一、转基因动物检测方法的比较研究（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中研究说明近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
王玉梅[2]（2020）在《耐高温家蚕的制备及转基因家蚕的安全性评价》文中认为家蚕（Bombyx mori）是一种具有重要经济价值的泌丝昆虫,属于变温动物,最适生长温度为25℃。在养蚕业中,低温引起家蚕生长缓慢,高温导致蚕病的发生,降低蚕茧产量及茧丝质量。本实验室前期研究发现,Bmhsp19.9在高温和低温处理后的家蚕中都被诱导上调表达,推测其可能有助于家蚕对极端温度的耐受性。本研究制备了增量表达Bmhsp19.9的转基因家蚕并对其极端温度耐受能力进行了检测,进而评估了转基因家蚕的安全性,包括基因漂移风险和毒理学试验。主要获得以下的研究结果:1.增量表达Bmhsp19.9提高转基因家蚕对极端温度的耐受性温度胁迫会破坏生物细胞中的蛋白质稳态,小热激蛋白（s Hsps）在维持蛋白质稳态和保护细胞免受各种不利条件的影响中发挥着至关重要的作用。本研究首先通过RT-PCR和q PCR分析了Bmhsp19.9的表达模式;然后克隆了Bmhsp19.9的启动子hsp19.9P1和hsp19.9P2,q PCR和western blot结果显示,序列较长的启动子hsp19.9P1的活性比hsp19.9P2更高。增量表达Bmhsp19.9保护了Bm E细胞在高温胁迫下的活力;进而构建了由hsp19.9P1介导的Bmhsp19.9转基因增量表达载体pb-H19.9,通过显微注射P50家蚕胚胎获得了两个转基因品系H19.9A和H19.9B。q PCR和western blot显示转基因家蚕中Bmhsp19.9的表达量高于对照;与非转基因对照P50相比,在35℃高温处理49 h后,转基因品系的死亡率降低40%左右;当P50和H19.9A在13℃条件下饲养时,H19.9A的生长速率更快,其存活率和存活幼虫体重显着高于P50。这些结果表明,增量表达Bmhsp19.9提高了转基因家蚕对极端温度的耐受性。2.评估转基因DNA从家蚕转移到肉鸡的潜在可能性为了评估转基因DNA从家蚕转移到其他生物的潜在可能性,将100只孵化1天的雄性肉鸡平均分为4个组（T1-T4）。T1-T3组分别饲喂插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）DNA的转基因家蚕P3+5UI、插入了超氧化物歧化酶（SOR）DNA的转基因家蚕A4SOR和正常家蚕DZ,每只鸡每天饲喂一头家蚕幼虫,连续饲喂3周;T4为正常饮食对照。在第22日龄时,从每个处理组中随机挑选二十只鸡处死,收集血液进行血清生化检查,结果表明T4和T1-T3之间的血清参数没有明显差异。提取十二指肠、空肠、回肠、肝脏、肾脏和空肠消化物的DNA,利用EGFP、SOR、家蚕看家基因TIF-4A和鸡卵清蛋白基因OV特异引物进行PCR扩增,未在鸡的消化物和组织中检测到转基因DNA或家蚕TIF-4A。进一步增加转基因家蚕的添食数量和频率,在肉鸡中也观察到了相同的结果。这些结果表明来自家蚕的转基因DNA在鸡的消化道中被降解且没有转移到其他组织中。3.转基因家蚕的28天经口毒性试验将Sprague-Dawley大鼠分为4组（T1-T4）。T1-T3组分别饲喂耐高温转基因家蚕H19.9A、耐高温转基因家蚕A4SOR以及非转基因家蚕P50。以3.0 g/kg/day的剂量给每只大鼠经口饲喂干蚕蛹,连续饲喂28天。T4为正常饮食对照组。每周对各组大鼠进行体重的称量以及饲料消耗量的检测,在28天后收集血液进行血液生理和血清生化的检测,并解剖大鼠的主要器官进行称重,计算脏器指数;同时,对大鼠的主要脏器进行组织切片观察。结果显示,在雌鼠的各组之间以及雄鼠的各组之间每周平均体重无显着差异。雄鼠的各组之间每周饲料消耗量无显着差异;雌鼠中,在第二周T1显着低于T4,但与T3无差异,因此差异与饲喂转基因蚕蛹处理无关。在所测的16项大鼠血液指标中:雌鼠的MPV、HGB、HCT在各组之间有差异,雄鼠的HCT在各组之间有差异;在所测的12项大鼠血清生化指标中:雌鼠的ALT、AST、TRIG在各组之间有差异,雄鼠的CHOL、P在各组之间有差异,但由于在转基因蚕蛹组中这些指标没有同时与两个对照组都存在差异,这些差异均与饲喂转基因蚕蛹处理无关。在脏器指数结果中,雌鼠的肝脏、肾上腺、子宫在各组之间有差异,雄鼠的肾上腺、睾丸在各组之间有差异,但由于在转基因蚕蛹组中这些指标没有同时与两个对照组都存在差异,这些差异与饲喂转基因蚕蛹处理无关。组织病理学检查结果中,各组大鼠的脏器组织结构未见明显差异,未发现由转基因蚕蛹处理所导致的大鼠脏器组织病理学改变。在28天经口毒性试验中,没有发现转基因蚕蛹对大鼠生长发育不利的影响,表明转基因家蚕在毒理学上与正常家蚕没有区别。
汤飞[3]（2019）在《fat1和fat2融合表达转基因猪与共表达转基因小鼠的制备及研究》文中指出多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是一类含多个不饱和键的长链脂肪酸的统称,可依据多不饱和键个数及位置分为n-3 PUFAs和n-6 PUFAs等类别。它具有促进哺乳动物神经发育和胎儿生长,防治心血管疾病的发生等功能。多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸,必须从食物中摄取。由于猪肉是我国居民最主要的肉类消费品,提高其中PUFAs含量,对提高人们健康水平具有重要意义。为解决猪肉中n-3和n-6 PUFAs含量不足的问题,本研究获得控制PUFAs合成的两个必需酶基因,Δ12脂肪酸去饱和酶基因（fat2）和Δ15脂肪酸去饱和酶基因（fat1）,通过转基因技术初步制备fat1-fat2基因融合表达的转基因猪,并制备fat2-2A-fat1基因共表达的转基因小鼠模型。通过检测发现这两个动物模型肌肉、脂肪等组织中n-3和n-6PUFAs含量都得到了提高,为生产自身合成多不饱和脂肪酸的转基因动物研究提供基础研究。1.融合表达fat1-fat2转基因猪制备及检测我们使用本实验室前期已构建的p CAG-fat1-fat2融合表达质粒,通过脂质体介导稳定转染至猪胎儿成纤维细胞,利用体细胞核移植技术,获得fat1和fat2基因融合表达的转基因猪。本研究共获得5头在3日龄及120日龄均稳定表达fat1-fat2融合基因的转基因猪,利用实时荧光定量PCR证实fat1-fat2融合基因在肌肉组织中高效表达。转基因猪肌肉、皮肤、脂肪组织中PUFAs含量得到提高,其中3日龄转基因猪肌肉组织中n-3 PUFAs总量增加90.34%,n-6 PUFAs总量增加32.64%;120日龄转基因猪肌肉、脂肪、皮肤组织中n-3 PUFAs总量分别增加41.84%（p<0.01）、25.23%（p<0.01）、22.90%（p=0.05）,n-6 PUFAs总量分别降低25.01%（p<0.05）、24.32%（p<0.01）、36.17%（p=0.01）。同时我们发现转基因猪体内组织中SREBP1c、FAS、NFκB基因表达下调;三种组织中PPARα、ELOVL2、ELOVL5基因的表达上调。LXRα基因在三种组织中的表达并未检测到明显变化。2.fat2和fat1共表达质粒的构建及在细胞中的表达和功能验证为进一步提高fat1和fat2基因表达效率,采用重叠延伸PCR技术,利用2A序列构建了实现双基因自我剪切、共表达的fat2-2A-fat1片段;并构建p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP共表达质粒。将共表达质粒以脂质体介导瞬时转染至PK15细胞48小时后,细胞能高效表达fa2-2A-fat1;细胞内n-3 PUFAs总量增加30.7%（P=0.05）,n-6 PUFAs总量减少34.74%。3.共表达fat2和fat1的转基因小鼠制备与检测将试验2中构建的共表达双基因质粒经显微注射制备转基因小鼠,最终获得6只F0代阳性小鼠。其中606号小鼠经PCR、Southern blot、m RNA表达量检测和肌肉组织PUFAs含量的检测显示其fat2-2A-fat1基因表达量最高;以此为父本,共繁育出11只F1代阳性小鼠,26只F2代阳性小鼠。