一、重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析（论文文献综述）
岳永程[1]（2021）在《东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究》文中研究表明东毕吸虫病是由东毕属的六种虫体引起的一种人畜共患寄生虫病。在中国,主要流行的是土耳其斯坦东毕吸虫,成虫主要寄生在羊和牛的肠系膜静脉和肝门静脉中,病变主要发生在肝脏组织。东毕吸虫寄生在牛羊等终末宿主的血管中,虫体自身需要氧化还原酶来抵抗宿主免疫系统或代谢产生的活性氧自由基（ROS）,而东毕吸虫没有Trx和Grx这两种相互独立的系统,取而代之的是一种多功能酶——硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）系统,该酶具有硫氧还蛋白还原酶（Trx R）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷氧还蛋白（Grx）三种酶活性。鉴于这种独特性质,对寄生蠕虫TGR的研究受到寄生虫学者们的高度重视。本研究以常用的实验动物作为东毕吸虫的终末宿主,对其感染情况进行了探索。在实验室条件下,成功以山羊作为终末宿主维持东毕吸虫生活史循环;在大鼠和豚鼠体内可以获得虫体,但虫体发育迟缓;在小鼠和东方田鼠体内收集不到成虫。在兔子体内可以获得90-120天、发育成熟的虫体,并可用于后续实验;但180天后虫体发育受阻。利用PCR技术从东毕吸虫cDNA中扩增得到TGR基因的ORF序列,并将大肠杆菌含有的硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）插入到东毕吸虫TGR开放阅读框的末端。构建重组原核表达质粒p ET-28a（+）-Ot TGR和p ET-28a（+）-Ot TGRsec,并在在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过His-tag蛋白纯化磁珠对重组表达蛋白r Ot TGRsec和r Ot TGR进行纯化。将纯化的r Ot TGRsec蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,利用制备的抗体进行蛋白免疫印迹实验和免疫组织化学实验。实验结果表明,在大肠杆菌BL21（DE3）中,r Ot TGR以可溶性蛋白和包涵体形式表达,而r Ot TGRsec主要以可溶性蛋白的形式表达。制备得到了抗r Ot TGRsec的多克隆抗体,Western blotting的结果显示,可以检测到虫体蛋白中Ot TGRsec的存在,免疫组织化学结果显示,该蛋白在虫体中广泛分布,主要集中在虫体体被,其他组织有部分分布。通过TrxR、GR、Grx三种酶活性的检测体系,检测并计算了rOtTGRsec的Trx R、GR和Grx的酶活性。酶活性检测结果显示,r Ot TGRsec的Trx R酶活性为12.30±1.63 U/m L,GR酶活性为8.83±3.15 U/m L,Grx酶活性为0.31±0.07 U/m L。研究了Furoxan衍生物对r Ot TGRsec蛋白Trx R酶活性的抑制作用。利用实验室前期筛选的、对日本血吸虫、大片形吸虫TGR具有较好抑制效果的三种Furoxan衍生物LGM-35、ZWJ-19和CH-33,检测了其对东毕吸虫TGR酶Trx R活性的抑制作用,通过RNA干扰技术对东毕吸虫TGR基因进行了体外干扰,利用实时定量PCR和Western blot,比较分析了不同si RNA分子对该基因的体外干扰效果。结果显示,6个si RNA产生了不同的干扰效果,该基因的转录水平最高可降低46.1%,蛋白表达可降低30.6%。同时对不同浓度LGM-35的体外杀虫效果进行了观察和评价。实验结果表明,LGM-35对东毕吸虫具有一定的杀伤效果,当浓度为400m M,作用96 h后,杀虫效果可达100%,该结果略差于其对日本血吸虫的体外杀虫效果。本研究在实验室条件下维持了东毕吸虫的生活史循环,并对东毕吸虫TGR基因的生物学功能进行了初步研究,为后续开展东毕吸虫的实验室研究及以Ot TGR为靶标研制新的抗东毕吸虫药物奠定了基础。
蔡其刚[2]（2019）在《青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究》文中认为棘球蚴病又称包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫-棘球蚴寄生于人及其它动物的肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病。青海省是全国罕见的棘球蚴病的高发区,流行区域主要分布于玉树藏族自治州和果洛藏族自治州各县。两型棘球蚴病（CE/AE）混合流行,且流行程度高、疫情严重。为了摸清青海南部地区儿童棘球蚴病的流行状况和流行特征、青海田鼠Em感染情况及其病原学特征、探索敏感性和特异性的早期诊断技术,本研究对青海南部地区儿童棘球蚴病的感染状况进行了调查分析研究;对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行了流行病学调查,并进行了Em青海田鼠株的分离、鉴定;利用分离、鉴定的青海田鼠株Em,表达和纯化了EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18两个蛋白,并利用纯化的这两个蛋白分别进行了ELISA和胶体金免疫试纸条检测方法的探索;利用分离鉴定的Em青海田鼠株构建了Em沙鼠感染模型,并对构建的Em沙鼠感染模型进行了肝脏、脾脏和血浆代谢组学研究。主要研究结论如下:（1）通过采用影像学和血清学诊断方法,对青海南部地区儿童棘球蚴病感染状况进行了调查分析研究,明确了该区域儿童棘球蚴病的流行分布情况和特征。这对患棘球蚴病儿童采取早期诊断和制定最佳治疗方案,保障患病儿童尽早地正常生长发育具有重要的意义。同时,对于健康的儿童,也可以尽早地进行预防、保健及调理。（2）通过对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行流行病学调查,从捕获的50只青海田鼠中分离、鉴定得到了11株Em,Em感染率为22%。通过对其进行分子生物学分析,确定了Em青海田鼠分离株为亚洲型,且存在不同核苷酸位点的变异。该研究发现进一步确立了青海田鼠作为Em中间宿主在流行病学上的重要地位,这为在该地区通过控制青海田鼠的数量来降低人感染AE的风险提供了一个重要的思路。（3）通过提取Em青海田鼠分离株的基因组DNA,综合利用分子生物学和免疫学技术,克隆、表达和纯化了EmAgB3蛋白和EmAgB3-GGGS-Em18蛋白,获得了高纯度和高浓度的重组蛋白（EmAgB3蛋白的浓度为1.05 mg/mL,EmAgB3-GGGS-Em18蛋白浓度为0.5 mg/mL）。另外,通过利用3C酶酶切的方式,成功将重组EmAgB3蛋白的GST标签进行了切除。进行了纯化和蛋白复性,使其最大程度地恢复了天然EmAgB3蛋白的空间结构和生物学特性,为进一步对其进行更深入的结构、功能和应用研究奠定了物质基础。（4）通过对重组EmAgB3蛋白和重组EmAgB3-GGGS-Em18蛋白进行ELISA和胶体金试纸条技术的包装,分别建立了ELISA和胶体金免疫试纸条的诊断方法。经特异性、敏感性和符合性试验,均具有非常良好的临床诊断应用价值。（5）通过将分离鉴定的Em青海田鼠分离株进行腹腔接种沙鼠的方式,成功构建了Em沙鼠感染模型,感染率高达100%。这为将来进行更深入的针对Em青海田鼠分离株的生物学研究奠定了种子基础。（6）采集了Em沙鼠模型和正常沙鼠对照的肝脏、脾脏和血浆样本,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析技术,分别对采集的样本进行了非靶标代谢组学研究,筛选获得了数量众多的差异代谢物。肝脏代谢组学分析显示:在肝脏中检测到10493个代谢物,从中筛选出1509个差异代谢物。其中309个代谢物较正常肝脏代谢物上调,1200个代谢物下调;脾脏代谢组学分析显示:在脾脏中检测到8679个代谢物,从中筛选出1111个差异代谢物。其中586个代谢物较正常脾脏代谢物上调,525个代谢物下调;血浆代谢组学分析显示:在血浆中检测到4085个代谢物,从中筛选出316个差异代谢物。其中200个代谢物较正常血浆代谢物上调,116个代谢物下调。这些代谢组学的数据,为将来开展针对特异性代谢物的研究、筛选药物作用靶点和代谢通路提供了参考。
