一、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒囊膜蛋白odv-e66基因及其邻近区域的序列分析（论文文献综述）
周悦南[1]（2021）在《菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究》文中提出寄生蜂是一类营寄生生活的膜翅目昆虫,其寄主大部分为鳞翅目害虫。菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis是世界性十字花科蔬菜害虫小菜蛾Plutella xylostella的一类优势寄生蜂。其成功寄生需要精准调控寄主的生长发育和免疫,这些功能的实现主要依赖于寄生蜂体内携带的多种寄生因子,包括多分DNA病毒（Polydnavirus,PDV）、毒液、畸形细胞等。其中PDV是稳定整合在寄生蜂基因组上的一类共生病毒,仅能特异地在雌性寄生蜂卵巢的卵萼细胞（calyx cell）内发生复制和组装。PDV前病毒包括两部分,一是能够形成环状的双链DNA分子,此为成熟病毒粒子的基因组成分,另一部分功能为辅助病毒复制、组装并成熟,本研究统称这类基因为内源病毒元件（endogenous virus elements,EVEs）。一直以来,对PDV的研究主要围绕PDV环状基因组中的毒性基因对寄主昆虫的生理调控,而对PDV在寄生蜂体内的复制和组装的研究则相对较少。因此,本研究以菜蛾盘绒茧蜂及其携带的PDV（Cotesia vestalis Bracovirus,CvBV）为对象,通过基因组、转录组、蛋白组、绝对定量、RNA干扰、透射电镜等多组学和多种分子生物学技术,围绕CvBV在寄生蜂卵巢内的复制和组装机制展开研究。获得主要研究成果如下:1)明确CvBV复制和组装的动态过程。利用透射电镜及绝对定量的方法,阐明了CvBV复制和组装与寄生蜂卵巢发育的关系,明确了CvBV复制开始节点为寄生蜂蛹期第2.5天。详细展示了CvBV病毒组装的动态过程,发现CvBV于3日龄雌蛹的卵巢内出现少量组装,到蛹期第4天达到组装高峰期,羽化1天后病毒粒子成熟,卵萼内腔中CvBV丰度达到最高。2)明确CvBV复制和组装相关的EVEs的数量和表达动态。通过对菜蛾盘绒茧蜂基因组及转录组的数据分析,明确了菜蛾盘绒茧蜂基因组中共有73个保守的EVEs,获得了它们的全长序列,并进一步结合质谱分析对CvBV的结构蛋白和其它辅助组装的基因进行了鉴定,发现26个可能为其结构蛋白。表达谱分析表明EVEs在卵巢内的表达模式可分为两种:一类包含病毒DNA复制和病毒RNA转录调控相关基因,这部分基因在蛹早期开始表达,并在3日龄雌蛹的卵巢内达到最高峰,随后开始下降,此类基因称之为早期表达基因。另一类包括结构蛋白和组装相关基因,这部分基因的表达从2日龄雌蛹开始,并在在4日龄雌蛹的卵巢内达到峰值,到1日龄雌成虫体内出现缓慢下调,该类基因称为晚期表达基因。3)明确多个关键EVEs在CvBV复制和组装过程中的作用。通过RNA干扰等技术对24个EVEs在CvBV复制和组装过程的作用进行了探究,其中3个和病毒DNA复制相关（helicase、integrase-1和integrase-2）,3个和病毒RNA转录调控相关（p47、lef-9和lef-5）,8个为病毒衣壳组分（vp39、PMV、Hz NVorf9-1、Hz NVorf9-2、Hz NVorf106、38k、27b和K425＿459）,5个为病毒囊膜结构蛋白（11k、17a-1、35a-1、35a-2和K425＿461）,3个与衣壳组装相关（vlf-1、Hz NV140-1和Hz NVorf140-2）,1个负责病毒结构成分（衣壳与囊膜）运输（Hz NVorf64）,1个为辅助侵染因子（vp91）。4)明确蜕皮激素（20E）在CvBV复制和组装过程的调控作用,并鉴定了下游调控因子。发现20E在寄生蜂雌蛹卵巢内的丰度变化为早期（1-2日龄蛹）较高,蛹期第3天开始下调,此变化趋势正好和CvBV组装相关的晚期基因表达模式相反。通过体外添加20E活体培养卵巢的方式,明确了较高浓度的20E能够显着抑制EVEs相关基因的表达,进一步通过卵萼区转录组测序及RNA干扰方法明确了20E通路下游转录因子E93能够抑制vp39、38k和vlf-1基因的表达。综上,本研究表明,CvBV的复制和组装过程需要多个基因在寄生蜂蛹期协同作用,包括调控病毒基因表达的相关基因以及病毒结构蛋白等。本研究系统地对这些基因进行全基因组的鉴定,并利用RNA干扰等方法对其功能进行系统地探究,初步揭示了CvBV复制和组装的复杂过程。此外,本研究首次发现了20E通路对CvBV组装相关基因的调控作用。这些新的发现不仅提升了对PDV复制和组装机制的认知,也对深入探究PDV的起源和进化具有重要的参考意义。
龙羽燕[2]（2020）在《家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究》文中研究表明家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是引起家蚕血液型脓病的病原,每年都给养蚕业带来巨大的经济损失。BmNPV属于α杆状病毒属,在感染宿主时形成出芽型病毒粒子（Budded virion,BV）和包涵体衍生型病毒粒子（Occlusion-derived virion,ODV）,GP64蛋白是BV特有的一种囊膜糖蛋白,是病毒入侵宿主细胞的关键因子,也是病毒出芽成熟及二次感染所必须的病毒组分。掌握GP64蛋白的结构和功能,了解BmNPV毒株的流行传播规律,才能为BmNPV致病性的进一步研究,以及家蚕血液型脓病的防治研究提供参考。