一、肺腺癌细胞MRP基因甲基化与多药耐药的相关性（论文文献综述）
蔡晓燕[1]（2021）在《MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究》文中进行了进一步梳理背景肺腺癌是多发于支气管黏膜上皮或大支气管黏液腺的恶性肿瘤。肺腺癌易发于年龄偏小、无吸烟史的女性中,且临床症状不明显。肺腺癌虽然肿瘤组织生长缓慢,但多在早期就出现多发转移,因此化疗是目前临床治疗肺腺癌的主要方法之一,但大约三分之一的肺腺癌患者化疗后会产生多药耐药,导致化疗失败。多药耐药是肿瘤细胞对多种化疗药物产生的交叉耐药现象。当今国内外多项研究表明,多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）、结肠癌转移相关基因1（MACC1）与肺腺癌的多药耐药相关。顺铂是临床化学治疗肺腺癌的基本药物,肺腺癌患者对顺铂及顺铂类药物表现出的耐药性,是临床化疗肺腺癌疗效较差的直接原因,因此研发更有效的新型化疗药物已迫在眉睫。目的1.考察肺腺癌组织细胞对顺铂的耐药性。2.探究MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性,为临床采用更为高效的顺铂化疗方案治疗肺腺癌提供实验室参考。方法1.取材及分组:收集手术切除的肺腺癌新鲜标本75例,所有患者进行手术前均未进行放化疗。每份标本均分为2份:1份进行原代细胞的体外培养,以噻唑蓝比色法（MTT法）检测肺腺癌细胞对含顺铂的药敏试验;1份标本处理后以免疫组化法检测腺癌组织细胞中MACC1、MRP、LRP的表达。2.药敏实验:采用MTT法检测肺腺癌细胞对顺铂的总体耐药性,考察不同分化程度、不同TNM分期肺腺癌细胞对顺铂的耐药性。3.MACC1表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞MACC1蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。4.MRP表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞MRP蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。5.LRP表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞LRP蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。6.统计学方法:所有实验数据均带入SPSS17.0统计学软件系统处理。采用t检验进行组间比较,方差分析考察分化程度、TNM分期与肺腺癌对顺铂耐药的相关性,Spearman相关分析考察MACC1、MRP、LRP与肺腺癌对顺铂耐药性的相关性。检验水准α=0.05。结果1.在选取的75例肺腺癌组织中,采用MTT法检测肺腺癌细胞顺铂的耐药性可知:32例（42.67%）对8.0μg.ml-1的顺铂耐药,33例（44.00%）对6.0μg.ml-1的顺铂耐药,31例（41.33%）对4.0μg.ml-1的顺铂耐药,23例（30.67%）对2.0μg.ml-1的顺铂耐药,且对4.0μg.ml-1顺铂的耐药程度高于对2.0μg.ml-1顺铂的耐药程度（P<0.05）,对4.0μg.ml-1和6.0μg.ml-1顺铂的耐药性程度无差异,对6.0μg.ml-1和8.0μg.ml-1顺铂的耐药性程度无差异。肺腺癌细胞对顺铂的耐药性与分化程度和TNM分期无关（P>0.05）。2.MACC1在75例肺腺癌组织中的表达情况为16例（21.33%）-、21例（28.00%）+、27例（36.00%）++、11例（14.67）+++,MACC1的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。3.MRP在75例肺腺癌组织中的表达情况为11例（14.66%）-、23例（30.67%）+、32例（42.67%）++、9例（12.00%）+++,MRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。4.LRP在75例肺腺癌组织中的表达情况为0例（0.00%）-、25例（33.33%）+、31例（41.33%）++、19例（25.34%）+++,LRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。结论1.肺腺癌存在对顺铂的化疗耐药性。2.MACC1的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。3.MRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。4.LRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。
陈雨诗[2]（2020）在《基于线粒体动力学探讨参麦注射液影响肺腺癌细胞顺铂耐药性的分子机制》文中研究指明目的:参麦注射液（Shen-mai Injection,SMI）是临床上常用的中药注射剂,为红参和麦冬水提液。参麦注射液广泛用于治疗心肌梗死、心律失常、心肌纤维化等心血管性疾病;此外,联合化疗药物治疗肺癌、乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤,可明显提高化疗疗效、提高患者生存质量。目前,大多有关参麦注射液的研究都集中在临床治疗方面,但对其抗肿瘤机制尚不多见。本研究以亲代人肺腺癌细胞株A549及顺铂耐药的A549/DDP细胞为模式细胞,从线粒体动力学的角度研究参麦注射液改善肺癌顺铂耐药的分子机制,为寻找中西医结合治疗恶性肿瘤提供科学依据和理论基础。材料与方法:1.利用Kaplan Meier Plotter数据库分析肺腺癌组织中线粒体融合蛋白-2（Mitofusin-2,Mfn2）的基因表达水平与患者生存期的相关性;利用免疫组化法比较人肺腺癌组织及其癌旁组织中Mfn2蛋白表达水平,并进一步评估与其临床指标的相关性;2.Western blot方法比较A549及A549/DDP细胞中Mfn2、线粒体动力学与细胞死亡调控相关蛋白——腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA区域包含3A蛋白（ATPase family AAA domain containing 3A,ATAD3A）的表达水平;3.利用参麦注射液单独或联合顺铂干预A549/DDP细胞,CCK-8法检测参麦注射液对A549/DDP细胞增殖的抑制作用及对顺铂的增敏作用;4.参麦注射液诱导A549/DDP细胞凋亡的检测:A549/DDP细胞分别以（0 mg/m L SMI+0μg/m L顺铂、0 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂、10 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂、15 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂及20 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂）进行干预:（1）利用Hoechst 33234进行染色,荧光显微镜观察细胞核的变化;（2）通过AnnexinⅤ/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;（3）Simple Western检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3）的表达。5.参麦注射液干预A549/DDP细胞,线粒体动力学相关指标的检测:A549/DDP细胞分别以（0 mg/m L SMI+0μg/m L顺铂、0 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂、10 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂、15 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂及20 mg/m L SMI+7μg/m L顺铂）进行干预:（1）线粒体荧光探针（Mito-Tracker Green）标记,利用激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体形态的变化;（2）罗丹明123（Rhodamine 123）染色,利用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;（3）Western blot检测细胞线粒体相关蛋白（Mfn2与ATAD3A）的表达情况。结果:1.Mfn2表达水平与肺腺癌相关性分析（1）Mfn2表达m RNA及蛋白表达水平与临床病理学指标分析:对数据库中504例肺腺癌患者按照Mfn2基因表达水平中位数将病例分成Mfn2高表达组和Mfn2低表达组,根据生存曲线分析表明,Mfn2低表达的肺腺癌患者预后较差;对75例肺腺癌组织及癌旁组织中Mfn2蛋白表达水平进行免疫组化分析,结果显示,相对于癌旁组织,肺腺癌组织中Mfn2低表达,但Mfn2的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小及分期无关。（2）Mfn2表达表达水平与肺腺癌细胞顺铂耐药性分析:相对于亲代肺腺癌A549细胞,顺铂耐药的A549/DDP细胞中Mfn2表达水平降低、ATAD3A表达水平升高。2.参麦注射液联合顺铂对肺腺癌细胞耐药性的影响（1）CCK8显示参麦注射液对A549/DDP细胞的增殖具有明显抑制作用;参麦注射液可增敏顺铂对A549/DDP的细胞毒性作用。（2）参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞,可诱导细胞发生线粒体凋亡。与单纯顺铂干预相比,参麦注射液联合顺铂可促进细胞凋亡数量增加,激活凋亡相关蛋白Caspase 3,且上调促凋亡蛋白Bax、下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平。（3）参麦注射液联合顺铂诱导A549/DDP细胞发生线粒体凋亡,与其影响线粒体动力学相关。参麦注射液联合顺铂干预,可改变线粒体动力学使之更趋向于融合,同时使线粒体质量下降、线粒体膜电位降低,同时伴随线粒体融合蛋白Mfn2表达上调、线粒体动力学与细胞死亡调控相关蛋白ATAD3A的表达下调。结论:1.肺腺癌组织与癌旁组织相比Mfn2低表达,但与患者性别、年龄、肿瘤大小及分期无关;但肺腺癌组织中的Mfn2低表达与患者预后不良相关;且肺腺癌细胞中Mfn2低表达与顺铂耐药相关。2.参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞,可通过诱导细胞发生线粒体凋亡而影响肺腺癌细胞顺铂耐药性,且其诱导细胞的机制可能与药物的联合作用干预了肺腺癌细胞线粒体动力学。