李想[3]（2019）在《猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究》文中研究说明目的:生物信息学分析和预测猪带绦虫（Taenia solium,Ts）14-3-3基因家族及其编码蛋白的序列、结构与进化特征,分析Ts14-3-3基因家族在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达差异,原核表达Ts14-3-3.3基因并制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,分析Ts14-3-3.3蛋白的组织定位情况,为该蛋白的进一步研究奠定基础。方法:1.搜索Gene DB数据库中猪带绦虫全基因组数据,利用生物信息学分析工具及各类软件包,分析和预测Ts14-3-3基因家族的基因结构及其编码蛋白质的理化特性、二级结构、亚细胞定位、三级结构和系统进化树等。2.采集流行区猪带绦虫病人成虫标本,建立囊虫病猪模型,收集猪囊尾蚴,采用实时荧光定量PCR方法检测Ts14-3-3基因家族在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的相对表达量。3.将Ts14-3-3.3基因克隆至原核表达质粒p CznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析其表达产物,用His Link亲和层析柱进行纯化,免疫印迹法（Western blot）鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。4.将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的定位。结果:1.通过对猪带绦虫全基因组数据库搜索,共获得6个猪带绦虫Ts14-3-3基因,基因结构均由外显子和内含子组成,其编码蛋白分子质量介于26.8829.33KD之间,蛋白结构均为二聚体形式,分别位于4个不同的进化枝上。2.荧光定量PCR结果表明,6个Ts14-3-3基因在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达,Ts14-3-3.1、Ts14-3-3.2、Ts14-3-3.3和Ts14-3-3.4在囊尾蚴阶段表达量较高,Ts14-3-3.5和Ts14-3-3.6在成虫阶段表达量较高。3.成功构建猪带绦虫重组表达质粒p CznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 KD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。4.用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了高效价的Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论:1.初步获得了猪带绦虫Ts14-3-3基因家族的6个成员,其编码蛋白包含典型的14-3-3蛋白结构域,具有较高的序列保守性。2.猪带绦虫Ts14-3-3基因家族的6个成员在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。3.成功构建p Czn I-Ts14-3-3.3原核表达质粒,Ts14-3-3.3重组蛋白可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。4.Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。
张悦,周必英[4]（2019）在《寄生虫14-3-3基因工程疫苗研究进展》文中指出寄生虫病是危害人和动物的重要传染病之一,疫苗是目前控制寄生虫病最为经济有效的方式。近年来,免疫学及生物工程的迅速发展极大的促进了寄生虫基因工程疫苗的研究。14-3-3蛋白是一种广泛存在于真核生物中的高度保守蛋白,已被国内外学者运用于多种寄生虫基因工程疫苗的研究。本文则对国内外寄生虫14-3-3基因工程疫苗的研究进展做一综述。
吴冬丽,胡诗梦,王业富[5]（2018）在《日本血吸虫14-3-3蛋白的表达与诊断价值研究》文中认为制备可溶性表达的重组日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3（r Sj14-3-3）并优化表达条件,分析其免疫学特性和免疫诊断价值。成功构建了BL21/p ET30a-r Sj14-3-3表达菌株,最佳的表达体系为细菌生长至OD600为0.61.0时加入IPTG至最佳终浓度0.1 mmol/L,28℃诱导16 h。上清液中可溶性的r Sj14-3-3蛋白纯化后的浓度为2.804 mg/m L。以r Sj14-3-3为抗原,间接ELISA检测显示,48份急性与35份慢性血吸虫病患者血清的抗体阳性率分别为95.6%和92.0%;与27份华支睾吸虫和15份钩虫患者血清的交叉反应率分别为7.4%和6.7%;与30份健康人血清假阳性反应率为0%。抗r Sj14-3-3兔血清及所制备的多抗可被纯化出的r Sj14-3-3蛋白及血吸虫成虫抗原（AWA）和排泄分泌物（ESA）中的天然Sj14-3-3分子的反应,且多抗效价达1:1 280 000。本研究成功表达并纯化出r Sj14-3-3蛋白,优化了其诱导表达条件,且此蛋白具有较高的抗原特异性。
罗广旭[6]（2017）在《日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3）疫苗的构建及其表达》文中提出目的日本血吸虫病是一种由日本血吸虫（Sj）感染引起的的慢性寄生虫病,主要流行于印尼、中国、菲律宾等亚洲国家和地区,是我国重点防治的公共卫生问题之一。多年来我国防控血吸虫病主要利用药物治疗、灭螺、健康教育以及环境改造等综合措施,并且取得了显着的成就。但是这些措施不能完全消灭血吸虫病,研制疫苗成为防控该病的重要战略措施。本实验利用Sj谷胱甘肽-S-转移酶（Sj26GST）和信号转导蛋白（Sj14-3-3）两种抗原分子的编码基因进行拼接,并以两歧双歧杆菌（Bb）为载体,构建日本血吸虫重组Bb（p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3）疫苗,研究该融合基因在两歧双歧杆菌中的表达效率,为下一步疫苗免疫机制的研究打下基础。方法以本室构建并保存的重组质粒p ET28α-Sj26GST和p ET28α-Sj14-3-3为模板,PCR扩增Sj26GST和Sj14-3-3两种目的基因,然后将扩增的两种基因通过基因拼接法进行融合,构建Sj26GST-Sj14-3-3融合基因。再将其插入穿梭表达载体p GEX-1λT,获得重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3,然后将该质粒电穿孔导入大肠埃希菌BL21（DE3）后利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达;其诱导产物的分析和鉴定采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹法（Westernblot）。将重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3电穿孔导入Bb中,构建重组Bb（p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3）疫苗后经IPTG对该疫苗诱导表达,其诱导产物利用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳显示成功获得长度为1120bp的Sj26GST-Sj14-3-3融合基因,并构建了重组表达质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3;SDS-PAGE结果显示该重组质粒诱导表达产物的Mr约67k Da,其表达水平在诱导57h后较高,构建质粒所表达的融合蛋白占菌体总蛋白的19%;Westernblot分析显示Sj感染的兔血清可识别该表达蛋白。PCR及双酶切均显示Bb中被成功导入重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3。SDS-PAGE显示该重组质粒诱导表达产物的Mr约67k Da,其表达水平在诱导34d后较高,导入的重组质粒所表达的融合蛋白占菌体总蛋白的7.9%;Westernblot显示该蛋白能被Sj感染的兔血清识别。结论1.重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3构建成功,且该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中可得到表达,表达的蛋白具有抗原特异性。2.成功构建日本血吸虫重组Bb（p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3）疫苗,该疫苗可表达具有特异抗原性的Sj26GST-Sj14-3-3重组蛋白。