为了掌握BmNPV gp64基因的遗传进化特点,探明BmNPV与致病性相关的分子机制,本研究对广西不同蚕区采集的28个BmNPV野毒株和一个实验室重组r BmNPV毒株的gp64基因进行克隆测序及序列分析,并测定多个毒株的LD50,结果如下:1、所测序的广西BmNPV毒株gp64基因的ORF共有1590 bp、1593 bp和1599 bp三种长度,分别编码529、530以及532个氨基酸残基,造成序列大小不一致的原因是出现核苷酸的缺失与插入突变,这些缺失或插入突变都位于GP64蛋白的N端信号肽序列中。2、对比BmNPV野毒株的LD50发现,gp64基因长度为1593 bp以及1599 bp的毒株LD50大小相近,但比gp64基因长度为1590 bp毒株的小,流行毒株的毒力存在差异,说明野外BmNPV群体具有多种基因型,保持着丰富的遗传多样性。3、相同蚕区同时期采集的BmNPV毒株,gp64基因核苷酸同源性在99.6%～100%之间,推导氨基酸同源性均为100%,说明在同一时期同一蚕区短期流行的BmNPV毒株变异程度较小;相同蚕区不同时期采集的BmNPV毒株,gp64基因核苷酸同源性在98.9%～99.7%之间,推导氨基酸同源性98.9%～100%之间,说明BmNPV毒株经过较长时间的流行,出现的变异程度较大。4、根据gp64基因构建的NJ遗传进化树显示,除T3株外的国外BmNPV参考株都独立位于CladeⅡ的一个亚群中,与所有国内BmNPV参考株明显不在一个大群,说明BmNPV的遗传进化具有地域特点。从2019年采集的16个广西BmNPV毒株的流行分布地域图可以看出病毒的流行分布集中性与分散性并存,说明广西蚕区BmNPV存在局部范围内和远距离之间的传播与流行。
于乾龙[3]（2019）在《苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究》文中研究指明杆状病毒是一类感染昆虫的双链大分子DNA病毒,通常产生出芽型病毒（budded virions,BV）和包涵型病毒（occlusion-derived virions,ODV）两类形态不同的病毒粒子。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）BV的主要囊膜蛋白GP64属于第三类病毒膜融合蛋白家族,该家族代表性成员还包括水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）G蛋白和单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）gB等。目前,已解析的AcMNPV GP64在低pH条件下的三级结构包含五个结构域（domain I-V,简称DI-DV）,但其中性pH条件下的三级结构以及低pH诱导的构象变化分子机制尚不清楚。本文针对AcMNPV GP64的DI与DV之间可能的相互作用以及晶体结构仍未被完全解析的DIV开展了结构与功能关系研究,取得的主要结果如下:一、DI与DV的结构与功能关系结构分析表明,GP64 DV与DI中邻近融合环2（fusion loop 2）的两个区域存在多个可能的相互作用位点。氨基酸序列比对分析显示,这些相互作用位点及其邻近的氨基酸残基比较保守。采用丙氨酸替换的方法对DI和DV中保守性较高或参与相互作用的24个氨基酸进行单点或双点突变。结果分析发现,DI与DV中氨基酸之间形成的分子内相互作用不是GP64表达、多聚体形成、细胞膜定位及膜融合功能所必需,但是参与相互作用的单个氨基酸对GP64膜融合功能却具有重要意义,其中DV区域内的4个氨基酸残基（G438、W439、T452和T456）对膜融合的起始及后续融合孔的形成或扩大具有重要作用。进一步研究发现,G438与W439可能参与维持GP64融合前构象的形成或稳定。二、DIV的结构与功能关系结构分析表明,DIV由两个平行的loop（loop 1-2）组成,其中loop2内的第394398位氨基酸残基在已有的三级结构中缺失。分子内位点相互作用分析显示,在DIV内可能存在12个氨基酸之间的相互作用,主要分布在三个区域:1)顶部区域的N384-Y388;2)中部区域,由7个氨基酸形成包含位于loop1内的N381-N385、N381-K389、N385-K389和位于loop2内的D398-S400、D398-Q401以及连接loop1与loop2的N381-Q401、N381-I403、N385-W393、K389-W393的9个相互作用;3)底部区域,包括连接loop1与loop2的T379-F405以及位于loop2内的D404-S406。氨基酸序列分析表明,这些相互作用位点及其邻近氨基酸在GP64蛋白家族中高度保守。采用丙氨酸替换对DIV中保守的氨基酸及其形成的相互作用进行突变,发现所有位点的突变不影响GP64的表达及三聚体形成,但突变效应主要表现为:1.在转染质粒表达突变体的条件下,D404A、N407A不影响GP64在细胞表面的定位,却显着抑制融合孔的扩大;而另外5个保守位点（Y388、E390、G391、R392、W393）的氨基酸突变显着降低了GP64在细胞膜的定位并完全抑制膜融合起始;在重组bacmid表达各个突变体的条件下,E390A与G391A诱导形成较小的细胞融合嵌合体并抑制病毒入侵但不抑制病毒出芽释放。2.在双点突变中,T379/F405A、N385/K389A、D398/S400A、D398/Q401A不影响GP64的功能,而N381/Q401A、N381/I403A、D404/S406A抑制融合孔的扩大,N381/N385A、N381/K389A、N384/Y388A、N385/W393A、K389/W393A则抑制膜融合起始。