一、大肠癌hTERT和p16表达与端粒酶活性的关系（论文文献综述）
樊祥奎[1]（2014）在《端粒酶催化亚基和PinX1基因在食管癌治疗中的生物学意义》文中提出研究背景：食管癌是一种常见的恶性肿瘤,中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。食管癌的发生发展涉及多因素、多基因、多阶段,确诊时多为中晚期,预后极差,5年生存率仅为5%-20%。因此,探索食管癌的发病机制及安全有效的治疗方法成为食管癌治疗的关键。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进过程中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖及肿瘤的发生。端粒（telomere）作为分子钟控制着人类细胞的生长与衰老,与细胞寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA的长度会缩短55～200bp,经历多次分裂缩短至下限时,细胞最终凋亡。端粒酶（telomerase）是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。大量研究发现,在恶性肿瘤的发展中存在有端粒DNA长度的缩短,端粒酶的激活维持了癌细胞的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA的消耗,说明端粒酶在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有研究表明,人体除外少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞,大多数细胞的端粒酶都是无活性的,与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化在恶性肿瘤发生发展中起到了至关重要的作用,并且可以作为具有普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,则有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。端粒酶是由端粒酶RNA （hTR）,端粒酶催化亚基（hTERT）和端粒酶相关蛋白I （TEPI）三个亚单位组成。我们曾将互补于hTR模板区的反义寡核苷酸（ASODN）作用食管癌细胞（ECA109）,结果显示可抑制端粒酶活性,阻止细胞生长,但由于hTR广泛表达于正常组织细胞,针对hTR的反义治疗对正常组织细胞可能带来一定危害。新近的研究表明,hTERT是端粒酶的催化亚单位,在组织细胞中的表达量与端粒酶活性相平行,是影响端粒酶活性的最重要部分,也是端粒酶活性的限速因子,针对hTERT的反义治疗比对hTR治疗可能更有效,靶向hTERT基因治疗显然更为理想。其中重要的方法有反义核酸技术封闭、锤头状核酶切割和抑制hTERT的转录等。我们针对hTERT基因合成一段长19个碱基的反义寡核苷酸,硫化磷酸修饰（PS-ASODN）,脂质体包裹,转染食管癌细胞,研究其对食管癌端粒酶活性及癌细胞生长的影响。PinX1基因作为端粒酶的内源性基因,近几年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达水平明显下降,端粒酶活性增强。但到目前为止,PinX1基因在食管癌中的生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤有效手段,那么通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验研究采用RT-PCR,TRAP眼染法、MTT及流式细胞仪研究转染PinX1基因前后癌细胞增殖凋亡情况和端粒酶的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。以此证明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,可能通过靶向抑制端粒酶活性来影响肿瘤的发生发展,为食管癌的靶向基因治疗开辟新领域。目的：我们采用针对hTERT基因的全硫代修饰型反义寡核苷酸（PS-ASODN）转染于Eca-109人食管癌细胞,研究其对食管癌端粒酶活性及癌细胞生长的影响,探讨其对食管癌细胞的抑制作用及机理,寻找食管癌基因治疗的新方法。本实验成功构建PinX1基因表达载体pEGFP-C3-PinX1,将其转染有高转移潜能的Eca-109人食管癌细胞,观察转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响,同时应用TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,研究PinX1基因与端粒酶的关系,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。为食管癌的基因治疗提供理论依据。方法：1.端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用；采用MTT比色法测定PS-ASODN对Eca-109细胞的生长抑制率；采用倒置显微镜观察5μmol/L的PS-ASODN作用于Eca-109癌细胞10d后的细胞形态学改变；端粒酶活性检测采用半定量TRAP-银染法2基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响；利用分子生物学技术构建针对PinX1基因的表达载体pCDNA3.1-PinX1,采用脂质体LipofectamineTM2000包装形成的脂质体-RNA复合物,转染食管癌细胞Eca109,建立稳定表达PinX1的Eca109细胞模型,应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTT方法检测转染前后细胞增殖、FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR方法检测检测PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-银染法检测转染前后各组细胞端粒酶活性,阐明PinX1基因与端粒酶活化关系。结果：1.端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用；PS-ASODN对Eca-109细胞的生长抑制作用具有剂量及时间依赖性和序列特异性。PS-ASDON作用后,Eca-109细胞的生长速度缓慢,细胞间连接疏松,细胞变圆漂起,细胞体积缩小。随时间延长,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增强,呈时间-依赖性；随药物浓度增加,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增,呈浓度-依赖性。2基因转染PinXl对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响；应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1-PinX1重组质粒成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞, MTT法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢（P<0.05）；而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异（P>0.05）。表明pCDNA3.1-Pinx1对Eca109细胞增殖呈显着的抑制作用,以细胞在不同时间点（oh!24h!48h!72h）的OD490值绘制细胞生长曲线,并计算出的生长抑制率,说明转染PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、TRAP-银染法和FCM检测结果显示,Eca109/PinX1细胞中PinXl mRNA和蛋白表达水平较pCDNA3.1组、空白细胞组显着升高（P<0.05）。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低（P<0.05）。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数（PI）表达呈正相关性（rs=0.451,P=0.000）。结论：针对hTERT的反义寡核苷酸能诱导食管癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒酶合成端粒,从而抑制食管癌细胞的生长,说明端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能有效地抑制肿瘤细胞的生长,为抗端粒酶的肿瘤基因治疗提供了实验基础。Eca109细胞转染PinX1基因后,外源PinX1基因可显着下调食管癌细胞中端粒酶活性及其hTERTmRNA表达,抑制肿瘤细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡。表明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