覃婷[7]（2016）在《日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗的构建及其表达》文中研究指明目的血吸虫病是一种呈全球分布的、危害严重的人兽共患寄生虫病。流行于中国的主要为日本血吸虫病,在我国其仍然是一个值得重视的严重的公共卫生问题。我国现有的吡喹酮化疗、灭螺等血防措施虽然对血吸虫病的防治起到重要作用,但尚不能达到完全控制甚至消除血吸虫病的目的,而血吸虫病疫苗的研究为此带来了希望。由于各种不足,目前为止尚没有一种安全、有效的血吸虫疫苗应用于临床。本研究拟利用日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）14-3-3和Sj32抗原编码基因,以两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum,Bb）为“载体”,构建日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗,并研究Sj14-3-3-Sj32融合基因在两歧双歧杆菌中的表达情况,为日本血吸虫病疫苗的研究奠定基础。方法1.以本室保存的质粒pGEX-Sj14-3-3和p ET28α-Sj32为模板,通过PCR扩增出Sj14-3-3和Sj32抗原编码基因,再将得到的两个目的基因用基因拼接技术（gene SOEing）进行剪接,得到Sj14-3-3-Sj32融合基因;再将穿梭表达载体pGEX-1λT与构建的融合基因拼接,得到重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;采用电穿孔法将pGEX-Sj14-3-3-Sj32转化至大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）BL21（DE3）中,再用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）对其进行诱导表达;最后采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达产物,用蛋白印迹（Western blot）技术对表达蛋白的免疫原性进行分析。2.培养Bb菌,将构建的重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32电转化至B b菌中,构建重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗;用IPTG对疫苗进行诱导表达,再通过SDS-PAGE鉴定表达产物,以及Western blot技术分析表达蛋白的免疫原性。结果1.采用基因拼接技术成功得到长度约为1 750 bp的Sj14-3-3-Sj32融合基因;重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32经双酶切证实构建成功;SDS-PAGE分析结果显示重组质粒经IPTG诱导表达的产物为Mr约73k Da的重组蛋白;Western blot显示表达的重组蛋白可被Sj感染的兔血清所识别。2.双酶切和PCR均证实重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32成功转入Bb菌中,r Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗构建成功;SDS-PAGE分析显示,重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32经IPTG诱导后可在Bb菌中表达Mr约73KDa的重组蛋白,与预期结果相符,且在诱导后的23d表达水平较高,表达的蛋白占菌体总蛋白的8.2%;Western blot结果显示Sj感染的兔血清可识别所表达的重组蛋白。结论1.成功合成融合基因Sj14-3-3-Sj32,并与穿梭表达载体连接后得到重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;2.重组质粒在大肠埃希菌中能表达Mr约为73 k Da的重组蛋白,且具有较强的免疫原性;3.日本血吸虫r Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗经证实构建成功,且该疫苗可表达具有抗原特异性的Sj14-3-3-Sj32重组蛋白。
曹晓丹[8]（2016）在《日本血吸虫排泄分泌蛋白的研究》文中研究指明日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的一种慢性、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫释放或分泌一些抗原分子进入宿主体内,这些分子直接暴露于宿主免疫系统,诱导和调节宿主的免疫应答。一些排泄分泌蛋白（excretory/secretory proteins,ESPs）,包括早期童虫和其它不同发育阶段虫体差异表达的排泄分泌蛋白对血吸虫在终末宿主体内感染的建立和维持至关重要。研究日本血吸虫童虫和成虫不同发育阶段排泄分泌蛋白质的组成和变化,鉴定分析与日本血吸虫生长、发育、繁殖等相关的重要分子,将有助于理解血吸虫与宿主间的相互作用机制,有助于发现血吸虫免疫调节关键分子及血吸虫病的疫苗候选分子。1.日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白质组分析日本血吸虫具有复杂的生活史,童虫是血吸虫在终末宿主体内的早期发育阶段,是疫苗介导保护性免疫的主要靶标。排泄分泌蛋白在宿主与寄生虫相互作用中扮演重要角色,而日本血吸虫童虫排泄分泌蛋白质组至今尚未有研究报道。本实验首次应用高效液相色谱法和串联质谱技术对日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白质的组成进行分析鉴定,最终鉴定到713种蛋白。这些蛋白的理论分子量介于10kDa和70kDa之间,理论等电点介于3到13之间。生物信息学分析显示,鉴定到的童虫排泄分泌蛋白主要参与应激反应（如heat shock protein）、碳水化合物代谢（如glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、蛋白质降解（如protein disulfide isomerase）等,其中一些ESPs可能是与日本血吸虫早期童虫适应寄生生活,维持在终末宿主体内生存、发育等相关的重要分子。本研究有助于了解日本血吸虫童虫与宿主间的相互作用机制及血吸虫病疫苗候选分子的筛选。2.日本血吸虫童虫和成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析童虫和成虫是日本血吸虫寄生于终末宿主体内的两个主要发育阶段虫体,它们具有不同的形态学和生物学特征。童虫和成虫期别差异表达的排泄分泌蛋白在血吸虫的感染建立和维持、发育和繁殖过程中发挥了不同的生物学功能。本实验首次应用iTRAQ和液质联用技术,完成了日本血吸虫14d童虫和42d成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析,最终鉴定到298种差异蛋白。