此外,在重组bacmid表达突变体条件下,N381/K389A抑制病毒入侵但不抑制病毒出芽释放。3.特性类似的氨基酸取代突变体（Y388F、Y388W、E390D、R392H、R392K、W393F、W393Y）中,只有Y388F、E390D、W393Y诱导细胞融合,而其余4个突变体在细胞表面的定位显着下降。结构分析显示,在上述突变中,Y388A或N384/Y388A突变消除了N384-Y388的相互作用;而W393控制DIV的构象,丙氨酸替换W393导致DIV构象显着变化,突出表现为loop1内的S386、I387与loop2内的N396邻近并形成相互作用促使loop2顶部区域向蛋白中心偏移大约2.5?;另外,N381/K389A消除了N381-K389、N385-K389、N381-Q401、N381-I403的相互作用,而N381/I403A则消除了N381-Q401、N381-I403的相互作用,揭示破坏loop1与loop2之间的互作影响GP64的转运及其膜融合功能。最后,N381-N385、N385-K389与上述相互作用之间在维持DIV构象中具有冗余功能,消除这些相互作用后,DIV构象由于局部氨基酸的邻近形成新的相互作用（如A381-V394、A389-R392）协助其余的相互作用仍维持稳定。总之,我们的研究结果表明,DV结构域内的G438与W439以及DIV结构域内的N381、Y388、E390、G391、R392、W393及其与邻近氨酸酸形成的分子内相互作用在维持GP64中性pH条件下的三级结构及诱导膜融合的起始和融合孔扩大过程中具有关键调控作用。根据已获得的部分第三类病毒膜融合蛋白的融合前及融合后结构,我们提出了GP64可能的构象变化机制。
刘婷婷[4]（2019）在《宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用》文中研究说明在真核细胞内,内吞体分选转运复合体（the endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）具有剪切脂质双层膜的功能,参与多泡体的形成、胞质分裂、质膜修复、核膜重构及囊膜病毒的入侵和出芽释放等多种生理代谢过程。已知,ESCRT复合体由ESCRT-0-III和Vps4等五个复合物以及一些辅助蛋白组成。其中ESCRT-0-II主要负责转运物的分选和囊泡的形成,而ESCRT-III则作为“剪刀手”直接参与囊泡的剪切释放。最后,Vps4水解ATP催化ESCRT-III复合物解离。杆状病毒是一类大分子双链DNA囊膜病毒。在感染周期中,杆状病毒通常产生两种类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子（budded virions,BV）和包埋型病毒粒子（occlusion-derived virions,ODV）。近期的研究表明,过表达Vps4的显性-负性突变体（Dominant-negative,DN）显着降低苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）感染性BV的入侵和出芽释放。然而,关于宿主细胞ESCRT复合体在AcMNPV感染中的作用尚不明确。在本研究中,我们从草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞Sf9中克隆了ESCRT-III关键组成基因Vps2B、Vps20、Vps24、Snf7、Vps46和Vps60。序列分析表明,草地贪夜蛾ESCRT-III各组分的同源基因广泛存在于已测序的昆虫基因组中。激光共聚焦分析表明,表达瞬时转染质粒的细胞中,融合GFP标签的ESCRT-III各组分与融合mCherry标签的Vps4突变体E231Q存在共定位,推测这些融合蛋白可能定位于细胞内吞体中。采用病毒缺失-补偿系统（瞬时转染病毒膜蛋白GP64的表达质粒拯救缺失gp64基因AcMNPV的复制）,我们发现过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分（DN突变体）显着减少进入宿主细胞的病毒粒子,并且进入细胞的病毒粒子大多数被束缚在细胞质中不能被有效转运至细胞核进行复制。进一步利用β-galactosidase与β-glucuronidase作为标记基因并结合定量检测病毒基因组DNA的复制来分析病毒基因的表达,我们发现过表达ESCRT-III组分显性-负性突变体显着抑制病毒复制的早期阶段。揭示宿主ESCRT-III复合物与AcMNPV入侵有关;为了避免表达ESCRT-III各组分的显性-负性突变体对病毒入侵的影响,我们把融合GFP的ESCRT-III各组分构建到AcMNPV基因组DNA（bacmid）中,然后转染Sf9细胞。在转染后24小时,收集细胞上清并分析感染性AcMNPV的产量。结果表明,过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分显着抑制感染性病毒的产量。透射电子显微镜分析表明,表达融合GFP标签的ESCRT-III组分蛋白Vps24与Snf7均能显着抑制子代病毒核衣壳从核膜释放,这些数据揭示ESCRT-III参与感染性AcMNPV出芽型病毒粒子的释放过程。由于AcMNPV出芽型病毒粒子的释放依赖于自身编码的一些蛋白（如Ac93:AcMNPV ORF93编码的蛋白）,我们选择Ac93作为目的蛋白进一步分析病毒蛋白与宿主ESCRT-III亚基及Vps4之间可能的相互作用关系。