通过检测PUFAs含量发现,F0代转基因小鼠肌肉组织中n-6 PUFAs含量较对照组增加30.61%（p<0.01）,n-3 PUFAs总量增加6.87%;脂肪组织中n-6 PUFAs含量降低29.47%（p<0.01）,n-3 PUFAs总量降低29.20%（p<0.01）;皮肤组织中n-6 PUFAs总量升高8.39%,n-3 PUFAs总量下降33.10%。F1代雄性转基因小鼠肌肉组织中n-6PUFAs总量比对照组增加4.31%,n-3 PUFAs总量增加9.47%;雌性小鼠中n-3 PUFAs总量增加16.34%,n-6 PUFAs总量增加22.64%。脂肪组织中雄性小鼠n-3 PUFAs总量增加7.21%,n-6 PUFAs总量增加6.50%;雌性小鼠n-6 PUFAs总量增加16.50%,n-3PUFAs总量减少5.93%。推测转基因小鼠fat2和fat1基因共表达水平及PUFAs含量存在组织和性别上的差异转基因小鼠体内FAS、SREBP1c和LXRα基因在部分组织中表达下调;PPARα、ELOVL2、ELOVL5基因在三种组织中均表达上调;但NFκB基因在三种组织中表达量无显着变化。结论:本研究成功制备fat1和fat2双基因融合表达的转基因猪与共表达转基因小鼠,两种转基因动物体内均能高效表达fat1和fat2基因,显着提高体内PUFAs的含量,为未来培育富含多不饱和脂肪酸的转基因家畜新品种提供基础。
李晓琳,吴绍强,刘晓飞,王勤,景宏丽,仇松寅,林祥梅[4]（2019）在《转基因动物及其产品的主要管理制度》文中研究表明转基因三文鱼被美国FDA批准上市,成为世界上首个获批可直接食用的转基因动物食品,开启了转基因动物商品化的大门。为对转基因动物及其产品进行有效的监管,世界各国均在不同程度上制订了管理制度,其中主要包括安全性评价制度和转基因成分标识管理制度。文中对猪、牛、羊等转基因动物的研发现状和转基因动物的检测技术进行了阐述,对世界主要国家/地区的转基因动物及其食品安全性评价制度和转基因成分标识制度的发展现状进行了综述,最后对转基因动物及其产品的发展做出了展望。
毛琳[5]（2016）在《ULK1转基因小鼠的构建及初步鉴定》文中研究说明前列腺癌（PCa）是西方国家男性最常见的恶性肿瘤之一。前列腺癌是一种老年病,但近年来其在年轻男性中的发病率呈上升趋势。在中国,随着老龄化的不断加深和饮食习惯的改变,前列腺癌的发病率也在逐年增高。雄激素阻断法是常用的前列腺癌治疗方法,但随着治疗时间的延长容易发展为对雄激素不敏感的去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。自噬是进化中保守的物质细胞内分解过程,在细胞的存活和发育等过程中起着重要作用。肿瘤中自噬是一把双刃剑,可以抑制肿瘤,或为癌细胞提供能量。ULK1是一个丝氨酸/苏氨酸激酶,对饥饿引起的自噬诱导过程至关重要。通过研究ULK1在前列腺癌的发生和发展过程中的作用可以从自噬的角度探究前列腺癌的机制。模式动物现已成为生物研究的重要工具。前列腺癌小鼠模型已经在癌症机制研究和抗癌药物筛选中得到了广泛应用。传统的前列腺癌鼠模是将从原发癌或转移瘤中分离出的癌细胞或组织移植到小鼠体内得到的。随着基因工程的发展,现在可以通过人为改变小鼠的基因组而得到转基因小鼠,使我们对癌症相关的特定基因或通路的研究成为可能。本研究运用分子生物学技术构建了ULK1基因的转基因载体,获得转基因小鼠后通过与PB-Cre小鼠配种繁育出了ULK1;PB-Cre转基因小鼠,用来研究ULK1基因对前列腺癌的发生的作用。首先,通过PCR技术和免疫组化（IHC）技术证明ULK1基因被成功转入小鼠体内,转基因小鼠构建成功,然后通过H&E染色法对转基因小鼠和其同窝对照小鼠的前列腺组织进进行观察分析。实验结果表明,ULK1基因在3M时对前列腺癌的发生仍无明显作用。为了探索ULK1基因在前列腺癌发展过程中的作用,构建了ULK1;Ptenf/f;PB-Cre转基因小鼠。分别取4-5M、5-6M的转基因小鼠和等大的Ptenf/f;PB-Cre小鼠前列腺组织进行H&E染色观察比较其组织形态。通过染色结果可以看出,随着年龄的增长,组织由增生状态经过low-grade PIN阶段向high-grade PIN发展,与前列腺癌的发展规律相符。相同年龄组中,ULK1;Ptenf/f;PB-Cre小鼠组织整体发展速度均高于Ptenf/f;PB-Cre小鼠。由此可以初步判断ULK1基因具有促进前列腺癌发展的作用。综上所述,ULK1基因在一定程度上推动了前列腺癌的发展进程,提示ULK1基因可以作为潜在的前列腺癌治疗靶点,通过分子手段对前列腺癌的发展进行有效的控制。
鲍泽坤[6]（2016）在《转生长激素基因奶山羊安全性评价》文中进行了进一步梳理近些年,转基因技术发生了迅猛的发展,为了快速提高经济动物的生产性能,科学家们制备了越来越多的转基因动物。通过转入外源基因改变生产性能的转基因动物是否会对生态环境和人类健康造成威胁,这一问题在科学界和社会上一直存在这比较大的争议。因此,全方位多角度的对未上市的转基因动物进行安全性评价,对人类社会的和谐发展以及生态环境的稳定具有重要的意义。本实验室前期通过体细胞核移植技术,成功的制备了提高奶产量的转生长激素（growth hormone,GH）基因奶山羊。本试验以转GH基因奶山羊为研究目标,从自身安全、环境安全和食品安全角度来评价其安全性。首先,通过高通量转录组测序技术比较泌乳期的转GH基因奶山羊和非转基因奶山羊乳腺的基因表达水平,来评价转GH基因奶山羊的自身安全性;然后,采集转GH基因奶山羊的粪便和肠道内容物以及转基因羊场内环境土壤为样本,检测样品中样品基因组中外源基因GH和neo的漂移情况,进而通过PCR-DGGE方法分析样品中菌群结构,进行转GH基因奶山羊的环境安全性评价;最后,通过饲喂SD大鼠来评价转GH基因羊奶的食品安全性,主要检测了转GH基因羊奶对SD大鼠的生长发育、免疫水平以及行为状态的影响。主要试验分为以下四个阶段:1转GH基因奶山羊泌乳期乳腺基因表达水平的变化转基因动物的安全性评价体系中,对转基因动物自身安全的评价是重要的一环,这关系到转基因动物制备成功与否的关键。转GH基因奶山羊转入的是乳腺特异性表达的山羊生长激素基因,因此转基因山羊乳腺发育的变化是否会对动物体的健康造成隐患,需要进一步的研究。本试验通过转录组测序方法,比较转GH基因奶山羊泌乳期乳腺组织基因水平与非转基因奶山羊的差别。并选择15个与生长激素影响乳腺发育相关的基因,通过qRT-PCR方法进一步验证。结果表明,转GH基因奶山羊乳腺中过表达的生长激素虽然能够促进乳腺细胞的过量增殖,但是动物机体通过自身的调节可以将乳腺的增殖保持在健康水平,证明了转GH基因奶山羊能够健康的生长发育。2转GH基因奶山羊外源基因漂移检测在评价转基因动物安全性的过程中,环境安全性评价是必不可少的一环,而外源基因漂移的检测又是环境安全性评价的重中之重。本部分试验的研究目的是通过PCR扩增反应对转GH基因奶山羊的肠道内容物、粪便和环境土壤中细菌基因组进行检测,以确定是否发生基因漂移事件。首先,分别采集转生长激素奶山羊和非转基因奶山羊的肠道内容物和粪便以及羊场内部和附近的土壤作为样品,然后利用商业化的基因组提取试剂盒提取样品中存在的细菌基因组,在针对制备转GH基因奶山羊的载体设计检测引物,最后通过PCR扩增反应验证样品基因组中是否存在外源基因。检测的结果显示,转GH基因奶山羊的肠道内容物样品、粪便样品以及环境土壤样品中的细菌基因组均未检测到外源的山羊生长激素基因以及neo基因。这些结果证明了,转GH基因奶山羊外源基因整合状态稳定,没有发生基因漂移事件。3转GH基因奶山羊对环境菌群结构的影响转基因动物在养殖生产阶段是否会对周围环境物种造成影响一直是社会和科学界关注的焦点,而评价周围环境菌群结构是转基因动物环境安全性评价的重要指标。本研究的目的是评价转GH基因奶山羊对周围环境菌群结构的影响。首先通过PCR扩增方法得到转GH基因奶山羊的粪便、肠道内容物和环境土壤样品中细菌基因组的16srDNA基因V3区域片段;然后通过PCR-DGGE方法将不同序列的DNA片段分离,并将分离出来的条带进行回收纯化;最后将回收的DNA片段进行测序,并提交到GenBank数据库进行Blast比对,得到细菌种属信息。PCR-DGGE电泳相似性数据分析表明,各类样品的相似度在95%以上;各样品的菌群种属统计数据显示,各样品的优势菌群相同,整体菌群机构分布趋势一致。这些结果表明,转GH基因奶山羊的存在,对其生存空间存在的微生物菌群结构并没有造成显着性的差异。从环境安全性方面考虑,转GH基因奶山羊并没有展现出破坏环境中生物多样性的特性。4转GH基因羊奶食品安全性评价在评价转基因动物安全性时,转基因动物产生的食品同样要进行安全性评价。因此,本试验通过饲喂动物试验来评价转GH基因奶山羊产出的羊奶的食品安全性。本试验将60只大鼠分成三组,分别饲喂转GH基因羊奶、正常羊奶以及生理盐水,饲喂周期为90天。饲喂期间每天观察记录大鼠的生活习性,并定期称量体重;采集各组大鼠的血液样品进行血常规检测和血清生化检测;用ELISA试剂盒检测血清中免疫相关指标IL-2、IgG、IgE和IFN-γ的水平;90天后对大鼠进行剖检,对主要脏器进行称重以及组织病理切片观察。各项检测结果显示,转GH基因羊奶对大鼠生长发育情况的影响与正常羊奶没有差异,在一定程度上证明了转GH基因羊奶的食品安全性。
