 |
| 2.4 细胞核-质组分分离 |
| 2.5 凝胶迁移实验 |
| 2.6 DNA结合蛋白免疫共沉淀 |
| 2.7 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.8 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HMGB1与PCV2 基因组DNA的复制起始区相互作用 |
| 3.2 HMGB1 B box是抑制PCV2 复制的关键结构域 |
| 4 分析与讨论 |
| 第三章 PCV2 通过提高感染细胞内ROS促进HMGB1 蛋白出核和病毒自身复制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 病毒感染及药物处理 |
| 2.3 细胞核-质组分分离 |
| 2.4 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.5 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胞内ROS能影响HMGB1 的亚细胞定位 |
| 3.2 H_2O_2促进HMGB1 出核并增强PCV2 复制 |
| 3.3 NAC阻断HMGB1 向核外转移并抑制 PCV2 复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 第四章 PCV2 感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1 向核外转移 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 病毒感染及药物处理 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 细胞核-质组分分离 |
| 2.5 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
| 2.6 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 感染促进内质网ERO1α表达 |
| 3.2 PCV2 感染激活内质网应激(PERK)通路调控ERO1α表达 |
| 3.3 PCV2 利用PERK通路激活产生的ROS诱导HMGB1 出核促进自身复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 第五章 PCV2 通过Rep和 Cap蛋白诱导内质网氧化还原稳态失衡和 HMGB1 核外转移的机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 PCV2 主要病毒蛋白及其半胱氨酸突变体的真核表达载体构建 |
| 2.3 病毒感染与质粒转染 |
| 2.4 细胞核-质组分分离 |
| 2.5 病毒基因组DNA提取 |
| 2.6 免疫印迹与免疫荧光 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
| 2.8 重组病毒体外拯救 |
| 2.9 病毒滴度测定 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rep和 Cap蛋白能引起内质网ERO1α上调以及ROS的产生 |
| 3.2 Rep和 Cap蛋白的半胱氨酸残基参与内质网ROS的产生 |
| 3.3 Rep和 Cap蛋白促进HMGB1 向核外转移 |
| 3.4 Rep和 Cap的半胱氨酸残基影响细胞应激反应及病毒复制 |
| 4 分析与讨论 |
| 全文结论 |
| 创新性 |
| 展望 |
| 主要缩略词表 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 病原学 |
| 1.1.3 猪瘟流行病学和临床症状 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 伪狂犬的研究概况 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 伪狂犬流行病学和临床症状 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概况 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 病原学 |
| 1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学和临床症状 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 口蹄疫病的研究研究概况 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 病原学 |
| 1.4.3 口蹄疫病流行病学和临床症状 |
| 1.4.4 诊断方法 |
| 1.5 圆环病毒2 型的研究概况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 病原学 |
| 1.5.3 圆环病毒2型病流行病学和临床症状 |
| 1.5.4 诊断方法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 3 个规模化母猪场5 种疫病抗体检测与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 规模母猪场猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.2 规模母猪场伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.3 规模母猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.4 规模母猪场口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.5 规模母猪场圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测结果分析 |
| 第三章 A规模化母猪场圆环病毒2 型抗原检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品来源及抽样原则 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 圆环病毒2 型抗原ELISA检测 |
| 3.3 检测结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 A规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型鉴定及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病料采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 引物设计与合成 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 病毒核酸提取 |