利用免疫共沉淀和双分子荧光互补分析发现,Ac93与ESCRT-III各组分及Vps4均存在相互作用。而Ac93与Vps4的两个突变体K176Q和E231Q之间存在的相互作用揭示Ac93与Vps4的相互作用并不依赖于其ATP酶活性。进一步分析表明,Ac93与另外两个参与子代核衣壳从核膜释放的病毒蛋白Ac76与Ac103之间存在相互作用。这些数据表明:Ac93可能与Ac76、Ac103、ESCRT-III及Vps4形成复合物参与调控BV的出芽释放过程。为了进一步明确Ac93与ESCRT-III亚基及Vps4的相互作用机制,我们首先对杆状病毒Ac93同源蛋白序列进行比对分析发现在Ac93的C-末端存在一个富含亮氨酸的MIM1-like模序,它可能参与Ac93与ESCRT-III亚基以及Vps4的相互作用。采用定点突变方法,我们构建了一系列由丙氨酸替换6个保守亮氨酸的单点或多点突变体。瞬时表达分析表明,丙氨酸替换亮氨酸不影响Ac93突变体的表达。免疫共沉淀与双分子荧光互补分析发现,丙氨酸替换单个或多个亮氨酸均不同程度降低了Ac93与ESCRT-III各组分、Vps4及病毒蛋白Ac76或Ac103的相互作用。同时,单个或多个位点突变均显着降低了感染性AcMNPV的产量及自带病毒核衣壳经核膜出芽释放效率及病毒诱导的核内微囊泡的形成。Vps4此外,由于AcMNPV的侵染依赖于宿主脂肪酸合成酶活性,为了探讨线粒体在杆状病毒侵染中的作用,我们初步获取了草地贪夜蛾（S.frugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）线粒体基因组序列,并进行了初步组装分析。总之,上述研究揭示宿主细胞ESCRT-III/Vps4参与AcMNPV的入侵和出芽释放过程,er而病毒自身编码的关键蛋白Ac93可能通过与病毒蛋白Ac76及Ac103互作形成复合体参与募集ESCRT-III/Vps4进而调控子代BV的出芽释放和ODV的组装。Vps4
王海萍[5]（2019）在《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bm11基因的研究》文中研究说明杆状病毒（baculovirus）是一种昆虫特异性病毒,病毒粒子呈杆状,具有双链、环状、超螺旋DNA基因组。杆状病毒具有双相生活史,产生两种不同类型的病毒粒子,即出芽型病毒（budded virus,BV）和包涵体衍生型病毒（occlusion-derived virus,ODV）。BV主要负责宿主昆虫体内的全身系统性感染,而ODV则通过与宿主中肠上皮细胞的特异性结合,实现病毒的经口感染（原发感染）。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）属于杆状病毒家族q杆状病毒属,该病毒感染引起的血液型脓病对蚕丝业生产造成严重损害。目前,BmNPV的大多数基因在病毒生活史中的作用已被阐明,然而仍有部分基因的功能未知。本论文以BmNPV高度保守但功能未知的基因bm11作为研究对象,利用λ-red同源重组和Bac-to-Bac系统,对该基因的转录表达、亚细胞定位、生物学功能及作用机制进行了比较系统的研究。主要结论如下:1、对BmNPV bm11基因序列及编码蛋白进行了生物信息学分析。bm11位于BmNPV基因组10,459～10,791 nt,C末端保守性较高。蛋白质序列分析发现Bm11同源蛋白属于功能未知的DUF1477蛋白家族,且具有多个转录激活因子位点。反转录PCR等分析证实bm11是杆状病毒晚期基因。在病毒感染过程中,Bm11主要在细胞核内环状区域分布。病毒结构定位和液相分离实验表明Bm11既不是BV或ODV结构蛋白,也不是整合膜蛋白。2、通过λ-red重组系统构建bm11敲除型重组病毒,分析了 bm11基因缺失对BmNPV侵染的影响。实时定量PCR分析发现,敲除该基因并不影响病毒增殖及其基因组DNA复制。细胞及蚕体生物学实验表明,敲除bm11导致多角体产量显着降低。进一步的电镜观察显示,虽然bm11的缺失并不影响子代病毒粒子的形成、组装以及核内微泡的产生,但多角体内包埋的ODV病毒粒子数量显着减少,进而影响了病毒的有效经口感染。3、对该基因进行C端截短敲除、部分恢复和保守氨基酸位点突变,确定了 Bm11关键氨基酸序列及位点。结果表明,Bm11 C末端80-110 aa与多角体产量及ODV包埋密切相关。而进一步的点突变结果显示,Q94是介导上述过程的关键氨基酸。4、通过多种蛋白互作实验技术明确了与Bm11互作的病毒蛋白,并初步阐明了其入核机制。非病毒感染情况下,瞬时表达的Bm11主要分布在细胞质中;而病毒感染后,Bm11则弥散分布于整个细胞,暗示Bm11的入核需要其它病毒蛋白的辅助。通过与已知的12种病毒整合膜蛋白进行一对一酵母杂交,发现ODV囊膜蛋白PIF4和ODV-E66与Bm11存在相互作用,免疫共沉淀实验则进一步证实了PIF4与Bm11的互作关系。双分子荧光互补结果显示,PIF4与Bm11主要共定位于细胞质、核膜及核内环状区域。综上可知,Bm11通过与PIF4相互作用介导其自身入核。5、通过构建双荧光素酶报告系统,分析了Bm11转录因子的特性,并揭示了其影响多角体产量的分子机制。在BmNPV感染晚期,bm11基因的缺失导致病毒晚期与极晚期基因（包括多角体相关基因）的转录水平下调,但对ODV囊膜蛋白编码基因的转录无显着影响。利用双荧光素酶报告系统分析发现,Bm11对v-cath、fp和vlf-1启动子具有正调控作用。由此可知,敲除bm11导致fp及vlf-1启动子活性减弱,影响polh和p10等多角体相关基因的转录水平,最终使得多角体产量降低。