桓聪聪[7]（2015）在《关岭牛MyoD I基因组织特异性启动子的筛选和功能研究》文中研究说明MyoD I（MyoGenic differentiation I）基因是成肌调节因子（Myogenic regulatory factors,MRFs）家族的成员之一,于1987年被首次克隆,该基因是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因（gene）。现已知牛的MyoD I位于15号染色体,总长度2648 bp,有3个外显子。MyoD I基因在肌肉特异基因转录调控过程中起总开关作用,与肌球蛋白、结蛋白、肌细胞生成素等基因的启动子区结合可发挥调控作用,促使它们转录作用的激活（YoshikaAkizawa.,2013;Blum R.,2013）。随着基因工程研究的深入,启动子（promoters）作为基因表达调控的重要元件,对实现外源基因在转基因生物中的高效表达具有重要意义。目前,启动子应用研究所面临的主要问题是如何筛选活性较高的组织特异性启动子,使外源基因在机体中高效稳定表达的同时又具备严格的时空特异性,以克服在动物基因工程中可利用的组织特异性启动子数目不足及调控能力较弱的缺陷。常规育种技术在实现杂种优势利用及优良品种培育方面取得了巨大的成就,但其选择周期长、遗传进展慢等问题一直是培育突破性新品种的“技术瓶颈”。利用转基因技术育种可将外源基因直接导入动物品种中,打破不同生物物种间的界限,能够大幅度缩断世代间隔,有利于培育出新品种。转基因育种可以充分利用所有可能的遗传变异,从而极大地提高遗传改良的幅度和速度,同时还可根据人们的需求创造出一些新型的产品。本试验以关岭牛的MyoD I基因为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）、分子克隆、细胞转染、原核显微注射等技术对MyoD I基因组织特异性以及MyoD I基因启动子的活性及功能进行了研究。研究结果如下:1.MyoDI基因在关岭牛不同组织表达量的差异及在肌肉发育过程中表达情况的研究。采用实时荧光定量PCR技术对18月龄关岭牛背最长肌、大腿肌、心、肝脏、脂肪、小肠六个组织的MyoD I基因相对表达量进行检测。同时分析关岭牛胎儿、18月龄、30月龄时期背最长肌组织中MyoD I基因的表达规律。结果显示:MyoD I基因在背最长肌中表达量最高;在出生后的关岭牛肌肉组织中也具有比较高的表达量,且随着出生时间的推移呈上升趋势。推测可能由于背最长肌是肌肉富集地方因此基因表达量较高,随着年龄增大,肌肉丰满度增加,基因表达量也随着增加。2.探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性,初步确定该基因活性较强启动子位置。以关岭牛血液DNA为模板,设计5’端加磷的引物,PCR扩增获得的4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子,定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区,构建重组载体pEGFP-N3-MyoD I。通过脂质体法将重组质粒瞬时转染到小鼠C2C12细胞,依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示:本试验成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I;4个启动子均具有启动活性,其中P3启动子在小鼠C2C12细胞中启动活性最高,初步推断P3启动子为该基因活性较强启动子。3.研究MyoD I基因启动子在小鼠体内的表达情况。本研究通过原核显微注射的方法获得发绿色荧光的转基因小鼠胚胎,为本试验室建立转基因小鼠技术平台提供技术支持。
任晓叶[8]（2014）在《转基因动物乳汁中高效、稳定表达人FVⅢ的研究》文中研究说明人凝血因子VⅢ（hFVⅢ）是一种重要的凝血蛋白,它的缺失或缺乏会导致血友病A。目前血友病A的治疗方法主要是注射给病人重组凝血因子VⅢ蛋白或来源于血浆的VⅢ因子浓缩产品。但目前这些方法存在病毒污染、产量低、价格昂贵等风险,近年来动物乳腺生物反应器以其产量高、成本低、生物活性高的优势成为一种新型的生物制药模式,本工作目的为研制用于动物乳腺生物反应器生产hFVⅢ的高效表达载体,并在细胞和小鼠水平上分别进行其体外、体内表达系统的研究。在本文的第一部分,我们分别构建了由巨细胞病毒（CMV）、山羊β-酪蛋白调控序列（P1A3）和小鼠血清白蛋白调控序列（Palb）为启动子驱动的表达全长hFVⅢ和B区缺失（删除了编码760aa-1639aa的核苷酸序列）hFVⅢBDD cDNA的六种真核载体。转染细胞实验结果显示,六种载体在转录水平均有hFVⅢ的表达。将所构建的载体瞬时注射哺乳期的小鼠乳腺,ELISA检测结果显示,CMV-hFVⅢ和P1A3-hFVⅢ质粒转染后的小鼠乳汁中hFVⅢ的最高含量分别为2.01±0.23和1.20±0.21μg/mL,Palb-hFVⅢ和Palb-hFVⅢBDD转染后在小鼠乳汁中检测不到表达。CMV-hFVⅢBDD和P1A3-hFVⅢBDD质粒的表达情况与全长hFVⅢ相符,且瞬时转染小鼠乳腺后在乳汁中的最高表达量分别为2.81±0.31和1.82±0.25μg/mL,均高于同种启动子之全长hFVⅢ的表达量。本文第二部分的研究内容为,分别将CMV、P1A3和Palb启动子连接的hFVⅢ及hFVⅢBDD片段构建的六种载体,分别通过显微注射制备转基因小鼠,应用RT-PCR、real time PCR、ELISA、IHC和Western blot等方法检测各载体在小鼠各脏器中的hFVⅢ的表达及分布。结果显示,CMV-hFVⅢ（hFVⅢBDD）在转基因小鼠的各个脏器中均有hFVⅢ表达,而Palb-hFVⅢ（hFVⅢBDD）和P1A3-hFVⅢ（hFVⅢBDD）分别在肝脏和乳腺中特异表达hFVⅢ。且P1A3-hFVⅢ和P1A3-hFVⅢBDD转基因小鼠乳汁中hFVⅢ平均浓度分别为1.16±0.80μg/mL和2.45±0.80μg/mL,其相应的平均活性分别为337±118m U/mL和662±114mU/mL。各种转基因小鼠与野生型小鼠相比,没有不良的生理异常如呼吸困难,不育或哺乳障碍等。由于P1A3启动子的hFVⅢBDD载体具有乳腺组织特异表达的特点,且能高效表达有活性的重组hFVⅢ,因此更适用于乳腺生物反应器的研制。在本文的第三部分,重点开展了利用血管性血友病因子（vWF）在hFVⅢ转基因小鼠的乳汁中共表达来提高hFVⅢ稳定性的研究。我们构建了vWF与hFVⅢ的共表达载体P1A3-hFVⅢBDD-IRES-vWF,并制备其相应的共表达转基因小鼠,在不同储存条件和不同时间点分别检测转基因小鼠乳汁中的hFVⅢ发现,其hFVⅢ活性在体外降解到一半的时间(Td1/2v)分别是77.21 h（4oC）,32.45h（室温）和7.40 h（37oC）;明显的高于P1A3-hFVⅢBDD小鼠的时间43.82 h（4oC）,19.67 h（常温）和3.44 h（37oC）,相同条件下的两组数值之间有统计学差异（P<0.05）。同时我们也利用CMV-vWF载体生产转基因小鼠,获得的CMV-vWF转基因小鼠与P1A3-h FVⅢBDD转基因小鼠杂交获得P1A3-h FVⅢBDD/CMV-v WF双重杂合子小鼠。检测双重杂合子转基因小鼠乳汁中hFVⅢ的活性,结果显示不同条件下hFVⅢ活性的Td1/2v值与P1A3-h FVⅢBDD-IRES-vWF共表达转基因小鼠的时间相似,两者间数值无统计学差异。综上结果显示,在转基因小鼠乳汁中vWF的共表达能对凝血因子VⅢ起到明显的稳定作用。鉴于双重杂合子的制备耗时耗力,且传代过程中性状会发生分离等特点,P1A3-h FVⅢBDD-IRES-vWF共表达载体更适用于转基因动物乳腺生物反应器的研制。本研究结果表明,（1）P1A3启动子能启动hFVⅢ在小鼠乳腺组织特异表达;（2）P1A3引导的hFVⅢ（hFVⅢBDD）基因在转基因小鼠乳汁中能表达有凝血活性的hFVⅢ,且B区缺失的hFVⅢBDD载体在转基因小鼠乳汁中的hFVⅢ蛋白表达量高于全长的hFVⅢ载体;（3）在hFVⅢ转基因小鼠乳汁中共表达的vWF可以明显增加hFVⅢ的稳定性。