其中,童虫高表达蛋白有161个,包括hot shock proteins、glucose-6-phosphate isomerase、protein disulfide isomerase等,生物信息学分析显示这些蛋白主要参与应激反应、碳水化合物代谢和蛋白降解等过程;成虫高表达蛋白有137个,包括thioredoxin peroxidase、adenine phosphoribosyltransferase等,它们主要与免疫调节和嘌呤代谢等相关;另有31个蛋白在童虫和成虫间不具有显着性差异,如phosphoglycerate mutase等。该研究可为阐述童虫和成虫生理学上的差异,及理解这两个发育阶段虫体差异表达ESPs在血吸虫生长发育中的作用提供实验依据,同时也可为寻找有效的疫苗候选分子提供基础。3.日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶SjPDI的克隆、表达及重组蛋白rSjPDI诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）为本研究排泄分泌蛋白组分析中鉴定到的一种日本血吸虫排泄分泌蛋白。本文应用PCR技术对SjPDI基因进行克隆,该基因具有1410bp的开放阅读框,编码469个氨基酸。构建了重组表达质粒pET-28a-SjPDI,并在BL21大肠杆菌中获得成功表达,得到相对分子质量约为55 kDa的可溶性重组蛋白rSjPDI。Western blotting分析显示,rSjPDI可以被日本血吸虫成虫蛋白免疫兔血清识别,日本血吸虫成虫蛋白和成虫排泄分泌蛋白可以被rSjPDI免疫小鼠血清识别,说明重组蛋白rSjPDI具有良好的免疫原性和抗原性,且SjPDI确实存在于日本血吸虫排泄分泌蛋白中。实时定量PCR分析表明SjPDI在各个检测的生长发育阶段虫体中均有表达,且在42天成虫和早期童虫体内呈高表达。免疫荧光试验结果显示,SjPDI主要定位于日本血吸虫表膜及实质组织内。生物学特性分析显示,重组蛋白rSjPDI具有蛋白异构和抗氧化等功能。ELISA实验表明rSjPDI可引起免疫小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。在两批小鼠免疫保护实验中,与对照组相比,rSjPDI免疫组分别获得35.32%和26.19%的减虫率及33.17%和31.7%的肝脏虫卵减少率。本研究表明排泄分泌蛋白SjPDI在血吸虫生长发育过程中扮演着重要角色,为一种潜在的日本血吸虫病疫苗候选分子。4.日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶对LPS诱导的巨噬细胞活化的影响及其调节机制研究巨噬细胞在机体抗寄生虫感染中发挥重要的免疫调节作用,在促炎性和抗炎性反应中扮演重要角色。谷胱甘肽脱氢酶为本研究排泄分泌蛋白组分析中鉴定到的另一种重要的日本血吸虫排泄分泌蛋白。该蛋白含有GSTs结构域,与克氏锥虫Tc52免疫调节分子具有相同的结构位点。本实验首次对日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶进行克隆表达,分析该重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其潜在的免疫调节机制。结果表明,重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和iNOS的表达,同时可增强巨噬细胞中microRNA-146a分子的表达水平。进一步分析显示,miR-146a对LPS活化的巨噬细胞IL-1β的表达有负调控作用,miR-146a可能参与调节巨噬细胞促炎性免疫应答反应。本研究表明重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可以通过影响巨噬细胞活化和促炎性反应参与宿主免疫应答进程,该分子可能在血吸虫的生存和发育中具有重要作用。综上,本研究应用高效液相色谱法和串联质谱法对日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白组的组成进行分析鉴定,应用iTRAQ和液质联用技术对日本血吸虫14d童虫和42d成虫排泄分泌蛋白组进行比较分析。对日本血吸虫排泄分泌蛋白SjPDI的编码基因进行了克隆、表达及生物学特性研究,对重组蛋白rSjPDI诱导小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护效果进行评估。对日本血吸虫排泄分泌蛋白谷胱甘肽脱氢酶编码基因进行了克隆和表达,就该重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其潜在的免疫调节机制进行了初步分析。本研究有助于更好的了解血吸虫生长发育机制及血吸虫与宿主之间的相互作用机制,并可为筛选有效的疫苗候选分子提供实验依据。
吕超[9]（2016）在《多表位重组抗原的研制及在日本血吸虫病诊断和免疫预防上的初步应用》文中进行了进一步梳理日本血吸虫病（schistosomiasis）仍然是我国重要的公共卫生问题之一。病牛是我国血吸虫病最重要的传染源,在某些流行区内羊在血吸虫病传播中的作用也不可忽视,有效控制牛、羊血吸虫病对我国早日阻断血吸虫病传播将有重大的意义。诊断是血吸虫病防控中的中心环节。在现已建立的各种血清学诊断技术中,血吸虫虫卵可溶性抗原SEA是最常用的诊断抗原,但以SEA作为诊断抗原,往往特异性较差,交叉反应高,不能区分现症感染和既往感染以及不能作为疗效考核的诊断抗原。一些血吸虫重组抗原已被用作诊断抗原或疫苗候选分子,评估其应用前景,但大多数重组抗原获得的敏感性都低于SEA,诱导的保护效果都不够高或不稳定。多表位重组抗原含有多个抗原表位有可能增强其抗原性和免疫原性,把它们作为诊断抗原或疫苗候选分子,有可能提高诊断方法的敏感性和疫苗的免疫保护效果。基于此,本文开展了以下几个方面的研究:1.候选抗原SjPGM和SjRAD23细胞表位的分析及单分子和多表位重组抗原的构建应用BepiPred 1.0、T-epitope Designer、PredictProtein、IEDB Analysis等在线预测软件预测候选抗原SjPGM和SjRAD23的B细胞和T细胞表位及候选抗原肽段的抗原性、可接近性等,综合各个预测软件的分析结果,筛选出表位富集肽段三段,包括从SjPGM挑选出的BSjPGM（aa 85-166）;Sj RAD23挑选出的BSj RAD23-1（aa 46-123）和BSjRAD23-2（aa 166-230）。另Sj23抗原的大亲水区（LHD-Sj23）也被引入作为候选表位富集肽段。设计特异性引物,共构建了9种重组原核表达质粒,其中包括4种单分子重组表达质粒:BSjPGM/p ET-28a（+）、BSj RAD23-1/pET-28a（+）、BSjRAD23-2/p ET-28a（+）、BSj23/p ET-32a（+）和5种多表位重组表达质粒:BSjPGM-BSj23/p ET-28a（+）、BSjPGM-BSj RAD23-1/pET-28a（+）、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a（+）、BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj23/p ET-28a（+）和BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a（+）。除BSjPGM/p ET-28a（+）、BSjRAD23-2/p ET-28a（+）、BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a（+）外,其余6种重组表达质粒均成功在大肠杆菌中表达,并经纯化获得条带单一的目的蛋白。2.单分子/多表位重组抗原用于诊断山羊血吸虫病的初步研究以重组抗原rSjPGM和rSj RAD23及新构建的6种表位重组蛋白作为诊断抗原,以sea作为参照抗原,应用间接elisa方法检测山羊日本血吸虫病,共检测91份山羊感染日本血吸虫血清,44份健康山羊血清,12份捻转血矛线虫感染血清及37份东毕吸虫感染血清。