一、组织多肽特异抗原测定在乳腺癌治疗中的应用（论文文献综述）
解云天[1]（2021）在《基于主客体自组装的MUC1金纳米肿瘤疫苗的制备及活性评价》文中研究表明癌症严重威胁着人类的生命健康,并给个人和社会带来了巨大的经济负担。近年来,肿瘤疫苗作为一种更为安全的免疫治疗手段,引起了研究者的广泛关注。其中,肿瘤相关糖抗原（tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs）在肿瘤细胞表面大量表达,化学结构保守,是癌症疫苗设计的理想靶点。与正常细胞相比,肿瘤细胞表面表达的粘蛋白1（Mucin 1,MUC1）,具有缩短的糖基化修饰和异常的分布,是肿瘤诊断和治疗的重要靶点,已被广泛用于肿瘤疫苗的设计和开发。然而因糖肽抗原存在着免疫原性弱、免疫耐受等问题,难以引起有效的免疫反应。为了增强MUC1的免疫原性,经典的疫苗设计手段是将其与蛋白载体、免疫刺激剂或新型的纳米颗粒载体等偶联,通过疫苗载体的辅助,促进抗原呈递细胞的摄取和呈递、刺激产生更强的免疫反应。金纳米颗粒具有较强的免疫刺激能力,且纳米尺寸可控、生物安全性和兼容性较好,已被开发用作疫苗的载体颗粒。一般采用共价偶联的方式将抗原负载于金纳米颗粒,但是这种偶联方法十分依赖于化学合成技术,制备方式复杂,难以控制抗原偶联效率,对疫苗的大量生产造成质量控制和安全控制的难度。为了提高基于金纳米颗粒的疫苗制备效率,简化疫苗制备步骤,降低质量和安全控制难度,本文采用金刚烷与环糊精的主客体自组装方式,将化学合成的MUC1糖肽抗原负载于环糊精修饰的纳米金颗粒表面,构建非共价偶联MUC1金纳米肿瘤疫苗,并对该疫苗进行了免疫学活性评价。主要成果如下:（1）通过化学合成和多肽的固相合成手段成功合成三个N端具有金刚烷修饰的MUC1多肽衍生物,通过高效液相色谱验证其纯度均高于95%,且质谱验证均合成正确。通过还原法使用硼氢化钠成功将氯金酸还原为金纳米颗粒,并将环糊精修饰在金纳米颗粒表面。成功将金刚烷多肽与环糊精修饰的金纳米颗粒通过主客体作用组装在一起,制备金纳米颗粒MUC1疫苗。（2）通过透射电镜及热重分析对金纳米颗粒及组装后的金纳米颗粒MUC1疫苗进行表征。金纳米颗粒的粒径在3-5 nm之间,表面环糊精负载量为37%;组装后的纳米颗粒中多肽自组装比例较为稳定,均在70-80%之间。（3）通过体外实验验证金纳米颗粒生物相容性较好,可以作为疫苗载体,并且拥有促进抗原肽被细胞摄取的能力;小鼠经MUC1金纳米疫苗免疫后,成功产生特异性的抗体,且小鼠免疫后的血清可以与高表达MUC1的肿瘤细胞结合,并且诱导补体依赖的细胞毒性作用裂解细胞。
孟祥州[2]（2021）在《多肽药物筛选及基于肿瘤细胞膜的多肽运载体系的构建与应用》文中认为多肽通常指不超过50个氨基酸构成的肽链,分子量介于小分子和蛋白之间。多肽在结构和功能上具有和蛋白类似的性质,例如,很多激素,生长因子,神经递质就是多肽类物质。多肽作为功能分子,具有合成工艺简单、成本低、安全性高等优点,因此在药物研发领域引起了广大研究者的关注。本论文针对肿瘤和感染性疾病的热门靶点蛋白进行了多肽药物的筛选和开发,以期获得具有临床应用潜能的多肽药物。肿瘤免疫疗法由于其卓越的临床治疗效果,已经成为肿瘤治疗的重要的手段之一。肿瘤免疫治疗包括过继性细胞治疗,肿瘤疫苗和针对免疫检查点（immune checkpoint）的生物治疗等等,其中针对免疫检查点之一的程序性死亡受体-1/程序性死亡分子配体-1（Programmed cell death protein-1/Programmed cell death ligand-1,PD-1/PD-L1）的抗体治疗在临床上取得了巨大的成功。尽管如此,由于抗体的高成本以及高的免疫原性,需要我们寻找更多能够替代抗体的生物分子。我们通过细菌表面展示技术筛选获得了 PD-1特异结合多肽,并对其阻断PD-1/PD-L1信号通路的可能性进行了检测。具体来说,我们运用细菌表面展示技术从随机多肽库中获得6条能与PD-1结合的多肽。序列比对发现两类保守序列DDCWXD（X代表:D/E/H）和DGW。经ELISA和流式细胞术检测,与PD-1结合效果最佳的多肽被命名为PBP-1。实验证明了该多肽与PD-1的结合具有特异性以及阻断PD-1/PD-L1相互作用的功能。在以上结果初步显示PBP-1多肽可以作为拮抗PD-1的候选分子,参与肿瘤的免疫治疗。2019 年底至今,COVID-19（Corona Virus Disease 2019）全球迅速蔓延,造成了全球发病率和死亡率的上升,给社会带来了巨大的动乱和经济损失。文献报道,COVID-19病毒进入人体细胞是由病毒细胞膜表面的S（Spike）蛋白与人体细胞中的ACE-2（Angiotensin converting enzyme 2）受体介导的。因此,阻断S蛋白与ACE-2受体的结合的药物有可能遏制COVID-19的蔓延。基于此,我们首次运用细菌表面展示技术对ACE-2分子进行特异性结合多肽的筛选。经过多轮筛选最终得到12条与ACE-2特异性结合的多肽,经序列比对没有发现这些多肽的保守序列。通过流式验证并选择与ACE-2结合效果最佳的多肽,命名为TAP-1。利用荧光ELISA的方法进一步验证了 TAP-1与ACE-2结合的特异性。通过竞争实验和假病毒试验,确认了 TAP-1多肽可以与S蛋白竞争结合ACE-2且具有浓度依赖性。以上结果得出TAP-1多肽可以有潜力阻断COVID-19进入细胞,新冠肺炎的治疗提供新的治疗方案。由于多肽本身具有半衰期短和易降解等特点,因此限制了其临床的广泛应用。为了解决这一问题,本研究结合纳米递送技术,设计并开发了利用肿瘤细胞膜纳米载药体系运输多肽药物。我们构建了基于肿瘤细胞膜的多肽传递系统（SPIO NP@M-P）,用于运载课题组前期获得针对PD-L1的拮抗性多肽TPP1。实验证明,H460细胞膜囊泡具有优越的同源靶向能力,可以介导纳米囊泡在肿瘤部位的富集。该系统中的SPIONPs（Superparamagnetic Iron Oxide）可以用于肿瘤磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging）,便于对多肽药物的肿瘤治疗效果进行监控。表面修饰TPP1多肽的SPIO NP@M-P不但仍然具有阻断PD-LI和PD-1相互作用的能力,而且具有了较长的半衰期（是游离多肽的60倍）。SPIO NP@M-P中含有的MMP2酶（Metallomatrix protease 2）的底物肽有助于TPP1肽在肿瘤微环境的释放。肿瘤细胞膜的SPIO NP@M-P多肽传递系统的成功构建,为多肽药物的临床转化提供了新途径。综上所述,本研究通过细菌表面展示技术对PD-1和ACE-2的两个靶点进行多肽筛选,分别得到结合效果较好的多肽序列,并验证了多肽具有较好的分子靶向能力以及阻断功能。在多肽应用方面,成功构建了基于肿瘤细胞膜的多肽传递系统（SPIO NP@M-P）,延长多肽半衰期,同时赋予了多肽在肿瘤中的诊疗功能,为多肽提供临床转化的可能性。
于迎春[3]（2020）在《组织多肽特异性抗原在胃腺癌中的表达及意义》文中提出目的:通过研究组织多肽特异性抗原（TPS）在胃腺癌患者中的表达情况,探讨其在胃腺癌中的应用价值。方法:选取2018年01月到2019年06月之间由高唐县医院收治的60名初诊胃腺癌（Cancer of the stomach）患者,再选择20名胃良性病变患者,组成胃良性病变组,24名胃癌前病变的病人,组成胃癌前病变组,随机选取2018年01月到2019年06月之间在高唐县人民医院进行体检的健康人群40名,为健康人群组。应用酶联免疫吸附试验的检测方法,对所有入组人员的血清TPS表达情况进行化验分析,比较胃腺癌组血清TPS水平及阳性率与其他各组有无区别;通过对比胃腺癌组患者治疗前后的TPS水平,判断在治疗中的临床价值;通过对不同年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、有无转移、临床分期的胃腺癌患者的TPS水平进行比较,评估胃腺癌患者血清TPS水平与临床病理特征的关系;在胃腺癌组中,通过比较EGFR阳性患者与EGFR阴性患者的TPS水平,观察血清TPS水平与EGFR表达有无相关性;通过比较Her2阳性患者与Her2阴性患者的TPS水平,观察血清TPS浓度与Her2表达有无相关性。结果:1.胃腺癌组血清TPS水平为227.65±140.64U/L,在胃腺癌患者中的阳率为86.68%,血清TPS浓度和阳性率均明显高于其他三组。2.在胃腺癌病人中,高分化和中分化的患者的TPS水平（177.25±110.85U/L）显着低于低分化的患者（285.24±148.74U/L）;浸润深度为T1和T2的胃腺癌患者的TPS水平（162.66±83.09U/L）显着低于浸润深度为T3和T4的患者（267.13±156.42U/L）;TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期的胃腺癌患者TPS水平（164.7±78.84U/L）明显低于Ⅲ+Ⅳ期患者TPS水平（264.09±154.95U/L）,有统计学差异（P值<0.05）。血清TPS升高程度与患者的年龄大小、肿块的大小及是否存在淋巴结转移关系不明显。3.血清TPS浓度治疗后较前有明显的降低,有统计学意义（P<0.05）。4.TPS的敏感性（86.67%）要高于CEA（48.33%）及CA199（45%）,特异性（96.43%）高于CEA（94.05%）及CA199（95.24%）,但三者联合检测敏感性（93.33%）较单一检测明显提高。5.胃腺癌组中Her2表达阳性的病人血清TPS升高程度明显高于Her2表达阴性的病人,具有统计学意义（P值为0.019）,EGFR表达不同的胃腺癌患者的血清TPS水平无明显差异（P>0.05）。结论:TPS在胃腺癌患者的诊断、病情的评估及预后分析方面都具有重要价值,CEA、CA199和TPS三者联合检测在胃腺癌患者中的诊断价值高于单一指标检测。