余乾[9]（2014）在《转eGFP基因小鼠环境释放安全性评价研究》文中指出转基因动物产品在逐渐进入人们的生活,人们对转基因动物的安全性也日益关注。目前转基因动物安全性评价策略与方法主要从三个方面入手：转基因动物自身的安全性评价、转基因动物产品安全性评价和转基因动物对环境的安全性评价,转基因动物对环境方面的安全评价近乎空白。本文以转eGFP基因（enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白）小鼠为研究对象,主要进行了：（1）用单线法对其进行传代,获得转eGFP基因小鼠及其后代共94只,其中F0代6只,F1代8只,F2代19只,F3代22只,F4代39只,用PCR法和荧光蛋白观察法分别对这些小鼠进行检测,分析转基因动物在传代过程中外源基因的表达情况;（2）用半荧光定量PCR技术（real-time quantitative PCR）对小鼠外源基因在传代过程中的表达情况进行定量检测：（3）分别检测全同胞转基因阴性（对照组）和阳性小鼠个体4周龄和8周龄的肠道微生物的菌群结构,利用PCR法检测转基因小鼠的eGFP基因和WRPE原件,分析转基因小鼠肠道微生物是否发生基因漂移现象,用选择性培养基对肠道微生物中11种菌群（包括总需氧细菌、沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌、总厌氧细菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌、类杆菌、链球菌）进行分离培养,活菌计数,分析转基因小鼠菌群结构是否发生变化；（4）最后,利用DGGE技术研究转eGFP小鼠粪便微生物群落结构,对4周龄和8周龄小鼠肠道微生物V3区的30条和29条特异性条带进行克隆测序。主要研究结果如下：1.以转eGFP基因小鼠原代为父、母本,用单线法对其进行传代,获得转eGFP基因小鼠及其后代共94只。PCR法检测,阳性小鼠为77只,阳性率为81.91%,FO代至F4代阳性小鼠分别为6只、5只、18只、17只和31只,阳性率分别为100.00%、62.50%、94.74%、77.27%和79.49%；荧光蛋白观察,有绿色荧光的个体为80只,阳性率为85.11%,F0代至F4代阳性小鼠分别为6只、8只、13只、21只和32只,阳性率分别为100.00%、100.00%、68.42%、95.45%和82.05%。卡方检验,X2=2.7163,X2<X2005（4）,P>0.05,PCR检测结果与绿色荧光性状观察结果差异不显着（P>0.05）,说明在本研究中PCR法检测转基因动物可行；转基因动物采用单线法传代可行。2.利用半荧光定量PCR检测F0代转基因小鼠心、肝、脾、肺、肾、盲肠和睾丸中外源基因的表达情况,发现eGFP在所有检测组织中均表达,其中在心、肝、肾和睾丸中表达量相对较高,之间差异不显着（P>0.05）；心脏中表达量最高,极显着高于脾脏、肺脏和盲肠（P<0.01）；在脾脏和盲肠中表达量相对较低。WRPE原件的表达情况与eGFP基因趋势相同。对F0代至F4代小鼠心脏中的外源基因表达情况进行定量检测,发现外源基因在F0代小鼠中的表达量显着高于F1、F2、F3和F4代小鼠（P<0.05）,F1至F4代每一代之间均有降低,但差异均不显着（P>0.05）,WRPE在不同代（F0、F1、F2、F3和F4代）中的表达情况与eGFP基因趋势相同。表明外源基因在传代过程中的表达量随着传代数的增加,有不断降低的趋势。3.对4周龄和8周龄全同胞阴性（对照组）和转基因阳性小鼠个体粪便微生物菌群活菌计数,发现转基因小鼠个体粪便微生物优势菌群数量与对照组均差异不显着（P>0.05）,表明外源基因对转基因动物肠道微生物菌群结构没带来显着性影响。经过PCR检测,没有在4周龄和8周龄小鼠的粪便样品中发现eGFP基因和WRPE原件,说明在研究时限内转基因小鼠肠道没有检测到基因漂移现象。4.利用DGGE技术比较转基因小鼠与对照组小鼠粪便微生物,发现二者的微生物菌群结构相似;对4周龄和8周龄小鼠肠道微生物V3区特异性条带进行测序比对,发现二者具有同样的优势菌群：厚壁菌（Firmicutes）、杆菌（Bacteroidetes）和放线菌（Actinobacteria）,均没有发现未知的菌群,说明在研究时限内转基因小鼠与对照组小鼠粪便微生物群落结构相
房义[10]（2014）在《转基因羊生殖安全评价的研究》文中研究表明本研究主要以TLR4（Toll-like receptor4）转基因羊为模型,从生殖生理角度进行了系统的安全评价,旨为解释转基因是否具有生物安全性提供部分理论依据,这将有助于今后对提高转基因动物的认识和对转基因生物技术的公共认知。实验采用本实验室生产的F0和F1代TLR4转基因羊为实验动物,分别从血液学、组织病理学、繁殖学、表观遗传学等方面进行监测或检测。经Southern blot鉴定,共获得5只FO和7只F1代TLR4阳性后代。局部炎症实验表明转基因绵羊能快速启动炎症反应。免疫荧光染色的结果显示TLR4表达于卵母细胞质膜上,且表达量高于对照组。血液生理生化指标、繁殖性状各项指标的检测结果显示：转基因羊与非转基因羊相比较,血液生理和生化指标均无显着性差异。同样,在初情期、发情周期、发情持续时间、超数排卵效果、总受胎率以及妊娠周期的基本繁殖参数也无显着性差异。在此基础上,实验进一步检测了转基因对卵母细胞DNA甲基化的影响。本实验分为两部分：（1）注射pTLR4-3s和Elution Buffe组在1、2、4细胞期胚胎甲基化水平显着高于对照组（P<0.05）,但8细胞和囊胚阶段与对照组间无显着性差异（P>0.05）；（2）免疫荧光染色的结果显示,转基因羊的GV、GVBD、MI、Mil卵母细胞甲基化水平和对照组间无显着差异（P>0.05）。同样,转基因对羊耳成纤维细胞甲基化水平也无显着影响（P>0.05）。流式细胞仪分析公羊精子结构的结果显示,在F0和F1代,转基因组与非转基因组间精子活力（85.63%vs.85.90%和85.61%vs.84.38%）、质膜完整精子比例（82.23%vs.87.33%和85.00%vs.82.71%）、线粒体高膜电位精子比例（85.58%vs.83.27%和86.61%vs.83.53%）均无显着性差异（P>0.05）。计算机辅助分析仪检测结果显示,转基因对精子运动性无显着性影响（P>0.05）。人工受精结果显示,转基因羊的妊娠率（66.67%）与非转基因羊（66.33%）无显着性差异。综上所述,转TLR4基因对雌性绵羊血液生理生化指标、繁殖性状的各项指标无显着影响；转TLR4基因对羊各阶段卵母细胞及耳成纤维细胞DNA甲基化水平无显着性影响；转TLR4基因不影响公羊的精子质量。
二、转基因动物检测方法的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因动物检测方法的比较研究（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）耐高温家蚕的制备及转基因家蚕的安全性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 转基因技术及其应用 |