| 4.1.7 PCR产物纯化回收、测序 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PCR扩增结果 |
| 4.2.2 基因核苷酸同源性分析 |
| 4.2.3 基因遗传进化树分析 |
| 4.3 .讨论 |
| 第五章 A规模化母猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫程序调整试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 调整后母猪抗体检测结果 |
| 5.2.3 调整前后母猪抗体合格率对比 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）PCV3的分子流行病学调查及分离株的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 圆环病毒研究进展 |
| 1.1.1 圆环病毒科 |
| 1.1.2 猪圆环病毒 |
| 1.1.3 猪圆环病毒分子生物学特征 |
| 1.1.4 猪圆环病毒流行现状 |
| 1.1.5 猪圆环病毒基因分型 |
| 1.2 PCV3 研究进展 |
| 1.2.1 PCV3 的发现与检测 |
| 1.2.2 PCV3 的起源与进化 |
| 1.2.3 PCV3 的流行现状 |
| 1.2.4 PCV3 的致病性研究 |
| 1.2.4.1 生殖系统疾病相关 |
| 1.2.4.2 呼吸道疾病相关 |
| 1.2.4.3 其他相关疾病 |
| 1.2.4.4 健康动物 |
| 1.2.4.5 混合感染 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 第二章 PCV3 分子流行病学调查以及与PCV2 共感染情况 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 样本处理 |
| 2.1.4 总DNA提取 |
| 2.1.5 特异性PCR检测 |
| 2.1.6 基因序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 黑龙江某一场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.2 黑龙江某二场的PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.3 河南某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.4 河北某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.5 新疆某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.6 湖北某场PCV2和PCV3 的流行情况 |
| 2.2.7 PCV2 Cap蛋白差异分析 |
| 2.2.8 PCV3 Cap蛋白差异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PCV3-DB-1 的分离鉴定与生物学特性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 病料来源 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 全基因组测序 |
| 3.1.5 基因序列分析 |
| 3.1.6 细胞嗜性探索 |
| 3.1.7 病毒分离 |
| 3.1.8 电镜观察 |
| 3.1.9 RNA原位杂交 |
| 3.1.10 生长动力学的测定 |
| 3.1.11 等密度梯度离心 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PCV3 全基因组序列 |
| 3.2.2 PCV3 系统发育分析 |
| 3.2.3 PCV3 细胞系传代 |
| 3.2.4 PCV3 原代细胞传代 |
| 3.2.5 PCV3 病毒颗粒 |
| 3.2.6 PCV3 原位杂交 |
| 3.2.7 PCV3 生长动力学 |
| 3.2.8 PCV3 浮密度 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 PCV3-DB-1 分离株的致病性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 攻毒设计 |
| 4.1.5 临床症状 |
| 4.1.6 血清采集 |
| 4.1.7 体重测量 |
| 4.1.8 解剖观察 |
| 4.1.9 病理学观察 |
| 4.1.10 荧光定量PCR检测 |
| 4.1.11 ELISA抗体检测 |
| 4.1.12 RNA原位杂交 |
| 4.1.13 流式细胞术 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PCV3 细胞分离毒动物感染试验 |
| 4.2.1.1 临床症状 |
| 4.2.1.2 病毒血症 |
| 4.2.1.3 眼观病变观察 |
| 4.2.1.4 病理组织学分析 |
| 4.2.1.5 病毒对不同器官的嗜性 |
| 4.2.1.6 RNA原位杂交 |
| 4.2.1.7 血清抗体分析 |
| 4.2.1.8 外周血T淋巴细胞亚群分析 |
| 4.2.2 PCV3 组织毒动物感染试验 |
| 4.2.2.1 临床症状 |
| 4.2.2.2 病毒血症 |
| 4.2.2.3 组织器官的病毒载量 |
| 4.2.2.4 病理学损伤 |
| 4.2.2.5 血清抗体 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 CRISPR/Cas9 系统的研究进展 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历史 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的机构和分类 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas的作用机制 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9 系统的应用 |
| 1.2 猪圆环病毒 |
| 1.2.1 猪圆环病毒的发现 |
| 1.2.2 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1.2.3 猪感染PCV2 后的临床症状 |
| 1.2.4 PCV2 的基因型 |
| 1.2.5 PCV2 的致病机理和传播特点 |