郭亚君[6]（2016）在《苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac75功能研究》文中指出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa california multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）属于杆状病毒科 a-杆状病毒属。ac75 是 AcMNPV的第75个开放阅读框（open reading frame,ORF）,其同源基因存在于所有感染鳞翅目和膜翅目昆虫的杆状病毒病毒基因组中,功能未知。本文构建了ac75基因缺失突变体,通过对ac75缺失突变体的系列实验分析,对ac75在AcMNPV复制中的作用进行了初步探究。ac75位于AcMNPV基因组上一个包含10个同向排列的ORF的基因簇（ORF73-82）中,全长 402 bp（63126-63527 nt）,与相邻的 ac74 和 ac76 互不重叠,编码133个氨基酸残基（amino acid,aa）。通过序列分析发现在ac75 ORF上游-15 nt,-94 nt,-139 nt和-142 nt四处存在典型的晚期启动子核心序列TAAG。Blast检索分析结果显示,aac75的预期编码产物与其它杆状病毒同源物的序列相似度高达90%～99%。通过SignalIP软件分析,在AC75的氨基酸序列中没有发现信号肽序列。利用NCBI保守结构域检索程序发现AC75序列中存在一个功能未知的DUF1160超家族结构域。用野生型AcMNPV感染性细胞培养上清液接种新鲜Sf9细胞培养,定时收集和裂解细胞,将细胞裂解物做SDS-PAGE,用AC75特异性抗体通过western-blot检测AC75,结果显示,在感染后12 h收集的细胞裂解物中开始检测到AC75条带,在感染后36 h的样品中AC75的检出量达到最大,体现晚期基因表达特征。利用λ-Red重组系统将一拷贝细菌氯霉素乙酰转移酶基因（chloraamphenicol,cat）插入AcMNPV bacmid替代ac75 ORF 5’-端229nt序列,再利用Bac-to-Bac系统将一拷贝与AcMNPV g16启动子相连的egfp或一拷贝多角体蛋白基因（polh）插入ac75缺失突变体构建带荧光标记或polh的aac75缺失突变体vAcac75ko-gfp和vAcac75ko-PH；利用Bac-to-Bac系统将一拷贝aac75连同egfp或polh插入ac75缺失突变体的polh位点构建ac75缺失异位回复突变体vAcac75ko-rep-gfp和vAcac75ko-rep-PH。将野生型、缺失突变体和缺失回复突变体分别对Sf9细胞做转染-感染实验,发现被ac75缺失突变体转染的细胞培养没有产生感染性芽殖型病毒体（BV）但被转染细胞中有包涵体产生。对被转染细胞培养上清液的实时荧光定量PCR分析结果显示,ac75缺失突变体转染的细胞培养没有BV释放。细胞超薄切片电镜分析结果显示,在ac75缺失回复突变体转染的Sf9细胞核中可见病毒形态发生不同阶段的典型特征;在ac75缺失体转染的细胞核中也可以看到明显的病毒发生基质,其中含有核衣壳,在病毒发生基质外围环状区域可见大量核衣壳,但没有观察到获得包膜的核衣壳,也未见有微泡结构,在多角体中也没有观察到病毒粒子。对被转染细胞内DNA的荧光定量PCR分析结果显示,在转染后24 h之内,ac75缺失突变体转染细胞与野生型转染细胞中病毒DNA增量大致相同;表明ac75缺失对病毒DNA复制无明显影响。将一拷贝绿色荧光蛋白编码序列（enhance green fuorescent protein,egfp）与ac75的3’端连接后插入AcMNPV基因组构建表达AC75-EGFP融合蛋白的荧光报告病毒vAcac75ko-ac75:gfp-PH。vAcac75ko-ac75:gfp-PH感染的Sf9细胞的激光共聚焦显微镜分析结果显示,在感染后12h绿色荧光主要见于细胞质中,在感染后18h开始进入细胞核中,在感染后24h主要存在于细胞核中,在感染后72h荧光几乎全部进入细胞核中。为了确定ac75是否涉及病毒晚期基因表达调节,用荧光素酶ORF（lucifearse,luc）作为报告基因分别与AcMNPV晚期基因vp39、p6.9、e18、gp64、an、pk1和polh启动子连接后插入ac75缺失突变体和gp64缺失突变体构建报告bacmids。用这些bacmids分别感染Sf9细胞,在感染后不同时间点取样测定荧光素酶活性。结果显示,所有包含报告基因的ac75缺失突变体转染细胞的荧光素酶活性值与对应的包含报告基因的gp64缺失突变体转染细胞相近;表明ac75的缺失对这些晚期基因的表达没有明显影响。上述实验结果表明,ac75是一个病毒复制必需基因,其功能可能与核内囊膜发生和核衣壳被囊膜包被的过程有关。
张健家,沈运旺,吴小锋[7]（2014）在《昆虫杆状病毒的经口感染因子研究概况》文中研究指明昆虫杆状病毒在感染宿主的过程中产生2种结构和功能不同,但遗传物质完全一致的病毒粒子表型,即出芽型病毒粒子（BV）和包涵体衍生型病毒粒子（ODV）。在昆虫中肠碱性环境下释放出的ODV通过其表面囊膜上高度保守的经口感染因子（PIF）介导感染中肠上皮细胞,引发原发性感染。已有研究发现,由经口感染因子PIF1、PIF2、PIF3和P74组成的多分子复合物在ODV入侵昆虫中肠上皮细胞的过程中发挥重要作用。最近有研究报道其他囊膜蛋白如PIF4、PIF5和PIF6,可与已知的PIF互作促进ODV感染。进一步的研究发现,PIF4和P95（AC83）也是PIF复合物的组分,PIF4能与PIF1、PIF2、PIF3形成稳定的复合物,而P95和P74与这个复合物的结合并不紧密。通过蛋白质组分析发现,其他3种蛋白质——AC5、AC68（PIF6）和AC108（SF58的同系物）也与PIF复合物有关。揭示ODV入侵昆虫中肠上皮细胞时复合物的形成与构象变化,PIF的潜在受体及其复合物识别宿主细胞受体的过程,将是阐明杆状病毒PIFs及其复合物介导ODV病毒感染机制的重要研究内容。