李钰[3]（2019）在《抑制xCT通过诱导铁死亡逆转肺腺癌细胞对顺铂耐药的研究》文中认为目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,长期居于癌症相关致死率的首位。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常见的类型,约占85%。尽管外科手术是NSCLC的首选治疗,但术后仍有较高复发率,而且大部分中晚期NSCLC失去手术机会,因此多疗程化疗是决定患者生存期限的重要辅助治疗手段。以顺铂（Cisplatin,CDDP）为核心化疗方案的快速耐药是预后不良的重要原因。因而,探索有效辅助治疗方案成为延长患者生存率和改善患者预后的关键。顺铂主要通过形成顺铂-DNA复合体,激活DNA损伤,进而诱导肿瘤细胞凋亡;顺铂诱导恶性肿瘤细胞发生程序性死亡的另一个重要机制就是上调细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,破坏细胞内稳态,造成氧化应激（oxidative stress）,氧化/抗氧化失衡,从而诱导肿瘤细胞凋亡。以肺腺癌为代表的多种肿瘤细胞存在凋亡通路信号转导障碍、抗凋亡蛋白被激活以及受到多药耐药基因高表达的影响,对凋亡机制的耐药十分明显,以往大多针对信号转导障碍靶点研发新药或者多种化疗药物联合应用,来解决原发性和继发性凋亡抵抗,以此提高化疗药物介导的肿瘤细胞凋亡水平。遗憾的是,由于凋亡通路存在极其完整的互补代偿机制不易长时间被小分子药物所抑制或激活,加之联合应用多种化疗药物所引发的人体难以耐受的副作用等问题,导致这方面的探索始终未能取得较大进展。诱导肺腺癌顺铂耐药细胞发生非凋亡性死亡是克服顺铂抵抗的新策略。Nrf2是抗氧化系统的主要调控因子,表达大量抗氧化基因,在抗氧化防御起到重要作用。在相当比例的肺腺癌中,由于Nrf2的抑制因子Keap1存在变异,导致Nrf2持续活化,参与其对化疗药物的抵抗性。但是Nrf2/ARE具体的下游基因如xCT尚未确定,是否参与肺腺癌顺铂抵抗尚不明确。另外,最近被报道的铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖的非凋亡性细胞死亡形式,铁死亡发生的本质是由脂质活性氧（lipid reactive oxygen species,lipid ROS）在胞浆中蓄积而诱发的一种具有铁离子依赖性的程序化细胞死亡,最显着的细胞亚显微结构改变是透射电子显微镜下线粒体内膜缩小。细胞发生铁死亡最直观的特征是不能被程序性坏死、凋亡、以及坏疽的小分子抑制剂Nec-1（necrostatin-1,坏死稳定素1）、BOC-D-FMK和Z-VAD-FMK阻断;但可以特异性地被铁离子螯合剂deferoxamine（DFO,去铁胺）、及亲脂性抗氧化剂vitamin E（Vit-E）,ferrostatin-1（Fer-1）所抑制。而铁死亡的诱导机制之一就是抑制xCT对胱氨酸向细胞内转运,靶向阻断xCT通过阻断胱氨酸摄取导致谷胱甘肽耗竭,并使癌细胞对化疗剂敏感。xCT抑制剂包括小分子化合物Erastin、Sorafenib。遗憾的是,肺腺癌铁死亡的研究尚处空白。综上所述,本实验需要证实:（1）Nrf2/xCT通路活化是否参与肺腺癌顺铂耐药;（2）抑制xCT是否提高顺铂耐药的肺腺癌细胞对顺铂敏感性;（3）抑制xCT是否诱导肺腺癌顺铂耐药细胞发生铁死亡。研究方法:1、CCK-8方法测定不同浓度顺铂干预下的肺腺癌细胞系和腺癌组织标本原代培养细胞的存活率。2、RT-qPCR方法测定顺铂干预后肺腺癌细胞系和腺癌组织标本原代培养细胞中Nrf2,xCT,HO-1和NQO1的mRNA表达水平。3、Western blotting测定顺铂干预后NSCLC细胞系和腺癌组织标本原代培养细胞中Nrf2,xCT,H0-1和NQO1的蛋白表达水平。4、含ARE双荧光素酶报告基因检测Nrf2和xCT的转录活性。5、在顺铂耐药相对较明显的A549细胞中,我们用转染siRNA的方法敲减了Nrf2和xCT。并用WB验证了siRNA对相应基因的敲减效率。测定对顺铂的敏感性。6、对顺铂相对较为敏感的N5细胞中过表达了Nrf2或xCT,测定对顺铂的敏感性。7、采用H2DCFDA方法测定顺铂干预后细胞ROS产生量。8、将对顺铂相对敏感的N5细胞驯化建立顺铂抵抗细胞系（N5CP）9、N5CP分别经Erastin/Sorafenib,DFO,Vit-E干预后,CCK-8法测定细胞的存活率,PI方法测定细胞的死亡率。10、N5CP细胞种植在裸鼠皮下,分别经顺铂、Erastin或Sorafenib腹腔内注射后,称量肿瘤重量。结果:1、10-80μg/mL顺铂对四种肺腺癌细胞（NCI-H1299,A549,N2和N5,N2和N5来源于外科手术切除的腺癌组织的原代培养细胞）表现出不同的细胞毒性效果。其中,A549细胞对顺铂耐药最明显,而N5细胞对顺铂最敏感。2、A549和N5细胞暴露于20μg/mL顺铂分别作用3-12小时,顺铂上调了Nrf2和其下游靶基因xCT mRNA的表达,并未明显改变HO-1和NQO1的mRNA表达水平。尤其xCT在12小时被显着提高了8.6倍。3、WB结果可以看出顺铂作用下A549细胞暴露于20 to 40μg/mL顺铂12小时后,Nrf2及xCT蛋白表达明显增加,xCT增加尤其显着,与上述mRNA水平结果一致。4、顺铂诱导了ARE双荧光素酶报告基因活性,并且相对于N5细胞,顺铂对A549细胞中Nrf2转录能力活化作用更为显着。5、转染siRNA的方法敲减了Nrf2和xCT的A549细胞,经20μg/mL顺铂处理48小时,细胞的存活率较对照组明显降低（p<0.05）,说明敲减Nrf2或xCT的A549细胞对顺铂敏感性显着提高。6、N5细胞中Nrf2或xCT表达水平提高显着降低了顺铂对N5的细胞毒性。7、20μg/mL顺铂作用6小时后,A549和N5细胞内的ROS（reactive oxygen species）水平。结果可以看出,顺铂显着诱导了N5细胞ROS蓄积,说明顺铂敏感的N5细胞内产生ROS多于对顺铂不敏感的A549细胞。8、Erastin 10μM和Sorafenib 20μM大幅降低了N5CP细胞的存活率（p<0.05）。并且,可以被铁死亡特异性抑制剂去铁胺DFO（50μM）及抗氧化剂Vit-E（100μM）显着抑制,说明细胞发生的死亡方式为铁死亡。同时,我们也用PI染色法,检测了Erastin和Sorafenib作用时,细胞的死亡情况。Erastin和Sorafenib明显增加PI染色阳性的N5CP细胞（p<0.05）。9、N5CP细胞种植在裸鼠皮下,分别经顺铂、Erastin或Sorafenib腹腔内注射后,肿瘤重量减轻。结论:1、Nrf2/.xCT通路活化是肺腺癌细胞顺铂耐药的重要机制,其中肺腺癌细胞对顺铂的敏感性与顺铂介导的Nrf2/.xCT通路活化水平呈负相关。Nrf2/xCT表达水平变化改变了肺腺癌细胞对顺铂敏感性。2、抑制xCT可以高效率的诱导顺铂耐药的肺腺癌细胞发生铁死亡。
曹斐[4]（2018）在《FOX-A1参与人肺腺癌多西他赛化疗耐药的机制研究》文中指出目的:研究转录因子FOX-A1在人肺腺癌多西他赛化疗耐药中的作用及其机制。方法:使用Real-time RT-PCR,Western blot方法检测人肺腺癌细胞株SPC-A1和H1299及多西他赛耐药细胞株SPC-A1/DTX和H1299/DTX中FOX家族重要成员的基因表达。并对52例晚期肺腺癌患者的组织样本进行检测,分析相关基因的表达情况,以及其与多西他赛耐药和患者临床预后之间的关系。通过平板克隆形成实验、Transwell实验、CCK-8实验、体内移植瘤实验分析FOX-A1在肺腺癌细胞多西他赛耐药中的作用。染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告实验确定FOX-A1的下游靶基因,并研究其靶基因对多西他赛耐药的肺腺癌细胞EMT、迁移、侵袭、凋亡的影响。使用Real-time RT-PCR方法检测肺腺癌细胞、组织中的下游靶基因的表达,并统计分析其与肺腺癌患者临床预后、FOX-A1表达以及多西他赛耐药的关系。结果:FOX-A1在多西他赛耐药的细胞系SPC-A1/DTX及H1299/DTX中的表达显着上调。FOX-A1在人肺腺癌组中较正常组织中表达上调,且其在多西他赛耐药的病人肺腺癌组织中表达明显上调。统计分析显示FOX-A1的表达与肺腺癌患者预后不良相关,多变量Cox回归分析提示FOX-A1是PFS和OS的独立不良预后因子。在多西他赛耐药的肺腺癌细胞中抑制FOX-A1表达可抑制细胞克隆形成、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,并逆转EMT。体内外实验表明抑制FOX-A1可增强DTX耐药的肺腺癌细胞对DTX化疗敏感性。染色质免疫共沉淀及双荧光素酶报告实验提示,SOX5是FOX-A1的直接靶点。SOX5的下调可抑制多西他赛耐药的肺腺癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭,且可促进细胞凋亡,并逆转EMT。SOX5在肺癌组织中较正常肺组织中上调,且其在多西他赛耐药病人的肺癌组织中显着上调。Kaplan-Meier分析表明SOX5的高表达与较短的PFS和OS显着相关。线性回归分析结果显示SOX5与FOX-A1表达呈统计学正相关。结论:本研究揭示了 FOX-A1/SOX5信号轴可作为调节人肺腺癌对多西他赛耐药的重要信号通路,并且为多西他赛耐药的肺腺癌治疗提供新的治疗靶点。