结果显示,除rbsjpgm-bsjrad23-1外,其余3种多表位重组抗原获得的敏感性都高于4种单分子重组抗原（rsjrad23,rsjpgm,rbsjrad23-1,rbsj23）,其中多表位重组抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23获得最高的敏感性（97.8%,89/91）,且保持良好的特异性（100%,44/44）和较低的交叉反应性（捻转血矛线虫:8.33%,1/12;东毕吸虫13.51%,5/37）。而以sea作为诊断抗原,其敏感性为100%（91/91）,但特异性仅为75%（33/44）,且与捻转血矛线虫和东毕吸虫分别有25%（3/12）和83.78%（31/37）的交叉反应。本研究结果显示,多表位重组抗原的研制与应用有可能提高重组抗原检测山羊血吸虫病的敏感性,多表位重组抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23有可能是一种诊断山羊血吸虫病的优选抗原。3.单分子/多表位重组抗原用于诊断水牛血吸虫病的效果评估将在诊断山羊血吸虫病中显示出较好效果的5种重组表位抗原,包括2种单分子表位抗原（rbsjrad23-1,rbsj23）和3种多表位重组抗原（rbsjpgm-bsj23、rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23、rbsjrad23-2-bsjpgm-bsj23）,用于诊断水牛血吸虫病,同样以sea作为参照抗原。共检测114份日本血吸虫感染水牛血清,92份健康水牛血清,14份前后盘吸虫感染血清。elisa结果显示,5种重组表位抗原中rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23获得最高的敏感性（95.61%,109/114）,其特异性和交叉反应率分别为97.83%（90/92）和7.14（2/14）。而以sea作为诊断抗原,获得的敏感性为100%,特异性和交叉反应率分别为82.61%（76/92）和50%（7/14）。本研究结果显示,多表位重组抗原的研制与应用可以提高重组抗原检测水牛血吸虫病的敏感性。同样,多表位重组抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23是水牛血吸虫病的优选诊断抗原。4.表位重组抗原诱导免疫保护效果的初步评价在抗原表位分析基础上,本研究构建了一重组表达质粒bsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1/pet-28a（+）,将三种重组表位抗原rbsjrad23-1,rbsjpgm-bsjrad23-1,rbsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1结合206佐剂免疫小鼠,结果在两批独立的动物实验中,rbsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1在小鼠中诱导的减虫率（42.7%,30.4%）和减卵率（40.3%,30.3%）均高于另两种表位重组抗原,本研究提示构建多表位重组抗原可提高重组抗原诱导的免疫保护效果。本研究研制了一种在牛、羊血吸虫病诊断中具有较高敏感性和特异性的重组多表位诊断抗原r BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj RAD23-1,并建立了ELISA检测技术,为我国家畜血吸虫病防控提供了一种可选择的诊断新技术。
张宁,冉瑞明,李文桂[10]（2013）在《Sj14-3-3在日本血吸虫病免疫诊断方面的研究进展》文中认为日本血吸虫病是一种人兽共患寄生虫病。诊断在血吸虫病防治中具有极其重要的地位,免疫学诊断技术因其良好的敏感性、特异性及实用性,成为当前血吸虫病的常用诊断手段。本文对日本血吸虫14-3-3应用于日本血吸虫病免疫诊断的主要研究进展进行综述。
二、重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析（论文提纲范文）
（1）东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 东毕吸虫病的现状 |
| 1.1.1 东毕吸虫病的危害 |
| 1.1.2 东毕吸虫病的防治 |
| 1.2 寄生虫氧化还原系统 |
| 1.2.1 生物体的氧化还原系统 |
| 1.2.2 寄生虫氧化还原系统 |
| 1.2.3 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶 |
| 1.2.4 谷胱甘肽(GSH)系统 |
| 1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)系统 |
| 1.2.6 硫氧还蛋白(Trx)系统 |
| 第二章 东毕吸虫不同宿主适宜性观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 耳萝卜螺的饲养 |
| 2.3.2 土耳其斯坦东毕吸虫毛蚴孵化与耳萝卜螺感染 |
| 2.3.3 土耳其斯坦东毕吸虫尾蚴的释放、收集与终末宿主的感染 |
| 2.3.4 粪便毛蚴孵化检查 |
| 2.3.5 感染宿主的不同组织虫卵计数 |
| 2.3.6 兔子感染不同时间虫体发育情况统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同实验动物感染东毕吸虫的情况统计 |
| 2.4.2 兔子在感染后不同时间的虫体发育情况 |
| 2.4.3 兔子在感染后不同时间的虫卵分布情况 |
| 2.4.4 东毕吸虫不同时期虫体观察 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 东毕吸虫TGR的克隆表达和纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器和实验试剂配制 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 东毕吸虫总RNA的提取和反转录 |
| 3.3.2 东毕吸虫TGR序列的生物信息学分析 |
| 3.3.3 OtTGR基因的扩增和pET-28a(+)-OtTGR表达质粒的构建 |
| 3.3.4 pET-28a(+)-OtTGRsec表达质粒构建 |
| 3.3.5 rOtTGR和 rOtTGRsec的表达和纯化 |
| 3.3.6 rOtTGR多克隆抗体的制备与免疫组织化学实验 |
| 3.3.7 蛋白免疫印记实验(Western blot) |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 OtTGR、OtTGRsec基因的克隆及pET28a(+)-OtTGRsec和 p ET28a(+)-Ot TGR的重组质粒构建与鉴定 |
| 3.4.2 OtTGR的生物信息学分析 |
| 3.4.3 rOtTGR和 rOtTGRsec的表达和纯化 |
| 3.4.4 rOtTGR蛋白免疫印迹与重组蛋白的质谱鉴定 |
| 3.4.5 OtTGR的免疫组织化学结果 |
| 3.4.6 免疫小鼠抗体效价的测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 东毕吸虫TGR的酶特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 rOtTGRsec硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的活性检测 |
| 4.3.2 rOtTGRsec谷胱甘肽还原酶(GR)的活性检测 |
| 4.3.3 rOtTGRsec谷氧还蛋白(Grx)的活性检测 |
| 4.3.4 抑制剂对rOtTGRsec TrxR酶活性的抑制作用 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 rOtTGRsec TrxR的酶活性 |
| 4.4.2 rOtTGRsec GR的酶活性 |
| 4.4.3 rOtTGRsec Grx的酶活性 |