| 1.2.1 转基因技术 |
| 1.2.2 转基因技术的应用 |
| 1.3 转基因生物安全评价的研究进展 |
| 1.3.1 转基因生物的潜在风险 |
| 1.3.2 国内外转基因安全评价管理及相关法律、法规 |
| 1.3.3 转基因动物的生物安全评价 |
| 1.4 转基因家蚕的研究进展 |
| 1.4.1 基因功能研究 |
| 1.4.2 蚕丝的遗传改良 |
| 1.4.3 生物反应器开发 |
| 1.4.4 抗病育种 |
| 1.4.5 抗逆育种 |
| 1.5 家蚕小热激蛋白sHsp19.9的研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 第3章 增量表达Bmhsp19.9提高转基因家蚕对极端温度的耐受性 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Bmhsp19.9的表达模式分析 |
| 3.2.2 Bmhsp19.9的启动子活性检测 |
| 3.2.3 细胞活性分析 |
| 3.2.4 转基因家蚕的制备 |
| 3.2.5 转基因家蚕的分子检测 |
| 3.2.6 转基因家蚕对极端温度的耐受能力检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bmhsp19.9的表达模式分析 |
| 3.3.2 Bmhsp19.9的启动子活性检测 |
| 3.3.3 过表达Bmhsp19.9 保护了BmE细胞在高温胁迫下的活力 |
| 3.3.4 增量表达Bmhsp19.9的转基因家蚕制备 |
| 3.3.5 转基因家蚕的插入位点检测 |
| 3.3.6 转基因家蚕中Bmhsp19.9表达量检测 |
| 3.3.7 转基因家蚕对极端温度的耐受性更高 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 评估转基因DNA从家蚕转移到肉鸡的潜在可能性 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 肉鸡饲养 |
| 4.2.2 肉鸡组织和消化物的采样 |
| 4.2.3 基因组DNA的提取和PCR分析 |
| 4.2.4 血清生化的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 家蚕和肉鸡基因组中外源和内源基因的检测 |
| 4.3.2 摄食转基因家蚕后鸡组织和消化物的PCR分析 |
| 4.3.3 增加转基因家蚕的添食数量和频率后的PCR分析 |
| 4.3.4 血清生化指标分析 |
| 4.3.5 饲喂转基因家蚕后肉鸡的体重调查 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 转基因家蚕的28天经口毒性试验 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验分组设计 |
| 5.2.2 大鼠的饲养条件 |
| 5.2.3 每周体重及饲料消耗量的检测 |
| 5.2.4 血液学及血清生化的检测 |
| 5.2.5 脏器指数的测定 |
| 5.2.6 组织病理学检查 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 大鼠每周体重及饲料消耗量的检测 |
| 5.3.2 血液学及血清生化指标分析 |
| 5.3.3 大鼠的脏器指数测定 |
| 5.3.4 大鼠的组织病理学检查 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 综合与讨论 |
| 6.1 增量表达Bmhsp19.9制备耐高温转基因家蚕品系 |
| 6.2 评估转基因DNA从家蚕转移到肉鸡的可能性 |
| 6.3 转基因家蚕的毒理学评价 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文及参研课题 |
| 致谢 |
（3）fat1和fat2融合表达转基因猪与共表达转基因小鼠的制备及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 我国的猪肉生产及消费概况 |
| 1.1.2 猪肉中脂肪酸的组成、含量及对人体的影响 |
| 1.1.2.1 猪肉中脂肪酸的组成及含量 |
| 1.1.2.2 n-3和n-6 PUFAs的生物学功能 |
| 1.1.3 PUFAs的膳食推荐量及我国居民的实际摄入量 |
| 1.1.4 培育富含多不饱和脂肪酸的转基因猪是我国种猪育种新方向 |
| 1.1.4.1 多不饱和脂肪酸合成途径 |
| 1.1.4.2 通过转基因技术提高猪肉中PUFAs含量的研究概况 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第2章 融合表达fat1-fat2 的转基因猪制备及检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 质粒和细胞系 |
| 2.2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2.1.4 试剂配制 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 转基因猪移植及分娩生产 |
| 2.2.2.3 转基因猪体表绿色荧光检测 |
| 2.2.2.4 转基因猪基因组DNA抽提 |
| 2.2.2.5 PCR鉴定转基因猪中fat1-fat2 基因的表达 |
| 2.2.2.6 转基因猪组织样RNA的提取 |
| 2.2.2.7 转基因猪反转录PCR鉴定 |
| 2.2.2.8 转基因猪的Southern Blot检测 |
| 2.2.2.9 实时荧光定量PCR检测转基因猪中融合基因表达水平 |
| 2.2.2.10 转基因猪肌肉、脂肪、皮肤组织中多不饱和脂肪酸含量的测定 |
| 2.2.2.11 转基因猪脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 fat1-fat2 基因融合表达质粒的制备 |
| 2.3.2 PCR鉴定fat1-fat2 融合表达质粒 |
| 2.3.3 fat1-fat2 融合表达转基因猪的制备 |
| 2.3.4 PCR鉴定转基因猪中融合基因的整合 |
| 2.3.5 Southern Blot检测鉴定转基因阳性猪 |
| 2.3.6 转基因猪体表绿色荧光蛋白表达检测 |
| 2.3.7 转基因猪肌肉、皮肤、脂肪组织中融合基因的表达量检测 |
| 2.3.8 三日龄转基因猪肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.9 一百二十日龄转基因猪多不饱和脂肪酸含量的检测 |
| 2.3.9.1 一百二十日龄转基因猪肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.9.2 一百二十日龄转基因猪脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.9.3 一百二十日龄转基因猪皮肤组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.10 转基因猪脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 fat2和fat1 共表达质粒的构建及在细胞中的表达和功能验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 质粒和细胞系 |
| 3.2.1.2 试剂及耗材 |
| 3.2.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 引物设计 |
| 3.2.2.2 p CAG-fat2-2A-fat1-NEO质粒的制备 |
| 3.2.2.3 p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP质粒的制备 |