宋英华[5]（2017）在《E3泛素化连接酶NEDD4-1调控PTEN参与肺腺癌发生发展和化疗耐药的研究》文中研究说明研究背景肺癌是危害人类健康的最常见肿瘤之一,高居恶性肿瘤的首位,近年来在世界范围内发病率和致死率都呈急剧上升的趋势。非小细胞肺癌（no small cell carcinoma,NSCLC）占所有肺恶性肿瘤的80%,其中腺癌（adenocarcinoma,ADC）占NSCLC的60%,因此肺腺癌是NSCLC最常见的病理组织学类型。肺癌的传统治疗以手术切除辅以放化疗为主,近十年来分子靶向治疗在改善NSCLC特别是肺腺癌患者预后方面取得了巨大的进展,有效的延长了患者的生存时间。但是,即使治疗的手段不断进步,肺腺癌患者的5年总生存率仍低于30%,即使是肺腺癌Ⅰ期的完整切除肿瘤的患者,肿瘤的复发仍占有很大的比例（约30%）;而大多数肺腺癌患者在确诊时即为晚期,因此传统化疗在晚期肺腺癌患者的治疗策略中占有主导地位。部分肺腺癌患者对放化疗甚至靶向药物产生的耐药现象,尤其是多药耐药（multidrugresistance,MDR）表型的出现依然仍是患者化疗失败和预后不良的重要分子事件之一。因此,寻找促进肺癌发生发展的薪的分子机制,明确新的分子靶点和逆转肿瘤化疗耐药的方法是预防复发转移和改善肺腺癌预后的有益探索。肺癌的发生发展和耐药发生机制复杂,涉及到多种抑癌基因和癌基因的表达失调。目前,细胞信号传到通路与肿瘤的发生发展以及肿瘤耐药的关系成为肺癌研究的新亮点。其中PTEN-PI3K/Akt细胞信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一,多种生长因子激活通路中的关键蛋白活化PI3K,使Akt磷酸化激活下游的多种靶基因,如BAD、mTOR、FKHR、GSK3β和MDM2等,从而促进细胞存活、生长、增殖和恶性转化等生物学过程和表型,与肺腺癌的发生发展和预后关系密切。抑癌基因PTEN（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）是这一通路的抑制分子,能通过使第二信使PIP3脱磷酸化为PIP2,拮抗PI3K/Akt细胞信号通路信号传递过程而发挥其抑癌作用。在肺腺癌中,PTEN的失表达率可达30～50%,是肺腺癌发生早期最常见的分子事件,失活机制除了基因突变和缺失之外,翻译后修饰可能也是其失活的重要机制。PTEN的泛素化是其在胞质泛素-蛋白酶体系中降解和影响蛋白稳定性的主要翻译后修饰过程,这一过程的增强可能是PTEN缺失表达的机制之一。由于PTEN-PI3K/Akt通路在诸多信号传导途径中的中心地位备受关注,目前认为,肺腺癌细胞中PTEN失活介导P13K/Akt信号通路活化,是促进肿瘤细胞发生恶性转化和化疗耐受的重要机制,这一通路异常还与患者的不良预后密切相关。NEDD4-1（Neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4,NEDD4-1）是NEDD家族成员之一,是一种E3泛素化连接酶,可通过其协同蛋白Ndfip1等共同作用下使PTEN发生泛素化,多泛素化促进PTEN在胞质中的降解,单泛素化可发生细胞核转入,从而调控PTEN的稳定性和亚细胞定位,因此NEDD4-1介导的泛素化可能是调控PTEN的翻译后修饰的主要机制。多项研究证实,NEDD4-1的高表达和PTEN的表达缺失存在于大多数人类恶性实体肿瘤组织中,并与肿瘤的进展和化疗敏感性密切相关。新近研究发现NEDD4-1是某些恶性肿瘤,如前列腺癌、乳腺癌等患者的独立的预后因子。但是,NEDD4-1在肺腺癌中的表达和预后意义尚未可知,参与调控PTEN的表达以及对化疗耐受的关系和机制的研究鲜见报道。研究目的研究泛素化E3连接酶NEDD4-1在肺腺癌组织中的表达,及其与浸润转移和化疗敏感性等多种临床病理因素之间的相关性,并初步探讨其提示肺腺癌患者预后的价值。采用肺腺癌细胞株A549和耐药细胞A549/DDP细胞,通过转染特异性siRNA沉默NEDD4-1的表达,探讨对肺腺癌敏感细胞A549和多药耐药细胞A549/DDP的生长、凋亡、浸润迁移能力、EMT表型以及对化疗药物的敏感性的影响;初步分析NEDD4-1沉默对PTEN-PI3K/Akt信号传导通路的活性的调控作用和机制;探讨NEDD4-1沉默对耐药蛋白P-糖蛋白、LRP和MRP等的耐药相关蛋白的表达的影响;研究对NF-κb和AP-1等细胞转录因子在此调控过程中的影响;为肺腺癌的靶向性基因治疗和耐药逆转提供理论基础和依据。研究方法我们采用免疫组织化学的方法回顾性分析研究了 135例肺腺癌组织及对应癌旁组织中NEDD4-1、PTEN和p-Akt的表达,同时采用Western Blot和RT-PCR的方法研究了 20例新鲜肺腺癌组织中的表达,分析蛋白之间的相互表达关系及与各临床病理因素和预后的关系和临床意义。培养肺腺癌细胞系A549和耐药细胞A549/DDP,转染NEDD4-1的siRNA进行蛋白沉默,采用MTS方法检测细胞生存活性和对顺铂和紫杉醇等化疗药物的敏感性,Transwell小室和琼脂糖实验检测细胞干预前后迁移和浸润能力的改变,采用流式细胞学检测细胞凋亡,实时定量RT-PCR检测转染siNEDD4-1沉默效率和靶基因mRNA水平的表达,Western blot检测沉默前后细胞内NEDD4-1、PTEN、p-Akt和NF-kB的表达分析对PTEN-PI3K/Akt细胞信号通路分子的影响;检测凋亡蛋白BAD、Bcl-2、Caspase和MDM2等的表达以及EMT表型相关蛋白Vimentin和E-cadherin等表达;采用激光共聚焦显微镜研究PTEN在细胞内分布和含量的改变,免疫共沉淀检测对PTEN泛素化状态的影响;同时Western blot检测NEDD4-1对细胞内P-gp、LRP和MRP等多药耐药相关蛋白表达的影响,分析NEDD4-1与肺腺癌发生发展,预后提示,细胞药物敏感性的关系,以及在调控PTEN-PI3K/Akt细胞信号通路活性中可能发挥的作用。结果1.NEDD4-1在肺腺癌组织中呈显着高表达状态,而在周围肺肿瘤肺组织中呈弱表达或阴性表达（P<0.01）。分析结果显示,NEDD4-1高表达与患者的肺门淋巴结转移状态、TNM分期和化疗耐受等临床病理因素密切相关（P分别<0.05）,而与其他多种临床病理学因素均不相关。PTEN在肺腺癌组织中的失活率显着高于周围非肿瘤性肺组织（P<0.01）,并与淋巴结转移、组织学类型、TNM分期和化疗敏感性密切相关（P分别<0.05）,此外还与EGFR突变状态相关。P-Akt在肺腺癌中的表达较周围肺组织明显升高,差异有显着性意义,并与患者的临床分期和化疗耐受性相关（P<0.05）。NEDD4-1与PTEN表达呈负相关关系（r =-0.632,P = 0.01）,而与P-Akt表达呈正相关关系（r = 0.689,P = 0.05）。同时Cox比例风险模型和Kaplan-Meier曲线分析检测显示NEDD4-1高表达和PTEN低表达与患者的不良预后相关（P<0.05）,多因素分析结果显示NEDD4-1和PTEN是肺腺癌患者的独立的预后因子。2.SiRNA介导的NEDD4-1沉默诱导肺腺癌敏感细胞A549细胞生长抑制,抑制率为42.97 ± 3.04%;促进细胞发生凋亡;Transwell小室检测显示siNEDD4-1导致A549细胞的浸润和迁移能力明显下降;Western blot检测发现NEDD4-1沉默增加了 A549细胞质中PTEN的表达水平,同时激光共聚焦检测实验结果显示沉默后胞浆内PTEN和细胞核内PTEN荧光信号较对照组均有不同程度增强,而免疫沉淀显示PTEN泛素化水平降低。NEDD4-1沉默后细胞内p-Akt的活化程度降低,从而阻断了 PI3K/Akt细胞信号通路的活性,并调控其下游的多种靶蛋白的表达,如检测凋亡蛋白BAD表达升高,mTOR磷酸化水平降低,细胞核转录因子NF-kB p65蛋白表达降低。3.沉默肺腺癌耐药细胞A549/DDP中的NEDD4-1蛋白表达后,MTS检测发现细胞顺铂和紫杉醇等化疗药物的耐受性降低而敏感性增加,IC50值均有不同程度的降低:流式细胞仪检测发现细胞在化疗药物处理后的凋亡率增加;transwell小室显示NEDD4-1沉默后细胞浸润和迁移能力降低;琼脂糖克隆形成能力下降;罗丹明外排实验显示NEDD4-1沉默组细胞内罗丹明含量实验组高于对照组;Western blot检测结果显示PTEN表达增加p-Akt磷酸化水平降低,其下游凋亡蛋白BAD和Caspase表达上调而抗凋亡蛋白Bcl-2和MDM2表达下调;EMT相关蛋白E-cadherin表达增加而Vimentin表达下降;重要的是,NEDD4-1沉默还显示耐药蛋白P-gp、MRP和LRP蛋白的表达水平较干预前有所降低,其中P-gp蛋白和mRNA水平均降低并伴有其细胞转录因子NF-kB和AP-1下调（P均<0.05）。结论1.肺腺癌中NEDD4-1和p-Akt表达较周围肺组织明显上调,而PTEN表达缺失,三者均与肺腺癌的肿瘤进展和化疗耐受相关,多因素分析显示NEDD4-1高表达和PTEN低表达均与肺腺癌患者的不良预后有关。本结果提示NEDD4-1表达上调可能是肺腺癌发生发展中的常见分子事件,其高表达可能与肺腺癌患者的耐药表型出现密切相关,可能是预测肺腺癌患者预后的因子之一。2.SiNEDD4-1对肺腺癌NEDD4-1的沉默能有效的降低A549细胞内NEDD4-1的表达,抑制肺腺癌细胞A549的生长,增加细胞凋亡,细胞的浸润和迁移能力都明显降低,提示NEDD4-1表达上调可能促进肺腺癌细胞生长存活和的浸润转移过程,与肿瘤的复发转移能力及预后相关。NEDD4-1可能是促进细胞恶性表型的一种原癌基因。3.SiNEDD4-1对肺腺癌细胞NEDD4-1沉默后,细胞质PTEN表达增加而泛素化水平下降,并见在细胞质和细胞核中聚集量增加,这能有效下调磷酸化p-Akt水平,提示NEDD4-1介导的PTEN泛素化通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。此外,其下游靶蛋白BAD表达上调,磷酸化mTOR下调以及细胞录因子NF-Kb p65亚单位表达表达水平下降,均提示NEDD4-1表达上调通过泛素化过程拮抗PTEN的抗癌作用,活化PI3K/Akt细胞信号通路及其下游靶蛋白来诱导肺腺癌细胞生长存活和出现化疗耐受表型。4.SiNEDD4-1对肺腺癌细胞NEDD4-1转染沉默后,A549/DDP细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性均不同程度的增加,并检测到多药耐药蛋白P-gp、MRP和LRP的表达降低,提示NEDD4-1沉默能部分的提高肺腺癌细胞对化疗药物的敏感性,并可能通过调节PTEN增加凋亡、抑制EMT表型或降低耐药相关蛋白的表达部分逆转A549/DDP细胞的耐药性,这一结论提示NEDD4-1可能成为逆转肺腺癌化疗耐药的分子靶蛋白,其小分子抑制剂的研究为肺腺癌的治疗提供了新的思路和方法。总之,NEDD4-1在肺癌组织中高表达通过泛素化拮抗PTEN的活性,活化了PI3K/Akt细胞信号通路并作用于多种靶蛋白,从而促进了肺腺癌细胞的生长,浸润和迁移过程,同时还增加了肺腺癌细胞对于化疗药物的耐受性,并部分的促进了肺多药耐药相关的耐药蛋白的表达水平的增加,继而参与了肺腺癌的肿瘤进展过程,使患者出现肿瘤复发和转移,并提示患者的不良预后。因此,我们认为NEDD4-1可能使肺腺癌治疗的一个新的分子靶点,对于临床治疗提供了新的思路和策略。