| 4.4.4 抑制剂对rOtTGRsec的 TrxR酶活性的抑制作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 东毕吸虫TGR的体外干扰及抑制实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 生物材料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 东毕吸虫收集 |
| 5.3.2 东毕吸虫培养 |
| 5.3.3 体外干扰东毕吸虫虫体实验 |
| 5.3.4 虫体RNA提取 |
| 5.3.5 qPCR分析干扰结果 |
| 5.3.6 Western blot分析siRNAs干扰OtTGR后的蛋白表达水平 |
| 5.3.7 LGM35 对东毕吸虫成虫的抑制效果评价 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 siRNAs干扰后OtTGR的转录水平 |
| 5.4.2 siRNAs干扰OtTGR后的蛋白表达分析 |
| 5.4.3 LGM35 对东毕吸虫成虫的杀伤效果评价 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 棘球蚴病简史 |
| 2 病原体及其特征 |
| 2.1 生物学分类地位 |
| 2.2 棘球属绦虫种类及其形态 |
| 2.2.1 细粒棘球绦虫 |
| 2.2.2 多房棘球绦虫 |
| 2.3 棘球绦虫的生活史 |
| 3 棘球蚴病临床症状 |
| 4 棘球蚴病的流行分布情况 |
| 5 泡型棘球蚴病动物模型构建研究进展 |
| 5.1 理想的Em动物模型应具备的特点 |
| 5.2 动物模型建立的方法 |
| 5.2.1 口服虫卵感染 |
| 5.2.2 经皮肝穿刺法 |
| 5.2.3 开腹肝穿刺法 |
| 5.2.4 切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法 |
| 5.2.5 门静脉分支注射法 |
| 5.2.6 腹腔注射法 |
| 5.3 动物模型评价方法 |
| 5.3.1 剖检法 |
| 5.3.2 影像学方法 |
| 5.3.3 免疫学方法 |
| 6 诊断方法研究进展 |
| 6.1 病原学检测 |
| 6.2 影像学诊断 |
| 6.3 血清免疫学诊断 |
| 6.4 DNA检测 |
| 7 分子生物学研究进展 |
| 7.1 基因组特征 |
| 7.2 棘球蚴代谢组学研究进展 |
| 7.3 棘球蚴蛋白质组学研究进展 |
| 8 棘球蚴病疫苗免疫学研究进展 |
| 8.1 基因工程疫苗 |
| 8.2 核酸(DNA)疫苗 |
| 8.3 多肽疫苗 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 青南地区儿童棘球蚴病感染状况的调查分析研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 调查区域 |
| 1.2 学校调查 |
| 1.3 超声检查 |
| 1.4 血清学检测 |
| 1.4.1 前期准备 |
| 1.4.2 样品检测 |
| 1.4.3 参考范围 |
| 1.4.4 结果判定 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 儿童棘球蚴病病例的地理分布情况 |
| 2.2 儿童棘球蚴病病例的性别和年龄分布情况 |
| 2.3 儿童棘球蚴病的地域分布情况 |
| 2.4 AE和 CE病变的超声分类 |
| 3 讨论 |
| 第三章 青海田鼠株多房棘球蚴的分离鉴定及系统进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 青海田鼠的捕获 |
| 1.2 捕获青海田鼠解剖及囊液收集 |
| 1.3 包囊HE染色 |
| 1.4 原头蚴分离及镜检 |
| 1.5 PCR分析 |
| 1.6 进化分析 |
| 1.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 样本收集 |
| 2.2 捕获青海田鼠的解剖特征 |
| 2.3 包囊原头蚴HE染色 |
| 2.4 原头蚴分离及镜检 |
| 2.5 PCR分析 |
| 2.6 进化分析 |
| 2.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 EmAgB3 蛋白及串联EmAgB3-GGGS-Em18 蛋白的克隆表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 寄生虫 |
| 1.1.2 质粒及菌种 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 扩增用引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.2 EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的基因合成 |
| 1.2.3 载体酶切 |
| 1.2.4 目的片段与载体连接 |
| 1.2.5 转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选克隆 |
| 1.2.6 诱导表达融合蛋白 |
| 1.2.7 蛋白的纯化 |
| 1.2.8 纯化蛋白的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 2.1.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.1.2 PCR产物克隆测序鉴定 |
| 2.2 Bam HI-EmAgB3-Xho I及 Nde I-EmAgB3-GGGS-Em18-Xho I基因生物合成 |
| 2.3 重组载体酶切鉴定 |
| 2.4 融合蛋白诱导结果 |
| 2.5 融合蛋白GST/镍琼脂糖亲和层析纯化 |
| 2.6 EmAgB3 融合蛋白酶切后SDS-PAGE检测 |
| 2.7 EmAgB3 融合蛋白酶切后透析 |
| 2.8 蛋白最终Tricine-SDS-PAGE分析 |
| 2.9 目的蛋白Western blot分析 |
| 2.10 蛋白浓度测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 基于EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 重组蛋白的AE ELISA诊断方法的建立及应用. |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基本方法 |
| 1.2.2 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数的筛选 |
| 1.2.3 临界值的确定及判定方法 |
| 1.2.4 特异性检测 |
| 1.2.5 符合性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数确定 |
| 2.2 临界值的确定 |
| 2.3 特异性交叉检测 |
| 2.4 符合性检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 基于重组蛋白EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的棘球蚴病胶体金试纸条诊断方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 所需溶液配制 |
| 1.2.2 材料准备 |
| 1.2.3 胶体金的制备 |
| 1.2.4 胶体金标记二抗(山羊抗人Ig G Fc)及纯化 |
| 1.2.5 金标垫、样品垫处理 |
| 1.2.6 喷金与划膜 |
| 1.2.7 组装与测试 |
| 1.2.8 特异性试验 |
| 1.2.9 敏感性试验 |
| 1.2.10 符合性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性试验 |
| 2.2 敏感性试验 |
