一、汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定（论文文献综述）
易立[1]（2015）在《犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析》文中研究指明犬瘟热（Canine Distemper,CD）是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒（Canine Parvovirus,CPV）引起的以肠炎、腹泻与主的烈性传染病。为了更好的控制与预防上述两种疫病的流行,本研究开展了犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析。首先,本研究以CDV3的RNA为模板,原核表达纯化了带His标签的N蛋白截短片段（aa277-471）,免疫BALB/c雌鼠后,将其B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过包被N蛋白截短片段（aa277-471）的ELISA筛选,获得分泌抗CDV的单克隆抗体杂交瘤阳性细胞1株,命名为1N8,亚类鉴定为Ig G1a,kappa链,该单克隆抗体间接免疫荧光检测阳性、WB检测阳性。接下来采用噬菌体展示和肽扫描的方法,筛选1N8结合的抗原表位:合成N蛋白（aa277-471）的15肽文库,每条多肽长度15aa,位移5aa,通过结合和筛选,得到一条与单克隆抗体1N8阳性反应的多肽,通过多肽N端和C端的不断缩减,最终证明该抗原表位的最小识别单位:351NFGRSYFDP359。通过3D模拟,发现此表位位于N蛋白的外侧,其与CDV阳性血清具备一定的ELISA反应能力。通过比对,其与CDV同属麻疹病毒、牛瘟病毒,小反刍兽疫病毒一致,并对小反刍兽疫病毒进行了WB验证,其结果为阳性。以杂交瘤细胞1N8为模板,分离出抗体轻链和重链可变区,通过基因工程的方式组装成单链抗体,通过原核表达,获得了重组1N8单链抗体蛋白,经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测,其具备1N8单抗的部分活性。以腺病毒为表达载体,研究了351NFGRSYFDP359表位疫苗的免疫效力:构建含351NFGRSYFDP359表位和肠炎细小病毒VP2基因的表达盒,通过PCR和WB检测,重组腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表达出外源片段。小鼠免疫试验显示:与商品化对照疫苗相比,重组腺病毒的CPV的ELISA效价与之相当,但CDV的ELISA效价比较低。最后,在本研究开展了CPV VP2基因遗传变异研究:历经4年,收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份,分离病毒8株,获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份,其中CPV-2a型20份,CPV-2b型2份,测序结果显示我国CPV存在CPV-2a（Ser297Ala）变异,而且CPV VP2基因序列相似度为99.3-99.9%,系统发育树证明本次分离的大多数CPV毒株为一个大的分支中,与泰国KU143-09株类似,且不呈现地域相关性。
张琳[2]（2013）在《鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定》文中研究说明抗原表位（Epitope）又称为抗原决定簇（antigenic determinant,AD），是抗原分子中被免疫系统，特别是抗体、B细胞、T细胞识别的部分。B细胞的BCR识别的表位为B细胞表位，T细胞的TCR识别的表位为T细胞表位。鉴定分析抗原表位对了解抗原物质的结构与功能，研制安全有效的表位疫苗以及研发基于表位诊断试剂具有重要意义。鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）引起的，以蛋鸭、种鸭产蛋骤然下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。2010年初，我国的江浙沪地区陆续爆发该病，蛋鸭产蛋严重下降，肉鸭生长迟缓，给我国养殖业造成了严重的经济损失。近两年对该病毒的一些分子生物学特已经进行了深入研究，但迄今为止，对于该病毒的抗原表位还没有报道。为深入了解病毒的抗原结构，便于设计科学合理的疫苗和诊断试剂，我们对DTMUV浙江分离株（YY5株）进行了抗原表位的鉴定。本研究RT-PCR扩增出鸭坦布苏病毒YY5株的E蛋白基因，插入pMBP-c表达载体进行原核表达，获得了具有良好生物活性的可溶性融合蛋白MBP-E。用纯化的重组蛋白MBP-E为抗原免疫Balb/C小鼠，经细胞融合，选择培养，成功筛选出两株抗鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ（domain Ⅲ，DⅢ）的单克隆抗体，分别命名为AE4和BD10。两株单克隆抗体间接免疫荧光试验（IFA）结果呈阳性，而仅有BD10能与MBP-E重组蛋白进行Western blot反应，可初步推断BD10识别E蛋白DⅢ区的一个B细胞线性表位。针对E蛋白的DⅢ区设计了一系列末端相互重叠的15个短肽，这些短肽与MBP进行融合表达，用BD10对15个短肽融合蛋白进行Western blot和ELISA鉴定，精确定位BD10识别的一个B细胞线性抗原表位。将纯化的表位融合蛋白MBP-EP385对小鼠进行免疫，获得的多克隆抗体能够识别DⅢ蛋白和MBP-E融合蛋白，表明表位EP385具有良好的免疫原性。结果表明，通过表达蛋白结合单抗法鉴定出一株鸭坦布苏病毒E蛋白的一个B细胞线性表位的核心区域EP385(385LVGSGKGQ393)。这对进一步分析鸭坦布苏病毒E蛋白的结构与功能以及建立以表位为基础的诊断方法和基于表位的疫苗设计具有重要的意义。
杨栋强[3]（2012）在《汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定》文中提出肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）均是由汉坦病毒属病毒（hantaviruses）引起的自然疫源性疾病，目前全世界每年仍有5～10万HFRS和HPS病例发生，病死率因感染的病毒型别而异，自0.1%～40%不等[1-3]。我国是当今世界上受HFRS危害最为严重的国家之一，自建国后至2010年年末，已累计发现上报出血热病例近160万，占到同期世界上总发病例数的83%以上[4]。由于HFRS多散在发生，且早期主要在农村和城镇周边中小医院救治，难以组织开展较大样本、随机、双盲和对照的临床研究，对各种治疗药物和治疗方案的评价仍缺乏高质量的循证医学的证据，远远落后于乙型和丙型病毒性肝炎等高发传染病。目前临床上抗汉坦病毒感染的治疗药物仍限于利巴韦林和干扰素α等少数品种。且时至今日，美国FDA仍未批准包括利巴韦林等在内的任何针对HFRS和HPS的特效治疗药物[5]。因此，深入探讨汉坦病毒致病的分子机理，进而寻找有效的治疗靶点和抗病毒药物仍是HFRS防治的重要任务。抗微生物肽是近些年发现的新型活性生物分子。短肽或寡肽类分子具有分子量小、抗原性弱、活性强、穿透力强、易于制备且比较容易与靶分子结合等优点，是当前治疗肿瘤和感染等疾病的有效靶向药剂。功能性多肽的筛选工作量十分浩大，需要高通量的筛选技术，而噬菌体展示技术恰好可满足该项工作的需要[6-8]。已知病毒感染靶细胞的第一步是病毒进入（entry）细胞质内，通常需要病毒吸附蛋白或表位与靶细胞的特定受体结合[9]。近年研究表明β3整合素是汉坦病毒感染靶细胞的关键受体，并且可能参与了血管屏障功能的维持，封闭或阻断β3整合素已成为抗汉坦病毒治疗研究的重要策略之一[10-11]。本研究在既往对β3整合素和汉坦病毒感染的基础上，应用噬菌体展示技术，以β3整合素为靶分子，对噬菌体七肽展示库进行8轮亲和筛选，获得结合β3整合素的噬菌体蓝色克隆，挑取其中结合力比较强的克隆，测得插入其中的外源性DNA序列，并推导出各自对应的多肽序列，然后应用生物信息学软件分析多肽序列的特性，同时行同源性分析，从而找出特异性结合且与比对序列有相似生物学特性、较高同源性的多肽序列。