高燕萍[6]（2017）在《E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控人肺腺癌细胞化疗敏感性的分子机制研究》文中研究说明一、背景与目的肺癌是全球范围内发病率和死亡率均位居第一的恶性肿瘤,非小细胞肺癌大约占了 4/5,其中又以腺癌最为常见。对于进展期NSCLC患者,多药耐药的产生是限制其临床疗效的重要原因。肿瘤细胞耐药现象的最终形成是一个多基因、多因素的复杂过程,涉及关键信号通路上众多癌基因和抑癌基因的调控异常。MiRNA是表观遗传调控体系的重要组分,可在转录后水平负向调控基因表达。近期研究表明miRNA及其靶基因可形成功能反馈性调控通路,广泛参与肿瘤发生发展和耐药形成。前期研究发现:miR-200b/E2F3功能轴表达紊乱与肺腺癌耐药表型形成密切相关,并发现E2F3b可能对miR-200b产生负向调控。本课题在前期成功建立耐多西他赛人肺腺癌细胞模型、miRNA-200b生物信息学及功能学分析的基础上,拟采用荧光素酶报告基因、凝胶阻滞、染色质免疫共沉淀、位点突变、基因干涉及过表达等实验方法,分析肺腺癌耐药细胞中E2F3b与miR-200b间的负反馈调控关系,并通过体外细胞和活体动物模型分析E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控肺腺癌细胞化疗敏感性的可能机制,为临床逆转肺腺癌耐药提供新的策略。二、方法与结果方法:1.生物信息学分析miR-200b基因P2启动子区的E2F3结合位点。利用GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/Nucleotide）检索并结合以往文献报道,获取miR-200b基因P2启动子全长序列（-1004～+34）。接下来,利用RT-PCR方法从结肠癌细胞基因组DNA中扩增miR-200b基因P2启动子全长序列,利用分子克隆技术成功构建该启动子调控的萤火虫荧光素酶质粒载体（pGL3-miR-200b/promoter）,并构建多种启动子区部分缺失型突变体,分别转染SPC-A1/DTX细胞,利用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒测定萤火虫荧光素酶活性。随后通过启动子在线分析软件CoreBoostHM（http://rulai.cshl.edu/tools/CoreBoostHM/）及转录因子结合位点在线分析软件 TFSEARCH（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）、CONSITE（http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite）对该核心启动子区进行分析。2.E2F3a和E2F3b真核表达载体构建。针对人E2F3a和E2F3b基因表达编码框分别设计PCR引物,以肺腺癌细胞SPC-A1为cDNA模板,利用PCR方法扩增并克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）（购自上海英骏生物科技有限公司）的BamHI和XhoI酶切位点之间。利用PCR引物在线设计软件设计引物并进行BLAST同源性筛选,引物由上海生工生物工程有限公司合成,载体构建成功后进行测序验证,分别命名为:pcDNA/E2F3a、pcDNA/E2F3b。3.E2F3干涉表达载体构建。利用Ambion在线siRNA序列分析软件设计E2F3基因干涉序列并进行BLAST同源性筛选,序列由上海吉玛生物公司合成,正义及反义链退火后克隆到真核表达载体pSilencer4.1-CMVneo（购自美国Ambion公司）的BamHI和HindⅢ酶切位点之间。克隆成功后进行测序验证,命名为:pSil/shE2F3。4.基因转染、稳定筛选及目的基因检测。分别将pcDNA/E2F3a、pcDNA/E2F3b质粒载体转染入亲本细胞株SPC-A1及H1299中,将pSil/shE2F3质粒载体转染入耐药细胞株SPCA-1/DTX及H1299/DTX中,同时设空载体转染对照组。G418抗生素稳定筛选后,将得到的稳定转染细胞系分别命名为:SPC-A1/pcDNA/E2F3a、SPC-A1/pcDNA/E2F3b和 SPCA-1/DTX/shE2F3;H1299/pcDNA/E2F3a、H1299/pcDNA/E2F3b 和H1299/DTX/shE2F3。以 Western Blot 法检测 E2F3 蛋白表达水平;参照 TaqMan（?）MicroRNA检测试剂盒（购自美国ABI公司）说明书,以荧光实时定量RT-PCR法检测miR-200b表达水平。5.验证E2F3（a/b）、miR-200b表达与肺腺癌耐药表型相关性。通过稳定转染以人为改变SPC-A1/DTX及SPC-A1细胞中E2F3表达水平,荧光实时定量RT-PCR和/或Western Blot法检测E2F3和miR-200b表达情况,MTT法测定细胞对多西他赛IC50值。6.利用 qRT-PCR 和 Western Blot 分别检 E2F3a 和 E2F3b 在 SPC-A1/DTX、H1299/DTX 耐药细胞和相应SPC-A1、H1299亲本细胞中的mRNA和蛋白表达水平。如前述得到稳定转染的两对细胞系 SPC-A1/pcDNA/E2F3a、SPC-A1/pcDNA/E2F3b、SPCA-1/DTX/shE2F3和 H1299/pcDNA/E2F3a、H1299/pcDNA/E2F3b、H1299/DTX/shE2F3,分别在 mRNA水平和蛋白水平进行验证。7.启动子活性测定。利用脂质体Lipofectamine 2000介导法,分别将pcDNA/E2F3a、pcDNA/E2F3b与含有miR-200b核心启动子序列的质粒载体pGL3-miR-200b/promoter共转染 SPC-A1 细胞,将 pSil/shE2F3 与 pGL3-miR-200b/promoter 共转染 SPC-A1/DTX 细胞,利用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒测定萤火虫荧光素酶活性。8.染色质免疫共沉淀实验。利用甲醛固定法使SPC-A1/DTX细胞中miR-200b启动子区与其相结合的转录调控因子交联,使用E2F3b特异性抗体与E2F3b结合,沉淀法分离复合物,PCR法扩增与各转录因子特异性结合的启动子序列,获得细胞内E2F3b与miR-200b启动子直接结合的证据。9.细胞水平分析E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控肺腺癌细胞化疗敏感性的可能机制。利用MTT法测定其多西他赛的IC50值。体外验证E2F3b影响肺腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期。利用克隆形成实验分别测定各组体外增殖率差异;利用流式细胞技术,分别检测各组细胞的早期凋亡率和细胞周期分布情况。10.拯救试验验证E2F3b通过miR-200b途径参与肺腺癌化疗耐药形成。上述构建SPC-A1/pcDNA/E2F3b 和 H1299/pcDNA/E2F3b 中分别共转染 miR-NC mimics 或共转染miR-200 mimics,与 SPCA-1/NC、SPC-A1/pcDNA/E2F3b 及 H1299/NC、H1299/pcDNA/E2F3b一起分别进行四组间DTX的MTT法分析IC50、增殖、凋亡以及细胞周期中G2/M相分布比例;上述构建SPCA-1/DTX/shE2F3和H1299/DTX/shE2F3分别共转染miR-NC inhibitor或共转染miR-200 inhibitor与SPCA-1/DTX/NC、SPCA-1/DTX/shE2F3和1299/DTX/NC、H1299/DTX/shE2F3一起进行四组间DTX的MTT法分析IC50、增殖、凋亡以及细胞周期中G2/M相分布比例。11.活体动物水平分析E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控肺腺癌细胞化疗敏感性。将pSil/shE2F3及对照质粒分别转染到SPC-A1和SPC-A1/DTX/细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型。密切观察成瘤情况,当瘤体直径达5mm左右时,分别给予DTX（20mg/kg）行腹腔内注射治疗,按公式a×b2/2（a为长径,b为短径）计算皮下瘤体积（单位是mm3）,绘制生长曲线。打药注射35天后处死,剥离瘤块提取肿瘤组织的总RNA和蛋白,qRT-PCR和Western Blot法检测miR-200b和E2F3b表达水平差异。利用免疫组化法检测各组肿瘤组织中Ki67和PCNA 阳性表达水平。利用TUNEL法对石蜡包埋的肿瘤组织切片中的细胞进行凋亡原位检测,分析各组凋亡率差异。结果:1.miR-200b基因P2启动子的核心区域位于-200～+34处。该核心启动子内含有一个潜在的 E2F3 结合位点（5’-TTTC[A]CGC-3’）,位于-133～-126 处。2.对比亲本SPC-Ai细胞,耐药SPC-A1/DTX细胞较存在显着的E2F3过表达。在SPC-A1/DTX细胞中敲除E2F3基因表达后,miR-200b表达水平显着升高,同时细胞对多西他赛敏感性增高;另一方面,在SPC-A1细胞中过表达E2F3a时miR-200b表达无明显改变,而过表达E2F3b时则出现miR-200b表达降低并伴随多西他赛敏感性降低。3.qRT-PCR结果显示与亲本株SPC-A1和H1299相比,耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平明显降低（p<0.01）;在亲本细胞中分别转染了过表达E2F3a和E2F3b的质粒,在耐药细胞中转染了干扰E2F3的质粒,E2F3b过表达后亲本细胞的miR-200b表达量明显下降,而E2F3a过表达后变化不明显。耐药珠中干涉E2F3后miR-200b表达量明显升高（p<0.01）。在亲本细胞SPC-A1和H1299细胞中分别转染了过表达E2F3a和E2F3b的质粒后通过qRT-PCR结果及western blot检测验证其过表达效果（p<0.01）。同样在耐药珠中转染了三种E2F3干涉表达载体,根据qRT-PCR结果及western blot结果挑选出来干扰效果最好的3号载体进行后续试验（p<0.01）。4.ChIP实验结果显示在SPC-A1和SPC-DTX细胞系里转录因子E2F3都可以调控miR-200b启动子区域,验证了 E2F3与miR-200b启动子直接结合。荧光素酶活性测定发现在SPC-A1细胞中过表达E2F3b可以降低miR-200b基因启动子活性,SPC-DTX细胞中干扰E2F3可升高miR-200b基因启动子活性（p<0.01）,验证了 E2F3b能够直接调控miR-200b启动子活性。