| 2.3 符合性试验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 Em沙鼠模型的建立及其代谢组学的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验鼠及寄生虫虫株 |
| 1.1.2 样品 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 1.2.2 代谢组学研究用样本采集 |
| 1.2.3 代谢物提取 |
| 1.2.4 上机检测 |
| 1.2.5 数据处理 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 2.2 沙鼠组织UHPLC-QTOF-MS检测 |
| 2.3 质量控制 |
| 2.3.1 过程质控 |
| 2.3.2 数据质控 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.4.1 肝脏代谢组学变化 |
| 2.4.2 脾脏代谢组学变化 |
| 2.4.3 血浆代谢组学变化 |
| 3 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目及发表论文 |
| 导师简介 |
（3）猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 猪带绦虫Ts14-3-3 基因家族鉴定及生物信息学分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 猪带绦虫Ts14-3-3 基因家族的表达及Ts14-3-3.3 蛋白组织定位研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（4）寄生虫14-3-3基因工程疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 寄生虫14-3-3分子生物学特点 |
| 2 寄生虫14-3-3基因工程疫苗研究进展 |
| 2.1 14-3-3亚单位疫苗 |
| 2.1.1 细粒棘球绦虫 |
| 2.1.2 多房棘球绦虫 |
| 2.1.3 旋毛虫 |
| 2.1.4 捻转血矛线虫 |
| 2.1.5 日本血吸虫 |
| 2.1.6 肝片吸虫 |
| 2.1.7 巨片吸虫 |
| 2.1.9 刺激隐核虫 |
| 2.2 14-3-3DNA疫苗 |
| 2.2.1 日本血吸虫 |
| 2.2.2 弓形虫 |
| 2.3 14-3-3活载体疫苗 |
| 2.3.1 日本血吸虫 |
| 2.3.2 多房棘球绦虫 |
| 3展望 |
（5）日本血吸虫14-3-3蛋白的表达与诊断价值研究（论文提纲范文）
| 1 结果与分析 |
| 1.1 r Sj14-3-3蛋白编码基因的扩增和鉴定 |
| 1.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.3 r Sj14-3-3蛋白的诱导表达及条件优化 |
| 1.4 可溶性r Sj14-3-3蛋白的纯化 |
| 1.5 r Sj14-3-3免疫反应性分析 |
| 1.6 多抗制备及效价检测 |
| 2 讨论 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 r Sj14-3-3基因克隆 |
| 3.3 重组质粒p ET30a/r Sj14-3-3的构建 |
| 3.4 r Sj14-3-3蛋白的诱导表达及条件优化 |
| 3.5 r Sj14-3-3蛋白的纯化 |
| 3.6 r Sj14-3-3免疫学活性分析 |
| 3.7 多抗的制备及免疫原性鉴定 |
（6）日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3）疫苗的构建及其表达（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 日本血吸虫重组质粒p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3 的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 日本血吸虫重组Bb(p GEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗的构建及其表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（7）日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗的构建及其表达（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj1433-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj1433-Sj32)疫苗的构建及其表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
（8）日本血吸虫排泄分泌蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 血吸虫及我国血吸虫病防控 |
| 1.2 日本血吸虫的生活史 |
| 1.3 血吸虫感染免疫 |
| 1.3.1 抗原复杂性 |
| 1.3.2 宿主免疫效应机制的多样性 |
| 1.3.3 免疫逃避 |
| 1.3.4 宿主免疫应答作用的两面性 |
| 1.4 单核吞噬细胞 |
| 1.5 排泄分泌蛋白及相关研究 |
| 1.5.1 排泄分泌蛋白 |
| 1.5.2 排泄分泌蛋白与免疫调节 |
| 1.5.3 寄生蠕虫排泄分泌蛋白质组学研究 |
| 1.6 蛋白质组学研究技术 |
| 1.6.1 蛋白质组分分离技术 |
| 1.6.2 蛋白质组分鉴定技术 |
| 1.6.3 蛋白质组分定量分析技术 |
| 1.6.4 蛋白质组生物信息学分析 |
| 1.7 本研究的总体思路 |
| 第二章 日本血吸虫 14d童虫排泄分泌蛋白质组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 14d童虫排泄分泌蛋白质组的总体分析 |
| 2.3.2 童虫排泄分泌蛋白的分泌特性分析 |
| 2.3.3 童虫排泄分泌蛋白的理化特性分析 |
| 2.3.4 GO注释 |
| 2.3.5 KEGG通路分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫童虫和成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.2 童虫和成虫差异ESPs的总体分析 |
| 3.3.3 童虫和成虫差异ESPs的理论相对分子量和等电点预测及分泌特性分析 |
| 3.3.4 童虫和成虫差异ESPs的GO功能显着性分析及通路分析 |
| 3.3.5 iTRAQ验证试验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶（SjPDI）的克隆、表达及重组蛋白rSjPDI诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SjPDI基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 重组质粒pET28a（+）-SjPDI的原核表达及重组蛋白的纯化 |
| 4.3.3 rSjPDI的抗原性和免疫原性分析 |
| 4.3.4 Real-time PCR检测SjPDI在不同发育阶段虫体内的转录水平 |
| 4.3.5 SjPDI蛋白在虫体内的组织定位观察 |
| 4.3.6 重组蛋白rSjPDI的异构活性和抗氧化活性测定 |
| 4.3.7 重组蛋白SjPDI在小鼠体内诱导的特异性抗体检测 |
| 4.3.8 重组蛋白rSjPDI在小鼠体内诱导的免疫保护效果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶对LPS诱导的巨噬细胞活化的影响及其调节机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶基因的克隆及生物信息学分析 |