曹云飞[2]（2012）在《Bmi-1与P16在乳腺癌中的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的:检测B细胞特异性莫洛尼白血病毒插入位1基因（Bmi-1）（B-cell-specificMoloney murine leukemia virus integration site1）与P16基因在乳腺癌和癌旁乳腺组织中的表达水平，分析其与临床病理因素的关系，并探讨它们在乳腺癌发生、发展、转移中的作用。方法：应用免疫组织化学Elivision法,检测120例乳腺癌及其癌旁组织中Bmi-1与P16蛋白表达水平，并分析它们的表达与临床病理指标之间的关系。结果：1、（1）Bmi-1蛋白在120例乳腺癌及其相应的癌旁组织中的表达阳性率分别是80.83%（97/120），21.67%（26/120）,Bmi-1蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率显着高于癌旁乳腺组织（p<0.05）。（2）在有淋巴结转移的癌组织中Bmi-1阳性表达率为92.30%（60/65），无淋巴结转移的癌组织中阳性表达率为67.27%（37/55）,两者之间的差异有显着性（p <0.05）。（3）Bmi-1蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级、临床分期、cerbB-2和雌、孕激素受体表达均无相关性（p>0.05）.2（1）p16蛋白在120例乳腺癌及其相应的癌旁组织中的表达阳性率分别是33.33%（40/120）,87.5%（105/120），p16蛋白在癌旁乳腺组织中的阳性表达率显着高于乳腺癌组织（p <0.05）。（2）在有淋巴结转移的癌组织中p16阳性表达率为15.38%（10/65），无淋巴结转移的癌组织中阳性表达率为54.60%（30/55）,两者之间的差异有显着性（p <0.05）。（3）p16蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级、临床分期、cerbB-2和雌、孕激素受体表达均无相关性（p>0.05）.3、97例Bmi-1蛋白阳性表达者中p16蛋白阳性表达者25例，72例阴性表达,。23例Bmi-1蛋白阴性表达者中有15例p16蛋白阳性表达；8例p16蛋白阴性表达。其中Bmi-1和p16蛋白同表达（+）共25例，同表达（—）者共8例，表达完全一致的符合率27.5%（33/120）,经统计学分析，结合实验数据表明，在本实验中Bmi-1和p16在乳腺癌中的表达呈明显负相关关系。（rs=-0.329, p <0.05）.结论：1Bmi-1在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，p16在乳腺癌旁组织的表达高于癌组织，二者在乳腺癌中表达呈负相关性。2Bmi-1在有淋巴结转移的癌组织中的表达高于无淋巴结转移的表达，而p16在无淋巴结转移的癌组织中的表达高于有淋巴结转移的表达，Bmi-1和p16表达可能与乳腺癌淋巴结转移相关。3联合检测二者可能对预测乳腺癌的预后和指导治疗有一定意义。
曹先乾[3]（2012）在《塞来昔布及丁酸盐对大肠腺瘤和大肠癌细胞作用的实验研究》文中研究指明目的：观察非甾体抗炎药（NSAIDs）塞来昔布及丁酸钠对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞株抗增殖作用的影响，并探讨其可能的作用机制。。方法：不同浓度的塞来昔布（100,200,400umol/L）、丁酸钠（0.5,1.0,2.0mmol/L）及联合用药（塞来昔布100umol/L+丁酸钠0.5mmol/L）处理对数生长期的大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞株，培养不同时间（24,48,72h）后收集细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增值的变化，流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期分布的变化，PCR-ELSA检测端粒酶活性，RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶hTERTmRNA和COX-2mRNA水平表达的变化。结果：1.塞来昔布及丁酸钠在一定时间范围（24,48,72h）内呈剂量、时间依赖性地抑制大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞的增殖，各浓度组与对照组比较有显着性差异，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞增殖的抑制效应明显高于单一用药，与单一用药组比较具有统计学意义，（P<0.05）。2.不同浓度的塞来昔布与丁酸钠处理大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞，48h后收集细胞，流式细胞仪检测结果提示随着药物浓度的升高，大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞G1期百分率明显升高，各药物浓度组与对照组比较，差异具有统计学意义，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药组G1期比例明显高于单一用药组，与单一用药组比较具有统计学意义，（P<0.05）。3.不同浓度的塞来昔布与丁酸钠处理大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞，48h后收集细胞，流式细胞仪检测结果发现随着药物浓度越高，大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞凋亡率越高，各药物浓度组与对照组比较有显着性差异，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药组细胞凋亡率明显高于单一用药组，与单一用药组比较具有统计学意义（P<0.05）。4.不同浓度的塞来昔布与丁酸钠处理大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞，48h后收集细胞，PCR-ELSA检测结果提示伴随着药物浓度的升高，大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞内的端粒酶活性逐渐降低，不同药物浓度组与对照组比较有显着性差异，（P<0.05），而RT-PCR检测结果提示端粒酶逆转录酶hTERT与COX-2mRNA表达也逐渐降低，各药物浓度组与对照组比较，差异具有统计学意义，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药组端粒酶活性、hTERT及COX-2mRNA表达均明显低于单一用药组，与单一用药组比较均具有统计学意义，（P<0.05）。结论：1.塞来昔布与丁酸钠对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞有明显的增殖抑制作用，并呈现剂量与时间依赖性。塞来昔布与丁酸钠联合应用具有协同抑制效应。细胞周期阻滞可能是塞来昔布与丁酸钠抑制大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞增殖的机制。2.塞来昔布与丁酸钠对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞的增殖抑制作用可能与通过抑制COX-2、端粒酶逆转录酶hTERT的表达，降低端粒酶活性，减少前列环素的合成及诱导细胞凋亡有关。
蔡艳玲[4]（2011）在《RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究》文中研究指明目的构建含有小发夹RNA （shRNA）的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的表达对大肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法设计合成3条针对hTERT基因的siRNA,将筛选出最有效的siRNA合成shRNA寡核苷酸片段插入到真核质粒pGPU6/GFP/Neo中,进行酶切和测序鉴定。将构建好的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,采用脂质体法转染人大肠癌SW480细胞。在荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞形态学变化。RT-PCR法检测不同转染时间SW480细胞中hTERTmRNA的表达水平。TRAP-PCR-ELISA法检测转染48小时后SW480细胞的端粒酶活性。免疫组化法检测SW480细胞中hTERT蛋白的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期分布。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况。激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体跨膜电位（MMP）的变化。透射电镜观察转染后细胞超微结构。结果将筛选出干扰效率较好的的siRNA序列合成shRNA片段后,将其成功插入质粒pGPU6/GFP/Neo中,构成重组真核质粒pGPU6/GFP/ Neo-hTERT-shRNA。SW480细胞以质粒与脂质体比例为1：2.5、转染48h时的转染效率较高,其转染率达59%。RT-PCR结果显示,hTERT-shRNA组的hTERTmRNA表达水平在转染48h时降低较明显,与空白组、脂质体组、NC-shRNA组比较,抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。TRAP-PCR-ELISA结果示,hTERT-shRNA组SW480细胞端粒酶活性显着降低18.7%,与其它三组比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果示,hTERT-shRNA组被染色的阳性细胞明显少于其他组,经病理图像分析软件分析灰度值后得出,转染48h后hTERT-shRNA组与空白组比较,差异有明显统计学意义（P<0.05）,同时与脂质体组和NC-shRNA组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。流式细胞仪结果示,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加,S期细胞减少,提示hTERT-shRNA质粒转染SW480细胞后,使进入静止状态的细胞增多,细胞增殖指数下降约14.2%,与NC-shRNA组比较,差别有显着统计学意义（P<0.05）。