周洁[4]（2020）在《乳腺癌患者分子标志物CD44的高效检测及靶向纳米复合材料的构建研究》文中指出背景:乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率有逐年上升的趋势。易转移和复发是目前临床治疗的主要难点,研究表明主要由乳腺癌干细胞导致。CD44是常见的乳腺癌干细胞表面标志物之一,其表达水平与乳腺癌恶性程度及预后具有相关性,可作为乳腺癌诊治的潜在靶点。目的:本实验构建了检测血清CD44的电化学阻抗生物传感器,筛选恶性程度高及预后差的乳腺癌患者。为提高这部分患者的治疗效果,制备了pH响应和CD44靶向的载化疗药物大黄素纳米体系并进行表征,为高表达CD44的乳腺癌患者诊断和治疗打下基础。方法:本文包括两部分:基于CD44适配体的电化学阻抗生物传感器的制备及乳腺癌患者血清中CD44的检测;靶向乳腺癌CD44且具有pH响应的聚合物胶束的制备和评价。1带有5’-巯基末端的CD44特异性适配体通过金巯键修饰到金电极表面,金电极表面阻抗值Rct增大。当金电极表面孵育CD44蛋白后,CD44蛋白与其表面适配体结合引起阻抗值的变化,根据CD44蛋白在金电极表面孵育前后阻抗值变化的程度对其浓度进行定量,使用电化学阻抗谱测定传感器的阻抗值。进行了实验条件优化,建立校准曲线和测定检测限,对传感器的抗干扰能力、稳定性和重现性进行评价。2将构建的电化学阻抗生物传感器,应用于血清中CD44水平的测定,并与ELISA测定结果进行比较,通过Pearson相关分析和Bland-Altman法进行方法一致性评价,比较传感器和ELISA测定的健康对照者和乳腺癌患者血清中CD44水平的差异。3本实验通过酯化反应和缩醛反应合成了偶联CD44靶向多肽CD44p的两亲性三嵌段共聚物CD44p-PEG-HES-PLA,通过核磁共振氢谱以及X-射线光电子能谱进行相应表征,芘荧光探针法测定其临界胶束浓度。4通过透析法制备载大黄素聚合物胶束,使用激光粒度仪、透射电子显微镜进行粒径、形貌表征,测定其zeta电位。通过紫外分光光度法测定药物大黄素的标准曲线,通过冷冻干燥计算其包封率和载药量。测定聚合物胶束在4℃、pH 7.4的PBS中随时间变化的粒径,评价其稳定性。测定聚合物胶束在不同pH溶液（pH 6.5、7.4）环境下粒径、电位的变化。利用透析法体外模拟聚合物胶束在不同pH条件下药物释放的情况。结果:1本实验成功构建了基于CD44适配体的电化学阻抗生物传感器,用于血清中CD44蛋白的简便检测。该传感器孵育蛋白CD44后阻抗值Rct变小,阻抗降低程度θ和蛋白浓度的对数在0.1 ng/m L～1000.0 ng/m L呈良好的线性关系,校准曲线为:θ（%）=0.16 Lg C+0.385,R2=0.992,检测限为0.087 ng/m L（S/N=3）,实验重现性RSD为3.96%,抗干扰能力和稳定性良好。2使用电化学传感器和ELISA试剂盒对人血清中CD44水平进行测定,Pearson相关系数为0.993,线性回归方程y=1.032x+6.121,R2=0.987,Bland-Altman分析两种方法测定的CD44结果具有相关关系和较好的一致性。传感器检测结果显示乳腺癌患者血清中CD44浓度为139.5±30.4 ng/m L,健康人血清CD44浓度为82.5±11.9 ng/m L,独立样本t检验P<0.05有统计学意义,乳腺癌患者血清中CD44水平高于健康者,提示了CD44作为乳腺癌诊断及预后生物标志物的潜力。3本研究成功合成了偶联CD44p和具有pH响应化学键的两亲性三嵌段共聚物PEG-HES-PLA,临界胶束浓度为1.3×10-4 mg/m L,由其组装的CD44靶向和pH响应的载大黄素聚合物胶束的尺寸为154.5±0.9 nm,透射电子显微镜下呈散在、均匀分布的球形,zeta电位为-11.8±0.5 m V。载药量和包封率分别为9.6%和98.5%。在pH 7.4的PBS中放置2周粒径无明显变化,具有良好的稳定性。当聚合物胶束处于酸性缓冲液（pH 6.5）中粒径变小,zeta电位向正移动。体外药物释放的实验结果显示,与pH 7.4条件下比较,在pH6.5条件下释药率更高。结论:本实验成功构建了用于便捷检测乳腺癌患者血清中高表达CD44的电化学阻抗生物传感器,以及制备了具有合适尺寸、良好载药能力和稳定性的CD44靶向的pH响应的纳米载药系统,为今后乳腺癌的诊断和靶向治疗奠定了基础。
张凌宵[5]（2020）在《水滑石纳米佐剂在肿瘤免疫治疗中的应用研究》文中研究说明肿瘤治疗性疫苗可诱导机体特异性免疫杀伤肿瘤细胞,抑制恶性肿瘤的生长、转移及复发,具有良好的临床应用前景。然而,由于可高效诱导T细胞免疫反应的疫苗佐剂不足,同时由于肿瘤免疫耐受的存在和疫苗在体内递送效率低下等原因,造成肿瘤治疗性疫苗治疗效果不理想,严重限制了疫苗的临床应用。针对这些问题,本文使用了一种新型铝佐剂（镁铝水滑石,LDH）,并联合应用免疫调节分子,设计得到了三类能够抵抗肿瘤抑制性免疫环境和肿瘤抗原多发性突变的多功能肿瘤治疗疫苗,并提出了新的疫苗皮下递送或注射途径优化策略,显着提高了疫苗在体内诱发免疫应答的效率,提高了疫苗的免疫治疗效果。具体开展的研究工作如下:1.研究制备的能够共递送IDO抑制剂（siIDO）和抗原Trp2的LDH纳米疫苗（TLIs）有效缓解树突状细胞（DC）的免疫抑制状态,促进抗原特异性免疫应答。在肿瘤患者体内,肿瘤细胞释放的促炎性因子导致DC胞内吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）过度表达,进而影响色氨酸代谢,并造成DC由免疫激活态转变为免疫抑制态。TLIs具备快速的内涵体逃逸能力,能够迅速将siIDO与Trp2释放到细胞质。一方面,siIDO通过干扰IDO mRNA的表达实现IDO的下调,促进DC的激活;另一方面,Trp2与主要组织相容性复合体（MHC）I分子结合,并被呈递至细胞表面,从而有效促进抗原提呈、激活特异性T细胞免疫应答并对肿瘤组织进行杀伤。2.研究制备的同时载有肿瘤经典抗原表位Trp2、突变表位M27和M30及CpG的LDH三价疫苗（s-BmALC）,可引发广谱的抗肿瘤免疫应答,显着提升疫苗对肿瘤的杀伤效率。s-BmALC在被DC摄取后,能够在内涵体的酸化过程中释放CpG与抗原表位,并快速逃逸至细胞质中。其中,释放的CpG与内涵体TLR-9结合,促进DC细胞的激活;释放的抗原在细胞质中被进一步加工后与MHC I类分子结合,并被分别呈递至细胞表面,激活广谱的抗原特异性T细胞免疫应答。相对于传统的单价疫苗,三价疫苗能够更广谱地诱导T细胞免疫应答,更好地抑制肿瘤的生长,降低由于肿瘤细胞表面抗原持续突变与丢失所造成的抗原特异性T细胞免疫攻击脱靶的问题。3.研究制备的联合光热疗法和化学疗法的多功能LDH纳米佐剂诱发强烈的原位抗肿瘤免疫应答。通过将FDA批准的吲哚菁绿（ICG）、盐酸表阿霉素/DNA复合前药（Dox/DNA）和CpG装载于LDH中得到多功能LDH纳米佐剂（IDCB-LDH）。IDCB-LDH能够高效地富集于肿瘤内,在808nm激光的诱导下,ICG能够快速加热肿瘤至～55℃,对肿瘤进行热杀伤。在温度升高的环境中,Dox/DNA中的DNA（Tm=40.5℃）快速解旋并释放Dox,对肿瘤细胞进一步杀伤,释放大量肿瘤抗原。随后,抗原被LDH/CpG在原位结合并呈递至DC,引发强烈的抗原特异性T细胞应答,有效清除原位残余肿瘤组织,并预防肿瘤的复发与转移。4.研究阐明了 LDH疫苗的分散性与其诱发抗肿瘤免疫应答效率之间的关系。基于“白蛋白包被技术”,可控地制备得到在生理环境下处于单颗粒分散状态的LDH疫苗（s-BTLC）和聚集状态的LDH疫苗（a-BTLC）。研究表明,s-BTLC可主动浸润淋巴结（LNs）,短时间内促进疫苗被更多的抗原提呈细胞（APC）摄取,从而显着提升疫苗诱发细胞免疫应答的效率。相对地,聚集的a-BTLC则主要停留在注射位点,浸润LNs效率低下,从而无法有效诱发细胞免疫应答。5.脾脏靶向性LDH疫苗可快速诱发强烈的抗肿瘤免疫应答。恶性肿瘤通常生长迅速且致死率高,对疫苗的时效性要求较高,而当前大多数肿瘤治疗性疫苗对于中晚期的实体瘤治疗效果较差。通过静脉注射（IV）优化的LDH疫苗能够迅速富集于脾脏,并诱发强烈的T细胞免疫应答。在这基础上,通过联合皮下注射（SC）的方式,设计了一种新型的疫苗注射策略IV+SC。即在肿瘤早期通过Ⅳ途径注射疫苗以快速引发免疫应答,随后通过SC途径注射疫苗来持续刺激免疫系统,实现“快速强效免疫反应”与“长期免疫激发”的结合,从而更高效地抑制肿瘤生长。更有意义的是,将疫苗以IV和SC途径同时注射,能够引发更强烈的T细胞免疫应答,显着抑制晚期肿瘤的生长。
庄齐[6]（2020）在《基于穿膜肽和细菌外膜囊泡的新型肿瘤疫苗的设计构建及其在肿瘤治疗中的探索》文中进行了进一步梳理人类对抗肿瘤的历史已有几百年,所发展的肿瘤治疗手段也越来越多。传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗和化疗等。肿瘤免疫治疗是一种新型的肿瘤治疗手段,能够能通过诱发病人自身的抗肿瘤免疫反应来清除肿瘤。肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的分支之一,近年来发展迅速,但是具有高抗肿瘤疗效的理想肿瘤疫苗仍有待进一步开发。为诱发有效的抗肿瘤免疫反应,达到更好的抗肿瘤效果,理想的肿瘤疫苗需要具有高免疫原性的抗原,有效的递送策略,以及高效的免疫佐剂。本论文据此设计了两种肿瘤疫苗,并对其抗肿瘤效果进行了评估。首先,肿瘤疫苗中的抗原作为外源性抗原,无法高效地引发能够直接杀伤肿瘤的CD8+T细胞免疫反应,是多种肿瘤疫苗疗效有限的主要原因之一。针对该问题,我们以鸡卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）为模式抗原,利用新型穿膜肽胞质定位内化肽 6（Cytosol localizing internalization peptide 6,CLIP6）与其偶联改变OVA的入胞形式。