| 3.2.2.4 共表达质粒转染PK15细胞 |
| 3.2.2.5 共表达质粒细胞转染后绿色荧光表达及RNA抽提 |
| 3.2.2.6 共表达质粒细胞转染后fat2-2A-fat1 基因表达量的检测 |
| 3.2.2.7 共表达质粒转染后细胞中PUFAs含量的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 fat2和fat1 共表达质粒的构建 |
| 3.3.1.1 fat2-2A-fat1 共表达基因片段的构建 |
| 3.3.1.2 p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP质粒的构建 |
| 3.3.2 fat2和fat1 共表达质粒在猪细胞中的表达验证 |
| 3.3.2.1 fat1和fat2 双基因共表达质粒转染PK15 细胞后绿色荧光蛋白的表达 |
| 3.3.2.2 转染PK15 细胞后fat2-2A-fat1 基因的m RNA表达检测 |
| 3.3.3 fat2和fat1 共表达质粒在细胞中功能验证 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 共表达fat2和fat1 的转基因小鼠制备与检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 质粒和小鼠 |
| 4.2.1.2 试剂及耗材 |
| 4.2.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 引物设计 |
| 4.2.2.2 转基因鼠模型的制备 |
| 4.2.2.3 转基因小鼠的日常饲养与管理 |
| 4.2.2.4 转基因小鼠基因组DNA抽提 |
| 4.2.2.5 转基因小鼠组织样RNA的提取和反转录PCR |
| 4.2.2.6 小鼠体表组织绿色荧光蛋白表达检测 |
| 4.2.2.7 PCR鉴定转基因小鼠中fat2-2A-fat1 基因共表达 |
| 4.2.2.8 转基因小鼠的Southern Blot检测 |
| 4.2.2.9 转基因小鼠的实时荧光相对定量PCR检测转基因m RNA表达水平 |
| 4.2.2.10 转基因小鼠的肌肉、脂肪、皮肤多不饱和脂肪酸含量的测定 |
| 4.2.2.11 转基因小鼠脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转基因小鼠的制备 |
| 4.3.2 PCR鉴定F0代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.3 Southern blot检测F0 代转基因小鼠 |
| 4.3.4 转基因小鼠体表绿色荧光蛋白检测 |
| 4.3.5 F0 代转基因小鼠肌肉组织中fat2-2A-fat1 基因表达量的检测 |
| 4.3.6 F0 代转基因小鼠的肌肉、脂肪、皮肤组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.6.1 F0 代各家系转基因小鼠肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.6.2 F0 代转基因小鼠脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.6.3 F0 代转基因小鼠皮肤组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.7 F0代转基因小鼠配种与扩繁 |
| 4.3.8 PCR与 Southern blot鉴定F1 代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.8.1 PCR鉴定F1代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.8.2 Southern blot检测F1 代转基因小鼠 |
| 4.3.9 F1 代转基因小鼠肌肉组织中fat2-2A-fat1 基因表达量的检测 |
| 4.3.10 F1 代转基因小鼠的肌肉、脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.10.1 F1 代转基因小鼠肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.10.2 F1 代转基因小鼠脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.11 F1代转基因小鼠配种与扩繁 |
| 4.3.12 PCR检测鉴定F2代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.13 转基因小鼠脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 全文讨论与结论 |
| 5.1 双基因表达方法的探讨 |
| 5.2 Fat1或fat2 单转基因与fat1和fat2 双转基因对动物体内多不饱和脂肪酸合成的影响 |
| 5.3 影响转基因动物的多不饱和脂肪酸含量的因素 |
| 5.4 提高动物的多不饱和脂肪酸含量对调控脂肪合成相关基因表达的影响 |
| 5.5 Fat1和fat2 基因的转入对动物生长发育及繁殖性能的影响 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:文献综述 |
| 1 多不饱和脂肪酸的分类及疾病防治 |
| 2 脂肪酸去饱和酶的研究进展 |
| 附录B 基因序列 |
| 1 Fat2序列 |
| 2 2A序列 |
| 3 Fat1序列 |
| 附录C 在读期间发表科研成果 |
（4）转基因动物及其产品的主要管理制度（论文提纲范文）
| 1 转基因动物及其产品概述 |
| 1.1 转基因动物及其产品的研究概况 |
| 1.2 转基因动物及其产品检测技术的研究概况 |
| 2 转基因动物及其产品的安全性评价制度 |
| 2.1 转基因动物的健康状态评估 |
| 2.2 致敏性评价 |
| 2.3 毒理学评价 |
| 2.4 关键组分的成分分析 |
| 2.5 营养学评价 |
| 2.6 储藏和加工测定 |
| 2.7 非预期效应评估 |
| 3 标识管理制度 |
| 3.1 自愿标识 |
| 3.2 强制标识 |
| 3.2.1 美国 |
| 3.2.2 欧盟 |
| 3.3 中国 |
| 4 展望 |
（5）ULK1转基因小鼠的构建及初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前列腺癌研究进展 |
| 1.1.1 前列腺癌简介 |
| 1.1.2 前列腺癌发生的分子机制 |
| 1.1.3 前列腺癌治疗的研究进展 |
| 1.2 转基因动物研究进展 |
| 1.2.1 转基因动物发展史 |
| 1.2.2 转基因动物制备方法 |
| 1.2.3 转基因动物的检测方法 |
| 1.2.4 转基因动物癌症模型 |
| 1.2.5 转基因小鼠使用中的缺陷与不足 |
| 1.3 ULK1基因研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 ULK1;PB-Cre转基因小鼠的构建及表型初步鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的片段扩增 |
| 2.2.2 目的片段与载体的双酶切 |
| 2.2.3 目的片段与载体的连接及转化 |
| 2.2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.5 ULK1;PB-Cre转基因小鼠基因型检测 |
| 2.2.6 免疫组化（IHC） |
| 2.2.7 H&E染色 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 ULK1转基因载体的构建和双酶切鉴定 |