TUNEL结果示,与其他组比较,hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着增多,凋亡指数为21.5%,明显比其他组增高,差异有统计学意义（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果,hTERT-shRNA组可见多个含有核分裂相的细胞,细胞Rh123荧光强度明显增强,MMP显着下降,与其他组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。透射电镜观察结果示,SW480细胞体积明显缩小,表面突起及微绒毛减少,甚至消失,细胞核固缩,染色质不均匀地沿核膜下聚集,空泡增多。结论成功构建了针对hTERT基因的重组真核表达质粒pGPU6/GF P/Neo-hTERT-shRNA。它能有效沉默hTERT基因,因而能有效抑制人大肠癌SW480细胞增殖生长,降低端粒酶活性,最终促使肿瘤细胞凋亡。目的研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。方法于裸鼠右侧腋下皮下注射人大肠癌SW480细胞建立大肠癌移植瘤动物模型,待肿瘤长到一定大小时,随机分为生理盐水组（NS组）、NC-shRNA组和hTERT-shRNA组。各组连续进行相应治疗6次后,观察肿瘤的生长状况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,HE染色观察肿瘤组织细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况,RT-PCR法检测瘤组织中hTERTmRNA的表达,PCR-TRAP-ELISA法检测肿瘤组织的端粒酶活性。结果所有裸鼠在接种SW480细胞第14天后,皮下肿瘤结节直径达5-7mm,成功构建了裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。荷瘤裸鼠开始治疗后,hTERT-shRNA组瘤体积增长速度慢于NS组和NC-ShRNA组,并于第18天开始明显减慢。HE染结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织出现局部坏死区,瘤组织细胞形态发生明显改变。免疫组化法检测结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT蛋白表达水平下降,可见少量hTERT蛋白阳性细胞,细胞呈浅棕色。TUNEL法检测结果示,hTERT-shRNA组凋亡细胞数明显增多,细胞分布密集,与NS组和NC-shRNA组比较,凋亡指数分别增加29.4%和31.1%,差异有显着统计学意义（P<0.01）；RT-PCR法检测结果示,hTERT-shRNA组hTERT mRNA表达水平较NS组和NC-shRNA组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。PCR-TRAP-ELISA法检测结果示,hTERT-shRNA组与NS组和NC-shRNA组比较,端粒酶活性降低较明显,抑制率分别为48.5%和53.0%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,从而抑制大肠癌移植瘤的生长。
葛林虎[5]（2011）在《siRNA靶向沉默hTERT对肺癌细胞增殖的抑制作用》文中研究说明目的（1）检测不同病理类型肺癌细胞株中hTERT mRNA表达情况,探讨hTERT mRNA随着原代细胞传代的变化并筛选出表达量较高的肺癌细胞系进行后期实验。（2）设计并化学合成3对靶向hTERT mRNA的siRNA序列并转染入95D细胞中,探讨hTERT mRNA-siRNA对hTERT基因的沉默和肺癌细胞的增值抑制作用,并筛选出具有高效干扰效果的siRNA序列。（3）将hTERT mRNA-siRNA重组入质粒介载体中,并稳定转染到肺癌H1299细胞,探讨在肺巨细胞癌95D细胞株中筛选出的siRNA序列在肺腺癌H1299细胞是否具有干扰效应,siRNA干扰作用是否在不同癌症的病理类型存在差异。方法（1）培养多种不同类型的肺癌细胞株及从肺癌病人组织中获取的原代细胞株,用TRIZOL法提取细胞总RNA。然后运用Real Time RT-PCR法检测各细胞株中hTERT mRNA的表达,并对荧光定量PCR后的扩增产物做琼脂糖凝胶电泳。（2）设计3对hTERT mRNA-siRNA分别转染95D细胞,分别运用Real Time RT-PCR技术、western blot技术、MTT、流式细胞仪等方法比较转染前后及转染不同siRNA序列细胞中hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞周期间差异。筛选出高效的siRNA序列。（3）构建siRNA表达载体,通过脂质体的方法将重组siRNA表达载体及空白载体转染到肺癌H1299细胞,G418筛选、单克隆之后获得稳定转染细胞。分别运用Real Time RT-PCR技术、western blot技术、MTT、流式细胞仪等方法比较重组siRNA表达载体及空白载体组细胞中hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞周期间差异。进一步验证筛选出的siRNA的高效性。结果（1）在肺癌细胞中,hTERT mRNA均有表达,其中肺巨细胞癌细胞95D表达最高；而对于肺癌原代细胞,随着传代次数的增加,hTERT mRNA表达逐渐下降。（2）hTERT siRNA转染95D细胞48小时后（转染浓度为100nmol/L）,与空白脂质体对照组和阴性对照组比较,siRNA-1和siRNA-2均明显抑制了hTERT mRNA表达（P值均小于0.01）,抑制率分别为77.33±5.13%和50.67±8.02%,siRNA-3抑制率较低,仅为27.67±10.26%。（3）选取抑制效果最显着的hTERT siRNA-1对95D肺癌细胞进行由低到高3个浓度的转染,转染浓度分别为50nmol/L,80nmol/L,100nmol/L。50nmol/L浓度转染组与阴性对照组之间hTERT mRNA表达量差异无统计学意义（P>0.05）。80nmol/L组、100nmol/L浓度转染组分别与阴性对照组比较,hTERT mRNA表达量差异均有统计学意义（P值均小于0.01）,而这两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（4）转染48h后,与空白脂质体对照组比较,50nmol/L、80mol/L、100nmol/L浓度的hTERT siRNA-1转染组细胞凋亡率均显着增加（P值均小于0.01）。与阴性对照组比较,50nmol/L浓度转染组的细胞凋亡率无显着增加（P>0.05）,而80nmol/L、100nmol/L组细胞凋亡率显着增加（P值均小于0.01）。空白脂质体对照组与阴性对照组比较亦有显着差异（P<0.05）。（5）MTT检测结果显示,转染12小时后肺癌细胞增殖抑制作用开始显现,但效果尚弱,24小时已较明显,48小时最显着,72小时抑制效果转弱。hTERT siRNA可以有效抑制肺癌细胞增殖,抑制效应具有时间依赖性。（6） pGenesil.1-hTERT转染H1299细胞经单克隆后获得稳定转染细胞株H1299-pGenesil.1-hTERT和H1299-pGenesil.1。与稳定转染空白质粒细胞组相比,稳定转染siRNA质粒细胞的hTERT mRNA表达量显着下降,抑制率为93.97±0.83%,P<0.01。（7）肺癌H1299-pGenesil.1-hTERT细胞较H1299-pGenesil.1细胞hTERT蛋白的表达受到明显抑制。（8）肺癌H1299-pGenesil.1-hTERT细胞较H1299--pGenesil.1细胞增殖能力降低。（9）H1299-pGenesil.1-hTERT细胞与对照组H1299-pGenesil.1比较,G1期细胞增多,比对照组增加了18.3%（P<0.05）,S、G2期细胞分别少了10.4%、7.9%（P<0.05）。结论（1）hTERT基因在不同类型肺癌细胞均有表达；随着原代肺癌细胞的传代培养传代增加,hTERT表达量逐渐下降。（2）人肺癌细胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA均高表达,其中肺巨细胞癌细胞95D相对表达量最高。（3）有效设计并合成了特异性针对hTERT的siRNA,可以有效下调肺巨细胞癌细胞95D的端粒酶hTERT mRNA表达,从而抑制端粒酶活性、诱导肺癌细胞凋亡,抑制肺癌细胞增殖。（3）成功构建的hTERT mRNA-siRNA表达质粒转染进肺癌H1299细胞后,可以有效下调细胞中hTERT mRNA、蛋白表达,抑制端粒酶活性和肺癌细胞的增殖,改变细胞周期。