我们的工作表明,CLIP6的偶联能够显着提高髓源树突状细胞（Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs）中 OVA 被主要组织相容性复合物 I（Major histocompatibility complex I,MHC I）提呈的效率,而且在小鼠黑色素瘤模型（Mouse melanoma cells,B16-OVA）中,CLIP6-OVA 做为预防型疫苗能够在一定程度上抑制肿瘤生长。其次,细菌外膜囊泡（Bacterial outer membrane vesicle,OMV）具有很强免疫刺激能力,但需要多次注射才能够抑制肿瘤生长,副作用风险较高。在前期工作中,我们发现单次注射沙门氏杆菌的外膜囊泡S.t ΔpG-OMV能致肿瘤变黑。因此,我们首先对该现象展开研究。实验结果表明,S.t ΔpG-OMV能够导致肿瘤淤血,进而致使肿瘤在近红外区的光吸收显着增加。机制研究表明,革兰氏阴性菌表面的脂多糖是导致肿瘤淤血的关键。基于此现象,我们进一步设计了基于S.tΔpG-OMV和光热治疗（Photothermal therapy,PTT）的肿瘤原位疫苗策略,即在不外加光热剂的情况下,通过注射S.tΔpG-OMV引发肿瘤部位淤血,以淤血富集的血红素为光热剂实现PTT;同时,利用PTT过程中破损的肿瘤细胞提供“原位”抗原,并利用S.t ΔpG-OMV的免疫刺激能力进一步增强抗肿瘤免疫反应。研究结果显示,在活体水平单次、低剂量注射S.t ΔpG-OMV原位疫苗未观察到明显的生物毒性,而且在小鼠结肠癌（Mouse colon cancer cells,CT26）和乳腺癌（Mouse breast cancer cells,4T1）模型中,该原位疫苗能够完全清除4T1和CT26皮下瘤,并在治疗120天后完全抑制CT26肿瘤的复发,显示出极佳的抗肿瘤效果。综上,本论文设计构建了两种新型肿瘤疫苗。两种疫苗均制备工艺简单,成本较低,且具有较高的生物相容性,具有进一步开发的潜力,为开发不同类型的肿瘤疫苗提供了新思路。
刘婷婷[7]（2020）在《乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选及鉴定》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:目前,乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,过去20年中乳腺癌的发病率逐步升高。虽然乳腺癌的早期诊断和综合治疗已取得很大进步,但仍有部分患者出现局部复发或远处转移。随着人们对肿瘤发生机制的研究以及肿瘤干细胞理论的提出,实体瘤干细胞逐渐引起人们的关注。乳腺癌干细胞是一群具有自我更新、高度致瘤性的多潜能细胞,处于细胞等级的顶端,一般情况下处于静止状态,很少分裂。当分裂时,通常以不对称分裂的方式进行,产生一个新的静止的干细胞,同时产生一个分裂活跃的子细胞。乳腺癌的发生发展、转移、复发及治疗抵抗都与其有着密切联系。在乳腺癌的临床治疗中,只有靶向消除乳腺癌干细胞才是从根源上治愈乳腺癌的方法。因此,研究乳腺癌干细胞的生物特性和表型,并针对乳腺癌干细胞采取相应的治疗措施,对乳腺癌的治疗,尤其对内分泌治疗和靶向抗Her-2治疗均不敏感的三阴性乳腺癌具有重要意义。噬菌体随机肽库及其筛选技术是一种寻找高特异性蛋白分子的技术,将随机多肽与噬菌体的衣壳蛋白进行融合,在病毒颗粒表面排列表现为极高的序列多样性,与靶分子进行淘选后可以快速得到与靶蛋白相互作用的多肽或氨基酸序列,已广泛应用于肿瘤靶向治疗、肿瘤诊断标志物等研究。利用噬菌体肽库筛选肿瘤细胞,可以得到能与其特异性结合的多肽片段,本研究选用了人源性普通乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7细胞系,通过“无血清-有血清”交替培养法分别富集其中的乳腺癌干细胞,流式细胞术进行验证分选后,利用噬菌体随机肽库对富集到的乳腺癌干细胞分别进行多轮筛选,得到能够分别与MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞特异性结合的阳性噬菌体,进行扩增并测序。之后根据测序结果合成多肽,以FITC进行标记,体外细胞实验及动物实验体内分别验证多肽与乳腺癌干细胞结合的特异性,为进一步寻找乳腺癌新型标记物,及靶向治疗乳腺癌干细胞提供基础的理论依据。材料与方法:人乳腺正常细胞系hs578bst、人源性MCF-7细胞系、人源性乳腺癌MDA-MB-231 细胞系均由天津医科大学附属肿瘤医院免疫学国家重点实验室保存并提供。所用宿主菌E.coli ER2738、噬菌体随机肽库（Ph.D-12TM Phage Display PeptideLibrary）购自New England Biolabs公司;胰酶、胎牛血清、DMEM培养基等购自Hyclone公司;M13噬菌体质粒提取试剂盒购自Biomiga公司;HRP-antiM13噬菌体抗体购自GE公司;ELISA染色试剂等购自武汉默沙克生物科技有限公司;ALDEFLUOR Kit 购自 STEMCELL Technologies公司。选取人源性乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231,使用含有10%胎牛血清和双抗的DMEM培养液进行常规培养后,将B27、bFGF和EGF三种生长因子添加到无血清培养基中,以此培养并富集普通乳腺癌细胞当中的干细胞,每两三天离心换液,每无血清培养七天后,有血清培养一代以去除死细胞,如此“无血清-有血清”培养法交替,之后置于显微镜下,注意观察干细胞微球体形成情况,以能够最大程度成功富集到乳腺癌干细胞。以CD44+CD24-/lowESA+、ALDH+分别作为乳腺癌干细胞的细胞表型,流式细胞仪鉴定乳腺癌干细胞的富集情况。使用噬菌体随机肽库对富集到的乳腺癌干细胞进行多轮筛选,每一轮筛选后都要注意洗脱噬菌体,对筛选产物进行扩增和滴定后,进入下一轮筛选。ELISA检测法对阳性噬菌体鉴定和测序后,随机挑取10个阳性蓝色噬菌斑,用于后续的实验测序。将选中的阳性噬菌体进行克隆扩增,应用M13噬菌体质粒试剂盒提取DNA,送上海微基生物科技有限公司测序,根据测序结果合成多肽。将合成的多肽用FITC标记,分别与人普通乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞共同孵育,在荧光显微镜（FITC使用490nm激发波长,Hochst33258使用346nm激发波长）下进行观察拍照。之后建立BALB/c-nu裸鼠动物移植瘤模型,将MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞分别接种于裸鼠右后肢皮下组织,在局部形成原发癌,再将合成多肽通过尾静脉注入裸鼠动物体内,解剖裸鼠,检测多肽在裸鼠体内肿瘤组织和对照肝脏组织的分布情况。结果:“无血清-有血清”法交替培养普通乳腺癌细胞,经过三轮交替培养后,可以观察到培养液中形成大量悬浮的干细胞微球体,呈不规则圆球状,并随时间延长逐渐增大增多,将其传代至有血清培养基中后可见贴壁生长。以CD44+CD24-/lowESA+为乳腺癌干细胞的表型,流式细胞仪进行鉴定,可见MDA-MB-231和MCF7干细胞诱导比例,分别为77.7%和82.2%。以ALDH+作为乳腺癌干细胞的表型标记,流式细胞仪进行鉴定,可见MDA-MB-231和MCF7干细胞诱导比例,分别为 75.8%和 58.7%。噬菌体随机肽库经过与普通乳腺癌细胞系的减性筛选,以及与乳腺癌干细胞的亲和筛选,进行3轮筛选后可得到近200倍富集的噬菌体。与MDA-MB-231乳腺癌干细胞筛选后可得到8个阳性噬菌体序列,与MCF7乳腺癌干细胞筛选后可得到6个阳性噬菌体序列。从中针对MDA-MB-231乳腺癌干细胞随机选取B8进行测序,根据测序结果,合成多肽,命名为多肽B8,同时选取对照多肽为B11。针对MCF7乳腺癌干细胞随机选取A3进行测序,根据测序结果,合成多肽,命名为多肽A3,同时选取对照多肽为A13。对所得阳性多肽和对照多肽均以FITC标记。将多肽B8和A3分别与普通乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞共孵育后,荧光显微镜（FITC使用490nm激发波长,Hochst33258使用346nm激发波长）下进行观察拍照,可见合成多肽B8可与MDA-MB-231乳腺癌干细胞特异性结合,同时,合成多肽A3可与MCF7乳腺癌干细胞特异性结合。以乳腺癌干细胞MDA-MB-231和MCF7成功建立裸鼠动物模型,将合成多肽B8和A3通过尾静脉注射分别注入裸鼠体内,解剖裸鼠,可见多肽B8和A3在肿瘤组织中的分布明显高于对照肝脏组织。结论:利用噬菌体随机肽库成功筛选出能够与MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞特异性结合的多肽,为乳腺癌干细胞的靶向治疗和进一步深入研究提供基础理论依据。