继之请生物公司合成这些多肽序列，用病毒感染阻断实验对这些多肽的抗汉坦病毒的活性进行初步测试，为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。本课题研究内容和结果如下：1.细菌生长的测定用标有不同时间的锥形瓶和摇菌管分别培育大肠埃希菌E.coliER2738，以用于噬菌体的扩增，培养相应的时间后用分光光度计测定600nm波长的OD值，最终找出最佳摇菌时间。结果发现扩增噬菌体时，最佳摇菌时间为2.5h；测滴度时，最佳摇菌时间为5.5h。2.噬菌体肽库的淘筛应用亲和富集法对噬菌体7肽库进行8轮筛选，β3整合素用量逐轮减少，并逐轮缩短结合时间，逐轮延长洗涤时间和不断增加洗涤液中Tween-20的浓度，以筛选得到高亲和力、特异性强的噬菌体克隆。结果显示每轮淘洗噬菌体数量都有较高的富集，淘筛过程中通过用不同梯度浓度的β3整合素靶分子来改变选择强度，在经过8轮淘筛后，我们筛选出与β3整合素具有较高亲和力和较高活性的短肽。3.融合基因的测序和序列分析比对随机挑取80个克隆，经过DNA测序，得到5条重复率较高结构不同的寡肽序列，分别为TGVKGPG、LPLTPLP、KLTSSPT、SPVGPLP和DHRNHLV。将上述多肽序列与汉滩型病毒囊膜糖蛋白氨基酸序列比对，发现5条短肽与汉滩病毒的囊膜糖蛋白具有较高的同源性。运用生物信息学手段分析这些短肽，发现他们具有与同源序列相似的等电点和典型的疏水性。结论：通过对噬菌体展示肽库的淘筛，获得若干与β3整合素结合并具有潜在抗汉滩病毒的多肽，为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。
闫果林[4]（2011）在《汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定》文中研究表明肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠类为主要传染源的一种自然疫源性疾病，又称流行性出血热（epidemic hemorrhagic fever，EHF），简称出血热。全球每年新发病例有90%左右在中国；死亡率在2%10%左右。该病在我国绝大多数省区流行，病情危急，危害很大。汉滩病毒（hantaan virus， HTNV）和汉城病毒（Seoul virus， SEOV）是我国HFRS的两种主要病原体。汉坦病毒感染可引起机体明显的适应性免疫应答。体液免疫应答强烈而持久；细胞免疫可能在免疫保护和免疫病理损伤两方面都有作用。汉坦病毒核蛋白是诱导体液免疫应答主要的免疫原，可在发病数天内引起抗体应答。因此，重组核蛋白常被用来检测患者血清中病毒特异性抗体的类型和水平，为HFRS的诊断提供依据。糖蛋白免疫原性较弱，糖蛋白特异性抗体出现稍晚，多在病程中后期。但是，一般认为汉坦病毒糖蛋白是诱导中和抗体产生的主要来源；而据报道，中和抗体出现的早晚与患者的病情及预后密切相关。人感染汉坦病毒后，血清病毒特异性IgG水平随时间延长不断升高，一般于恢复早期达到平台期；持续时间长，有时在病愈后数十年仍可检测到。抗体的产生离不开抗原特异性B细胞的活化、增殖、分化；抗原特异性B细胞接触并结合抗原是体液免疫应答的始动环节；而这离不开B细胞受体（B cell receptor, BCR）对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇（antigenic determinants），又称表位（epitope）。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。研究汉坦病毒结构蛋白特异性抗体识别的B细胞表位对于深入认识病毒致病和抗体产生机制，中和抗体的免疫保护作用，以及研发新的诊断材料、亚单位疫苗等具有重要意义。目前，有关汉滩病毒结构蛋白B细胞表位的报道较少，尚缺乏系统的研究。本论文首次采用合成的重叠多肽对HFRS患者血清抗体识别的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）线性B细胞表位进行了系统分析。把覆盖HTNV NP氨基酸全序列的70条重叠15肽包被于ELISA板，用间接ELISA法筛选了35例HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位，并用竞争ELISA证实了患者血清抗体与抗原肽结合的特异性。发现HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位主要在NP氨基端（aa1-117），其次为NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部仅有数个线性B细胞表位。发现一些患者血清抗原肽特异性IgG水平在急性期可有不同的变化。同时，我们合成了覆盖HTNV GP氨基酸全序列的281条重叠15肽，利用间接ELISA和点杂交两种PepScan法对3D8、3G1、8G3这3株鼠源性中和抗体识别的B细胞表位进行表位作图。首先，将合成的281条重叠多肽分成28组，每10条肽为一组，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，用上述3株单克隆抗体做粗筛；然后将与单克隆抗体呈阳性反应的混合肽中各组成肽分别包被ELISA板或NC膜继续用单克隆抗体反应，做细筛，从而确定各单克隆抗体识别的抗原肽。然后用竞争ELISA证实抗原肽与中和抗体结合的特异性。我们发现单克隆抗体3D8和8G3识别HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而单克隆抗体3G1可能识别由数个线性肽组成的构象表位。由于原合成肽相邻肽间相差4个氨基酸残基，因此又追加合成了与881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分别相差3个、2个、1个氨基酸残基的15肽。将这些肽包被于ELISA板或NC膜上与单克隆抗体3D8反应，进行单克隆抗体3D8识别线性B细胞表位的精细定位。我们发现单克隆抗体3D8与882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反应最强烈。接着，用丙氨酸扫描突变法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896这条抗原肽发挥主要作用的氨基酸残基，发现aa885C、aa896C是该抗原肽表位最关键的氨基酸残基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K对单克隆抗体3D8识别这个抗原肽表位也有重要影响。本论文首次系统分析了肾综合征出血热患者血清抗体识别的HTNV核蛋白线性B细胞表位，对具有中和作用的单克隆抗体3D8的B细胞表位作图确定了汉滩病毒糖蛋白上一个新的中和表位。这一结果不仅为深入探讨HTNV感染引起的体液免疫应答规律以及研制新型疫苗提供了理论依据，同时为搞清单克隆抗体3D8作为HFRS治疗性抗体的抗病毒感染机制提供了重要的实验依据。
魏建超[5]（2010）在《日本脑炎病毒入胞机制及其靶向抑制分子的研究》文中进行了进一步梳理日本脑炎（Japanese encephalitis, JE）,又称流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B）,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。该病对猪的致死率不高,但可引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎,公猪发生睾丸炎而不育。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。这不仅严重危害养猪业的健康稳定发展,而且还严重威胁着人类的公共卫生安全。尽管目前对JEV的病原学、分子生物学和免疫学特性的研究已取得了很大的进展,疫苗的应用也使乙脑的发病率有所下降,然而幸存者也往往会留有严重的后遗症,尚无有效的抗病毒治疗药物,而且JEV的致病的分子机制仍不完全清楚,因此,JEV的致病机理和抗病毒研究成为当前研究的重点和难点。病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒生命周期中的始动环节,也是影响病毒宿主范围、组织嗜性和致病性的决定因素之一。