范福玲[6]（2010）在《Bmi-1和端粒酶在食管鳞癌中表达与细胞凋亡的关系》文中研究表明背景与目的：肿瘤的致病因素众多,但追根溯源是基因及细胞相关代谢酶发生了改变。食管癌是肿瘤的一种类型,也是经过多阶段的演进过程,多基因改变和参与,以及相关代谢酶的基因改变和（或）DNA错配修复酶的异常改变。原癌基因Bmi-1（Blymphoma Mo MLV insertion region, Bmi-1）是多梳基因（Polycomb group genes）家族中重要的调节基因,多梳基因由多种转录抑制子组成,转录抑制子与细胞周期和增殖有关,因此,PcG是一类重要的与发育相关的基因。原癌基因Bmi-1又是PcG基因家族的核心成员之一,其最初发现与另一种癌基因c-myc协同作用促使细胞转化和肿瘤的形成。近年来研究发现Bmi-1作为一种广泛表达核蛋白跟肿瘤发生、发展、侵袭、预后等病理指标相关性很高。端粒是染色体末端的一种特殊结构,它是由许多简单短重复序列和端粒结合蛋白（telomere end-binding protein,TEBP）组成。在正常人体细胞中,可随着细胞分裂而逐渐缩短。端粒是细胞必需的遗传组分,因为它能够保护和补偿染色体末端遗传信息的丢失,保护它不会被核酸酶识别而免遭降解。端粒的存在是为了维持染色体的稳定。没有端粒,末端将暴露,易被外切酶水解。端粒不是用DNA聚合酶来合成的,是用端粒酶来合成的。端粒酶是合成端粒DNA的特殊逆转录酶,具有RNA依赖性和DNA多聚酶性质的核糖体蛋白复合体,能以自身RNA为模板,不断合成端粒酶DNA序列,保持染色体端粒的完整性。正常体细胞每分裂一次,端粒的长度就会缩短,最终缩短到一定的长度后细胞衰老。当端粒酶存在且被激活的状态下,端粒酶作用于端粒,使端粒的长度不在缩短,因而细胞发生永生化。尤其是在恶性、晚期肿瘤中,端粒酶活性增强,使大量的癌细胞无休止的增殖,导致细胞的恶化转移。目前大量研究发现,端粒酶的激活是促进肿瘤发生、增殖及转移的一个重要因素,端粒酶的表达水平跟恶性肿瘤发生、发展、浸润、转移及预后密切相关。在大多恶性性肿瘤中,Bmi-1在肿瘤的发生发展中起到了显着的作用,过度表达Bmi-1可以激活端粒逆转录酶的转录,从而提高了端粒酶的活性,而端粒酶是目前研究已趋成熟的一个酶,越来越多的研究证实端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制,而在肿瘤中重新被激活,激活的端粒酶可能参与恶性转化。目前研究表明,激活的端粒酶与多种肿瘤的发生发展关系密切。因此Bmi-1和端粒酶在肿瘤的发生发展过程中有可能是协同效应。食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的2%。我国是食道癌高发区,北方较南方多见,其中河南省发病率最高,其中以食管鳞状细胞癌（鳞癌）最多见,发病年龄大多在40岁以上,但近年来40岁以下发病者有增长趋势,发病年龄有年轻化的趋势,因此成了近年来我们研究的热点。关于Bmi-1和端粒酶各自在肿瘤细胞中的表达情况以及它们与细胞凋亡的关系,国内外已有报道,但未见在食管癌组织中同时检测Bmi-1和端粒酶的表达以及与肿瘤细胞凋亡的关系报道,值得进一步研究探讨。本研究应用了免疫组织化学SP法检测了Bmi-1和端粒酶在正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型增生组织及食管鳞癌组织中的表达情况；用TUNEL方法分析了食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡情况,以研究Bmi-1和端粒酶与食管鳞癌发生、发展、浸润、转移及预后的关系,同时探讨Bmi-1、端粒酶与食管癌细胞凋亡的关系。以期寻找食管癌早期诊断和判断预后的分子指标。方法：1.采用免疫组化SP法分别对65例食管鳞癌组织、38例癌旁非典型增生组织及25例正常粘膜上皮组织中Bmi-1、端粒酶的表达进行检测；用TUNEL方法检测了在食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡情况。2.统计学处理：采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理,Bmi-1和端粒酶的表达强度的比较采用χ2检验,两变量之间的关系分析采用spearman等级相关分析表示,检验标准以a=0.05为显着性检验水准。凋亡指数（apoptosis index, AI）的比较采用方差分析及t检验,a=0.05有显着性意义。结果：1.在正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型增生组织和食管鳞癌组织中,Bmi-1阳性表达率依次升高,分别为20.00%（5/25）、47.74%（17/38）和64.62%（42/65）,三者两两相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。在癌组织中,Bmi-1阳性表达率与年龄、性别、肿瘤的直径、浸润深度、分化程度无关,而与有无淋巴结转移以及TNM分期有关。无淋巴结转移组Bmi-1阳性表达率低于有淋巴结转移者（χ2=6.460,P=0.011）；Ⅰ-ⅡA组Bmi-1阳性表达率低于ⅡB-Ⅲ组（χ2=9.432,P=0.002）。2.在正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型增生组织和食管鳞癌组织中,端粒酶蛋白阳性表达率依次升高,为12.00% （3/25）、52.63%（20/38）和92.31%（60/65）,三者两两相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。在癌组织中,端粒酶阳性表达率与年龄、性别、肿瘤的直径、浸润深度、分化程度无关,而与有无淋巴结转移、以及TNM分期有关。无淋巴结转移者端粒酶阳性表达率低于有淋巴结转移者（χ2=8.125,P=0.004）；Ⅰ-ⅡA组Bmi-1阳性表达率低于ⅡB-Ⅲ组（χ2=8.125,P=0.004）。3.食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡与Bmi-1表达有关。Bmi-1阳性表达组中肿瘤细胞AI为（5.35±2.33）%,低于阴性表达组（13.41±5.62）%,差异有统计学意义（P<0.01）。4.食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡与端粒酶表达有关。端粒酶阳性表达组中肿瘤细胞AI为（6.35±2.33）%,低于阴性表达组（15.52±5.94）%,差异有统计学意义（P<0.01）。5.Bmi-1、端粒酶在食管鳞癌组织中的表达相关性经统计学分析显示两者呈正相关（P<0.05）。结论：1.Bmi-1、端粒酶的异常表达与食管鳞癌的发生发展关系密切,且两者可能在食管鳞癌的发生、发展中起协同作用。2.Bmi-1、端粒酶在食管鳞癌组织中的异常表达与淋巴结转移和TNM分期有关；提示Bmi-1、端粒酶的异常表达可能参与浸润、转移的过程。
葛莲英[7]（2010）在《端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究》文中提出在我国,消化道恶性肿瘤中大肠癌发病占有很高的比率。目前以手术治疗为主的综合治疗仍存在局限性,疗效不尽人意。因此,能否找到一个有效的分子治疗靶点,是丰富大肠癌治疗方法和最终应用于临床提高综合疗效的关键。有研究表明,大肠癌标本中端粒酶活性表达高达85%以上,而正常组织表达仅5%左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA （hTR）、端粒酶相关蛋白（TPI）和端粒酶催化亚基（hTERT）三部分组成。hTR和TPI在正常组织和肿瘤组织均有表达,与端粒酶活性无相关性。而hTERT与端粒酶的活性相一致,hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,与肿瘤的关系尤为密切,因此将端粒酶作为肿瘤分子靶点的研究是极有意义的研究领域。本研究从本院临床收集30例大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织,通过对端粒酶活性的检测,探讨端粒酶与大肠癌的相关性,并进一步验证端粒酶催化亚基（hTERT）的表达是否与端粒酶活性一致。同时回顾性分析本院178例大肠癌患者病理标本中hTERT表达水平和临床病理学参数之间的相关性；通过临床随访资料分析,阐明影响大肠癌患者生存预后的风险因素,明确hTERT能否作为判断大肠癌预后的标志物及作为大肠癌治疗的分子靶点。通过RNAi沉默技术,观察hTERT沉默对大肠癌细胞生长增殖和凋亡的影响,最终阐明hTERT基因RNAi沉默技术对大肠癌靶向治疗的可行性。本研究将从细胞、分子和整体水平上,为开展大肠癌hTERT基因靶向治疗提供实验和临床依据。第一部分端粒酶与大肠癌相关性研究第一章端粒酶活性与大肠癌相关性研究目的探讨端粒酶与大肠癌相关性,进一步验证端粒酶催化亚基（hTERT）的表达是否与端粒酶活性一致。方法运用PCR-TRAP-ELISA及免疫组织化学方法对大肠癌组织及其癌旁组织、大肠正常组织各30例检测端粒酶活性、hTERT的表达水平,并研究端粒酶与临床病理学特征之间的关系。结果（1）端粒酶阳性检出率在大肠癌组织、癌旁组织、大肠正常组织分别为83.33%13.33%3.33%,癌组织中检出率明显高于其他组织（P<0.05）。（2）大肠癌组织端粒酶活性随组织分化程度变低而升高,低分化大肠癌组织中的端粒酶阳性表达率高于中分化及高分化大肠癌（P<0.05）。（3）通过用免疫组化检测hTERT的表达与PCR-TRAP-ELISA法检测得端粒酶活性相比较,显示端粒酶活性与hTERT表达具有一致性,两法检测无显着差异。结论（1）大肠癌组织端粒酶阳性率明显高于癌旁组织及正常大肠组织,大肠癌组织中hTERT表达高于癌旁组织及正常组织。（2） hTERT的表达与端粒酶活性一致。第二章端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析目的通过对178例大肠癌患者的临床资料回顾性分析,阐明hTERT表达水平与大肠癌临床病理特征及预后的关系,为大肠癌患者的预后评估提供一定的理论指导。方法选取有完整临床资料的178例大肠癌石蜡包埋组织标本及60例癌旁组织标本作为实验组,30例大肠正常组织石蜡包埋标本作为对照组。采用免疫组化的方法检测大肠癌组织中hTERT蛋白表达水平。查阅病例获得相关临床参数资料及随访资料,分析hTERT表达水平与大肠癌进展及临床预后的关系。结果（1） hTERT蛋白在大肠癌组、癌旁组与大肠正常组中阳性率分别为94.4%、6.67%、3.33%,其差异有统计学意义（P<0.001）;（2） hTERT在大肠癌组织中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤直径无关（P>0.05）,与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期、临床分期及远处转移有关（P<0.05）。（3）经多因素Cox模型分析,不同浸润深度、远处转移、淋巴结转移、hTERT表达4项指标是影响大肠癌患者术后预后的独立危险因子；hTERT表达水平与患者术后无瘤生存时间呈负相关。结论hTERT在大肠癌组织中呈高表达。经多因素Cox分析,大肠癌浸润深度、远处转移、淋巴转移、hTERT表达与大肠癌患者预后存在显着性相关,是影响预后的危险因子。