刘潇[8]（2020）在《基于模拟表位肽聚合物的曲妥珠单抗纯化检测新技术研究》文中研究指明单克隆抗体药物在肿瘤及免疫系统疾病治疗方案中占据重要地位,开发新靶点的抗体药物具有广阔的市场前景。但不同患者体内单抗药响应、组织分布水平、药物清除率均存在差异。因此监测单抗药在患者体内的浓度水平不仅为药代动力学研究提供数据,而且有利于个体化治疗。目前临床上使用最广泛的抗体浓度检测方法是酶联免疫吸附测定法（ELISA）,尽管该法利用抗原抗体识别作用可对目标物实现高特异性和高灵敏度的分析,但抗原成本高昂且难以获得,此外存在免疫交叉反应干扰、系统偏差等缺点。LC-MS/MS可作为ELISA的重要补充,但其需要复杂的样品前处理、昂贵的质谱设备以及耗时的酶解反应。因此开发简单、低成本、高特异性的单抗捕获和分析方法对于体内单抗药浓度监测及相关应用意义重大。模拟表位肽具有特异性高、分子量小、成本低等优点,是替代抗原的最佳选择之一。聚合物材料易于制备修饰、疏松多孔且具有较好的抗非特异性吸附能力,是合适的配基载体。本文的研究内容主要是将模拟表位肽与聚合物材料相结合制备模拟表位肽聚合物,将其用于血清中单抗药的高效捕获,并与常规的蛋白定量方法相结合开发简单、低成本、高特异性的新型单抗定量分析技术,实现乳腺癌病人血清样本或细胞培养液中单抗药的靶向富集与定量分析。论文的主要内容如下:第一章,系统介绍了乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）靶向治疗性单抗药的基本情况,包括研究进展、曲妥珠单抗的药效学机制及临床应用,并对血清中单抗药的定量检测技术进行归纳,分析体内单抗药检测面临的热点与难点,总结现有方法的优缺点。在此基础上,提出本论文的研究思路、实验设计以及创新点。第二章,分析HER2抗原与曲妥珠单抗的结合位点,设计靶抗原模拟表位肽HH24,选择微量热泳动技术对多肽的亲和力进行测定,探究修饰过程对于模拟表位肽亲和力的影响。利用分子动力学模拟技术分析HH24肽与曲妥珠单抗的结合位点、主要作用力以及贡献氨基酸。结果表明,HH24肽可通过多种作用力（尤其是静电作用力）与曲妥珠单抗Fab中的互补决定区（CDR）靶向结合。第三章,开发HH24肽仿生聚合物材料,利用一系列表征验证HH24肽的成功修饰。系统考察HH24肽聚合物材料在复杂样本中对曲妥珠单抗的识别纯化能力,通过吸附等温曲线以及穿透曲线测定该材料对曲妥珠单抗的吸附容量;利用FITC标记的BSA考察HH24肽聚合物材料的抗非特异性吸附能力;进一步采用MADIL-TOF MS以及LC-MS/MS对加标血清洗脱液进行分析。实验结果表明HH24肽聚合物材料对曲妥珠单抗有较好的吸附容量,并且具备高特异性和优异的抗非特异性吸附能力,能够在人血清中有效区分h Ig G与曲妥珠单抗,并从加标血清中高效捕获曲妥珠单抗,回收率和纯度分别达到90%与98%。第四章,基于HER2模拟表位肽聚合物材料的复杂体系中曲妥珠单抗定量分析平台的构建与应用。本章整合HH24肽聚合物材料的高特异性识别能力与荧光分光光度法的高灵敏度构建新型的定量分析平台,用于实际乳腺癌患者血清中曲妥珠单抗的定量分析和CHO细胞培养液中曲妥珠单抗生物类似药的富集纯化与含量分析。研究结果发现该平台的定量结果与ELISA方法之间具有较好的一致性,充分证明了该平台不仅可以有效捕获复杂体系中的目标单抗,而且展现出高效、准确的临床监测分析能力。第五章,对全文的主要研究内容和创新点进行总结,并对不足之处进行讨论,最后对HH24肽仿生聚合物材料的应用前景进行展望。
安雅聪[9]（2020）在《新型OFA/iLRP核酸适配体的筛选及AML靶向治疗系统的构建》文中认为目的:AML是严重威胁人类生命健康的血液系统恶性肿瘤,是致死率最高的白血病类型。目前,化疗是大部分AML患者的标准治疗方案,但传统化疗药物通常会产生严重的毒副作用,限制了治疗效果。靶向治疗通过将细胞毒药物选择性地递送至肿瘤部位,既可杀伤肿瘤细胞,又能降低对正常细胞的损伤,是减轻化疗毒副作用、提高疗效的重要策略。OFA/iLRP是治疗AML较为理想的靶标分子,在大多数AML肿瘤细胞表面高表达,而在正常组织细胞表面低表达或不表达。核酸适配体是一类以单链DNA或RNA构成的新型配体分子,能够以较高的亲和力和特异性与靶标结合,并具有易于合成、易于修饰、价格低廉、易于渗透进入肿瘤组织、免疫原性低等优点,在肿瘤靶向治疗领域具有较大应用潜能。目前,针对OFA/iLRP的核酸适配体尚未见文献报道。本课题筛选出了首个以OFA/iLRP为靶标的核酸适配体,利用此适配体构建了适配体-阿霉素（Apt-Dox）药物靶向递送系统,并在体外对该系统的特异性及有效性进行了初步评估。方法:以OFA/iLRP抗原表位多肽为靶标,利用SELEX技术,经过多轮筛选,得到针对OFA/iLRP的核酸适配体。利用流式细胞术检测适配体与OFA/iLRP多肽结合的亲和常数,以及适配体与OFA/iLRP多肽、白蛋白、卵清蛋白和胰蛋白酶的结合情况。利用流式细胞术和激光共聚焦显微镜技术检测适配体与OFA/iLRP阳性肿瘤细胞（HL-60、Jurkat和Ramos）及OFA/iLRP阴性细胞（PBMC）的结合情况。通过将阿霉素（Dox）嵌入适配体的DNA结构中,构建Apt-Dox复合体。利用激光共聚焦显微镜技术观察OFA/iLRP 阳性的AML细胞和OFA/iLRP阴性细胞对Apt-Dox的摄取情况。通过MTS法检测Apt-Dox对OFA/iLRP阳性/阴性细胞的杀伤情况。结果:（1）经过多次尝试及反复筛选,我们得到了一个针对OFA/iLRP的核酸适配体（AB3）,该适配体含有59个碱基,一级序列为:5’-TGCGTGTGTAGTGTG TCTGTTGTTTGTATTGTTGTCTATCCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3’。（2）靶标亲和力测量显示,该适配体与OFA/iLRP结构的亲和常数为101.25 nM。（3）靶标特异性评估显示,该适配体与OFA/iLRP多肽的结合较强,但几乎不与白蛋白、卵清蛋白和胰蛋白酶结合。（4）细胞结合实验显示,适配体AB3能选择性地结合OFA/iLRP阳性的肿瘤细胞HL-60、Jurkat和Ramos,而几乎不与OFA/iLRP阴性的对照细胞结合。（5）药物递送实验显示,适配体AB3与Dox可自组装成Apt-Dox复合体,并选择性地将Dox递送至OFA/iLRP阳性的AML细胞,同时降低阴性细胞对药物的摄取。（6）细胞杀伤实验显示,Apt-Dox能选择性地杀伤OFA/iLRP 阳性的AML细胞,并显着降低对OFA/iLRP阴性细胞的杀伤。结论:OFA/iLRP在大多数AML细胞表面高表达,而在正常组织细胞表面低表达。本课题筛选到了首个针对OFA/iLRP的核酸适配体AB3,该适配体对OFA/iLRP结构的亲和力和特异性较高,能选择性地结合OFA/iLRP 阳性的肿瘤细胞,而几乎不与OFA/iLRP阴性的对照细胞结合。用AB3构建的Apt-Dox复合物,在体外能够选择性地将Dox递送至OFA/iLRP阳性的AML细胞,实现对肿瘤细胞的靶向性杀伤。上述结果提示,OFA/iLRP核酸适配体可能在AML靶向治疗方向具有较为重要的应用前景。
金丹[10]（2020）在《功能化DNA纳米探针用于外泌体检测及其监测中药活性成分调控肿瘤来源外泌体》文中认为研究背景和目的作为中国传统文化的瑰宝,中医药以其独特的理论体系和良好而确切的临床疗效,几千年来为国人的健康事业作出了巨大的贡献。近些年来,随着人们健康观念的转变和医学模式的变更,中医药在各类疾病的预防和治疗上更展现出了独特的优势。肿瘤尤其是恶性肿瘤是危害人类生命和健康最严重的疾病之一。根据中医学理论,肿瘤的产生因为是阴阳失衡,气血不调,五脏之气机紊乱。中药治疗肿瘤是在辨证论治基础上,给予扶正固本、软坚散结、活血化瘀、理气行滞、清热解毒等方法进行整体观的治疗。近年来,随着中药抗肿瘤的实验研究和临床应用的深入开展,中药及其活性成分在肿瘤放化疗时的增效减毒、提高患者整体免疫机能、改善临床症状和提高生命质量等方面的作用日趋凸显,使得中药抗肿瘤越来越受到国际社会的认可和接受。现代临床研究者们从分子生物学和分子药理学的角度对中药抗肿瘤的机制进行了广泛的探索,发现中药抗肿瘤具有多靶点、多效应、多环节的特点,但其抗肿瘤的复杂机制尚不完全清楚,特别是中药对于肿瘤微环境、肿瘤的免疫逃逸和肿瘤耐药的调控,都有待更加深入地研究。外泌体广泛分布于人体各种体液中。作为细胞间物质交换和信息传递的信使,外泌体不仅参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,还介导了肿瘤细胞的免疫逃逸和耐药等过程。目前外泌体作为理想的液体活检标志物和药物载体已被用于多种肿瘤的诊断、监测和治疗。近些年来,亦有许多中药单体、复方和中药活性成分被发现能通过调控外泌体释放来发挥抗肿瘤作用,这使得外泌体有望成为肿瘤治疗新的靶点。因此,研究中药如何调控肿瘤来源的外泌体将具有十分重要的意义,而如何快速、准确地监测肿瘤外泌体在中药作用肿瘤时发生的变化是研究者们首先需要关注和探索的问题。当前报道的文献中主要是采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和蛋白免疫印迹法（WB）等传统分析方法来检测外泌体。这些检测方法虽然经典可靠,但是灵敏度和特异性有限,实验所需要的仪器设备和试剂成本较高,而且操作步骤繁琐耗时。所以,发展简单快捷、准确可靠、灵敏特异且成本低廉的新技术和新方法来实施外泌体的检测分析显得尤为重要。由于具有灵敏度高、特异性好、快速、准确和方便的特点,生物传感检测已被广泛应用于环境卫生和临床医药等领域。目前已有多种生物传感技术用于外泌体的检测,如电化学、表面等离子共振、表面声波、场效应晶体管等。这些基于界面修饰的外泌体生物传感技术具有较高的灵敏度,但是其生物传感器件的制备通常需要复杂的纳米制备工艺或者繁琐的界面工程,并且大多数生物传感技术都以昂贵的抗体来作为外泌体的识别元件。然而,在临床常规实验室中,可靠有效且成本合理的外泌体检测仍然是个艰难的任务,主要问题在于缺乏足够简易和快速的测定平台。脱氧核糖核酸（DNA）是生物体内遗传信息的重要载体。随着DNA固相合成技术的发展,人工合成DNA的成本显着降低。体外合成的DNA可以作为功能性分子或纳米材料发挥很多重要的功能。DNA可作为核酸探针对其互补序列进行特异性识别,也能作为核酸适体来靶向识别结合包括小分子有机化合物、无机金属离子、蛋白质、多肽、微囊泡甚至细胞和组织在内的各种靶标。将DNA的生物识别属性与一些纳米材料（如氧化石墨烯、碳纳米管等）的优良传感特性和信号转导机制相结合,可通过各种常规实验室检测平台（如荧光分析、比色分析等）实现对包括外泌体在内的各种生物样本的高灵敏检测。值得注意的是,DNA本身还可利用互补链之间严格的碱基互补配对自组装形成结构有序、功能可控的DNA纳米材料,并可构建成为对外泌体具有信号响应功能和信号扩增功能的DNA纳米分子机器。鉴于外泌体的纳米尺度,功能化DNA组件和外泌体都限制在同一个纳米空间内,反应物有效浓度将得到极大的提高,能够实现检测信号的快速放大。