| 1.2.6 不同品种的猪感染PVC2 之后的差别 |
| 1.3 Mx1 基因研究进展 |
| 1.3.1 Mx1 的基本信息 |
| 1.3.2 猪Mx1 基因抗病能力的研究 |
| 1.4 Cre-LoxP系统的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂和来源 |
| 2.1.4 常用试剂的配制 |
| 2.1.5 主要数据库和生物学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 同源重组载体的构建 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9 靶向载体的构建 |
| 2.2.3 同源重组载体和靶向载体的共转染 |
| 2.2.4 表达Cre酶载体对单克隆细胞的处理 |
| 2.2.5 单克隆细胞的抗病毒能力的处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 同源重组载体的构建 |
| 3.1.1 同源臂扩增 |
| 3.1.2 骨架载体的酶切 |
| 3.1.3 多克隆位点MCS的设计 |
| 3.1.4 筛选标记基因的扩增 |
| 3.1.5 同源重组载体包装慢病毒 |
| 3.1.6 荧光计数法测定的同源重组载体的慢病毒滴度 |
| 3.2 Lenti CRISPR-v2 靶向载体的构建 |
| 3.2.1 Lenti CRISPR-v2 酶切 |
| 3.2.2 sgRNA活性的鉴定 |
| 3.3 同源重组载体和靶向载体共转染 |
| 3.3.1 单克隆细胞的筛选 |
| 3.3.2 单克隆细胞的鉴定 |
| 3.3.3 表达Cre酶的载体处理 |
| 3.4 抗病毒能力的验证 |
| 3.4.1 接种病毒后Mx1 蛋白的表达 |
| 3.4.2 PCV2 病毒的拷贝数测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas9 系统存在的脱靶效应 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统的递送形式 |
| 4.3 Mx1 的抗病毒效应 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（8）藏猪猪圆环病毒2型分离、鉴定与遗传特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 猪圆环病毒2 型研究进展 |
| 1.1.1 PCV2 的发现 |
| 1.1.2 PCV2 的理化特性 |
| 1.1.3 PCV2 的基因组特征 |
| 1.1.4 PCV2 的遗传与变异 |
| 1.1.5 PCV2 的病毒复制 |
| 1.2 猪圆环病毒2 型流行病学研究 |
| 1.2.1 猪圆环病毒病 |
| 1.2.2 国内外流行情况 |
| 1.3 猪圆环病毒2 型与宿主的相互作用 |
| 1.3.1 PCV2 引起的免疫抑制 |
| 1.3.2 PCV2 诱导的细胞自噬 |
| 1.3.3 PCV2 诱导的细胞凋亡 |
| 1.4 猪圆环病毒2 型检测技术 |
| 1.4.1 环介导等温扩增技术检测PCV2 的研究进展 |
| 1.4.2 聚合酶链式反应技术检测PCV2 的研究进展 |
| 1.4.3 酶联免疫吸附试验检测PCV2 的研究进展 |
| 1.4.4 免疫荧光技术检测PCV2 的研究进展 |
| 第二章 西藏林芝猪圆环病毒2 型流行病学调查及病毒分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 检测样本来源 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PCR和荧光定量PCR检测PCV2 相关引物设计 |
| 2.2.2 样本处理和核酸提取 |
| 2.2.3 特异性PCR扩增 |
| 2.2.4 病毒基因组的克隆与序列分析 |
| 2.2.5 分析比较PCV2 全长基因序列 |
| 2.2.6 病毒的分离 |
| 2.2.7 藏猪PCV2 分离毒株的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 特异性PCR扩增结果 |
| 2.3.2 样本中PCV2 全长序列的基因分析 |
| 2.3.3 PCV2 分离毒株PCR检测及全长基因序列鉴定结果 |
| 2.3.4 PCV2 分离株不同代次增殖情况的测定 |
| 2.3.5 间接免疫荧光(IFA)检测 |
| 2.3.6 PCV2 分离株TCID_(50)测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 多重荧光定量PCR检测猪圆环病毒2a、2b和 2d基因型方法的建立与应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒与病料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物的设计及合成 |
| 3.2.2 PCV2a、PCV2b、PCV2d重组质粒标准品的制备 |
| 3.2.3 PCV2 多重荧光定量PCR分型检测方法的建立 |
| 3.2.4 临床样本的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 多重荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.3.2 标准曲线的绘制结果 |
| 3.3.3 特异性试验结果 |
| 3.3.4 灵敏性试验结果 |
| 3.3.5 重复性试验结果 |
| 3.3.6 临床样本的检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PCV2 藏猪分离株感染性克隆的构建及相关特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞及抗体 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 构建感染性克隆质粒引物的设计与合成 |
| 4.2.2 ZZ2、5123 毒株PCR全长基因重组质粒的构建 |
| 4.2.3 ZZ2 毒株基因回补重组质粒的构建 |
| 4.2.4 5123 毒株基因敲除重组质粒的构建 |
| 4.2.5 感染性克隆的构建 |
| 4.2.6 感染性克隆质粒的转染及测序鉴定 |
| 4.2.7 感染性克隆毒株的TCID_(50)测定 |
| 4.2.8 病毒拯救Cap蛋白表达的Western blot检测 |
| 4.2.9 拯救病毒的复制增殖检测 |
| 4.2.10 检测PCV2 体外感染细胞因子m RNA水平 |
| 4.2.11 检测PCV2 体外感染对细胞自噬的影响 |
| 4.2.12 检测PCV2 体外感染对细胞凋亡的影响 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 毒株全长基因组的扩增 |