大肠癌组织中hTERT高表达者预后相对较差,低表达者预后相对较好。第二部分RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究第一章hTERT基因shRNA真核表达载体的构建目的构建人端粒酶催化亚基（hTERT）基因shRNA真核表达载体质粒,为大肠癌RNAi介导的基因治疗打下基础。方法化学合成3条hTERT基因siRNA,通过脂质体转染大肠癌细胞SW480,48h后采用RT-PCR方法筛选出一条对hTERT mRNA有明显沉默作用的siRNA。将筛选出的siRNA设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链后,插入到pGPU6/GFP/Neo真核表达载体中,并进行酶切和测序鉴定。结果酶切和DNA测序证实构建的ShRNA已插入载体中。结论成功构建的hTERT基因shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA,为进一步开展hTERT基因在人大肠癌细胞中的作用机制及体内外RNAi实验研究奠定了基础。第二章RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响目的观察hTERT基因对SW480细胞生物学特性的影响。方法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA （hTERT-shRNA）用脂质体转染法导入SW480大肠癌细胞,含无效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA （NC-shRNA）作为阴性对照,单纯SW480细胞作为空白对照,等量转染试剂脂质体作为脂质体对照组,分别于转染后24h、48h、72h,在荧光显微镜下观察重组质粒转染效率和细胞形态学变化。采用MTT法检测各组细胞的生长增殖情况,RT-PCR法检测不同转染时间细胞hTERT mRNA的表达水平,免疫细胞化学法检测hTERT特异性蛋白表达；PCR-TRAP-ELISA法检测转染后48小时端粒酶活性；流式细胞仪检测转染后细胞周期分布,TUNEL法和透射电镜观察转染后细胞凋亡变化及线粒体膜电位（MMP）的改变检测。结果（1） hTERT-shRNA质粒转染24h、48h及72h比较,转染48h其转染效率明显高于24h和72h的转染效率,质粒与脂质体比例为1：2.5时,其转染效率显着高于其它各组,转染率达59%。（2）MTT检测结果显示：hTERT-shRNA质粒转染组对SW480细胞的生长增殖有明显抑制作用,于转染后第2d达到峰值,增殖率减少达28.22%,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（3）半定量RT-PCR结果显示,转染48小时的hTERT-shRNA组的hTERT mRNA表达量明显低于转染24h和72h组的表达量。转染48小时的hTERT-shRNA组和空白对照组、脂质体对照组、NC-shRNA组比较,其抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。（4）免疫细胞化学结果示：hTERT-shRNA组染色阳性细胞明显少于对照组。经病理图像分析软件进行灰度测量后比较发现,转染48h的hTERT-shRNA组较空白对照组灰度值下降约30.2%,同时和脂质体对照组和NC-shRNA组相比,差异均有明显统计学意义（P<0.01）。（5）PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性检测显示：较空白对照组相比,hTERT-shRNA转染组细胞端粒酶活性下降了18.7%,与较其它三组之间差别均有显着性意义（P<0.05）。（6）流式细胞术检测：与对照组比较,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加。与NC-shRNA组比较,hTERT-shRNA组增殖指数（PI）下降14.2%,差别有显着学意义（P<0.05）。（7） TUNEL法检测：hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着多于对照组,因而其凋亡指数较其它组也明显增高,hTERT-shRNA组较空白对照组AI增高20%。（8）转染48h后透射电镜观察：可见凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,染色质不均匀地地沿核膜下聚集。部分可见细胞核新月体,空泡形成增多。（9）与空白对照组相比,转染48h后线粒体跨膜电位（MMP）显示：hTERT-shRNA组线粒体Rhodamine123荧光强度明显增强（增加约24.2%）,MMP显着下降,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长和增殖,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡。第三章RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究目的探讨重组pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA质粒对SW480细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法（1）经皮下接种SW480细胞株（1×107个细胞/只）建立裸鼠人大肠癌细胞移植瘤模型。（2）24只裸鼠随机地分为3组,每组8只。以瘤内接种pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA简称hTERT-shRNA)质粒组为实验组,以瘤内注射pGPU6/GFP/Neo-NC shRNANC （简称NC-shRNA）作为阴性对照,以瘤内注射生理盐水作为空白对照组。（3）观察各组裸鼠皮下肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率。（4）治疗结束后取标本进行病理学检查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表达分析,端粒酶活性及组织凋亡检测。结果（1）所有裸鼠均于7天后可见皮下肿瘤形成。（2） hTERT-shRNA组裸鼠肿瘤生长较慢,生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组裸鼠肿瘤仍较快增大。（3）hTERT-shRNA组肿瘤组织切片HE染色,部分肿瘤可见大片坏死区,细胞结构消失。生理盐水组和NC-shRNA组肿瘤生长良好,细胞形态不规则,可见病理性核分裂相。（4）半定量RT-PCR检测hTERT mRNA水平,发现hTERT-shRNA组较生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。（5）免疫组化结果表明：hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT阳性细胞明显减少,蛋白表达下调。hTERT蛋白平均灰度较生理盐水组和NC-shRNA组分别降低19.9%和14%。（6）端粒酶活性检测表明,pGPU6/GFP/Neo-hTERT组较生理盐水组和NC-shRNA组端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。端粒酶活性抑制率分别为48.5%和53.0%。（7）TUNEL法检测发现,hTERT-shRNA组肿瘤细胞凋亡明显多于对照组,AI（凋亡指数）较生理盐水组和NC-shRNA组增加29.4%,31.1%,差异有统计学意义（P<0.01）。结论hTERT基因的shRNA瘤内注射能延缓大肠癌细胞SW480裸鼠皮下移植瘤的生长,其机理可能是通过抑制hTERT mRNA和蛋白的表达、抑制端粒酶的活性、促进肿瘤细胞凋亡而发挥作用。
陶双芬[8]（2010）在《去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞端粒酶的影响及机制研究》文中研究指明肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,易转移复发,严重危害我国人民的健康。肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗,化疗是综合治疗的重要手段之一,尤其对不能手术的中晚期患者,也是主要的辅助疗法。但肝癌对化疗不敏感,致使化疗疗效仍不理想。因此,探索新的肿瘤治疗靶点和有效的化疗药物对提高化疗疗效具有重要意义,而新的治疗药物的寻找很显然依赖于肝癌发生发展机制的阐明。近年的研究表明端粒酶的激活和异常的基因甲基化参与肝癌的发生发展,靶向端粒酶和基因甲基化的药物有望成为新的治疗药物。端粒酶是一种核糖蛋白复合物,负责合成端粒重复序列（TTAGGG）并添加到染色体末端,补偿了随细胞分裂而出现的端粒丢失,稳定了永生化细胞的端粒长度。它由人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）以及人端粒酶相关蛋白（hTEP1等）组成。端粒酶的活化是细胞永生化和肿瘤形成的重要一步,而其hTERT组分的表达是决定端粒酶活性的限速步骤。在本实验室前期肝癌端粒酶相关研究中,发现HCC的端粒酶阳性率为85%,明显高于癌旁组织、肝硬化组织及慢性肝炎组织,而正常肝脏组织不表达端粒酶活性,认为端粒酶的表达可能在HCC的发生发展中起到了关键的作用。DNA甲基化（methylation）是一种表观遗传修饰形式,也是基因表达调控的重要机制之一。它是指利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基,在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase,DNMT）催化下,将CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5’位置的氢用活性甲基所取代,从而转变成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的过程。