5.MTT实验分别测定其对DTX的IC50值,过表达E2F3b后IC50值显着升高,亲本细胞的化疗敏感性减低,而相反干扰掉E2F3后,体外化疗敏感性升高（p<0.01）。证实E2F3b/miR-200b轴与肺腺癌细胞多西他赛敏感性密切相关。6.克隆形成实验结果表明:过表达E2F3b后明显增强了亲本细胞的体外增殖能力,而下调E2F3表达抑制了耐药珠细胞的体外增殖能力（p<0.01）。流式细胞术检测细胞凋亡结果表明:亲本细胞中过表达E2F3b后明显减弱细胞凋亡,过表达E2F3a并未观察到明显效果。而下调E2F3表达增强了耐药株的细胞凋亡。流式细胞术检测细胞周期结果表明:亲本细胞中过表达E2F3b后明显缩短G2M期,延长S期（p<0.05）,而下调E2F3表达明显延缓了 G2M 期（p<0.01）。7.在亲本细胞中转染E2F3b过表达载体,同时共转染miR-200b及其对应的NC组,检测miR-200b的表达变化,可以发现共转染200b后E2F3b过表达引起的miR-200b表达减低被逆转（p<0.01）。MTT结果表明过表达E2F3b使化疗敏感性降低可部分通过miR-200b而逆转;抑制E2F3b后升高的化疗敏感性可通过加入miR-200b抑制剂后又降低（p<0.01）。克隆形成实验结果表明:过表达E2F3b后亲本细胞的体外增殖能力增强,共转染miR-200b以后体外增殖能力又减弱,同样抑制E2F3b后体外增殖力降低可通过加入miR-200b抑制剂后又逆转（p<0.01）。流式细胞术检测细胞凋亡,过表达E2F3b后亲本细胞凋亡减弱,共转染miR-200b以后凋亡又明显增强,同样抑制E2F3b后增强的凋亡可通过加入miR-200b抑制剂后又逆转（p<0.01）。流式细胞术检测细胞周期,过表达E2F3b后亲本细胞G2M期缩短,S期延长,共转染miR-200b以后可以部分逆转,同样抑制E2F3b后G2M期延长,S期缩短也可以通过加入miR-200b抑制剂后又逆转（p<0.01）。8.收集转染干扰E2F3载体的人肺腺癌亲本细胞和耐药株,构建裸鼠皮下移植瘤,给予DTX腹腔内注射后测量绘制肿瘤生长曲线。结果表明:给予DTX药物后,与对照组比较,干扰E2F3组肿瘤体积明显小于对照组.剥离肿块提取各组肿瘤组织的总RNA和蛋白,Western Blot法检测E2F3b表达水平差异,与细胞水平的表达变化是一致的。qRT-PCR检测miR-200b的表达,结果显示亲本细胞和耐药细胞中,干扰E2F3后,miR-200b的表达量都有不同程度的升高（p<0.01）。利用免疫组化法检测各组肿瘤组织中E2F3的表达量,发现耐药细胞E2F3的表达高于亲本细胞,干扰后都明显减弱。Ki67和PCNA的免疫组化染色结果表明干扰E2F3组的Ki67和PCNA阳性率明显低于对照组。Tunel染色结果表明干扰E2F3组的细胞凋亡水平也都低于对照组。结论与意义:1.耐药SPC-A1/DTX细胞较亲本SPC-A1细胞存在显着的E2F3过表达。2.E2F3b 的表达在DTX耐药细胞LAD细胞中的表达明显高于亲本。过表达E2F3b后能够明显减低miR-200b的表达,而过表达E2F3a并没有看到明显效果。反过来干扰E2F3后miR-200b的表达明显升高。E2F3b参与了人肺腺癌耐药细胞miR-200b的表达调控。3.确认了 E2F3b与miR-200b基因启动子区的直接结合和调控作用。4.E2F3b/miR-200b负反馈通路可以在体内、体外层面参与调控人肺腺癌的化疗耐药。5.首次分析了肺腺癌细胞中E2F3b/miR-200b功能负反馈调控通路及其参与肺腺癌耐药形成的相关机制,目前国内外尚未见有报道。为阐明miR-200b在肺腺癌耐药形成中的生物学功能及调控机制提供实验依据,并为肺腺癌的分子靶向治疗探索新型分子标志物和治疗靶点。
马林[7]（2018）在《低分化非小细胞肺腺癌顺铂耐药机制的研究》文中研究指明肺癌是目前全世界具有较高发病率和死亡率,对人类健康和生命具有重大威胁的恶性肿瘤之一,包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma,NSCLC）。临床结果表明NSCLC占所有肺癌病例80%以上,其早期症状不明显,一经诊断往往进入中晚期,5年生存率较低。目前针对中晚期NSCLC的治疗,顺铂（cisplatin,DDP）是主要化疗手段,但不同分化状态的肿瘤细胞对DDP的敏感性差异很大。临床研究表明低分化NSCLC肺腺癌相对于高分化肺腺癌具有更强的耐药性,是导致临床低分化肺腺癌治疗效果差、肿瘤易复发与转移的重要原因,但病理机制不详。因此,探索低分化NSCLC肺腺癌耐药机制对提高药物治疗效果、改善患者生存质量、发现抗肺癌治疗新策略、研发抗肺癌新药物具有极其重要的意义。本文综合临床肿瘤病理、生物化学、分子药理学等多个学科的研究方法与手段,发现参与调控低分化NSCLC肺腺癌多药耐药的关键基因GCN2与调节肿瘤干性的关键基因RCD91,为低分化NSCLC肺腺癌治疗提供了新理论依据与治疗策略。1:GCN2调节低分化NSCLC对铂类药物敏感性在NSCLC肺腺癌临床标本中,发现eIF2α激酶GCN2蛋白表达水平与NSCLC腺癌的临床分化程度呈负相关,低分化肺腺癌高表达GCN2,耐受DDP诱导的细胞凋亡,抑制低分化肺腺癌GCN2-蛋白质表达水平可显着增强它们对DDP的凋亡敏感性,表明GCN2是影响肺腺癌低分化肺腺癌细胞对DDP耐药性的关键蛋白质。进一步研究表明GCN2可以通过转录因子CHOP激活P-gp、MRP-1、MRP-2等与耐药相关基因的转录。有趣的是,虽然GCN2蛋白质表达水平决定肺腺癌细胞对DDP的敏感性,但在DDP敏感的肺腺癌细胞中,DDP自身能促进β-arrestins与NEDD4L介导的GCN2泛素化降解;但在DDP耐受的肺腺癌细胞中,GCN2泛素化降解作用受抑,其原因在于GCN2第899位苏氨酸磷酸化在DDP耐受NSCLC细胞中增强,而磷酸化的GCN2抑制β-arrestins/NEDD4L/GCN2降解复合物形成,进而抑制GCN2泛素化降解。进一步研究发现GCN2第899位苏氨酸磷酸化在低分化肺腺癌中高表达。通过小分子GCN2磷酸化激活剂和抑制剂进行干预发现,激活高分化肺腺癌中GCN2第899位苏氨酸磷酸化能够增强DDP耐受性,减少DDP进入肿瘤细胞发挥作用;而抑制DDP耐受细胞中GCN2第899位苏氨酸的磷酸化可以逆转其DDP耐受性,促进DDP的细胞摄入。因此,GCN2磷酸化水平是影响NSCLC对DDP是否敏感的重要生物学机制,GCN2磷酸化通过激活CHOP/MDR抑制DDP进入细胞内发挥作用,抑制GCN2磷酸化能逆转低分化NSCLC腺癌对DDP的耐受性。本论文首次阐述了 GCN2在调节低分化非小细胞肺腺癌对DDP耐受的重要作用。2:RCD91调节低分化非小细胞肺腺癌的肿瘤干性与顺铂耐药性肿瘤中存在一类具有自我增殖、修复与分化潜能的“干性”细胞,称之为肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞,这群“干性”细胞是肿瘤耐药与肿瘤复发转移的“罪魁祸首”。因此,深入探索“干性”肿瘤细胞生物学机制,寻找调控肿瘤“干性”的相关基因,对逆转“干性”肿瘤细胞的耐药性,抑制肿瘤的复发恶化具有重要意义。本研究发现一种RNA结合蛋白RCD91在低分化NSCLC肺腺癌中低表达,而在高分化NSCLC腺癌中高表达,干扰RCD91表达能促进肺腺癌异植瘤的生长,由此推测RCD91可能是一个抑癌基因。为探索其生物学机制,发现在NSCLC中,RCD91的表达与肿瘤干性标志物CD133表达、肿瘤干细胞成球率、成瘤率与侧群细胞比例等呈负相关,而过表达RCD91能抑制肿瘤干性,逆转NSCLC对顺铂耐药性,因此RCD91是NSCLC肿瘤干性负调控蛋白。文献表明β-catenin/WNT通路的激活参与了 NSCLC中肿瘤干细胞功能的维持与耐药性,本研究发现RCD91通过RRM3 domain与CTNNB1上面的TCF4结合域结合,抑制WNT通路的激活,并抑制下游TCF4靶基因如CCND1和survivin的转录,从而抑制WNT通路介导的肿瘤干性和耐药性。有趣的是,RCD91通过β-catenin/WNT通路抑制c-Myc表达,而反过来c-Myc与转录因子Sp1协同负调控RCD91 mRNA的转录,从而形成RCD91-c-Myc反馈性调节环路,精密调控低分化NSCLC肺腺癌干性。基于RCD91在调节NSCLC腺癌干性中的重要性,本研究以RCD91转录为靶点建立了小分子筛药体系,发现白藜芦醇、槲皮素、大黄素、汉黄芩素以及c-Myc抑制剂JQ-1均能通过干预RCD91的表达,并在一定程度上抑制低分化NSCLC肺腺癌的肿瘤干性。因此,本研究发现RCD91在调控NSCLC腺癌干性中的新功能与生物学机制,表明RCD91是可供干预的逆转NSCLC肿瘤干性与顺铂耐药的靶基因。全文总结:顺铂是临床治疗中晚期NSCLC腺癌的一线药物,对延长患者存活时间,改善患者生存质量有积极治疗价值,但肿瘤细胞对顺铂耐药是肿瘤复发与转移的重要病理性机制,因此,有效逆转肿瘤耐药对攻克癌症有重大应用价值。本研究围绕低分化NSCLC肺腺癌对DDP耐药,发现GCN2磷酸化、RCD91表达在调节低分化NSCLC对顺铂耐药中新生物学机制,这些机制的阐明为纠正临床低分化NSCLC耐受DDP提供了丰富的理论依据,为开发能够逆转低分化肺腺癌对DDP耐受的治疗药物奠定基础。