| 4.3.2 感染性克隆重组质粒的构建 |
| 4.3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.3.4 PCV2 毒株感染性克隆的拯救及测序鉴定 |
| 4.3.5 拯救病毒Cap蛋白的Western blot检测结果 |
| 4.3.6 感染性克隆构建毒株的病毒增殖水平检测 |
| 4.3.7 感染性克隆构建毒株的TCID_(50)测定 |
| 4.3.8 检测PCV2 体外感染细胞因子m RNA水平 |
| 4.3.9 检测PCV2 体外感染对细胞自噬的影响 |
| 4.3.10 检测PCV2 体外感染对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（9）猪圆环病毒2型ORF5基因突变毒株的构建及感染特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2 型的研究进展 |
| 1.1 猪圆环病毒的发现和分类 |
| 1.2 猪圆环病毒的起源和进化 |
| 1.3 猪圆环病毒2 型的流行病学 |
| 1.3.1 传染源 |
| 1.3.2 传播途径和方法 |
| 1.3.3 易感动物及非猪源储存宿主 |
| 1.3.4 致病机制 |
| 1.3.5 临床表现和病理变化 |
| 1.4 PCV2 感染对宿主细胞的影响 |
| 1.4.1 PCV2 感染与细胞内质网应激反应 |
| 1.4.2 PCV2 感染与细胞自噬 |
| 1.4.3 PCV2 感染和细胞凋亡 |
| 1.5 PCV2 的基因定点突变 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 ORF5 基因突变毒株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌株 |
| 2.1.2 试剂、抗体、试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 溶液配制 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 PCV2 克隆毒株和ORF5 基因突变毒株PCV2~(△ORF5)的拯救 |
| 2.2.5 拯救病毒的观察 |
| 2.2.6 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株的复制曲线的绘制 |
| 2.2.7 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株感染细胞后ERS和自噬标志基因的检测 |
| 2.2.8 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株感染细胞后ERS和自噬标志蛋白的检测 |
| 2.2.9 病毒感染细胞的细胞凋亡和细胞周期测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒PUC57-PCV2和PUC57-PCV2~(△ORF5)的酶切鉴定 |
| 2.3.2 rPCV2和PCV2~(△ORF5)拯救病毒的获得 |
| 2.3.3 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株的电镜观察 |
| 2.3.4 rPCV2和PCV2~(△ORF5)毒株的复制曲线绘制 |
| 2.3.5 ORF5 基因突变减弱了PCV2 对细胞ERS的诱导 |
| 2.3.6 ORF5 基因突变减弱了PCV2 对细胞自噬的诱导 |
| 2.3.7 ORF5 基因突变减弱了PCV2 诱导的细胞凋亡及细胞周期阻滞 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PCV2~(△ORF5)对小鼠感染作用和病理观察 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 主要抗体、试剂、试剂盒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.2.2 动物分组和处理 |
| 3.2.3 小鼠感染后各项指标的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ORF5 基因突变毒株PCV2~(△ORF5)成功感染小鼠模型 |
| 3.3.2 小鼠组织病理变化观察结果 |
| 3.3.3 感染组小鼠各组织中ERS和自噬标志基因的检测 |
| 3.3.4 感染组小鼠各组织中ERS和自噬标志蛋白的检测 |
| 3.3.5 透射电镜观察攻毒小鼠组织中自噬小体和内质网应激作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于我国猪圆环病毒研究的文献分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 期刊分布 |
| 2.2 发表时间 |
| 2.3 不同作者发文量 |
| 2.4 作者所在机构 |
| 2.5 研究内容 |
| 2.6 研究对象 |
| 3 讨论与结论 |
四、猪圆环病毒研究进展（论文参考文献）
- [1]猪圆环病毒2型-猪肺炎支原体-副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的研制[D]. 吕茂杰. 吉林大学, 2021
- [2]猪圆环病毒2型和3型鉴别诊断方法的建立与分子流行病学调查[D]. 曹凤阳. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]嵌合型猪圆环病毒灭活疫苗（C1-233株）的临床试验[D]. 高磊. 扬州大学, 2021
- [4]猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制[D]. 孙仁杰. 浙江大学, 2021(02)
- [5]规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整[D]. 宋健颖. 塔里木大学, 2021(08)
- [6]PCV3的分子流行病学调查及分离株的致病性研究[D]. 汪孟航. 中国农业科学院, 2021(01)
- [7]基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究[D]. 石超群. 山东农业大学, 2021(01)
- [8]藏猪猪圆环病毒2型分离、鉴定与遗传特性研究[D]. 钱雯娴. 西藏大学, 2021(12)
- [9]猪圆环病毒2型ORF5基因突变毒株的构建及感染特性研究[D]. 冯全文. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [10]基于我国猪圆环病毒研究的文献分析[J]. 朱家平,周赛赛,钱雯娴,李天娇,何孔旺,索朗斯珠. 黑龙江畜牧兽医, 2021(05)