本研究拟利用功能化DNA的生物识别特性,结合纳米材料和DNA纳米分子机器的信号转导功能和信号扩增功能,设计均相体系中基于荧光分析的纳米生物传感技术,用于外泌体及其表型分子的检测。采用此技术分析肿瘤来源的外泌体,不仅可以准确反映肿瘤发生时的外泌体丰度及表型特征,也可以实时监测各种药物作用肿瘤的过程中外泌体发生的变化,这对于研究中药抗肿瘤机制以及抗肿瘤效果均具有十分重要的意义。方法与结果本研究首先制备了基于DNase I催化的氧化石墨烯核酸适配体纳米探针,用于肿瘤外泌体的高灵敏检测和表型分析;然后构建了外泌体激活的无酶放大的多价DNA纳米分子机器实现了外泌体的超灵敏检测以及表型分子的双色检测,并可用于肿瘤的免疫治疗监测。在此基础之上,运用构建的传感器监测中药活性成分对肿瘤外泌体及外泌体PD-L1的调控。本课题的主要内容包括以下三个部分:第一部分:基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于外泌体定量和表型分析外泌体的膜表面及囊泡内携带有多种生物活性分子,多为核酸、蛋白质、多肽和脂质等。由于外泌体的分子特征可以精确地反映其生物来源,因此肿瘤外泌体正逐渐成为肿瘤诊断的新型标志物。然而体液中外泌体的分子表达谱精准分析和定量检测在技术上仍具有很大挑战。针对这一问题,构建了一种基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于肿瘤外泌体表型分析和检测。ExoAPP通过氧化石墨烯和靶向外泌体表面特定蛋白的适体荧光探针相结合形成“Off”纳米探针复合物。在DNase I参与下,核酸适体纳米复合物探针可反复识别目标外泌体,不断循环放大荧光信号“On”,从而可甄别外泌体表面标志物的细微变化,实现了5种不同来源外泌体的表型分析,揭示了外泌体的异质性。相比已报道的外泌体均相检测方法,ExoAPP的灵敏度至少提高了12个数量级,检测限达到1.6×105 particles/mL。这种高灵敏的ExoAPP技术还可监测药物诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转变（EMT）。通过对前列腺癌患者血液样本外泌体表面的PSMA等标志物表达差异分析,ExoAPP可准确鉴别前列腺癌患者和健康人群,进一步证实PSMA等标志物在前列腺癌临床诊断中的潜力。第二部分:基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术用于外泌体表面标志物的双色分析和抗PD-1免疫治疗监测受到细胞内高效运行的分子机器的启发,我们将外泌体与核酸适体的多价识别与Toehold介导的链置换循环反应相结合,构建了一种由外泌体激活的具有多价循环放大效应的DNA纳米分子机器（ExoADM）,可实现超灵敏的外泌体检测和外泌体表面标志物的双色分析,并可用于抗PD-1免疫治疗监测。ExoADM包含三个核心部件:可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适体发生多价结合,释放识别探针中的引发链;引发链侵入信号探针,通过结合Toehold区域Ⅰ,驱动链的分支迁移释放出猝灭链,解放荧光报告基团,并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ;燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ,启动Toehold介导的链置换循环反应,发生连续的分支迁移和多价回收。基于信号探针中的荧光信号转导机制,单个分子识别事件可引发ExoADM连续释放大量荧光报告基团,实现信号放大,为外泌体分析提供了一个超灵敏（3.3×104 particles/mL）、高特异的无酶催化生物传感平台。此外,两种靶向不同外泌体表面标志物的ExoADM可以协同运行,实现外泌体的双色表型分析。利用双色策略,我们可以同时追踪由IFN-γ和白藜芦醇分别诱导PC-3细胞引起的外泌体PD-L1和外泌体CD63表达的动态变化。我们还发现PD-L1和CD63在循环外泌体上的表达水平可以很好地区分肿瘤患者与健康人群。更重要的是,循环外泌体PD-L1水平可以反映肿瘤患者对不同治疗措施（如放疗、化疗和抗PD-1免疫治疗）的治疗反应,有助于指导抗PD-1免疫治疗,并揭示外泌体PD-L1在临床诊断和治疗监测方面的潜力。第三部分:基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术监测中药活性成分调控肿瘤细胞外泌体及外泌体PD-L1的研究在上述工作基础上,选取四种中药活性成分:白藜芦醇、紫草素、桔梗皂苷D和紫杉醇,分别作用于非小细胞肺癌A549细胞。在分析了这四种药物对A549细胞增殖和凋亡的影响的基础上,采用ExoADM监测了中药活性成分对肿瘤细胞外泌体释放及外泌体PD-L1的调控。首先采用CCK-8法、流式细胞术和Western blotting技术分析了四种中药活性成分对非小细胞肺癌A549细胞的细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,四种药物在一定浓度范围内能够抑制A549细胞增殖,且呈时间浓度依赖性;流式凋亡检测和凋亡相关蛋白的免疫印迹分析证实四种药物有诱导A549细胞凋亡的作用。接下来从四种药物分别处理A549细胞48 h后的细胞上清中分离提取外泌体,并采用ExoADM技术检测外泌体CD63和PD-L1水平。结果表明,这些药物在抑制肿瘤细胞增殖促进其凋亡的同时,也影响了细胞内外泌体合成、内容物装配和转运释放等相关的信号路径,可诱导或抑制外泌体的胞外释放及影响外泌体携带的生物信息分子的表达。在选用的四种中药活性成分中,除了紫草素可以轻度抑制A549细胞的外泌体释放,其他三种均表现出对外泌体释放的诱导增强作用。与此同时,这四种药物均不同程度地促进了外泌体PD-L1的表达。我们用NTA法、BCA法和Western blotting技术进一步验证了我们的实验结果。这提示我们,当这四种中药活性成分被用于临床非小细胞肺癌治疗时,在抑制原发肿瘤病灶细胞增殖的同时,可能会通过上调外泌体PD-L1水平来激活外泌体介导的PD-L1/PD-1路径,促进肿瘤发生免疫逃逸和转移;也有可能通过上调肿瘤的PD-L1水平来提高免疫抑制剂治疗的敏感性,这提示我们联合应用中药活性成分治疗将成为肿瘤免疫治疗的一个重要发展方向。我们的实验结论进一步证实了中药对肿瘤细胞增殖的抑制效应,同时也揭示了中药对肿瘤外泌体及其携带的信号分子调控的复杂性,体现了中药对肿瘤的多靶点、多效应、多环节的调控特点。结论1.发展了一种基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术,实现了肿瘤外泌体的高灵敏定量检测和外泌体蛋白达谱分析,为基于外泌体的肿瘤液体活检提供了一种简单、快速、可靠的生物传感平台。2.发展了一种基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术,实现了无酶催化的超灵敏外泌体检测和外泌体双色表型分析,并将其应用于肿瘤免疫治疗（抗PD-1）的监测。3.白藜芦醇、紫草素、桔梗皂苷D和紫杉醇对A549细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。4.采用ExoADM技术监测了中药活性成分对肿瘤细胞外泌体及外泌体PD-L1的调控。紫草素可以抑制A549细胞外泌体的释放,白藜芦醇、桔梗皂苷D和紫杉醇均可诱导A549细胞外泌体释放;四种中药活性成分均不同程度地促进A549细胞外泌体PD-L1的表达。
二、组织多肽特异抗原测定在乳腺癌治疗中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、组织多肽特异抗原测定在乳腺癌治疗中的应用（论文提纲范文）
（1）基于主客体自组装的MUC1金纳米肿瘤疫苗的制备及活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症治疗的概述 |
| 1.1.1 癌症的传统治疗手段 |
| 1.1.2 癌症的免疫治疗手段 |
| 1.2 基于肿瘤相关糖抗原的免疫治疗 |
| 1.3 基于糖蛋白MUC1 的疫苗开发 |
| 1.3.1 MUC1 概述 |
| 1.3.2 基于蛋白载体的MUC1 疫苗 |
| 1.3.3 多组分MUC1 疫苗 |
| 1.3.4 多价MUC1 疫苗 |
| 1.3.5 基于纳米颗粒载体的MUC1 疫苗 |
| 1.4 基于金纳米颗粒载体的肿瘤疫苗 |
| 1.5 基于β-环糊精的主客体自组装及其生物学应用 |
| 1.6 本论文研究目的及内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验溶液配置 |
| 2.2 疫苗合成实验方法 |
| 2.2.1 糖基化氨基酸衍生物的化学合成方法 |
| 2.2.2 金刚烷修饰的MUC1 多肽的合成方法 |
| 2.2.3 环糊精修饰的金纳米颗粒的合成方法 |
| 2.2.4 MUC1 纳米金颗粒疫苗的自组装制备方法 |
| 2.3 疫苗活性评价方法 |
| 2.3.1 细胞培养方法 |
| 2.3.2 金纳米颗粒的细胞毒性测试 |
| 2.3.3 巨噬细胞对MUC1 金纳米颗粒的摄取评价 |
| 2.3.4 MUC1 金纳米颗粒疫苗的动物免疫方案 |
| 2.3.5 MUC1 金纳米颗粒疫苗的免疫效果评价 |
| 2.3.6 免疫血清中抗体与肿瘤细胞结合评价 |
| 2.3.7 补体依赖的细胞毒性实验 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 疫苗的合成与表征 |
| 3.1.1 糖基化氨基酸衍生物的合成 |
| 3.1.2 金刚烷修饰的MUC1 多肽的合成 |
| 3.1.3 环糊精修饰的金纳米颗粒的合成及疫苗自组装 |
| 3.1.4 金纳米颗粒及MUC1 疫苗的表征 |
| 3.2 MUC1 金纳米颗粒疫苗的体外生物学活性评价 |