张先稳[8]（2017）在《薏苡仁油注射液抑制LncRNA-PVT1表达影响胃癌细胞耐药性的研究》文中研究说明背景目前中晚期胃癌的治疗主要以减轻症状、缓解病情为主,而难以达到根治的目的。治疗方法包括手术治疗、放疗和化疗,而化疗由于兼顾局部与全身的特点,在晚期胃癌的综合治疗中占有重要地位。然而,随着大量化学药物的使用,多药耐药性也随之而来,据美国癌症协会统计,每年死亡的49万例癌症患者中,90%以上与多药耐药有关。所谓多药耐药（multidrug resistance,MDR）,指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他结构不同、作用机理不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药性的现象。长期以来,肿瘤的MDR现象是肿瘤化疗过程中的一个棘手问题,也是肿瘤治疗的一大障碍,认识肿瘤的多药耐药机制,寻找高效的耐药逆转剂,有重大的临床意义。肿瘤多药耐药机制非常复杂,已有研究报道,药物外排、药物失活、DNA损伤、细胞凋亡和生存信号途径改变是引起肿瘤耐药的主要机制。在胃癌研究中,参与胃癌耐药的调控因子有多种,其中主要表现为非编码RNA、转录因子、多药耐药相关分子等的调控。尽管部分胃癌耐药性的分子机制已经被研究,然而由于胃癌耐药性本身的复杂性及已有研究的局限性,现有的研究无法满足临床的需求,因此,深入研究胃癌耐药性产生的分子机制具有重要意义。目前中医认为,胃癌术后化疗后发生转移的病理因素,脾虚发病为内在因素,湿滞是其病理产物,又是治病病因,在脾虚的同时加重湿滞,胃癌术后化疗后有脾虚湿滞症患者应尤为重点预防转移。薏苡仁是治疗脾虚湿滞症的首选药。薏苡仁油注射液是一种以薏苡仁为主要原材料的中药注射剂,其有效成分为薏苡仁酯及薏苡仁素,该物质具有多种对抗肿瘤的作用机制,在免疫调节、降血糖、诱发排卵及抗肿瘤方面发挥重要作用。已有研究报道薏苡仁油注射液对多种肿瘤,包括肺癌、胰腺癌、肝癌及胃癌的治疗均有显着效果,同时,薏苡仁油注射液在抑制肿瘤生长的同时,还可加强肿瘤耐药的敏感性。胃癌研究中,有报道称化疗治疗结合薏苡仁油注射液对胃癌治疗具有较好的效果;同时,薏苡仁油注射液具有抑制胃癌多药耐药相关基因表达的作用。然而,薏苡仁油注射液在胃癌耐药性的分子机制中所发挥的作用还有待研究。长链非编码RNA作为非编码RNA的一种,广泛存在于哺乳动物体内。LncRNA虽然不具备编码蛋白质的功能,但其通过调控蛋白质的表达进而参与到生命体的生长、分化、增殖和凋亡等过程。大量研究表明,LncRNA在转录、转录后及表观遗传水平调控肿瘤相关通路,同时有研究表明:几乎所有的肿瘤中,都存在LncRNA表达异常。因此,lncRNA正逐渐成为研究肿瘤致病机制中的一个重要因子。LncRNA由于其本身的不保守性,它不只是参与到生命活动的各个进程,同时还调节着肿瘤耐药性及药物敏感性。已有研究证实多种LncRNA通过提高DNA修复功能,改变药物代谢和跨膜外排,调节细胞凋亡率以及影响上皮-间充质进程而改变细胞的耐药性。PVT1作为LncRNA的一种,其位于原癌基因MYC启动子上游60 kb处。有研究表明PVT1的过表达具有促癌作用,其在促进癌细胞增殖和侵袭的同时,还增强了肿瘤细胞对化疗的耐药性,相关研究已经在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌中得到证实。在胃癌中,PVT1的表达也显着上调,然而其对胃癌耐药性的影响暂无报道。因此,本研究首先在胃癌耐药组织和细胞中,利用qPCR检测了 PVT1的表达;然后通过调控PVT1的表达,观察其对胃癌耐药细胞中耐药相关蛋白的影响;随后利用薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞株,观察PVT1的表达变化;最后通过调控胃癌耐药细胞中PVT1的表达并利用薏苡仁油注射液处理后,观察胃癌耐药相关蛋白的表达变化。最终阐明PVT1在胃癌耐药性中所扮演的角色及其发挥功能的分子机制。本研究为深入阐明胃癌耐药性的分子机制提供了依据,同时为胃癌耐药性的治疗提供了理论基础。研究内容分为4部分:1.LncRNA-PVT1对胃癌细胞耐药性的影响目的:分析胃癌耐药性患者肿瘤组织和胃癌耐药细胞株中PVT1的表达情况,并进一步在体外观察PVT1过表达或表达抑制对胃癌细胞耐药性的影响。方法:首先分离顺铂耐药性和顺铂敏感性胃癌患者肿瘤组织,利用qPCR检测两组样本中PVT1的表达量;而后利用qPCR测定胃癌耐药细胞株BGC823/DDP和SGC7901/DDP中PVT1的表达量。BGC823/DDP和SGC7901/DDP细胞株分别转染干扰序列si-PVT1后,利用qPCR测定PVT1的表达量;随后利用11μg/ml的顺铂分别处理细胞株24 h、36 h和48 h后,CCK-8检测细胞的存活率。BGC823和SGC7901分别转染过表达载体LV-PVT1-GFP后,利用qPCR测定PVT1的表达量;随后再利用1 μg/ml的顺铂处理细胞株48 h后,流式细胞术结合Annexin V-PI法测定细胞的凋亡率结果:胃癌耐药性患者肿瘤组织和胃癌耐药细胞株（BGC823/DDP和SGC7901/DDP）中PVT1的表达量显着上调;PVT1干扰序列显着降低了胃癌耐药细胞株中PVT1的表达;胃癌耐药细胞转染si-PVT1并用顺铂处理后,显着降低了胃癌耐药细胞的存活率,并增加了其凋亡率;胃癌细胞株BGC823和SGC7901转染LV-PVT1-GFP并利用顺铂处理后,显着增加了胃癌细胞株中PVT1的表达,并抑制了细胞的凋亡率。结论:胃癌耐药性患者肿瘤组织及胃癌耐药细胞株中,PVT1的表达上调;过表达PVT1,增加了胃癌细胞株对顺铂的耐药性;抑制PVT1的表达,增加了胃癌细胞株对顺铂的敏感性。2.PVT1增加胃癌细胞耐药性的分子机制研究目的:体外过表达PVT1,检测顺铂处理后的胃癌细胞多药耐药性相关分子MDR-1、MRP1、mTOR和HIF-1α的表达变化,旨在探讨PVT1促进胃癌细胞耐药性的分子机制。方法:构建PVT1过表达载体LV-PVT1-GFP转染胃癌细胞BGC823和SGC7901,并用顺铂处理48h后,利用qPCR检测MDR-1、MRP1、mTOR和HIF-1α的mRNA的表达量;利用western blotting检测MDR-1和MRP1的蛋白表达量。结果:PVT1过表达显着增加了经顺铂处理的胃癌细胞株中MDR-1和MRP1的表达,而mTOR和HIF-1α的表达量不受PVT1的调控。结论:PVT1调控胃癌细胞对顺铂的耐药性极有可能是通过调控MDR1及MRP1的表达而实现的,而mTOR和HIFα的表达却不受PVT1的调控而参与胃癌耐药性机制。3.薏苡仁油注射液对胃癌细胞耐药性的影响目的:采用不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP,旨在探讨薏苡仁油注射液对胃癌细胞耐药性的影响。方法:选取胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP,用浓度梯度不同的薏苡仁油注射液（1、2.5、5μl/ml）分别处理24、36、48h,利用CCK-8检测细胞活力;薏苡仁油注射液处理48 h后,流式细胞术结合Annexin V-PI法检测细胞凋亡情况;利用qPCR检测MDR1和MRP1的mRNA的表达量;利用western blotting测定MDR1和MRP1蛋白表达量。结果:利用不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP一段时间后,结果显示:同一时间点,随着薏苡仁油注射液浓度的增加,细胞活力显着降低,而其凋亡率显着升高;同一浓度的薏苡仁油注射液,随着处理时间的增加,细胞活力显着下降,而其凋亡率显着升高。随后我们检测了不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP 24 h和48 h后,MDR1和MRP1的表达量。结果显示:无论处理时间是24 h还是48 h,MDR1和MRP1的表达都随着处理浓度的增加而显着降低,呈剂量依赖性。结论:薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞株促进了细胞的凋亡而抑制了其活性,同时降低了 MDR1和MRP1的表达。即表明:薏苡仁油注射液处理显着降低了胃癌细胞对顺铂的耐药性。4.薏苡仁油注射液抑制胃癌细胞耐药性的分子机制研究目的:体外过表达PVT1,检测薏苡仁油注射液处理后胃癌耐药细胞株多药耐药性相关分子MDR1、MRP1的表达,旨在探讨薏苡仁油注射液抑制胃癌细胞耐药性的分子机制。方法:不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞株BGC823/DDP和SGC7901/DDP 24 h后,qPCR检测PVT1的表达。PVT1高表达慢病毒转染胃癌耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP后,再利用2.5μl/ml浓度薏苡仁油注射液处理。流式细胞术检测细胞凋亡率;qPCR 检测 MDR1 和 MRP1 的 mRNA 表达量;western blotting 检测 MDR1 和 MRP1的蛋白表达量。结果:不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP后,PVT1的表达随着薏苡仁油注射液浓度的增加而显着降低;PVT1高表达慢病毒转染胃癌耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP,并用薏苡仁油注射液处理后,显着抑制了细胞的凋亡率,同时显着上调了 MDR1和MRP1的表达。结论:薏苡仁油注射液通过抑制PVT1降低多药耐药性相关分子MDR1和MRP1的表达进而抑制了胃癌细胞耐药性。综上所述,本文深入探讨了 PVT1对胃癌耐药性的影响,在明确胃癌耐药组织及细胞中PVT1的表达显着上调的基础上,部分揭示了 PVT1参与胃癌耐药性的机制。同时,PVT1调控胃癌细胞耐药性机制可能是通过调控MDR1及MRP1的表达而实现的。薏苡仁油注射液处理显着降低了胃癌细胞的耐药性,其具体分子机制是通过抑制PVT1的表达,降低多药耐药相关分子MDR1和MRP1的表达,从而降低胃癌细胞耐药性。
齐慧,苏乌云,呼群[9]（2015）在《肺癌耐药分子机制研究进展》文中研究指明肺癌化疗疗效差异与肿瘤的耐药密切相关,目前研究认为多种基因及分子通路参与调控肺癌细胞对化疗药物的耐药性。对肺癌耐药分子标志物的研究可预测药物治疗敏感性,对肺癌耐药的反转研究有重要意义。