| 2.3.2 ULK;PB-Cre转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 2.3.3 ULK1;PB-Cre转基因小鼠统计 |
| 2.3.4 ULK1;PB-Cre转基因小鼠及其前列腺组织解剖形态 |
| 2.3.5 ULK1转基因小鼠的免疫组化（IHC）鉴定 |
| 2.3.6 ULK1;PB-Cre小鼠与同窝对照小鼠前列腺组织的H&E染色结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 ULK1;Pten~(f/f);PB-Cre转基因小鼠的构建及表型初步鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ULK1;Pten~(f/f);PB-Cre转基因小鼠配鼠方案 |
| 3.2.2 ULK1;Pten~(f/f);PB-Cre转基因小鼠基因型的PCR检测 |
| 3.2.3 H&E染色 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 ULK1;Pten~(f/f);PB-Cre转基因小鼠的基因型鉴定结果 |
| 3.3.2 ULK1;Pten~(f/f);PB-Cre转基因小鼠统计 |
| 3.3.3 转基因小鼠及其前列腺组织解剖形态 |
| 3.3.4 ULK1;Pten~(f/f);PB-Cre小鼠与Pten~(f/f);PB-Cre小鼠前列腺组织H&E染色结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）转生长激素基因奶山羊安全性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 转基因动物的研究现状 |
| 1 转基因动物制备方法 |
| 1.1 原核显微注射技术 |
| 1.2 逆转录病毒介导的转基因技术 |
| 1.3 胚胎干细胞介导技术 |
| 1.4 原始生殖细胞技术 |
| 1.5 精子载体技术 |
| 1.6 体细胞核移植技术 |
| 1.7 转座子介导的转基因方法 |
| 1.8 转线粒体技术 |
| 1.9 锌指核酸酶介导的定点整合技术 |
| 1.10 TALEN介导的定点整合技术 |
| 1.11 CRISPR/Cas介导的定点整合技术 |
| 2 转基因动物的应用 |
| 2.1 工业方面的应用 |
| 2.2 医学方面的应用 |
| 2.3 农业方面的应用 |
| 3 转基因动物安全性评价的内容以及意义 |
| 3.1 转基因动物食品的安全性 |
| 3.1.1 转基因动物食品安全性评价的原则 |
| 3.1.2 转基因动物食品安全性评价的主要内容 |
| 3.2 转基因动物的环境安全性 |
| 3.3 国内外转基因动物安全性评价现状 |
| 参考文献 |
| 第二章 生长激素在动物研究中的应用 |
| 1 生长激素的基因与蛋白结构 |
| 2 生长激素的调控 |
| 3 生长激素的生物学功能 |
| 3.1 生长激素的促生长作用 |
| 3.2 生长激素对物质代谢的影响 |
| 3.3 生长激素对乳腺发育及泌乳的影响 |
| 4 GH在动物生产上的应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 转生长激素基因奶山羊乳腺发育的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 样品RNA提取 |
| 1.2.3 RNA样品的质检 |
| 1.2.4 文库构建与质检 |
| 1.2.5 qRT-PCR验证基因 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据与参考基因组对比结果 |
| 2.2 基因表达量差异分析 |
| 2.3 KEGG pathway富集分析 |
| 2.4 qRT PCR验证基因 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 转GH基因奶山羊外源基因漂移安全性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 样品基因组的提取 |
| 1.2.3 引物设计 |
| 1.2.4 PCR扩增检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品微生物基因组提取 |
| 2.2 外源基因PCR反应检测 |
| 2.2.1 山羊生长激素基因的检测 |
| 2.2.2 筛选基因neo的检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 转GH基因奶山羊对环境菌群结构的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品细菌基因组16srDNA基因V3区域扩增 |
| 1.2.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE) |
| 1.2.3 染色及显影 |
| 1.2.4 相似性分析 |
| 1.2.5 DGGE凝胶16srDNA基因条带的回收 |
| 1.2.6 DNA片段的克隆与测序 |
| 1.2.7 测序比对分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品细菌基因组16srDNA基因V3区域扩增 |
| 2.2 DGGE图谱分析 |
| 2.3 相似性分析 |
| 2.4 测序比对分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转GH基因羊奶食品安全性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 试验试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 乳样采集 |
| 1.2.2 试验分组 |
| 1.2.3 临床观察 |
| 1.2.4 临床病理检查 |
| 1.2.5 血常规检测 |
| 1.2.6 血清生化检测 |
| 1.2.7 免疫学检测 |
| 1.2.8 病理解剖检查 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床观察 |
| 2.2 血常规检测 |
| 2.3 血清生化检测 |
| 2.4 免疫学检测 |
| 2.5 病理解剖检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）关岭牛MyoD I基因组织特异性启动子的筛选和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 MYOD I研究概述 |
| 1.1 生肌调节因子(MRFs)基因家族 |
| 1.2 MyoD I的结构及作用机制 |
| 1.3 MyoD I表达调控研究现状和存在的问题 |
| 2 启动子研究概述 |
| 2.1 启动子区的基本结构和功能 |
| 2.2 启动子分类 |
| 2.3 启动子的研究方法 |
| 2.4 启动子的应用研究 |
| 3 转基因动物研究 |
| 3.1 转基因动物发展概述 |
| 3.2 转基因动物制作方法 |
| 3.3 转基因动物应用 |
| 3.4 转基因动物存在的问题及展望 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 关岭牛MYOD I基因在不同组织和时期的表达分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物与样品 |
| 1.2 试验仪器设备 |
| 1.3 试验主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 总RNA的提取及检测 |
| 2.3 反转录获得cDNA |
| 2.4 qRT-PCR分析 |
| 2.5 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA的提取及检测 |