发生在基因启动子或其附近区域的甲基化将通过直接的或结合特定甲基化CpG序列结合蛋白（methyl CpG binding protein,MBP）的间接方式阻碍转录因子与启动子的结合而阻止或降低基因的转录。正常的甲基化对于维持机体的功能是必需的,而异常的DNA甲基化则会引发疾病甚至肿瘤的发生。人类各种肿瘤都存在不同程度的抑癌基因的甲基化,我们的前期研究发现肝癌组织中,p21,p15,p16,E2F-1和Wilm’s tumor 1 tumor suppressor （WT1）等基因的甲基化水平明显高于癌旁及肝硬化组织,认为DNA甲基化亦在肝癌的发生发展中起重要作用。5-杂氮脱氧胞苷（decitabine,DAC）是一种具有多种生物学性质的核苷类似物,它最初合成作为一种抗代谢药物用于诱导急性髓性白血病。现普遍认为5-杂氮脱氧胞苷是一种DNA甲基转移酶抑制剂,通过去甲基化作用而激活肿瘤细胞中的一些抑癌基因,可能是其抗肿瘤机制之一。最近的研究表明5-杂氮脱氧胞苷能下调某些肿瘤细胞中端粒酶的活性和hTERT的表达,但其机制不明确。作为端粒酶活性调控的关键,hTERT表达的调控是多水平,多层次的,包括转录水平的调控及转录后的修饰等。基因序列分析显示hTERT的启动子区域不含有TATA和CAAT盒,但是富含GC二核苷酸,在转录起始位点附近形成一个大的CpG岛,这提示甲基化可能参与hTERT的表达调控；同时其启动子区包含很多不同转录因子结合位点,提示hTERT的表达受多水平的的调控,在不同的细胞背景中,可能受不同转录因子的调控。目前已发现多种正向和负向调控转录因子,其正向调控因子包括：c-myc,Sp1,人乳头瘤状病毒16 E6,类固醇激素；负向调控因子包括：Mad1,p53, pRB, E2F, WT1等。本实验室前期的研究也发现肝癌组织中端粒酶活性的上调与相关基因的甲基化相关。鉴于以上,5-杂氮脱氧胞苷作为一种去甲基化的药物,可能通过直接改变hTERT启动子区域的甲基化或间接改变其调控基因的表达而影响端粒酶的活性。我们在肝癌细胞系中进行了以下三个方面的研究：1) 5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞系中端粒酶活性的影响；2) 5-杂氮脱氧胞苷对端粒酶活性影响的机制研究；3) 5-杂氮脱氧胞苷和化疗药物顺铂联合处理对肝癌细胞生长和凋亡的影响。第一部分去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞端粒酶活性的影响首先应用不同剂量的5-杂氮脱氧胞苷处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,观察5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞存活的影响以及其细胞毒性和剂量、时间之间的关系；其次,根据以上实验结果选用合适的药物作用浓度（1μM,2μM和4μM）和作用时间（1d,3d和5d）,处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,分别用TRAP-ELISA、real time RT-PCR及’Western blot法检测在不同的药物作用浓度和作用时间下,肝癌细胞中端粒酶的活性和hTERT的表达变化。结果显示,两种肝癌细胞系中都有端粒酶的激活；5-杂氮脱氧胞苷能够下调肝癌细胞中端粒酶的活性和hTERT的表达,而且这种下调作用是具有剂量和时间依赖性的,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,端粒酶的活性和hTERT的表达抑制作用增强。第二部分去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷下调肝癌细胞端粒酶活性的机制研究由于hTERT的表达受多种转录因子和表观遗传甲基化修饰的调控,而5-杂氮脱氧胞苷是一种去甲基化的药物,本部分实验拟从端粒酶的调控因素和基因甲基化的角度出发,探讨5-杂氮脱氧胞苷下调肝癌细胞端粒酶活性的分子机制。目前的研究表明5-杂氮脱氧胞苷能通过去甲基化的机制激活某些基因的表达,又在肿瘤组织和细胞系中发现hTERT启动子区存在甲基化,并且甲基化程度与hTERT的表达成正比。所以5-杂氮脱氧胞苷可能通过直接影响hTERT启动子区的甲基化状态而影响hTERT的表达。鉴于HepG2是目前最为通用的肝癌细胞系,我们选择HepG2进行研究。我们用甲基化特异性PCR （MSP）法检测了hTERT启动子区的甲基化状态,并比较了不同作用浓度和作用时间的5-杂氮脱氧胞苷对hTERT启动子区的甲基化的影响。结果显示,在HepG2中hTERT启动子区并未检测到甲基化,5-杂氮脱氧胞苷对其甲基化状态并无影响。提示hTERT启动子区的甲基化状态可能不是hTERT表达的主要调控机制,而5-杂氮脱氧胞苷下调hTERT的表达可能不是通过直接影响其启动子区甲基化的水平。其次,据研究hTERT的表达调控主要是在转录水平,其启动子区包含很多不同转录因子的结合位点,这些转录因子包括正向调控的因子：c-myc,Spl,人乳头瘤状病毒16 E6,类固醇激素；和负向调控因子：Mad1, p53, p15, p16, p21, pRB, E2F和WT1。我们推测5-杂氮脱氧胞苷可能通过影响其调控因子的表达而间接下调hTERT的表达。结合我们前期在肝癌组织中发现的与端粒酶升高相关的甲基化基因,我们选择了以下基因进行研究：c-myc, p15, p16, p21, E2F和WT1。应用real time RT-PCR法分别检测有无5-杂氮脱氧胞苷作用时肝癌细胞系HepG2中c-myc, p15, p16, p21, E2F,和WT1的mRNA水平；观察比较5-杂氮脱氧胞苷对这些基因表达的影响。结果显示：c-myc, p15, p16,p21,E2F,和WT1在肝癌细胞系HepG2中有不同程度的表达,p16基因则低表达。5-杂氮脱氧胞苷使p16表达上调,同时下调了c-myc的表达。由于p16是hTERT的负向调控因子,而且5-杂氮脱氧胞苷主要的生物学功能是去甲基化作用,进一步研究p16基因的甲基化状态。结果发现肝癌细胞中p16基因存在甲基化,而5-杂氮脱氧胞苷逆转了其甲基化状态而上调了其表达。同时p16又是c-myc的负向调控因子,5-杂氮脱氧胞苷对c-myc的下调作用可能与p16上调有关。这些结果提示,肝癌细胞中hTERT的表达与c-myc, p16的调控相关,5-杂氮脱氧胞苷可能通过下调c-myc和激活p16的表达而下调hTERT的表达。第三部分5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞化疗敏感性的影响首先应用不同剂量的顺铂处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,观察顺铂对肝癌细胞存活的影响以及其细胞毒性和剂量、时间之间的关系；其次,根据以上实验结果选用合适的药物作用浓度和作用时间,5-杂氮脱氧胞苷和顺铂联合和单独处理肝癌细胞SMMC-7721和HepG2,观察比较两种情况下肝癌细胞生长情况的影响；并进一步通过DAPI染色、PI-AnnexinV染色流式细胞术检测观察5-杂氮脱氧胞对肝癌细胞凋亡的影响。结果显示联用5-杂氮脱氧胞苷和顺铂比单独使用顺铂对肝癌细胞生长的抑制作用更强,诱导肝癌细胞的凋亡率升高。提示5-杂氮脱氧胞苷增加了肝癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性。结合前部分的研究,其机制可能是5-杂氮脱氧胞苷下调端粒酶的表达。综上所述,我们的研究结果提示如下结论：1、去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷可以下调肝癌细胞系中端粒酶的活性和hTERT的表达。2、5-杂氮脱氧胞苷下调hTERT的表达主要通过去甲基化激活其负向调控因子p16的表达和下调c-myc的表达,而不是通过直接改变hTERT本身启动子区的甲基化状态。3、5-杂氮脱氧胞苷增加了肝癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性,有望与化疗药物联合应用于临床。
袁超君[9]（2008）在《RNA干扰（RNAi）技术抑制大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的实验研究》文中研究表明目的:通过RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶hTERT基因的特异性抑制作用,为RNA干扰技术对大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法:1.大肠癌细胞株HT-29的培养传代。2.化学合成靶向于hTERT基因的siRNA,用脂质体转染法将其导入大肠癌细胞内。3.实验分组如下:Control组（未转染的HT-29细胞）,Lipofectamine组（脂质体组）,加入阴性对照N-hTERT siRNA组（简称阴性组）,加入干扰hTERT的sihTERT组（RNA干扰组）。4.通过TRAP,RT-PCR和Western Blot方法分别检测大肠癌细胞转染前后细胞的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,流式细胞仪检测细胞生长增殖和凋亡情况。结果:1.荧光显微镜照片fluorescence显示大肠癌HT-29细胞的转染效率为60%。2. Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组的端粒酶活性分别为1.14±0.21,1.10±0.19,1.17±0.22,0.73±0.14,sihTERT组的端粒酶活性明显下降,与其他三组相比差异有非常显着性（p<0.01）。3. hTERT mRNA在Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组中的表达分别为0.87±0.15, 0.91±0.16, 0.85±0.14, 0.47±0.08,sihTERT组与其他三组相比,hTERT mRNA表达水平显着下降,差异有非常显着性（p<0.01）。4. hTERT蛋白在Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组中的表达分别为0.62±0.12, 0.67±0.13,0.59±0.12, 0.37±0.07,sihTERT组与其他三组相比,hTERT蛋白表达显着下降,差异有非常显着性（p<0.01）。5. Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组的细胞凋亡率分别为（7.5±0.21）%、（8.6±0.24）%、（8.3±0.15）%和（49.5±0.26）%,sihTERT组细胞凋亡率明显升高,与其他三组相比差异有非常显着性（p<0.01）。结论:RNA干扰技术能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡,为大肠癌的基因治疗研究提供理论依据。