病毒入胞于是也成为当前抗病毒治疗和抗病毒药物设计一个具有吸引力的靶点。一般认为JEV囊膜糖蛋白E是该病毒的病毒吸附蛋白（virus attachment protein, VAP）,介导JEV与宿主细胞受体结合及膜融合。研究发现黄病毒的E蛋白含有3个结构域,即结构域Ⅰ、结构域Ⅱ和结构域Ⅲ。其中,结构域Ⅲ（domainⅢ, DⅢ）被认为是受体的主要结合部位,而且该结构域中保守基序（Arg387-Gly387-Asp389, RGD）的单氨基酸突变可能影响JEV的受体识别和毒力。本研究从病毒黏附蛋白和细胞受体的两个角度探讨了日本脑炎病毒入胞机制并以此为靶点对其靶向抑制分子进行了筛选和抗病毒活性评价。研究内容具体如下：1.日本脑炎病毒E蛋白受体结合域及其突变体的可溶性表达与多克隆抗体制备本试验利用点突变技术和基因重组技术构建了日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ（EDⅢ）及其保守的RGD基序单氨基酸突变体（△EDⅢ, RGD突变为RGE）的原核表达载体,通过低温诱导（18℃）的策略获得了其可溶性重组蛋白。并以纯化EDⅢ蛋白免疫小鼠获得了抗EDⅢ的多克隆抗体。Western blot结果表明可溶性EDⅢ和ΔEDⅢ能被猪源JEV阳性血清所识别,制备的血清具有很好的特异性,为后续的研究奠定了基础。2.囊膜蛋白结构域Ⅲ及其保守的RGD基序在日本脑炎病毒入胞过程的作用分析本研究比较了含有保守RGD基序的重组E DⅢ蛋白或RGD多肽及其单氨基酸突变体（RGD突变为RGE）的重组ΔEDⅢ蛋白或RGE多肽结合到BHK-21细胞膜受体的能力。细胞黏附试验和流式细胞术结果显示重组E DⅢ蛋白较之其突变体能更有效地结合到BHK-21细胞膜表面,而且重组E DⅢ蛋白和RGD多肽与BHK-21细胞预孵育后能显着地抑制JEV感染BHK-21细胞,其抑制率分别达到65%和98%,然而RGD基序的突变（RGD突变为RGE）使得其抑制率分别下降到22%和52%。由此可推测,JEV是通过其囊膜蛋白上保守的RGD基序与靶细胞的膜受体相结合来介导其入胞的。这也进一步证实了,JEV囊膜蛋白DⅢ是其细胞膜受体的结合域,且可作为JEV入胞抑制剂的候选分子。3.日本脑炎病毒囊膜蛋白特异性结合肽的筛选与鉴定本试验以纯化的重组囊膜蛋白（Trx-E）作为靶标,Trx作为对照,对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆特异性,阳性克隆测序后合成多肽,应用表面等离子共振技术（SPR）进一步鉴定多肽的亲和力。ELISA结果显示,在随机挑选的20个单克隆当中,15个克隆靶向结合到重组蛋白Trx-E的囊膜蛋白（E）区域,5个克隆靶向结合到重组蛋白Trx-E的硫氧还原蛋白（Trx）区域。SPR试验进一步证实,5个人工合成多肽在一定程度上均能特异性结合到Trx-E的囊膜蛋白（E）区域,其中,多肽P1与Trx-E的囊膜蛋白（E）区域亲和力最高,其氨基酸序列为：TPDCTRWWCPLT。这为进一步研究JEV的入胞机制和靶向抗病毒治疗奠定了基础。4.日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽体内外抗病毒活性的研究本研究在前一章筛选到5个日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽的基础上,进一步评价了其抑制JEV感染的活性。Q-PCR结果显示5个囊膜蛋白结合肽在一定程度上均能抑制JEV感染BHK-21细胞,其中P1的抑制率最高,达到85%以上。进一步的PRNT结果证实P1在BHK-21、PK15和Vero细胞均呈现剂量依赖的抑制JEV感染的活性。而且,小鼠腹膜内接种试验表明P1预孵育JEV较之对照组能有效地减少（轻）病毒血症和致死率以及中枢神经系统的组织病理损伤。这些结果为JEV的抗病毒治疗和药物设计提供了一个新的思路。5.日本脑炎病毒在PK15细胞上膜受体的鉴定目前,JEV在猪源细胞上受体分子仍不清楚。本研究选择PK15细胞为主要的研究对象,同时选用Vero和BHK-21细胞,应用VOPBA鉴定出多个与JEV结合的蛋白,其中一个共有的约74kDa的JEV结合蛋白被随后的Western blot试验证实为HSC70。抗HSC70抗体能阻断JEV与上述三种细胞的结合,间接免疫荧光试验和激光共聚焦显微镜观察显示HSC70定位在BHK-21、PK15和Vero细胞膜上,提示HSC70可能是BHK-21、PK15和Vero细胞上的一个共有JEV受体候选分子。在BHK-21和Vero细胞上约67kDa、80kDa和105kDaJEV结合蛋白在JEV入胞过程起什么作用,是否是辅助受体,尚待进一步研究。综上所述,这些研究结果将为深入乙脑致病机制的解析及其新型抗病毒药物的设计提供了新的思路和有益的线索。
王倩[6]（2008）在《应用噬菌体肽文库筛选HFRSV优势B细胞结合表位肽》文中研究说明目的应用噬菌体展示肽文库筛选鉴定肾综合征出血热病毒优势B细胞结合表位肽。方法以Protein-A纯化的肾综合征出血热病人恢复期血清为筛选配基,对经正常人血清预吸附的噬菌体展示随机12肽文库（或次级肽文库）进行生物亲和淘选;夹心ELISA、竞争ELISA鉴定所获得克隆的结合特性,并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果ELISA测定显示,通过5轮淘选得到的噬菌体克隆半数以上可与筛选血清发生特异性结合;对45个阳性克隆进行序列测定分析,根据其推导的氨基酸序列可大致分为8组,同源性分析显示ⅠⅦ组序列基序可能为LVXKR、LTXR、IXKP、LXPA、VGA、KXIR、EKXP,其中4组基序在病毒结构蛋白氨基酸序列中发现同源区。结论获得了一组HFRSV优势B细胞表位肽,HFRSV核蛋白可能是诱导高水平抗体的主要免疫原,研究结果为基于表位的基因工程诊断试剂的研制和多肽疫苗的设计提供依据。
俞海青[7]（2004）在《噬菌体展示短肽亲和配基的筛选及其亲和色谱的研究》文中研究表明本文主要针对使用噬菌体展示系统获得目标蛋白质的亲和配基和将该配基应用于目标蛋白质的亲和色谱分离进行了研究。首先以溶菌酶为目标蛋白质筛选七肽噬菌体展示库，在借鉴传统肽库筛选方法的基础上，建立了一种新型筛选方法——交替洗脱法，即使用甘氨酸缓冲液和高浓度目标蛋白质溶液轮流对结合于蛋白质表面的噬菌体进行洗脱。通过与其它多种洗脱方法进行比较，以及将每轮实验各次洗脱液中噬菌体对目标蛋白质的亲和力的对比，证明该方法能够有效回收使用其它操作方法可能丢失的高亲和力噬菌体，而且可以大幅度缩短获得目标配体的时间，同时具有简便易行等优点。利用新建立的交替洗脱法，使用其它目标蛋白质对噬菌体展示肽库进行筛选，又获得了对胰岛素和核糖核酸酶A具有高亲和力的噬菌体。选择与目标蛋白质亲和力不等（高等、中等、低等）的多个噬菌体进行DNA测序，获得相应氨基酸序列，发现与溶菌酶、胰岛素和核糖核酸酶A亲和性最高的噬菌体展示肽序列均为HWWWPAS，将产生该现象的原因进行了分析，同时还对不同序列展示肽与目标蛋白质的亲和吸附机制进行了探讨。合成上述高亲和性肽段，并固定于琼脂糖基质上装填亲和色谱柱，研究了不同蛋白在亲和色谱柱上的吸附行为。通过调节流动相的pH值和离子强度，并使用尿素和乙二醇分别对吸附蛋白进行洗脱，详细研究了吸附效果最好的目标蛋白质（胰岛素）与肽配基之间的亲和吸附机理，发现静电作用和氢键是二者之间产生亲和吸附的主要作用力，而疏水相互作用对该亲和几乎没有贡献。进一步考察了操作流速对胰岛素在肽配基亲和柱上吸附的影响，测定计算了胰岛素在亲和柱上的动态吸附等温线，获得了该亲和柱的最大容量和结合常数，并使用其分离纯化模式混和蛋白和猪胰腺粗提液中的胰岛素，取得良好效果。另外，将该亲和柱用于卵清蛋白中溶菌酶的分离纯化，也取得了令人满意的结果。