| 3.2.1 金纳米颗粒的细胞毒性实验 |
| 3.2.2 MUC1 金纳米颗粒疫苗的细胞摄取实验 |
| 3.3 MUC1 金纳米颗粒疫苗的小鼠体内免疫活性评价 |
| 3.3.1 小鼠体内免疫实验及抗体滴度的检测 |
| 3.3.2 疫苗所引起的抗体类别和亚型的分析 |
| 3.3.3 抗体与肿瘤细胞的结合评价 |
| 3.3.4 补体依赖的细胞毒性试验 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A:化合物核磁谱图 |
| 附录 B:化合物质谱图 |
| 附录 C:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）多肽药物筛选及基于肿瘤细胞膜的多肽运载体系的构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 多肽在生物医学领域的应用 |
| 1.1.1 多肽在肿瘤治疗诊断领域中的概述 |
| 1.1.2 多肽在新冠病毒治疗中的应用 |
| 1.2 多肽药物的设计与开发 |
| 1.2.1 依据多肽-蛋白质相互作用原理进行多肽设计 |
| 1.2.2 多肽药物的设计方法 |
| 1.3 表面展示技术功能多肽筛选 |
| 1.3.1 噬菌体表面展示技术 |
| 1.3.2 细菌表面展示技术 |
| 1.3.3 酵母表面展示技术 |
| 1.4 用于多肽运输的细胞膜纳米载药体系 |
| 1.4.1 细胞膜纳米载药体系 |
| 1.4.2 诊疗一体化纳米载药体系 |
| 1.5 课题设计思路与研究目标 |
| 第2章 PD-1多肽抑制剂的筛选 |
| 2.1 本章引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.3 实验操作流程 |
| 2.3.1 PD-1蛋白的生物素标记,标记效率及标记后蛋白活性测定 |
| 2.3.2 从细菌随机多肽库中筛选PD-1特异性结合多肽 |
| 2.3.3 多肽理化性质测定 |
| 2.3.4 游离多肽生理活性测定 |
| 2.3.5 ZDOCK模拟PD-1靶向多肽与PD-1结合位点 |
| 2.3.6 数据统计与处理 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 PD-1蛋白生物素标记情况 |
| 2.4.2 磁珠分选与流式分选 |
| 2.4.3 PD-1结合多肽的保守序列分析 |
| 2.4.4 多肽理化性质 |
| 2.4.5 PBP-1多肽与PD-L1竞争结合PD-1 |
| 2.4.6 PBP-1多肽阻断T细胞中PD-1与PD-L1结合 |
| 2.4.7 PBP-1多肽与PD-1的结合位点预测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 ACE-2多肽抑制剂的筛选 |
| 3.1 本章引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 从eCPX库中筛选ACE-2特异性结合多肽 |
| 3.3.2 多肽理化性质测定 |
| 3.3.3 游离多肽生理活性测定 |
| 3.3.4 ZDOCK模拟ACE-2靶向多肽与S结合位点 |
| 3.3.5 数据处理 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 从eCPX库中筛选ACE-2特异性结合多肽 |
| 3.4.2 ACE-2结合多肽的保守序列分析 |
| 3.4.3 细菌表面多肽理化性质 |
| 3.4.4 游离多肽理化性质 |
| 3.4.5 TAP-1多肽的生理活性 |
| 3.4.6 多肽阻断ACE-2的假病毒入侵细胞 |
| 3.4.7 TAP-1多肽与ACE-2/S的结合位点预测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 肿瘤细胞膜运输多肽的载药体系建立 |
| 4.1 本章引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂及配制 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞膜载药体系建立 |
| 4.3.2 细胞膜包载铁磁粒子(SPIO NP@M-P)载药体系建立 |
| 4.3.3 SPIO NP@M-P体内实验 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 肿瘤细胞膜囊泡的合成与表征 |
| 4.4.2 细胞膜包载铁磁粒子(SPIO NP@M-P)载药体系建立 |
| 4.4.3 SPIO NP@M-P体内实验 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 讨论与展望 |
| 5.2.1 多肽成为药物的关键要素 |
| 5.2.2 肿瘤细胞膜载药体系用于的多肽运输 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
| 致谢 |
（3）组织多肽特异性抗原在胃腺癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 1 研究对象与临床筛选标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 标本采集与处理 |
| 2.2 仪器与检测方法 |
| 2.3 阳性判定标准 |
| 2.4 观察指标 |
| 3 统计学方法 |
| 结果 |
| 2.1 血清TPS在胃腺癌病人、胃癌前病变组、胃良性病变组和健康人群组的表达水平与阳性率的比较 |
| 2.2 不同临床病理特征的胃腺癌病人的血清TPS表达水平比较 |
| 2.3 胃腺癌患者中血清 TPS、CEA 和 CA19-9 敏感性及特异性比较 |
| 2.4 胃腺癌患者中血清 TPS 浓度治疗前后比较 |
| 2.5 在胃腺癌患者中,血清TPS浓度与EGFR、HER2 表达的关系 |
| 讨论 |
| 3.1 胃癌与肿瘤标记物 |
| 3.2 组织多肽特异性抗原 TPS |
| 3.3 癌胚抗原(CEA)和糖类抗原 199(CA199) |
| 3.3.1 癌胚抗原 |
| 3.3.2 糖类抗原 199 |
| 3.4 CEA、CA19-9和TPS联合化验 |
| 3.5 血清TPS水平与HER-2 在胃腺癌患者中的表达的关系 |
| 3.6 血清TPS水平与EGFR在胃腺癌患者中的表达的关系 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）乳腺癌患者分子标志物CD44的高效检测及靶向纳米复合材料的构建研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 检测血清中CD44蛋白的无标记电化学阻抗生物传感器 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 CD44靶向和pH响应的载药聚合物胶束的制备与表征 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 pH 刺激响应的纳米粒子在恶性肿瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写词表 |
| 攻读学位期间发表文章和奖励 |
| 致谢 |
（5）水滑石纳米佐剂在肿瘤免疫治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤主动免疫治疗所面临的主要挑战 |
| 1.1.1 临床佐剂现状 |
| 1.1.2 肿瘤免疫耐受的发生及潜在的对抗策略 |
| 1.1.3 新型递送系统的发展及其在体内的转运过程 |
| 1.2 水滑石纳米佐剂的发展与应用 |
| 1.2.1 水滑石的生物医学应用 |
| 1.2.2 水滑石的组成、制备及其佐剂活性 |
| 1.2.3 影响水滑石抗原负载能力的因素 |
| 1.2.4 水滑石与细胞间的相互作用 |
| 1.2.5 水滑石疫苗的体内递送过程及胶体稳定性调控策略 |
| 1.2.6 水滑石与商业化佐剂的对比及其抗肿瘤免疫应用 |
| 1.2.7 水滑石生物安全性 |
| 1.3 立题依据和目标 |
| 1.3.1 论文立题依据 |
| 1.3.2 论文工作目标及策略 |
| 第2章 共递送IDO抑制剂和抗原的LDH疫苗研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要疫苗配方及缩写对照 |
| 2.1.4 LDH纳米疫苗的制备 |
| 2.1.5 TLIs双功能纳米疫苗的表征 |
| 2.1.6 细胞培养及实验动物 |
| 2.1.7 细胞毒性测定 |
| 2.1.8 细胞吞噬与胞内分布 |
| 2.1.9 TLIs下调IDO表达的能力测定 |
| 2.1.10 TLIs疫苗的体内分布 |
| 2.1.11 免疫与肿瘤抑制 |
| 2.1.12 抗原特异性CTL反应测定 |
| 2.1.13 抗原特异性毒性记忆T细胞水平及相关炎症因子测定 |
| 2.1.14 LDH生物安全性评价 |
| 2.1.15 统计学分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 TLIs的制备及性质表征 |
| 2.2.2 TLIs的细胞吞噬能力及胞内分布 |
| 2.2.3 TLIs下调IDO表达的能力 |
| 2.2.4 TLIs的体内分布 |
| 2.2.5 TLIs抑制小鼠黑色素瘤能力评估 |
| 2.2.6 LDH安全性评估 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 体内稳定分散的LDH多价肿瘤疫苗的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 主要疫苗配方及缩写对照 |