陈雪梅[8]（2013）在《家蚕核型多角体病毒ORF79基因（bm79）的结构和蛋白互作分析》文中提出家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）感染家蚕引起的家蚕血液型脓病是目前蚕丝产业最为常见和危害严重的蚕病之一,每年对蚕丝业造成了巨大的损失。随着1999年BmNPV全基因组序列的测定,其基因功能的研究已成为研究重点。尽管其在侵染过程中发挥重要作用的相关基因已陆续被注释,但BmNPV ORF79（bm79）作为杆状病毒核心基因之一,它的功能仍然不清楚。因此本文主要对BmNPV ORF79基因的结构以及与其他蛋白相互作用做了研究。主要研究结果如下：1.bm79基因克隆及转录分析克隆得到的bm79基因位于BmNPV T3株基因组的76132-76678bp,全长549bp,编码一个含有182个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为20.9KD。bm79的起始密码子ATG上游145bp存在着杆状病毒的晚期转录基序TTAAG,终止密码子TAA的下游74bp和84bp存在转录终止信号AATAAA。用Signal IP软件对基因进行信号肽预测,发现在其N端包含一个22个氨基酸残基的信号肽。同源基因保守性分析结果表明,bm79蛋白氨基酸序列在已测序的杆状病毒中高度保守（>90%）。bm79基因转录时相分析结果表明bm79是一个晚期基因,并在感染晚期持续高量表达。2.BM79蛋白表达及核定位信号鉴定构建BM79的C端融合DsRed荧光蛋白的BM79表达载体pIZ-DsRed-BM79,以pIZ-DsRed和pIZ-DsRed-PIF3作为对照,转染BmN-SWU1细胞后,免疫荧光法检测BM79蛋白在家蚕细胞内的表达情况,发现BM79蛋白在细胞质和细胞核内均有分布,而且在细胞核内分布量明显高于细胞质内。另外,在BmNPV病毒感染细胞的情况下,BM79蛋白分布情况不受影响,说明BM79蛋白在细胞内的分布不受其他病毒因子的影响。进一步构建BM79蛋白截短多肽表达载体,免疫荧光检测结果表明,BM79蛋白C端Q151-N165氨基酸序列具有核定位功能,指导BM79蛋白由胞质向核内转运。3.BM79蛋白与其他蛋白的相互作用构建BiFC重组病毒vBiFC-BM79-VNVC、vBiFC-BM79-E66vBiFC-BM79-PIF1、vBiFC-BM79-PIF2和vBiFC-BM79-PIF3,感染BmN-SWUl细胞后,荧光信号检测结果表明,在细胞中表达的PIF1、PIF2、PIF3和ODV-E66分别与BM79存在相互作用关系。进一步免疫共沉淀实验验证结果显示,VC-E66、VC-PIF1、VC-PIF2和VC-PIF3融合蛋白皆能够被VN-BM79蛋白沉淀,表明BM79蛋白与PIF1、PIF2、PIF3和ODV-E66存在相互作用,与BiFC荧光信号结果一致。推测BM79可能与其他口服感染因子联合,在ODV侵染家蚕的过程中行使功能。
相兴伟[9]（2013）在《家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究》文中研究说明杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的病原微生物,在感染周期中产生两种表型不同但遗传物质完全一样的病毒形态,即出芽型病毒（Budded virus, BV）和包涵体衍生型病毒（Occlusion-derived virus, ODV）.家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是引起家蚕病毒病的主要病原,在感染后期产生大量的多角体蛋白,并在细胞核内聚合、组装成为超大分子的多角体蛋白结晶。这种多角体结构能有效地保护内部的ODV病毒粒子抵御外部恶劣环境。本论文研究了BmNPV ODV中两种关键的囊膜蛋白ODV-E56和BmP95（ORF69）,阐明了它们在ODV病毒粒子包埋入多角体以及经口感染过程中的作用。此外,通过与囊膜蛋白基因的融合表达和基因共表达等技术探讨了BmNPV多角体对外源蛋白的包埋特性。主要结论如下：1. BmNPV ODV囊膜蛋白ODV-E56的研究编码该囊膜蛋白的odv-e56位于BmNPV基因组118,837-119,964nt,全长1,128bp,编码375个氨基酸残基,预测分子量41kDa,在其C-端存在一段高度疏水的氨基酸序列。5’RACE分析表明odv-e56转录起始于ATG上游-14bp处的ATAAG的第3个核苷酸A。RT-PCR分析显示BmNPV感染细胞12h-96h均可检测到odv-e56的表达,这些结果表明odv-e56为一个晚期表达基因。利用同源重组技术成功敲除了odv-e56,发现缺失odv-e56的病毒突变体不影响BV的产量和感染力,也不影响病毒DNA的复制。进一步分析发现敲除该基因仍能形成成熟的ODV,而且能清晰地观察到多角体内包涵有大量的ODV病毒粒子。生物学分析表明,通过血淋巴注射缺失odv-e56的重组病毒可正常感染家蚕,但经口添食缺失odv-e56的多角体却不能引发有效的感染。