王长军[8]（2003）在《抗汉坦病毒单克隆抗体可变区基因分析及其噬菌体配体肽的筛选和鉴定》文中研究指明目的 肾综合征出血热病毒（HFRSV）为布尼亚病毒科汉坦病毒（HV）属成员。因其致病性强，世界卫生组织已将其列为潜在的生物战剂。其中汉滩型（HTN）与汉城型（SEO）在我国广泛分布，引起发病率和病死率较高的肾综合征出血热（HFRS），每年病例占全球总病例的90%以上。虽然近年来HFRS发病率和病死率在我国呈下降趋势，但疫区仍在不断扩大，并已波及某些中心城市。因而，从分子水平积极开展HFRSV的免疫预防和治疗研究具有重要意义。材料和方法 根据鼠源抗体可变区（V）氨基酸序列，设计合成一组抗体重、轻链可变区（VH/VK）简并引物。采用一步法提取单克隆抗体（McAb）H7、B11和F3细胞总RNA，通过RT-PCR扩增V基因，并进行核苷酸序列测定和分析。同时，利用McAb F3及B11，应用噬菌体肽文库筛选特异性的抗体结合肽，夹心ELISA和竞争抑制试验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性，阳性克隆序列测定和同源性分析；在此基础上，通过动物免疫试验初步分析噬菌体颗粒抗原的免疫原性。结果 通过RT-PCR成功克隆5条可变区基因，均为开放阅读框，符合小鼠抗体框架结构。B11-VH隶属于JH4重排，长345 bp，编码115个氨基酸；H7-VK属JK4重排，长357 bp，编码119个氨基酸；H7-VH属JH4重排，长360 bp，编码120个氨基酸；F3-VK属JK1重排，长348 bp，编码116个氨基酸；F3-VH属JH3重排，长366 bp，编码122个氨基酸。将上述基因核苷酸序列输入GenBank查询，证实为新基因，登记号依次为AY245600AY245604。同时，应用噬菌体肽文库筛选获得的特异性抗体结合肽阳性率达80%以上，可特异性地与筛选抗体结合。序列分析表明，McAb F3特异性结合肽的推导氨基酸序列高度一致，为MHGPTKNQMWHT，与HFRSV M蛋白G2区第750759位氨基酸有较高的同源性；而McAb B11特异性的结合肽在氨基酸水平表现出一定的多态性（分为4组），推测其序列基序为（M/F）HR（H/T）X（H/W）或（R/F）HX（H/T）PWL。阳性克隆动物免疫试验表明，噬菌体肽抗原不仅具有良好的免疫反应性，而且具有良好的免疫原性，是天然病毒抗原较好的免疫原模拟物。结论 上述McAb可变区基因的获得及模拟表位的初步鉴定，为有目的地开展<WP=10>HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究，以及基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基础。
王长军,王登高,唐家琪,余争平,陶开华,郭恒彬,潘秀珍[9]（2002）在《汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定》文中提出目的 应用噬菌体展示肽文库筛选可与肾综合征出血热病毒mAbB11特异性结合的短肽。方法 采用Protein A亲和纯化的单抗为筛选配基 ,对噬菌体展示的随机 12肽文库进行生物亲和淘选 ;夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性 ,并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果 通过 4轮淘选 ,ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽多数能与B11单抗特异性地结合 （12 15 ） ;序列分析表明 8个阳性克隆氨基酸序列分为 4组 ;同源性分析显示核心序列可能为 （M F）HR（H T）X（H W ）或 （R F）HX（H T）P（W M） （L Y）。结论 基于表位水平的HFRSV特异性诊断试剂的研制和小分子多肽疫苗的设计提供了重要依据
二、汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定（论文提纲范文）
（1）犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 犬瘟热病毒 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒病原学 |
| 1.1.2 犬瘟热病毒基因组及N蛋白研究进展 |
| 1.2 犬瘟热病毒单克隆抗体的研究 |
| 1.2.1 犬瘟热病毒单克隆抗体的制备 |
| 1.2.2 犬瘟热病毒B细胞表位 |
| 1.2.3 犬瘟热病毒单链抗体 |
| 1.3 犬瘟热病毒诊断技术研究 |
| 1.3.1 犬瘟热病毒病原学诊断 |
| 1.3.2 犬瘟热病毒血清学诊断 |
| 1.4 犬瘟热病毒疫苗研究进展 |
| 1.4.1 犬瘟热病毒毒株及疫苗 |
| 1.4.2 犬瘟热病毒新型疫苗 |
| 1.4.3 犬瘟热病毒免疫失败原因 |
| 1.5 腺病毒作为载体在动物疫苗中的研究进展 |
| 1.6 肉食动物细小病毒 |
| 1.6.1 肉食动物细小病毒概述 |
| 1.6.2 基因组特征 |
| 1.6.3 犬细小病毒 |
| 1.6.4 犬细小病毒变异和VP2蛋白氨基酸突变 |
| 1.6.5 我国犬细小病毒流行状况 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第二章 CDV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 摘要 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验试剂 |
| 2.1.2 毒株及实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.1.4 N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR |
| 2.1.5 N蛋白截短蛋白(aa277-471)表达载体构建 |
| 2.1.6 p EASY-N表达菌株诱导表达 |
| 2.1.7 重组CDV-N蛋白表达预处理 |
| 2.1.8 N蛋白表达Ni-NTA纯化 |
| 2.1.9 N蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.1.10 CDV-N蛋白免疫程序 |
| 2.1.11 N蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.1.12细胞融合试验 |
| 2.1.13阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.1.14 MAbs腹水的制备 |
| 2.1.15间接免疫荧光（IFA）鉴定 |
| 2.1.16 MAb的Western blot鉴定 |
| 2.1.17 MAb上清与腹水效价测定以及亚类鉴定 |
| 2.1.18 MAb 的初步应用：抗体与 HRP 及 488 偶联 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 N基因的PCR扩增 |
| 2.2.2 重组供体质粒p EASY-N的鉴定 |
| 2.2.3 p EASY-N重组质粒的表达与纯化 |
| 2.2.4 间接ELISA检测法的建立 |
| 2.2.5 阳性杂交瘤细胞株的获得 |
| 2.2.6 MAb上清与腹水效价测定以及亚型鉴定 |
| 2.2.7 MAb的IFA鉴定 |
| 2.2.8 MAb的Western blot鉴定 |
| 2.2.9 MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 CDV单克隆抗体的制备 |
| 2.3.2 选择CDV N蛋白的原因 |
| 2.3.3 CDV单克隆抗体国内外应用进展 |
| 第三章 筛选犬瘟热病毒N蛋白（AA 277-471）B细胞表位 |
| 摘要 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要实验试剂 |
| 3.1.2 单克隆抗体 1N8的纯化 |
| 3.1.3 噬菌体筛选与扩增 |
| 3.1.4 阳性噬菌体序列测定 |
| 3.1.5 犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）合成肽的制备 |
| 3.1.6 抗原表位的初步鉴定（肽扫描） |
| 3.1.7 抗原表位的精确鉴定 |
| 3.1.8 抗原表位的特异性鉴定 |
| 3.1.9 抗原表位合成多肽与CDV阳性/阴性血清ELISA反应 |
| 3.1.10 抗原表位的 3D位置 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 单抗腹水纯化 |
| 3.2.2 肽库淘选 |