| 3.2.4 LDH的合成及s-/a-BLC的制备 |
| 3.2.5 “BSA-抗原”复合物及s-BmALC三价纳米疫苗的制备 |
| 3.2.6 BLC体外分散性测试 |
| 3.2.7 细胞吞噬及分布 |
| 3.2.8 体内分布情况 |
| 3.2.9 免疫与体内抑瘤功能测定 |
| 3.2.10 体内CTL反应测定 |
| 3.2.11 抗原特异性毒性记忆T细胞水平及相关炎症因子测定 |
| 3.2.12 LDH生物安全性评价 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 LDH及相关疫苗的制备 |
| 3.3.2 s-BLC和a-BLC在生理环境下的分散性能测定 |
| 3.3.3 疫苗分散性对于细胞吞噬和胞内分布的影响 |
| 3.3.4 疫苗分散性对其淋巴节浸润能力的影响 |
| 3.3.5 疫苗体内递送过程优化对于黑色素瘤抑制的体内评价 |
| 3.3.6 个性化疫苗诱发广谱抗肿瘤T细胞免疫应答能力的评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 联合光热疗法和化学疗法的多功能LDH纳米佐剂研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 主要疫苗配方及缩写对照 |
| 4.2.4 LDH及IB-LDH的制备与表征 |
| 4.2.5 Dox/DNA、IDB-LDH、ICB-LDH和IDCB-LDH的制备 |
| 4.2.6 光热转化效率评价 |
| 4.2.7 NIR介导的Dox体外释放能力 |
| 4.2.8 NIR诱导的胞内Dox释放 |
| 4.2.9 细胞毒性评估 |
| 4.2.10 IDCB-LDH的肿瘤靶向性及体内分布 |
| 4.2.11 体内治疗 |
| 4.2.12 抗肿瘤细胞免疫应答水平测定 |
| 4.2.13 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 IDCB-LDH的理化性质表征 |
| 4.3.2 IDCB-LDH的分散性 |
| 4.3.3 NIR刺激的IDCB-LDH光热转化能力及Dox释放 |
| 4.3.4 光热疗法和化学治疗的协同作用评价 |
| 4.3.5 体内分布及肿瘤靶向性测定 |
| 4.3.6 PTT和CTX协同清除原位肿瘤 |
| 4.3.7 原位抗肿瘤免疫应答的诱发与维持 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 靶向脾脏和淋巴结的新型LDH疫苗注射策略的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 主要疫苗配方及方法缩写对照 |
| 5.2.4 不同尺寸LDH的合成及稳定化处理方法 |
| 5.2.5 CO-LDH及CT-LDH纳米疫苗的制备及表征 |
| 5.2.6 疫苗脾脏靶向能力及体内分布测定 |
| 5.2.7 DC激活与抗原提呈 |
| 5.2.8 小鼠E.G7-OVA肿瘤模型的构建与免疫 |
| 5.2.9 小鼠B16F10肿瘤模型的构建与免疫 |
| 5.2.10 抗体测定 |
| 5.2.11 脾脏记忆性T细胞及瘤内T细胞测定 |
| 5.2.12 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同粒径LDH纳米疫苗的合成与表征 |
| 5.3.2 不同粒径CO-LDH与细胞间的相互作用 |
| 5.3.3 不同粒径CO-LDH的脾脏靶向及抗肿瘤免疫应答诱导能力 |
| 5.3.4 IV与SC注射介导的疫苗体内分布与迁移 |
| 5.3.5 注射方式对治疗性疫苗诱导免疫应答及淋巴瘤抑制的影响 |
| 5.3.6 不同免疫策略对预防性疫苗抑制淋巴瘤能力的影响 |
| 5.3.7 不同免疫注射途径组合对体内黑色素瘤生长抑制的影响 |
| 5.3.8 脾脏和LNs为靶点的同时免疫对于晚期黑色素瘤的抑制作用 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论和展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点总结 |
| 6.3 后期工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）基于穿膜肽和细菌外膜囊泡的新型肿瘤疫苗的设计构建及其在肿瘤治疗中的探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 传统肿瘤治疗方法 |
| 1.2 免疫疗法 |
| 1.3 肿瘤疫苗 |
| 1.3.1 肽/蛋白疫苗 |
| 1.3.2 核酸疫苗 |
| 1.3.3 仿生疫苗 |
| 1.3.4 原位疫苗 |
| 1.3.4.1 免疫原性细胞死亡 |
| 1.3.4.2 基于放射治疗的原位疫苗 |
| 1.3.4.3 基于光学治疗的原位疫苗 |
| 1.3.4.4 基于化学治疗的原位疫苗 |
| 1.4 肿瘤疫苗改进策略 |
| 1.4.1 增强抗原的免疫刺激能力 |
| 1.4.1.1 新生抗原与个性化疫苗 |
| 1.4.1.2 核酸疫苗与个性化疫苗 |
| 1.4.2 提高抗原的交叉呈递效率 |
| 1.4.2.1 质子海绵效应 |
| 1.4.2.2 穿膜肽 |
| 1.4.3 增强免疫反应 |
| 1.4.3.1 铝盐佐剂 |
| 1.4.3.2 CpG寡脱氧核苷酸 |
| 1.4.3.3 细菌外膜囊泡 |
| 1.5 本研究的选题依据及内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于细胞穿膜肽CLIP6肿瘤疫苗的构建及抗肿瘤研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验药品及设备 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 CLIP6与OVA的偶联 |
| 2.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 偶联效率的测定 |
| 2.3.5 抗原交叉呈递检测 |
| 2.3.6 细胞摄入机制探究 |
| 2.3.7 皮肤内CD11c~+细胞抗原摄入效率检测 |
| 2.3.8 抗原呈递细胞淋巴结迁移检测 |
| 2.3.9 CLIP6-OVA活体肿瘤预防实验 |
| 2.4 实验结果和讨论 |
| 2.4.1 肿瘤疫苗CLIP6-OVA的制备与表征 |
| 2.4.2 CLIP6的偶联对OVA入胞效率的影响 |
| 2.4.3 CLIP6的偶联对抗原交叉呈递效率的影响 |
| 2.4.4 注射部位皮肤内CD11c~+细胞对疫苗摄取效率的研究 |
| 2.4.5 CLIP6的偶联对抗原呈递细胞淋巴结迁移的影响 |
| 2.4.6 CLIP6-OVA作为预防型疫苗的肿瘤预防疗效探究 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于细菌外膜囊泡和光热治疗的原位疫苗策略研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验药品及设备 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 细菌外膜囊泡的制备 |
| 3.3.2 细胞培养与小鼠来源 |
| 3.3.3 细菌外膜囊泡形貌与粒径表征 |
| 3.3.4 细菌外膜囊泡的内毒素检测 |
| 3.3.5 细菌外膜囊泡的吸光度检测 |
| 3.3.6 肿瘤血管荧光染色实验 |
| 3.3.7 肿瘤的光声检测 |
| 3.3.8 细胞毒性测试 |
| 3.3.9 细菌外膜囊泡的生物分布研究 |
| 3.3.10 骨髓源树突状细胞成熟刺激实验 |
| 3.3.11 细胞因子分泌水平测定 |
| 3.3.12 单次注射细菌外膜囊泡引发的肿瘤升温能力检测 |
| 3.3.13 基于细菌外膜囊泡和光热治疗的肿瘤治疗实验 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 沙门氏杆菌外膜囊泡S.t ΔpG-OMV的制备与表征 |
| 3.4.2 S.t ΔpG-OMV引发肿瘤部位变黑现象的研究 |
| 3.4.3 S.t ΔpG-OMV引发肿瘤淤血的机制研究 |
| 3.4.4 S.t ΔpG-OMV的细胞毒性和生物毒性研究 |
| 3.4.5 S.t ΔpG-OMV的免疫刺激能力检测 |
| 3.4.6 单独使用S.t ΔpG-OMV的抗肿瘤效果评价 |
| 3.4.7 基于S.t ΔpG-OMV和光热治疗的原位疫苗的设计与抗肿瘤效果评价 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 论文总结 |
| 4.2 研究展望 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学术论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（8）基于模拟表位肽聚合物的曲妥珠单抗纯化检测新技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 乳腺癌HER2靶向治疗性单抗药的研究进展 |
| 1.3 曲妥珠单抗的药效学机制及临床应用 |
| 1.4 血清中治疗性单抗药血药浓度监测技术 |
| 1.5 本论文研究的构想及创新 |
| 1.6 本学位论文的技术路线 |
| 第二章 模拟表位肽HH24与曲妥珠单抗的亲和力测定及分子动力学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 HH24肽聚合物材料的制备及其对曲妥珠单抗的富集纯化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 本章结论 |