以上结果说明,ODV-E56与病毒的复制无关,却是经口感染所必需。我们将其称作经口感染因子5（PIF-5）。2. BmNPV ODV囊膜蛋白BmP95的研究BmP95位于BmNPV基因组62,249-64,768nt,全长2,520bp,编码一个含839个氨基酸残基的蛋白。在已测序的57种杆状病毒中都含有BmP95及其同源物。生物信息学分析表明BmP95的N-端存在一段高度疏水的跨膜域,含有Pfam:BaculoVP91N和几丁质结合域ChtBD2两个功能域。利用大肠杆菌λ-Red同源重组系统和杆状病毒Bac-to-Bac系统成功构建了敲除BmP95的重组Bacmid。分析发现缺失BmP95后不能产生子代BV病毒粒子,却不影响病毒DNA的复制。进一步分析表明敲除BmP95导致形成异常的核衣壳,从而阻碍了BV的产生、ODV的成熟以及其随后包埋进入多角体的过程。在多角体蛋白基因位点重新补回全长的BmP95可以修复这种表型缺陷,而仅用含有功能域的N-端区域却无法修复。这些结果说明全长的BmP95为核衣壳精确组装所必需。3.病毒多角体对外源蛋白的包埋特性从病毒多角体内包涵大量ODV病毒粒子得到启发,产生了能否利用病毒囊膜蛋白信号引导外源蛋白包埋入多角体的设想。利用odv-e56和odv-e25两种ODV囊膜蛋白基因与绿色荧光蛋白基因egfP进行融合表达,能在多角体中检测到融合蛋白。为了验证这种外源蛋白的包埋是否都需要ODV囊膜蛋白信号的引导,将egfP和半乳糖甘酶基因LacZ与多角体蛋白基因进行共表达,发现外源蛋白也可以同样被包埋入多角体。进一步利用一种不形成多角体、却可以大量表达EGFP的重组病毒与野生型BmNPV共同感染家蚕BmN细胞,发现形成的多角体中也含有EGFP.由此认为,BmNPV多角体对细胞核内的外源蛋白的包埋存在非特异性,即外源蛋白的含量越高被包埋入多角体的概率就越大。
唐琦[10]（2013）在《可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析》文中指出家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境,因而已经逐渐取代传统的化学农药,广泛应用于农林防护。目前,越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知,对这些未知功能的基因进行研究,有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论,从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因,构建重组型的杆状病毒,从而更好地利用杆状病毒表达系统,或作为生物杀虫剂防治农林害虫。本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因（Bm65）和晚期基因（Bm91）为研究对象,分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒,进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下：一.Bm65基因功能1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游,预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基,理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示,Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族,推测该基因可能与病毒DNA复制有关。2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白,制备了抗血清。此外,利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白,为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h.5’RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。4.利用Red重组系统,用Cm基因成功地取代了Bm65后,通过抗性筛选得到缺失型病毒,并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因,但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。二.Bm91基因功能1.Bm91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白,在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处,预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示,Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族,推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。2.原核表达Bm91蛋白,制备多克隆抗体。转录分析表明,Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录,一直持续到感染后96h,且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。