| 3.2.3 随机噬菌体的测序结果 |
| 3.2.4 肽扫描结果 |
| 3.2.5 抗原表位的精确鉴定 |
| 3.2.6 抗原表位的比对 |
| 3.2.7 1N8与小反刍兽疫病毒的WB检验 |
| 3.2.8 抗原表位351NFGRSYFDP359在N蛋白中的 3D位置 |
| 3.2.9 抗原表位351NFGRSYFDP359与CDV阳性血清反应能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CDV N蛋白B细胞抗原表位 |
| 3.3.2 麻疹病毒属N蛋白抗原表位分析 |
| 第四章 基于杂交瘤细胞 1N8的单链抗体制备与鉴定 |
| 摘要 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 杂交瘤的RNA提取，c DNA合成和基因扩增 |
| 4.1.5 单链抗体sc Fv/1N8 gene的合成 |
| 4.1.6 原核表达重组质粒的构建 |
| 4.1.7 单链抗体基因的序列比对分析 |
| 4.1.8 单链抗体的表达 |
| 4.1.9 重组蛋白的纯化 |
| 4.1.10 重组蛋白的复性 |
| 4.1.11 蛋白浓度的测定 |
| 4.1.12 单链抗体活性检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 sc Fv/1N8 gene基因的扩增结果 |
| 4.2.2 sc Fv/1N8 gene基因的序列分析 |
| 4.2.3 sc Fv/1N8重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.4 sc Fv/1N8重组蛋白的活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 CDV单链抗体的研究 |
| 4.3.2 CDV单链抗体的构建方式 |
| 4.3.3 CDV不同蛋白单链抗体的未来展望 |
| 第五章 CDV 351NFGRSYFDP359表位疫苗研究 |
| 摘要 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 腺病毒表达载体和试剂 |
| 5.1.2 含目的基因(表位+VP2)的PCR扩增 |
| 5.1.3 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建 |
| 5.1.4 重组腺病毒载体菌内重组鉴定 |
| 5.1.5 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞 |
| 5.1.6 重组腺病毒滴度（TCID50）的滴定 |
| 5.1.7 重组腺病毒的形态学观察 |
| 5.1.8 重组腺病毒的PCR鉴定 |
| 5.1.9 重组腺病毒的WB鉴定 |
| 5.1.10 重组病毒免疫小鼠实验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 PCR扩增结果 |
| 5.2.2 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建结果 |
| 5.2.3 重组腺病毒的包装 |
| 5.2.4 重组病毒滴度（TCID50）的测定 |
| 5.2.5 重组腺病毒的电镜观察 |
| 5.2.6 重组腺病毒的VP2基因PCR结果 |
| 5.2.7 重组腺病毒的Western blot检测 |
| 5.2.8 重组腺病毒免疫小鼠后CPV抗体效价 |
| 5.2.9 重组腺病毒免疫小鼠后CDV抗体效价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 腺病毒载体的优势 |
| 5.3.2 CPV VP2基因的VLP特征 |
| 5.3.3 CDV表位疫苗 |
| 第六章 犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析 |
| 摘要 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、载体和试剂 |
| 6.1.2 CPV基因组提取方法 |
| 6.1.3 用于CPV毒株遗传进化分析的毒株信息 |
| 6.1.4 CPV PCR扩增 |
| 6.1.5 CPV特异性片段的PCR扩增与RFLP分析 |
| 6.1.6 CPV VP2基因的克隆 |
| 6.1.7 利用实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV病毒含量 |
| 6.1.8 犬细小病毒分离 |
| 6.1.9 犬细小病毒系统发育树的构建 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 样品中细小病毒的常规PCR鉴定 |
| 6.2.2 犬细小病毒RFLP分析 |
| 5.2.3 犬细小病毒病毒分离 |
| 6.2.4 犬细小病毒VP2基因的克隆 |
| 6.2.5 实时荧光定量PCR相对定量方法测定细小病毒载量 |
| 6.2.6 犬细小病毒VP2基因的序列分析 |
| 5.2.7 犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变 |
| 6.2.8 CPV VP2基因系统发育树分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 我国CPV流行趋势分析 |
| 6.3.2 VP2蛋白氨基酸变异分析 |
| 6.3.3 我国CPV免疫保护分析 |
| 6.3.4 CPV及其他犬科动物感染细小病毒联系 |
| 第六章 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗原表位概述 |
| 1.1.1 表位的分类 |
| 1.1.2 抗原的递呈过程 |
| 1.2 抗原表位的研究 |
| 1.2.1 表位疫苗的研究 |
| 1.2.2 表位的诊断研究 |
| 1.3 抗原表位的分析方法 |
| 1.3.1 B 细胞抗原表位的研究方法 |
| 1.3.2 T 细胞抗原表位的研究方法 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒概述 |
| 1.5 生物学特性 |
| 1.5.1 病原学及分类 |
| 1.5.2 DTMUV 的形态结构 |
| 1.5.3 TMUV 的基因组学研究进展 |
| 1.5.4 TMUV 的基因组编码蛋白 |
| 1.5.4.1 结构蛋白 |
| 1.5.4.2 非结构蛋白 |
| 1.6 分子免疫学及分子生物学诊断方法研究进展 |
| 1.6.1 病毒分离 |
| 1.6.2 分子诊断方法 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、细胞、动物 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DTMUV YY5 株 E 蛋白的可溶性表达与抗原性分析 |
| 2.2.1.1 引物 |
| 2.2.1.2 E 基因的扩增 |
| 2.2.1.3 PCR 产物的克隆与测序 |
| 2.2.1.4 连接产物转化 |
| 2.2.1.5 重组质粒 MBP-E 的构建 |
| 2.2.1.6 重组质粒的诱导表达和纯化 |
| 2.2.1.7 Western blot 检测融合蛋白多抗血清的免疫反应性 |
| 2.2.2 鸭坦布苏病毒 E 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.2.1 单克隆抗体制备技术路线 |
| 2.2.2.2 抗原制备 |
| 2.2.2.3 动物免疫 |
| 2.2.2.4 SP2/0 骨髓瘤细胞的复苏 |
| 2.2.2.5 免疫脾细胞的制备 |
| 2.2.2.6 饲养细胞的制备 |
| 2.2.2.7 细胞融合 |
| 2.2.2.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.2.2.9 间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清 |