常金荣[10]（2007）在《吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究》文中研究说明大肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。在我国，随着经济的发展，生活方式的改变，大肠癌的发病率也日趋增高，尽管采用了手术、化疗、放疗等多种治疗方法，但效果都不尽理想。现代研究者普遍认为：端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤。端粒酶已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点，因此目前有大量科学家致力于从端粒酶途径治疗大肠癌的研究。由于中药抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，同时其毒副作用低，不易产生耐药性，日益受到人们的重视。近几年中药抑制端粒酶活性成为肿瘤治疗的热点之一。随着现代生物化学和分子生物学技术的发展，表型遗传学异军突起，已成为许多学科的研究前沿，在肿瘤发生发展方面的研究也逐渐引起了人们的广泛关注。诸多研究表明在肿瘤发生的过程中，除了DNA序列改变外，表型遗传修饰在肿瘤形成过程中具有重要作用。主要包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化。其中DNA甲基化是目前研究的最多、也是最深入的一种表型遗传修饰表达机制。端粒和端粒酶与细胞增殖、分化、癌变及细胞凋亡有关，多种转录因子参与端粒酶逆转录酶（hTERT）的调节。近年来的研究发现DNA甲基化对端粒酶活性的调节具有重要的作用。本研究所对以吴茱萸、黄连、青黛为主药的加味左金丸及其主要成分吴茱萸碱、小檗碱、靛玉红防治胃肠癌的药理作用和临床研究已进行了多年，研究表明，加味左金丸能降低MNNG诱发大鼠胃及十二指肠癌的发生，减轻病理损伤；小檗碱可以明显抑制BGC823、MGC803等胃癌细胞的增殖，降低集落形成率、细胞分裂指数及软琼脂集落形成能力，促进细胞分化，降低肿瘤转移等，同时还可以抑制ras和c-erbB2基因的表达。临床方面，杨传标等观察了连黛胶囊（加味左金丸）治疗30例中晚期胃肠肿瘤患者的疗效及其与中医证型的关系，结果表明连黛胶囊治疗胃癌、大肠癌在改善临床症状和提高生存质量方面有显着疗效，其中对热毒（湿热）证的临床症状疗效最好。我们的课题正是在此基础上，从端粒酶活性及其逆转录酶的表型遗传修饰方面探讨加味左金丸对治疗大肠癌的分子药理机制。研究过程中发现，加味左金丸中的主要单体靛玉红的作用不太明显，故本研究在此基础上进一步研究吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌的抗癌作用机制。一．实验研究1．细胞培养条件的建立采用体外培养细胞的方法，研究了吴茱萸碱和小檗碱从端粒酶及其逆转录酶hTERT甲基化途径对HT29细胞的抗癌作用。选用的细胞为结肠腺上皮癌HT29细胞株，建立和稳定了整个研究工作中所需要的细胞培养条件。主要对细胞传代、细胞冻存和细胞复苏条件进行了优化，在此基础上，通过显微镜观察了细胞形态，采用了WST-8法测定了细胞生长曲线。结果显示，HT29细胞平铺于培养瓶底面积超过瓶底80％时，即可以比例1：2传代；按5×106细胞加入冻存液1ml这样的密度冻存；复苏时，液氮罐中取出的细胞，于38℃迅速在1～2min内解冻，细胞接种次日贴壁良好。生长曲线显示，细胞以1×105／ml接种后2～3日生长旺盛，此时，细胞处于倍增期前后，适合实验。2．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞的生长抑制和细胞凋亡的作用首先在体外培养人结肠癌细胞株HT29细胞，采用WST-8方法测定吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞生长抑制作用，并筛选了两种药物作用的最佳时间、有效浓度。结果显示：经过筛选后，作用时间取72h，吴茱萸碱取7.5，15，30μM3个浓度，盐酸小檗碱取52.5，105，210μM3个浓度用于后续实验；吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞具有显着生长抑制作用，具有剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系；相差显微镜动态观察药物作用后，细胞出现胞体缩小，变圆，胞浆混浊，增殖变慢等生长受到抑制的形态方面的变化。采用Annexin V-FITC／PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化，检测结果提示：吴茱萸碱和小檗碱能够诱导细胞凋亡，与空白对照组比较有显着差异性，随药物浓度的增加，凋亡率逐渐增加，表现为量效依赖性；荧光电镜下观察可见到细胞出现核固缩、核碎裂、染色体边集和凋亡小体等典型的细胞凋亡形态学特征。同时本研究还表明吴茱萸碱和小檗碱单独应用有抗大肠癌的作用，而二者合用对HT29细胞产生的抑制细胞增殖作用，与单药组吴茱萸碱的抑制率比较无显着差异性，说明吴茱萸碱和小檗碱对其生长抑制无明显的协同作用。3．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤，它已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点。许多研究表明，端粒酶在大肠癌中高表达，通过观察吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响，探讨其对人结肠癌细胞的作用机制。本实验采用了原位TRAP方法测定端粒酶活性，结果表明吴茱萸碱和小檗碱作用HT29细胞72h后，端粒酶活性明显降低，且随药物浓度逐渐增大，抑制端粒酶活性的作用逐渐增强，呈剂量依赖性；而二者协同用药作用时，和正常对照组比较，端粒酶活性无明显变化，表明吴茱萸碱和盐酸小檗碱联合用药与单独作用无明显变化，进一步证明二者无明显协同作用。4．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶逆转录酶hTERTmRNA表达的影响端粒酶的活化与肿瘤的发生发展和衰老机制密切相关，而hTERT作为端粒酶的逆转录组分，与端粒酶活性的表达具有密切相关性，能够反映出端粒酶的活性，且多种肿瘤调控因子均通过对hTERT的调节来影响端粒酶的活性，是更加理想的端粒酶抑制靶点。所以我们应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法，检测人结肠癌HT29细胞中hTERT mRNA的表达水平，探讨其对大肠癌细胞端粒酶活性的影响及其抑癌机理。研究结果表明吴茱萸碱和小檗碱能够降低HT29细胞中的hTERT mRNA的表达，且随着药物浓度的增加，表达逐渐降低，具有剂量依赖效应。hTERT mRNA表达代表端粒酶活性，hTERT mRNA表达下降，提示端粒酶活性降低，由此可证明吴茱萸碱和小檗碱影响大肠癌端粒酶活性是通过降低hTERT表达这一途径来完成的。二．结论通过对细胞传代、冻存和复苏条件进行优化，建立了稳定的HT29细胞培养条件，为后续的实验研究奠定了良好的基础；吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌HT29细胞具有显着生长抑制作用，该抑制作用与诱导细胞凋亡相关；能够抑制HT29细胞端粒酶的活性；能够降低HT29细胞中端粒酶逆转录酶hTERTmRNA的表达，间接抑制端粒酶活性；二者无协同作用。三．不足之处虽然研究工作取得了部分阶段性成果，但由于研究方法不太成熟及时间等方面的原因，研究中也存在着一些不太满意的方面，主要有两个方面：一是由于研究方法不太成熟，关于端粒酶逆转录酶hTERT甲基化程度检测方面的实验未预期完成；另一方面，我们只是选取了加味左金丸的主要有效单体吴茱萸碱和小檗碱来研究其抑癌机理，并不能代表中药复方加味左金丸的抑癌作用，如果探讨中药复方的抑癌机理研究，需要运用中药血清药理学，它能够真实地反映药物在体内的整体作用，实现体外实验和体内实验的结合，使实验结果和在体实验有很好的一致性，并能够为临床治疗大肠癌提供实验依据。四．展望本论文是通过对细胞生长抑制、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性和降低端粒酶逆转录酶hTERT基因表达这四个方面层层深入研究，证明了吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌HT29细胞的抑癌作用机理，为今后从转录因子c-myc、SP1等调控基因表达更深层面去研究中药抑癌的作用机制奠定了一定的基础，也为开发新药提供了实验依据。但本研究中表明，吴茱萸碱和小檗碱在HT29细胞生长抑制及端粒酶活性检测方面，二者无协同作用，可能通过其他机制参与了端粒酶活性的调节，有待以后进一步的深入研究。
二、大肠癌hTERT和p16表达与端粒酶活性的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠癌hTERT和p16表达与端粒酶活性的关系（论文提纲范文）