| 5.3.2 日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶基因的原核表达及纯化 |
| 5.3.3 重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可抑制LPS诱导的巨噬细胞中促炎性细胞因子和iNOS的转录水平 |
| 5.3.4 重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶抑制LPS诱导的巨噬细胞中NO的释放 |
| 5.3.5 重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可增强巨噬细胞中miR-146a的转录水平 |
| 5.3.6 mi R-146a负调控LPS诱导的巨噬细胞中IL-1β 的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）多表位重组抗原的研制及在日本血吸虫病诊断和免疫预防上的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 血吸虫病免疫诊断方法 |
| 1.2.1 间接血凝试验（IHA） |
| 1.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 1.2.3 胶体免疫试纸条（DDIA） |
| 1.3 单分子重组诊断抗原的研究近况 |
| 1.3.1 23KDa抗原 |
| 1.3.2 Sj26GST重组抗原 |
| 1.3.3 Sj1433 抗原 |
| 1.3.4 日本血吸虫SjSVLBP（极低密度脂结合蛋白） |
| 1.3.5 日本血吸虫硫氧还原蛋白过氧化物酶 1（SjTPx-1） |
| 1.3.6 SjSP-13重组抗原 |
| 1.4 重组多表位抗原用于诊断疾病方面的研究 |
| 1.5 构建多表位重组抗原应用于血吸虫病免疫预防的研究 |
| 1.6 日本血吸虫SjPGM和Sj RAD23的筛选背景 |
| 1.7 本论文的总体研究思路 |
| 第二章 候选抗原细胞表位的分析及多表位重组抗原的研制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 预测软件 |
| 2.2.2 载体、菌种、实验动物 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 候选抗原SjRAD23、SjPGM抗原表位的筛选 |
| 2.3.2 表位肽段编码核苷酸片段的克隆 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建 |
| 2.3.4 重组原核表达质粒的鉴定 |
| 2.3.5 重组原核表达质粒在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 候选抗原SjPGM和Sj RAD23表位肽段的筛选 |
| 2.4.2 挑选出的表位肽段的基因克隆 |
| 2.4.3 重组原核表达质粒的构建及其验证 |
| 2.4.4 重组原核表达质粒的表达及蛋白的纯化 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 SjPGM、Sj RAD23以及新构建的多表位重组抗原用于检测山羊日本血吸虫病的初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 血清与实验动物 |
| 3.2.2 主要材料与主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 可溶性虫卵抗原（SEA）的制备 |
| 3.3.2 应用ELISA评价候选抗原作为诊断抗原检测山羊血吸虫病的初步效果 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 方阵试验 |
| 3.4.2 应用重组抗原诊断山羊日本血吸虫病 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 评价多表位重组抗原检测水牛日本血吸虫病的初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 血清 |
| 4.2.2 实验材料、试剂与主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 可溶性虫卵抗原的制备 |
| 4.3.2 应用间接ELISA法评价候选抗原作为诊断抗原检测水牛血吸虫病的初步效果 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 方阵试验 |
| 4.4.2 应用重组抗原诊断水牛血吸虫病 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 多表位重组抗原免疫保护效果的初步评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物和尾蚴 |
| 5.2.2 主要仪器、试剂与试剂的配置 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 rBSj RAD232BSjPGM-BSj RAD23-1 的构建与表达 |
| 5.3.2 重组蛋白诱导的免疫保护效果观察 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 BSj RAD232BSjPGM-BSjRAD23-1/p ET-28a(+)双酶切验证 |
| 5.4.2 重组质粒BSj RAD232BSjPGM-BSjRAD23-1 的表达及纯化 |
| 5.4.3 重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫保护效果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）Sj14-3-3在日本血吸虫病免疫诊断方面的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Sj14-3-3蛋白概况 |
| 2 免疫诊断 |
| 2.1 重组抗原 |
| 2.2 重组Sj14-3-3抗体 |
| 2.3 融合蛋白 |
| 2.4 基因诊断 |
| 3 结语 |
四、重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析（论文参考文献）
- [1]东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究[D]. 岳永程. 中国农业科学院, 2021
- [2]青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究[D]. 蔡其刚. 甘肃农业大学, 2019
- [3]猪带绦虫Ts14-3-3基因家族鉴定、表达及Ts14-3-3.3蛋白组织定位研究[D]. 李想. 遵义医科大学, 2019(08)
- [4]寄生虫14-3-3基因工程疫苗研究进展[J]. 张悦,周必英. 中国病原生物学杂志, 2019(02)
- [5]日本血吸虫14-3-3蛋白的表达与诊断价值研究[J]. 吴冬丽,胡诗梦,王业富. 基因组学与应用生物学, 2018(07)
- [6]日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3）疫苗的构建及其表达[D]. 罗广旭. 重庆医科大学, 2017(01)
- [7]日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj14-3-3-Sj32）疫苗的构建及其表达[D]. 覃婷. 重庆医科大学, 2016(02)
- [8]日本血吸虫排泄分泌蛋白的研究[D]. 曹晓丹. 中国农业科学院, 2016(01)
- [9]多表位重组抗原的研制及在日本血吸虫病诊断和免疫预防上的初步应用[D]. 吕超. 上海师范大学, 2016(02)
- [10]Sj14-3-3在日本血吸虫病免疫诊断方面的研究进展[J]. 张宁,冉瑞明,李文桂. 中国病原生物学杂志, 2013(04)