| 2.2.2.10 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法） |
| 2.2.2.11 单克隆抗体的生产 |
| 2.2.2.12 单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）分析 |
| 2.2.2.13 单克隆抗体的 Western blot 鉴定 |
| 2.2.3 鸭坦布苏病毒 E 蛋白抗原表位的鉴定 |
| 2.2.3.1 短肽融合蛋白的设计 |
| 2.2.3.2 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达 |
| 2.2.3.3 抗原表位的初步鉴定 |
| 2.2.3.4 抗原表位的精确鉴定 |
| 2.2.3.5 抗原表位的印证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 E 蛋白的可溶性表达 |
| 3.1.1 E 基因的扩增 |
| 3.1.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.1.3 MBP-E 融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.1.4 重组蛋白的 Western Blot 分析 |
| 3.2 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞株的获得 |
| 3.2.2 间接免疫荧光（IFA）鉴定结果 |
| 3.2.3 Western blot 结果 |
| 3.3 E 蛋白抗原表位的鉴定 |
| 3.3.1 短肽融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 短肽蛋白的 Western blot 分析和 ELISA 分析 |
| 3.3.3 抗原表位示意图 |
| 3.3.4 抗原表位的印证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭坦布苏病毒 E 蛋白的可溶性表达 |
| 4.2 鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备 |
| 4.3 E 蛋白抗原表位的鉴定 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 作者简介及硕士期间发表论文情况 |
| 附录 |
（3）汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、汉坦病毒致病的多样性及其治疗现状 |
| 二、噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用 |
| 实验一 利用噬菌体展示技术筛选与汉坦病毒β3 整合素结合的高亲和力肽 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 实验二 噬菌体DNA 的序列测定及生物信息学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HFRS 及 HTNV 概述 |
| 二、HTV 诱导的免疫应答 |
| 1. HTV 诱导的体液免疫应答 |
| 2. HTV 诱导的细胞免疫应答 |
| 3. HTV 感染与固有免疫应答 |
| 三、B 细胞表位及研究方法 |
| 1. B 细胞表位研究方法 |
| 2. HTV 结构蛋白 B 细胞表位的研究 |
| 第一部分 HTNV 核蛋白线性 B 细胞表位的筛选和鉴定 |
| 实验一 PEPSCAN 法 HTNV 核蛋白 B 细胞表位作图 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 合成肽的溶解 |
| 2.2 间接 ELISA 检测患者血清抗 NP 合成肽的反应谱 |
| 2.3 间接 ELISA 检测单克隆抗体抗 NP 合成肽的反应谱 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HFRS 患者血清抗体与 HTNV NP 合成肽反应谱 |
| 3.2 PepScan 数据处理 |
| 3.3 HTNV 特异性单克隆抗体与 HTNV NP 合成肽的反应谱 |
| 4 讨论 |
| 实验二 竞争 ELISA 证明患者血清抗体与合成肽反应的特异性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 滴定实验 |
| 3.2 竞争 ELISA 预实验 |
| 3.3 竞争 ELISA 实验 |
| 4 讨论 |
| 实验三 HTNV 核蛋白抗原肽特异性血清 IgG 在急性期的动态变化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 终点滴定法确定 HFRS 患者血清抗原肽特异性 IgG 滴度 |
| 3.2 HFRS 患者不同时间点血清抗原肽特异性 IgG 变化 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 鼠源性 HTNV 中和抗体 3D8 识别线性 B 细胞表位 |
| 实验一 鼠源性中和抗体 3D8 识别 HTNV 糖蛋白线性 B 细胞表位的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 合成肽的溶解和分装 |
| 2.2 间接 ELISA 行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 2.3 竞争实验证明抗体-抗原肽结合的特异性 |
| 2.4 点杂交法行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 3 结果 |
| 3.1 PepScan 法筛选含有阳性 B 细胞表位的混合肽 |
| 3.2 PepScan 法筛选含有 B 细胞表位的单条肽 |
| 3.3 竞争实验进一步证实单克隆抗体结合单条肽的特异性 |
| 3.4 阳性反应肽临近肽与单克隆抗体的反应性 |
| 3.5 竞争 ELISA 证实单克隆抗体 3D8 与 G221 结合的特异性 |
| 3.6 硝酸纤维素（NC）膜包被混合肽行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 3.7 NC 膜包被单个 HTNV GP 合成肽行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 4 讨论 |
| 实验二 鼠源性中和抗体 3D8 识别 HTNV 糖蛋白线性 B 细胞表位的精细作图 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 iELISA 法检测单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 2.2 点杂交法观察单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 2.3 ECL-ELISA 法观察单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 丙氨酸扫描突变分析鼠源性中和抗体3D8识别的线性B细胞表位关键氨基酸残基 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 iELSA 法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 2.2 点杂交法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 2.3 ECL-ELISA 法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）日本脑炎病毒入胞机制及其靶向抑制分子的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 黄病毒囊膜蛋白与受体的研究进展 |
| 1 黄病毒囊膜蛋白的结构与功能 |
| 2 膜融合机制 |
| 3 黄病毒的受体研究现状 |