| 3.2 荧光定量PCR结果分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 关岭牛MYOD I基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12 细胞中的表达 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株、载体及细胞 |
| 1.2 试验仪器设备 |
| 1.3 试验主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 构建重组载体pEGFP-N3-P1~pEGFP-N3-P |
| 2.2 重组质粒的细胞转染 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MyoD I基因启动子片段的扩增 |
| 3.2 扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段 |
| 3.3 重组质粒pEGFP-N3-MyoD I的菌落PCR鉴定 |
| 3.4 重组质粒pEGFP-N3-MyoD I酶切和测序鉴定 |
| 3.5 重组质粒pEGFP-N3-MyoD I在小鼠C2C12细胞中的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 MYOD I基因启动子转基因小鼠模型构建的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物和质粒 |
| 1.2 试验仪器设备 |
| 1.3 试验主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验流程 |
| 2.2 制备转基因小鼠 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因胚胎体外培养阳性率的统计 |
| 3.2 制作pEGFP-N3-MyoD I转基因小鼠的数据统计 |
| 4 讨论 |
| 4.1 超数排卵对试验结果的影响 |
| 4.2 显微注射量对试验结果的影响 |
| 4.3 胚胎移植对试验结果的影响 |
| 4.4 试验重复次数影响试验结果 |
| 4.5 MyoD I基因启动子沉默 |
| 4.6 检测手段影响试验结果 |
| 5 结论 |
| 第五章 结论 |
| 1 研究结论 |
| 2 后续试验 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）转基因动物乳汁中高效、稳定表达人FVⅢ的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 绪论参考文献 |
| 第一章 不同启动子对人凝血因子VⅢ基因在细胞和小鼠乳腺中表达的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 人凝血因子VⅢ转基因小鼠的制备、鉴定及hFVⅢ表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 在转基因小鼠乳汁中vWF和 hFVⅢ的共表达对hFVⅢ稳定性的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述:人凝血因子VⅢ稳定性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
（9）转eGFP基因小鼠环境释放安全性评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词一览表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 转基因动物 |
| 1.2 转基因动物安全性评价的主要方面 |
| 1.3 转基因动物及其产品的安全性评价 |
| 1.4 转基因动物环境释放安全性评价 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 本研究的目的意义 |
| 2.2 本研究的技术路线 |
| 第3章 转eGFP基因小鼠传代及检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 转基因小鼠传代过程中外源基因表达量的变化趋势 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 转eGFP基因小鼠肠道微生物活菌计数与基因漂移检测 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 转eGFP基因小鼠肠道微生物DGGE检测与鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1：试剂配制 |
| 附录2：附图 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文 |
（10）转基因羊生殖安全评价的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 转基因动物和转基因安全评价研究进展 |
| 1.1 转基因动物的研究 |
| 1.2 转基因动物的应用 |
| 1.3 转基因动物生物安全研究进展 |
| 第二章 TLR4的研究进展 |
| 第三章 DNA甲基化的研究进展 |
| 3.1 DNA甲基化(DNA Methylation)的概念 |
| 3.2 DNA甲基化机制 |
| 3.3 DNA去甲基化机制 |
| 3.4 DNA甲基化的作用 |
| 第四章 哺乳动物精子质量检测技术的研究进展 |
| 4.1 精子质膜完整性的检测 |
| 4.2 精子线粒体功能检测 |
| 4.3 精子顶体完整性的检测 |
| 4.4 精子获能检测 |
| 4.5 精子DNA的检测 |
| 4.6 精子运动性检测 |
| 4.7 展望 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第五章 转TLR4基因对绵羊血液指标、繁殖性状和组织病理影响 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 转TLR4基因对卵母细胞、胚胎及体细胞全基因组甲基化水平的影响 |
| 摘要 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 转TLR4基因对精子结构和运动性的影响 |
| 摘要 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.3 结果 |
| 7.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、转基因动物检测方法的比较研究（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]耐高温家蚕的制备及转基因家蚕的安全性评价[D]. 王玉梅. 西南大学, 2020(01)
- [3]fat1和fat2融合表达转基因猪与共表达转基因小鼠的制备及研究[D]. 汤飞. 华南农业大学, 2019(02)
- [4]转基因动物及其产品的主要管理制度[J]. 李晓琳,吴绍强,刘晓飞,王勤,景宏丽,仇松寅,林祥梅. 畜牧与兽医, 2019(02)
- [5]ULK1转基因小鼠的构建及初步鉴定[D]. 毛琳. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [6]转生长激素基因奶山羊安全性评价[D]. 鲍泽坤. 南京农业大学, 2016(04)
- [7]关岭牛MyoD I基因组织特异性启动子的筛选和功能研究[D]. 桓聪聪. 贵州大学, 2015(01)
- [8]转基因动物乳汁中高效、稳定表达人FVⅢ的研究[D]. 任晓叶. 上海交通大学, 2014(05)
- [9]转eGFP基因小鼠环境释放安全性评价研究[D]. 余乾. 西南大学, 2014(09)
- [10]转基因羊生殖安全评价的研究[D]. 房义. 中国农业大学, 2014(08)