刘健楠[10]（2014）在《乳腺浸润性导管癌中GCS的表达及甲基化研究》文中提出研究目的与意义乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位,死亡率占第二位。手术、化疗、放疗、内分泌及分子靶向治疗的综合应用,成为乳腺癌治疗的主要模式。然而,对化疗药物产生多药耐药（multidrug resistance,MDR）成为导致乳腺癌治疗失败的主要原因。MDR是指肿瘤细胞对一种药物产生耐药的同时,对其他结构不同、作用靶点不同的药物也产生抗药性。MDR1/P-gp由多药耐药相关基因-1（multidrug resistance gene, mdr-1）编码,是腺苷三磷酸结合盒（adenosine triphosphate-binding cassette,ABC）转运蛋白家族成员之一,具有能量依赖性“药泵功能”,可以通过水解ATP产生的能量,将进入细胞内的药物逆浓度泵出细胞外,从而降低药物对细胞的杀伤作用,使细胞产生耐药。研究表明,大约50%乳腺肿瘤多药耐药与P-gp表达有关。葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase, GCS）是鞘脂类物质神经酰胺（ceramide, Cer）代谢途径的关键酶,可以上调mdr-1的表达。GCS可催化UDP-葡萄糖上的糖基以β型糖苷键与神经酰胺相结合,使神经酰胺糖基化成无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide,GlcCer）。研究发现所有MDR细胞鞘糖脂合成增加,其中以GlcCer最明显。在乳腺癌、白血病、肠癌等MDR细胞中均可发现GCS和GlcCer的增加。新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NC）是指在恶性肿瘤局部治疗前给予的全身化疗。研究发现,新辅助化疗可以引起多药耐药相关蛋白P-gp、MRP、LRP等表达上调,继而引起MDR。但目前对乳腺浸润性导管癌组织细胞中GCS蛋白表达及局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗后GCS蛋白表达研究较少。本论文第一部分：检测了200例乳腺浸润性导管癌患者中GCS蛋白表达规律；并分析了GCS蛋白表达与患者临床病理参数、分子亚型、预后的关系；以及60例局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗对GCS蛋白表达的影响。除了遗传因素,肿瘤的发生、发展也受到表观遗传修饰的影响。DNA甲基化是人类基因组最为常见的表观遗传学事件之一。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展中起着重要作用。此外,DNA甲基化与MDR的关系也成了当前的研究热点之一。研究表明,mdr-1基因启动子区CpG岛去甲基化,诱导了MDR1/P-gp的表达,与肿瘤化疗耐药有关。GCS基因启动子区亦富含G+C序列,但DNA甲基化是否参与了乳腺癌细胞GCS表达的调控,国内外尚无报道。本论文第二部分：我们从上述200例乳腺浸润性导管癌患者中随机选取了40例GCS（+）和40例GCS（-）的患者,检测了GCS基因的甲基化状态,并分析了其与患者临床病理资料及GCS表达的关系。在细胞实验部分,我们分别检测了乳腺癌细胞株MCF-7（ER阳性）、MDA-MB-231（ER阴性）、T47D（PR阳性）及耐阿霉素细胞株MCF-7/ADM（GCS高表达）的GCS mRNA、蛋白表达及甲基化状态；并观察了去甲基化药物5-氮杂-2’脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxy-cytidine,5-Aza-dc）处理后,乳腺癌细胞株GCS启动子区甲基化状态、GCS mRNA和蛋白表达的改变,探讨了表观遗传学改变对GCS表达调控的影响。GCS基因甲基化,能否为逆转乳腺癌耐药提供新的分子靶点。研究方法与结果第一部分乳腺浸润性导管癌中GCS的表达研究方法：1.从2007年6月到2009年1月搜集济南中心医院和烟台毓璜顶医院病理证实乳腺浸润性导管癌标本200例。所有患者术前均未行放、化疗及其他治疗。采用免疫组织化学SP二步法,检测乳腺浸润性导管癌患者中GCS蛋白的表达情况。2.分析GCS表达与ER、PR、HER-2、Ki67、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移、乳腺癌亚型等临床病理参数之间的关系；对临床资料进行随访,中位随访时间57.9月（38-60月）,分析GCS表达与5年无病生存率（five year-disease free survival,5-y-DFS）和5年总生存率（five year-overall survival,5-y-OS）的关系。应用统计学软件SPSS17.0进行数据处理,p<0.05为差异具有统计学意义。3.从2012年1月到2014年1月搜集烟台毓璜顶医院行新辅助化疗的局部晚期乳腺癌患者标本60例,采用免疫组织化学SP二步法,分析化疗前后GCS表达情况。研究结果：1.青年组（<35岁）GCS表达率较中、老年组（≥35岁）明显降低,差异具有统计学意义（p=0.033）。随着肿瘤病理学分级的增高,GCS表达率降低,II-III级浸润性导管癌中GCS表达率显着低于I级（p=0.038）。此外,数据显示,ER阳性组（p=0.030）或HER-2阴性组（p=0.002）乳腺浸润性导管癌患者GCS表达率较相应对照组显着增高。GCS表达率与肿瘤大小、淋巴结转移、Ki67等指标无相关性。2.200例乳腺浸润性导管癌患者,其中导管A型102例,导管B型39例,基底细胞型40例,HER-2阳性19例；导管A型GCS阳性表达率最高；基底细胞型GCS阳性表达率最低；导管A型和基底细胞型相比GCS阳性表达率有统计学意义（p=0.038）,与其他亚型相比,差异无统计学意义（p>0.05）。3.GCS表达阳性组5y-DFS（p=0.738）和5y-OS（p=0.714）与GCS表达阴性组相比,无统计学差异。4.60例局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗前GCS表达阳性率是15%（9/60）,化疗后GCS表达阳性率是41.7%（25/60）,差异有统计学意义（p=0.002）。第二部分乳腺癌中GCS表达的甲基化研究研究方法：1.在200例乳腺浸润性导管癌标本中,随机抽取GCS（+）和GCS（-）标本各40例,甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）检测标本中GCS甲基化状况,分析GCS甲基化与临床病理参数及GCS表达之间的关系,实验数据采用SPSS17.0统计学软件进行统计学处理,p<0.05为差异具有统计学意义。2.采用MSP、qRT-PCR和Westernblot检测了MCF-7（ER阳性）、MDA-MB-231（ER阴性）、T47D（PR阳性）及耐药细胞株MCF-7/ADM（GCS高表达）中GCS甲基化状态、GCS mRNA和蛋白表达情况；为了观察DNA甲基化对GCS表达的影响,又进一步检测DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-dc处理后的上述四种乳腺癌细胞株的GCS甲基化状态、GCS mRNA及蛋白表达的变化。研究结果：1.乳腺癌标本中GCS基因异常甲基化检测：乳腺癌标本中GCS（+）组10例发生GCS甲基化,30例未发生甲基化,甲基化率为25.0%；GCS（-）组35例发生GCS甲基化,5例未发生甲基化,甲基化率为87.5%；结果提示：GCS甲基化与GCS表达呈负相关（r=-0.63,p<0.001）。ER（+）组19例发生GCS甲基化,35例未发生甲基化,甲基化率为35.2%；ER（-）组16例发生GCS甲基化,10例未发生甲基化,甲基化率为61.5%；结果提示：GCS甲基化与ER阳性呈负相关（r=-0.249,p=0.026）。HER-2阳性组21例发生GCS甲基化,6例未发生甲基化,甲基化率为77.8%；HER-2阴性组24例发生GCS甲基化,29例未发生甲基化,甲基化率为45.3%；结果提示：GCS甲基化与HER-2阳性呈正相关（r=0.31,p=0.006）。而GCS甲基化与其他病理参数如年龄、病理分级、肿瘤大小、淋巴结转移、Ki67无相关性。2.乳腺癌细胞株中GCS基因异常甲基化检测：MSP结果显示,耐阿霉素细胞株MCF-7/ADM中GCS启动子区非甲基化；ER阴性细胞株MDA-MB-231中GCS启动子区完全甲基化；而MCF-7和T47D细胞株中GCS启动子区部分甲基化。qRT-PCR和Westernblot结果显示,MCF-7/ADM中GCS mRNA和GCS蛋白表达最高,MDA-MB-231中GCS mRNA和GCS蛋白表达最低。而MCF-7和T47D细胞株中GCS mRNA和GCS蛋白表达介于两者之间。3.用甲基化酶抑制剂5-Aza-dc处理后,MDA-MB-231、MCF-7和T47D细胞株中GCS基因甲基化被完全逆转或部分逆转,同时,其GCS mRNA和GCS蛋白表达较未处理组增加；而MCF-7/ADM细胞株中GCS甲基化、GCS mRNA和GCS蛋白表达较未处理组无明显改变。研究结论1.乳腺浸润性导管癌中,GCS蛋白的高表达与ER阳性、HER-2阴性有关；2.GCS在导管A型浸润性乳腺癌中的表达明显高于基底细胞型；3.GCS表达与乳腺浸润性导管癌患者5-y-DFS和5-y-OS无关；4.乳腺癌患者新辅助化疗后GCS表达增加,提示GCS可能参与了乳腺癌患者获得性耐药。5.乳腺癌组织细胞中存在GCS基因启动子区CpG岛甲基化,且GCS基因启动子区甲基化与GCS表达、ER阳性呈负相关,而与HER-2阳性呈正相关；6.乳腺癌细胞株中GCS基因启动子区CpG岛去甲基化,可以上调GCS表达。提示,GCS基因启动子区甲基化参与了乳腺癌细胞GCS表达的调节,可能是乳腺癌化疗耐药的机制之一。
二、肺腺癌细胞MRP基因甲基化与多药耐药的相关性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺腺癌细胞MRP基因甲基化与多药耐药的相关性（论文提纲范文）
（1）MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:MACC1、MRP、LRP的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于线粒体动力学探讨参麦注射液影响肺腺癌细胞顺铂耐药性的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤多药耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢信 |
（3）抑制xCT通过诱导铁死亡逆转肺腺癌细胞对顺铂耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 Nrf2/xCT通路在肺腺癌细胞中的表达及对顺铂敏感性的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 原代培养 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 RT-qPCR法 |
| 2.2.5 细胞总蛋白提取和Western blotting蛋白检测 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.7 敲减实验 |
| 2.2.8 过表达实验 |
| 2.2.9 ROS测定 |
| 2.2.10 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 比较顺铂对四种不同的人肺腺癌细胞的细胞毒作用 |
| 3.2 顺铂对人肺腺癌细胞Nrf2 及下游靶基因和蛋白表达的影响 |
| 3.3 顺铂对人肺腺癌细胞Nrf2 的转录能力的影响 |