| 参考文献 |
| 第二章 以病毒入胞为靶点的抗病毒策略 |
| 1 抗病毒的靶点之一--病毒粘附蛋白与受体的结合 |
| 1.1 病毒粘附蛋白 |
| 1.2 受体与辅受体(receptors and co-receptors) |
| 1.3 病毒受体模拟分子 |
| 2 抗病毒的靶点之二--膜融合 |
| 3 抗病毒的靶点之三--病毒内化 |
| 4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 病毒受体的研究方法 |
| 1 根据已有知识推测受体 |
| 2 用细胞特异性单抗鉴定受体--单克隆抗体法 |
| 3 用抗独特型抗体模拟病毒鉴定受体--抗独特型抗体法 |
| 4 分子克隆 |
| 5 病毒覆盖蛋白结合试验 |
| 6 亲和层析法 |
| 7 筛选易感细胞CDNA文库鉴别病毒受体 |
| 7.1 利用病毒感染的特性筛选阳性克隆 |
| 7.2 在病毒基因中加入报告基因作为筛选标志 |
| 7.3 利用FACS分离获得易感性细胞 |
| 8 噬菌体表面展示技术 |
| 9 免疫共沉淀技术 |
| 10 GST PULL-DOWN方法 |
| 11 酵母双杂交技术 |
| 12 表面等离子共振技术 |
| 13 蛋白质芯片 |
| 14 荧光共振能量转移技术 |
| 15 二维电泳与质谱技术 |
| 16 多种病毒受体研究方法的联合使用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 日本脑炎病毒E蛋白受体结合域及其突变体的可溶性表达与多克隆抗体制备 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株和动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 EDⅢ及其突变体ΔEDⅢ原核表达载体的构建 |
| 1.5 重组表达载体pET-EDⅢ或pET-/ΔEDⅢ的诱导表达 |
| 1.6 重组蛋白的His-Bind螯合层析柱纯化 |
| 1.7 纯化的重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的SDS-PAGE分析 |
| 1.8 纯化重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的Western Blotting分析 |
| 1.9 纯化重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的透析和定量 |
| 1.10 鼠抗重组蛋白EDⅢ血清的制备与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体pET-EDⅢ或pET-ΔEDⅢ的酶切鉴定 |
| 2.2 测序结果 |
| 2.3 表达产物的可溶性分析及纯化效果的分析 |
| 2.4 纯化的重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的Westem Blotting分析 |
| 2.5 纯化重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的定量 |
| 2.6 鼠抗重组蛋白EDⅢ血清的Western Blotting分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 囊膜蛋白结构域Ⅲ及其保守的RGD基序在日本脑炎病毒入胞过程的作用分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 细胞毒性试验 |
| 1.4 细胞膜受体结合试验 |
| 1.5 黏附试验 |
| 1.6 阻断试验 |
| 1.7 噬斑减少试验 |
| 1.8 荧光定量PCR检测 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞毒性评价 |
| 2.2 细胞膜受体结合试验 |
| 2.3 黏附试验 |
| 2.4 EDⅢ、AEDⅢ或RGD和RGE阻断JEV结合BHK-21到细胞表面的差异分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 日本脑炎病毒囊膜蛋白特异性结合肽的筛选与鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 噬菌体的富集效应 |
| 2.2 噬菌体克隆与JEV囊膜蛋白(E)结合特异性测定 |
| 2.3 阳性噬菌体DNA序列分析 |
| 2.4 表面等离子体共振(SPR)技术测定噬菌体展示短肽对靶分子亲和力的结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽体内外抗病毒活性的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 细胞毒性试验 |
| 1.4 体外抑制试验 |
| 1.5 噬斑减少试验 |
| 1.6 荧光定量PCR检测 |
| 1.7 体内试验 |
| 1.8 病理组织切片制作及HE染色 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞毒性评价 |
| 2.2 六种囊膜蛋白结合肽体外抑制JEV感染BHK-21细胞 |
| 2.3 囊膜蛋白结合肽P1在BHK-21、PK15和Vero细胞上抑制JEV感染 |
| 2.4 体内试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstraet |
| 第八章 日本脑炎病毒在PK15细胞上膜受体的鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞和抗体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 病毒纯化 |
| 1.4 细胞膜蛋白制备 |
| 1.5 VOPBA |
| 1.6 western blot分析膜蛋白与抗HSC70的结合 |
| 1.7 抗体阻断试验 |
| 1.8 间接免疫荧光试验(IFA)和激光扫描共聚焦显微镜((Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)观察 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 制备细胞膜蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.2 VOPBA鉴定在PK15、Vero和BHK-21细胞上的JEV结合蛋白 |
| 2.3 western blot分析膜蛋白与抗HSC70的结合 |
| 2.4 抗HSC 70抗体阻断JEV与PK15、Vero和BHK-21细胞的结合 |
| 2.5 激光扫描共聚焦显微镜((Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）应用噬菌体肽文库筛选HFRSV优势B细胞结合表位肽（论文提纲范文）
| 1、摘要 |
| 2、ABSTRACT |
| 3、论文正文 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 4、参考文献 |
| 5、附录 |
| 6、成果 |
| 1.1 论着 |
| 1.2 综述 |
| 7、致谢 |
（7）噬菌体展示短肽亲和配基的筛选及其亲和色谱的研究（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 亲和色谱简介 |
| 1.3 亲和色谱吸附剂常用基质 |
| 1.4 亲和配基的发展 |
| 1.5 噬菌体展示技术 |
| 1.5.1 丝状噬菌体的形态结构 |
| 1.5.2 丝状噬菌体的生活周期 |
| 1.5.3 噬菌体展示技术的基本原理和表达系统 |
| 1.5.4 噬菌体随机展示库的构建 |
| 1.5.5 噬菌体随机展示库的筛选方法 |
| 1.5.6 噬菌体展示技术的特点 |
| 1.5.7 噬菌体展示库技术的应用 |
| 1.5.8 噬菌体展示技术的局限 |
| 1.6 本文的研究目的和内容 |