| 第四章 HH24肽聚合物材料结合荧光分光光度法用于血清中曲妥珠单抗的检测研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.4 本章结论 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间已发表论文和专利 |
| 致谢 |
（9）新型OFA/iLRP核酸适配体的筛选及AML靶向治疗系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 急性髓系白血病 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 AML的治疗现状 |
| 2. OFA/iLRP |
| 2.1 OFA/iLRP蛋白 |
| 2.2 OFA/iLRP与肿瘤 |
| 2.3 OFA/iLRP与AML |
| 3. 核酸适配体 |
| 3.1 核酸适配体的筛选 |
| 3.2 核酸适配体在肿瘤诊断中的应用 |
| 3.3 核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的应用 |
| 4. 选题依据及研究意义 |
| 5. 拟解决的科学问题 |
| 6. 研究策略和技术路线 |
| 6.1 研究策略 |
| 6.2 技术路线 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1、实验材料和试剂 |
| 1.1 细胞及其培养 |
| 1.2 细菌 |
| 1.3 单链DNA文库和引物 |
| 1.4 多肤 |
| 1.5 磁珠 |
| 1.6 主要试剂及试剂盒 |
| 1.7 溶液配制 |
| 2. 实验仪器和设备 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 核酸适配体的筛选 |
| 3.2 核酸适配体的克隆、检测及测序 |
| 3.3 AB3二级结构预测 |
| 3.4 AB3与OFA/iLRP结合特异性的检测 |
| 3.5 AB3亲和力的测定 |
| 3.6 AB3与OFA/iLRP阳性/阴性细胞结合情况的检测 |
| 3.7 蛋白酶消化实验 |
| 3.8 适配体-阿霉素药物靶向递送系统(Apt-Dox) |
| 3.9 统计分析 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 1. OFA/iLRP核酸适配体的筛选 |
| 2. OFA/iLRP适配体AB3性质特征分析 |
| 2.1 AB3的序列及结构 |
| 2.2 AB3特异性结合OFA/iLRP多肽 |
| 2.3 AB3亲和力常数的测定 |
| 2.4 AB3选择性结合OFA/iLRP阳性的肿瘤细胞 |
| 2.5 AB3与OFA/iLRP阳性的AML细胞结合位点的定位 |
| 3. AB3能够将Dox选择性地递送到OFA/iLRP阳性的AML细胞 |
| 3.1 适配体-阿霉素复合物(Apt-Dox)的构建 |
| 3.2 Apt-Dox选择性进入OFA/iLRP阳性的AML细胞 |
| 3.3 Apt-Dox能够选择性杀伤OFA/iLRP阳性的AML细胞 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 1. 讨论 |
| 2. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词汇表 |
| 附录二 个人简历 |
| 附录三 非论文综述 针对LRP/LR的肿瘤治疗策略研研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）功能化DNA纳米探针用于外泌体检测及其监测中药活性成分调控肿瘤来源外泌体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 基于核酸适体纳米探针的ExoAPP技术用于外泌体定量和表型分析 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 实验所用仪器和设备 |
| 1.2 实验所用材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养以及外泌体的分离提取 |
| 2.2 外泌体的表征 |
| 2.3 外泌体和适体识别结合的表征 |
| 2.4 功能化的氧化石墨烯纳米适体探针的制备 |
| 2.5 外泌体的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.2 外泌体的表征 |
| 3.3 ExoAPP检测外泌体表面蛋白的可行性 |
| 3.4 外泌体表面蛋白谱分析 |
| 3.5 上皮-间充质转变的监测 |
| 3.6 外泌体的定量检测 |
| 4 结论 |
| 第二章 基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术用于外泌体表面标志物的双色分析和抗PD-1免疫治疗监测 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 实验所用仪器设备 |
| 1.2 实验所用材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养以及外泌体的分离提取 |
| 2.2 外泌体的表征 |
| 2.3 外泌体和适体识别结合的表征 |
| 2.4 DNA纳米分子机器的构建 |
| 2.5 DNA分子机器的运转可行性实验 |
| 2.6 外泌体激活的DNA纳米分子机器(ExoADM)对外泌体表面分子的检测 |
| 2.7 血浆总PD-L1的ELISA检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 实验原理 |
| 3.2 外泌体的表征结果 |
| 3.3 DNA纳米分子机器检测外泌体的可行性 |
| 3.4 DNA纳米分子机器的优化 |
| 3.5 ExoADM定量检测外泌体 |
| 3.6 双色ExoADM检测用于外泌体表型分析 |
| 3.7 ExoADM用于实际样本分析和抗PD-1 免疫治疗指导 |
| 4 结论 |
| 第三章 基于DNA纳米分子机器的ExoADM技术监测中药活性成分调控肿瘤细胞外泌体释放及外泌体PD-L1 的研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 实验所用仪器设备 |
| 1.2 实验所用材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养和外泌体提取 |
| 2.2 外泌体表征 |
| 2.3 CCK-8 法测定药物对细胞增殖的影响 |
| 2.4 细胞凋亡检测 |
| 2.5 双色ExoADM对外泌体CD63 和外泌体PD-L1 的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 四种中药活性成分对A549 细胞增殖的影响 |
| 3.2 四种中药活性成分对A549 细胞凋亡的影响 |
| 3.3 外泌体表征 |
| 3.4 中药活性成分对A549 外泌体释放的影响 |
| 3.5 Exo ADM 监测中药活性成分对 A549 外泌体 CD63 和 PD-L1 的调控 |
| 4 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1 文献综述:中药对于肿瘤来源外泌体的调控作用研究 |
| 1 中药的起源和历史 |
| 2 肿瘤与外泌体 |
| 3 中药活性成分调控外泌体抗肿瘤 |
| 3.1 中药对肿瘤的作用和调控 |
| 3.2 抗肿瘤中药活性成分对外泌体的调控作用 |
| 4 外泌体检测对于中药抗肿瘤研究的意义 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录2 博士研究生期间获得的科研成果 |
| 致谢 |
四、组织多肽特异抗原测定在乳腺癌治疗中的应用（论文参考文献）
- [1]基于主客体自组装的MUC1金纳米肿瘤疫苗的制备及活性评价[D]. 解云天. 江南大学, 2021(01)
- [2]多肽药物筛选及基于肿瘤细胞膜的多肽运载体系的构建与应用[D]. 孟祥州. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [3]组织多肽特异性抗原在胃腺癌中的表达及意义[D]. 于迎春. 青岛大学, 2020(01)
- [4]乳腺癌患者分子标志物CD44的高效检测及靶向纳米复合材料的构建研究[D]. 周洁. 南京医科大学, 2020
- [5]水滑石纳米佐剂在肿瘤免疫治疗中的应用研究[D]. 张凌宵. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2020(01)
- [6]基于穿膜肽和细菌外膜囊泡的新型肿瘤疫苗的设计构建及其在肿瘤治疗中的探索[D]. 庄齐. 苏州大学, 2020(02)
- [7]乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选及鉴定[D]. 刘婷婷. 山东大学, 2020(08)
- [8]基于模拟表位肽聚合物的曲妥珠单抗纯化检测新技术研究[D]. 刘潇. 暨南大学, 2020(03)
- [9]新型OFA/iLRP核酸适配体的筛选及AML靶向治疗系统的构建[D]. 安雅聪. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]功能化DNA纳米探针用于外泌体检测及其监测中药活性成分调控肿瘤来源外泌体[D]. 金丹. 湖北中医药大学, 2020(08)