（1）端粒酶催化亚基和PinX1基因在食管癌治疗中的生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 端粒酶抑制因子PinX1基因在食管癌细胞中的表达及作用效应分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（2）Bmi-1与P16在乳腺癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验图片 |
| 附录B 中英文术语缩略语对照 |
| 附录C 综述 |
（3）塞来昔布及丁酸盐对大肠腺瘤和大肠癌细胞作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
（4）RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写索引 |
| 前言 |
| 第一部分 shRNA真核表达载体构建及其对大肠癌SW480细胞凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因对人大肠癌SW480细胞荷瘤裸鼠的治疗作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）siRNA靶向沉默hTERT对肺癌细胞增殖的抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 hTERT在不同肺癌细胞株中的表达 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 siRNA抑制人肺癌细胞95D中hTERT实验研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 质粒介导的RNAi肺癌hTERT研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述一 RNAi的机制及其在肿瘤基因治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 综述二 端粒酶、端粒酶逆转录酶与肺癌诊疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要科研成果 |
（6）Bmi-1和端粒酶在食管鳞癌中表达与细胞凋亡的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 Bmi-1、端粒酶与肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及攻读硕士研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究（论文提纲范文）
| 主要名词的中英文对照缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 端粒酶与大肠癌相关性研究 |
| 前言 |
| 第一章 端粒酶活性与大肠癌相关性研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 靶向hTERT基因的RNAi真核表达载体的构建和鉴定 |
| 技术路线 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响 |
| 技术路线 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究 |
| 技术路线 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 研究的创新性 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 综述 |
| 综述1：大肠癌的治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2：RNA干扰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞端粒酶的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞端粒酶活性的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 5-杂氮脱氧胞苷下调肝癌细胞端粒酶活性的机制研究 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞化疗敏感性的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）RNA干扰（RNAi）技术抑制大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 大肠癌细胞 HT-29 培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 TRAP 法检测大肠癌 HT-29 细胞转染前后端粒酶活性 |
| 2.2.4 RT-PCR 技术检测hTERTmRNA 含量 |
| 2.2.5 蛋白量变化检测 |
| 2.2.6 细胞生长增殖和凋亡测定 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 细胞转染结果 |
| 3.2 siRNA 试剂对GAPDH 的干扰 |
| 3.3 TRAP 法检测端粒酶活性结果 |
| 3.4 RT-PCR 法检测hTERTmRNA 表达水平 |
| 3.5 Western blotting 检测hTERT 蛋白表达水平 |
| 3.6 hTERTsiRNA 对HT-29 细胞生长抑制作用 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 hTERT 与大肠癌 |
| 4.2 RNAi 抑制大肠癌 hTERT |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（10）吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 中药以端粒酶为靶点治疗大肠癌的研究进展 |
| 1.端粒及端粒酶 |
| 2.端粒酶与大肠癌的相关性 |
| 3.端粒酶在中药治疗大肠癌中的研究进展 |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 表型遗传修饰对大肠癌端粒酶的调节作用的研究 |
| 1 端粒和端粒酶 |
| 2 hTERT的甲基化调节 |
| 3 hTERT的乙酰化调节 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 第三章 黄连和吴茱萸及其有效成分小檗碱和吴茱萸碱抗肿瘤的研究概况 |
| 1.黄连及其有效成分小檗碱抗肿瘤作用 |
| 2.吴茱萸及其有效成分吴茱萸碱抗肿瘤的作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 研究目的、内容和意义 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究内容 |
| 3.研究意义 |
| 实验技术路线图 |
| 第二章 HT29细胞的培养 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.常用溶液的配制 |
| 3.实验方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞的生长抑制和细胞凋亡的作用 |
| 引言 |
| 1.实验材料与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学处理 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响 |
| 引言 |
| 1.实验材料与试剂的配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响 |
| 引言 |
| 1.实验材料和试剂的配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1.本实验研究结果表明 |
| 2.不足之处 |
| 3.展望 |
| 第三部分 附录 |
| 致谢 |
四、大肠癌hTERT和p16表达与端粒酶活性的关系（论文参考文献）
- [1]端粒酶催化亚基和PinX1基因在食管癌治疗中的生物学意义[D]. 樊祥奎. 山东大学, 2014(04)
- [2]Bmi-1与P16在乳腺癌中的表达及意义[D]. 曹云飞. 蚌埠医学院, 2012(S2)
- [3]塞来昔布及丁酸盐对大肠腺瘤和大肠癌细胞作用的实验研究[D]. 曹先乾. 大连医科大学, 2012(01)
- [4]RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究[D]. 蔡艳玲. 广西医科大学, 2011(09)
- [5]siRNA靶向沉默hTERT对肺癌细胞增殖的抑制作用[D]. 葛林虎. 中南大学, 2011(12)
- [6]Bmi-1和端粒酶在食管鳞癌中表达与细胞凋亡的关系[D]. 范福玲. 郑州大学, 2010(05)
- [7]端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究[D]. 葛莲英. 广西医科大学, 2010(10)
- [8]去甲基化剂5-杂氮脱氧胞苷对肝癌细胞端粒酶的影响及机制研究[D]. 陶双芬. 第二军医大学, 2010(12)
- [9]RNA干扰（RNAi）技术抑制大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的实验研究[D]. 袁超君. 南昌大学, 2008(01)
- [10]吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究[D]. 常金荣. 广州中医药大学, 2007(06)