| 第二章 噬菌体展示肽库筛选方法的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与设备 |
| 2.2.2 主要溶液和培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 宿主ER2738菌株的保藏与活化 |
| 2.3.2 宿主ER2738菌株生长曲线的绘制 |
| 2.3.3 宿主菌株对数生长期A600与其活菌含量关系曲线的绘制 |
| 2.3.4 噬菌体滴度测定 |
| 2.3.5 噬菌体的扩增 |
| 2.3.6 甘氨酸缓冲液反复洗脱对噬菌体活性影响的测定 |
| 2.3.7 交替洗脱法筛选七肽文库 |
| 2.3.8 酶联免疫分析法(ELISA) |
| 2.3.9 噬菌体亲合率的检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 宿主ER2738菌株的生长曲线 |
| 2.4.2 宿主菌株对数生长期A600与其活菌含量关系曲线 |
| 2.4.3 M13丝状噬菌体的扩增条件 |
| 2.4.4 反复酸洗对噬菌体感染能力的影响 |
| 2.4.5 交替洗脱法筛选七肽文库的结果 |
| 2.4.6 交替洗脱法与其它方法筛选结果的比较 |
| 2.4.7 各轮噬菌体的亲和率比较 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 从七肽噬菌体库中筛选几种蛋白质的亲和配基 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与设备 |
| 3.2.2 主要溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 噬菌体滴度测定 |
| 3.3.2 噬菌体的扩增 |
| 3.3.3 交替洗脱法筛选七肽文库 |
| 3.3.4 单克隆噬菌体的制备 |
| 3.3.5 酶联免疫分析法(ELISA) |
| 3.3.6 噬菌体DNA的提取 |
| 3.3.7 琼脂糖凝胶电泳原理及检测方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同目标蛋白对七肽文库的筛选结果 |
| 3.4.2 亲和性噬菌体DNA的提取及测序结果 |
| 3.4.3 噬菌体展示肽与三种目标蛋白质亲和吸附机制的探讨 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 胰岛素在肽配基亲和柱上吸附机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与设备 |
| 4.2.2 主要溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肽配基的合成 |
| 4.3.2 肽配基的固定和亲和柱的制备 |
| 4.3.3 溶液中肽含量的检测 |
| 4.3.4 亲和色谱操作条件 |
| 4.3.5 亲和柱的再生 |
| 4.3.6 亲和柱的保存 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 肽配基的固定效果 |
| 4.4.2 亲和柱对不同蛋白质的亲和吸附能力 |
| 4.4.3 胰岛素与肽配基之间亲和机制的研究 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 应用肽配基亲和柱纯化胰岛素 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验方法与设备 |
| 5.2.1 实验材料与设备 |
| 5.2.2 主要溶液 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 穿透实验 |
| 5.3.2 猪胰岛素提取 |
| 5.3.3 蛋白含量测定 |
| 5.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 5.3.5 猪胰岛素的分离纯化操作步骤 |
| 5.3.6 胰岛素含量的检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 流速对蛋白吸附的影响 |
| 5.4.2 动态等温吸附线的绘制 |
| 5.4.3 混和蛋白样品的分离 |
| 5.4.4 猪胰岛素的纯化 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 应用肽配基亲和柱纯化溶菌酶 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料与设备 |
| 6.2.1 实验材料与设备 |
| 6.2.2 主要溶液 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 卵清蛋白溶液的制备 |
| 6.3.2 蛋白含量测定 |
| 6.3.3 溶菌酶活性测定 |
| 6.3.4 丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 6.3.5 溶菌酶的分离纯化操作步骤 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 溶菌酶的纯化 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 建议与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的研究成果 |
| 致 谢 |
（8）抗汉坦病毒单克隆抗体可变区基因分析及其噬菌体配体肽的筛选和鉴定（论文提纲范文）
| 英文缩写说明 |
| 氨基酸缩写 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 |
| 第一章 抗汉坦病毒McAbH7、F3和B11可变区基因克隆和序列分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 应用噬菌体肽文库筛选McAbF3、B11特异性结合肽 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 噬菌体模拟表位肽免疫学特性初步分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述一 噬菌体表面展示技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 汉坦病毒表位生物学研究进展 |
| 参考文献 |
| 学习期间发表的学术论文及获奖情况 |
四、汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定（论文参考文献）
- [1]犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析[D]. 易立. 中国农业科学院, 2015(03)
- [2]鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定[D]. 张琳. 山东农业大学, 2013(05)
- [3]汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定[D]. 杨栋强. 第四军医大学, 2012(02)
- [4]汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定[D]. 闫果林. 第四军医大学, 2011(05)
- [5]日本脑炎病毒入胞机制及其靶向抑制分子的研究[D]. 魏建超. 南京农业大学, 2010(05)
- [6]应用噬菌体肽文库筛选HFRSV优势B细胞结合表位肽[D]. 王倩. 南方医科大学, 2008(06)
- [7]噬菌体展示短肽亲和配基的筛选及其亲和色谱的研究[D]. 俞海青. 天津大学, 2004(04)
- [8]抗汉坦病毒单克隆抗体可变区基因分析及其噬菌体配体肽的筛选和鉴定[D]. 王长军. 第三军医大学, 2003(02)
- [9]汉坦病毒核衣壳蛋白mAb B11模拟结合肽的筛选和鉴定[J]. 王长军,王登高,唐家琪,余争平,陶开华,郭恒彬,潘秀珍. 第三军医大学学报, 2002(12)