| 3.4 顺铂对人肺腺癌细胞内ROS的影响 |
| 3.5 Nrf2/xCT表达水平变化改变人肺腺癌细胞对顺铂的敏感性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 抑制xCT增加顺铂耐药的肺腺癌细胞的死亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代培养 |
| 2.2.2 建立顺铂耐药细胞 |
| 2.2.3 CCK-8细胞活力检测 |
| 2.2.4 RT-qPCR |
| 2.2.5 PI染色 |
| 2.2.6 体内动物实验(裸鼠移植模型实验) |
| 2.2.7 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 建立顺铂耐药N5CP细胞 |
| 3.2 N5CP细胞中Nrf2/xCT mRNA表达上调 |
| 3.3 单药使用Erastin或 Sorafenib可以增加N5CP死亡率 |
| 3.4 在裸鼠成瘤实验中,Erastin/Sorafenib显着减小肿瘤重量 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 抑制xCT通过铁死亡途径逆转肺腺癌细胞顺铂耐药 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代培养 |
| 2.2.2 建立顺铂耐药细胞 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 ROS测定 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Erastin和 Sorafenib通过铁死亡途径诱导顺铂耐药细胞死亡 |
| 3.2 Erastin和 Sorafenib可以诱导N5CP细胞ROS蓄积 |
| 3.3 Erastin或 Sorafenib使 N5CP恢复对顺铂的敏感性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）FOX-A1参与人肺腺癌多西他赛化疗耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 第一部分 FOX-A1在多西他赛耐药的肺腺癌细胞株、肺腺癌组织中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 FOX-A1对多西他赛耐药的肺腺癌细胞生物学行为的影响及其机制探讨 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 FOX-A1反式激活SOX5促进人肺腺癌细胞产生化疗耐药 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌化疗耐药机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（5）E3泛素化连接酶NEDD4-1调控PTEN参与肺腺癌发生发展和化疗耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 肺腺癌组织中NEDD4-1表达的临床意义及与化疗敏感性和预后的关系 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 NEDD4-1沉默调控PTEN对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 NEDD4-1沉默对肺腺癌化疗耐药的逆转作用和机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表和主要撰写的论文 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（6）E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控人肺腺癌细胞化疗敏感性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 E2F3(a/b)、miR-200b在肺腺癌细胞中的表达及与肺腺癌耐药表型相关性 |
| 实验材料 |
| 实验试剂与设备 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 E2F3b直接结合并调控miR-200b基因启动子 |
| 实验材料与试剂 |
| 实验设备 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 E2F3b/miR-200b通路对人肺腺癌耐药细胞体内外化疗敏感性的影响 |
| 实验材料 |
| 实验试剂与设备 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（7）低分化非小细胞肺腺癌顺铂耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1 非小细胞肺腺癌简介 |
| 2 低分化肺腺癌的临床治疗 |
| 3 非小细胞肺腺癌DDP耐受分子机制 |
| 3.1 ABC转运蛋白参与的多药耐药性 |
| 3.2 DNA修复系统参与的化疗耐受 |
| 3.3 肿瘤微环境与化疗耐受 |
| 3.4 肿瘤干细胞介导的化疗耐受 |
| 4 肿瘤干细胞理论 |
| 4.1 调控NSCLC的肿瘤干性的分子机理 |
| 4.1.1 NSCLC中WNT通路介导的肿瘤干性 |
| 4.1.2 NSCLC中Notch通路介导的肿瘤干性 |
| 4.1.3 NSCLC中Hedgehog通路介导的肿瘤干性 |
| 4.2 NSCLC肿瘤干性相关检测指标 |
| 4.2.1 常用的肿瘤干性检测手段 |
| 4.2.2 NSCLC的肿瘤干性相关标志物 |
| 5 逆转非小细胞肺腺癌DDP耐受性的策略 |
| 5.1 靶向ABC家族成员 |
| 5.2 靶向DNA修复系统 |
| 5.3 靶向肿瘤微环境 |
| 5.4 靶向肿瘤干细胞介导的化疗耐受 |
| 5.4.1 靶向介导的肿瘤干性的TAM |
| 5.4.2 靶向肿瘤干细胞定位的低氧区域 |
| 5.4.3 靶向介导肿瘤干性的信号通路 |
| 第二章 GCN2调节低分化NSCLC对DDP的敏感性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 RCD91调节低分化NSCLC的干性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文创新点 |
| 附录Ⅰ: 本论文全部引物序列 |
| 附录Ⅱ: 本论文全部小干扰RNA序列 |
| 附录Ⅲ: 博士期间已发表的论文 |
| 致谢 |
（8）薏苡仁油注射液抑制LncRNA-PVT1表达影响胃癌细胞耐药性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LNCRNA-PVT1对胃癌细胞耐药性的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 PVT1促进胃癌细胞耐药性的分子机制研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 薏苡仁油注射液对胃癌细胞耐药性的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 薏苡仁油注射液抑制胃癌细胞耐药性的分子机制研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（9）肺癌耐药分子机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 细胞膜药物泵相关耐药分子 |
| 2 DNA 损伤修复功能相关的耐药分子 |
| 3 药物代谢相关的耐药分子 |
| 4 血管生成相关的耐药分子 |
| 5 其他耐药分子 |
（10）乳腺浸润性导管癌中GCS的表达及甲基化研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| CONTENTS |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 乳腺浸润性导管癌中GCS的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表及附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌中GCS表达的甲基化研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表及附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| Paper Ⅰ |
| Paper Ⅱ |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、肺腺癌细胞MRP基因甲基化与多药耐药的相关性（论文参考文献）
- [1]MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究[D]. 蔡晓燕. 新乡医学院, 2021(01)
- [2]基于线粒体动力学探讨参麦注射液影响肺腺癌细胞顺铂耐药性的分子机制[D]. 陈雨诗. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [3]抑制xCT通过诱导铁死亡逆转肺腺癌细胞对顺铂耐药的研究[D]. 李钰. 中国医科大学, 2019(04)
- [4]FOX-A1参与人肺腺癌多西他赛化疗耐药的机制研究[D]. 曹斐. 苏州大学, 2018(04)
- [5]E3泛素化连接酶NEDD4-1调控PTEN参与肺腺癌发生发展和化疗耐药的研究[D]. 宋英华. 山东大学, 2017(03)
- [6]E2F3b/miR-200b负反馈通路参与调控人肺腺癌细胞化疗敏感性的分子机制研究[D]. 高燕萍. 南京大学, 2017(05)
- [7]低分化非小细胞肺腺癌顺铂耐药机制的研究[D]. 马林. 南京大学, 2018(06)
- [8]薏苡仁油注射液抑制LncRNA-PVT1表达影响胃癌细胞耐药性的研究[D]. 张先稳. 扬州大学, 2017(06)
- [9]肺癌耐药分子机制研究进展[J]. 齐慧,苏乌云,呼群. 转化医学杂志, 2015(02)
- [10]乳腺浸润性导管癌中GCS的表达及甲基化研究[D]. 刘健楠. 山东大学, 2014(04)