3.成功构建了Bm91缺失型病毒,通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现,Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生,且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比,滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LD50,却使得宿主幼虫的半数致死时间LT5o延长了24h,提示Bm91为病毒增殖的非必需基因,但该基因可能与病毒毒力有关。以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况,为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础,也为该病毒的改造和利用提供理论依据。
二、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒囊膜蛋白odv-e66基因及其邻近区域的序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒囊膜蛋白odv-e66基因及其邻近区域的序列分析（论文提纲范文）
（1）菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PDV的发现与形态 |
| 1.1 PDV的命名及分类 |
| 1.2 PDV的形态特征 |
| 2 PDV的生活史 |
| 2.1 复制与组装过程 |
| 2.2 成熟及侵染传播 |
| 3 PDV的起源 |
| 3.1 PDV环状基因组部分的起源 |
| 3.2 PDV前病毒中非基因组部分的起源 |
| 3.3 BV和IV是独立起源的 |
| 4 PDV及杆状病毒复制和组装基因功能的研究 |
| 4.1 杆状病毒复制及组装的核心基因 |
| 4.2 BV和IV复制及组装相关的基因 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基本材料与方法 |
| 1 基本实验材料 |
| 1.1 养虫设备 |
| 1.2 供试材料 |
| 2 实验仪器和软件系统 |
| 2.1 常用仪器 |
| 2.2 软件系统 |
| 3 常用实验试剂和配制方法 |
| 3.1 LB培养基 |
| 3.2 抗生素 |
| 3.3 PBS |
| 3.4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 |
| 3.5 感受态大肠杆菌的制备 |
| 3.6 电镜固定液的配置 |
| 3.7 常用试剂盒 |
| 3.8 其它试剂 |
| 4 常用实验方法 |
| 4.1 全基因组DNA提取 |
| 4.2 TRIzol法提取总RNA |
| 4.3 cDNA第一链的合成 |
| 4.4 普通PCR |
| 4.5 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.6 TA连接 |
| 4.7 转化 |
| 4.8 琼脂糖凝胶电泳和切胶回收 |
| 4.9 质粒提取 |
| 第三章 CvBV在卵巢内的复制及组装动态 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 寄生蜂不同发育时期卵巢的解剖 |
| 2.3 卵萼细胞核的染色 |
| 2.4 图片采集和处理 |
| 2.5 不同发育时期卵巢基因组DNA的提取 |
| 2.6 透射电子显微镜(TEM)样品制备 |
| 2.7 qPCR检测成环的粒子的丰度 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CvBV形成与卵巢发育的关系 |
| 3.2 卵巢内CvBV丰度动态 |
| 3.3 CvBV组装过程 |
| 4 讨论 |
| 第四章 CvBV复制与组装相关基因的鉴定及表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 全长转录组的c DNA文库构建和测序 |
| 2.3 Illumina cDNA文库构建和卵巢转录组测序 |
| 2.4 全长转录组数据处理 |
| 2.5 卵巢转录组数据处理 |
| 2.6 基因表达差异和富集分析 |
| 2.7 CvBV组装相关基因的鉴定 |
| 2.8 CvBV病毒粒子的质谱样品准备 |
| 2.9 CvBV组装相关基因的质谱分析 |
| 2.10 CvBV组装相关基因的进化分析 |
| 2.11 CvBV组装相关基因的表达谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菜蛾盘绒茧蜂基因组注释的更新 |
| 3.2 卵巢转录组测序及差异表达基因鉴定 |
| 3.3 差异基因GO和KEGG富集分析 |
| 3.4 CvBV复制及组装基因的序列鉴定与表达分析 |
| 3.5 CvBV复制与组装基因的表达谱 |
| 3.6 萼液及CvBV病毒粒子蛋白质谱分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 CvBV复制及组装相关基因的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 显微注射样品收集 |
| 2.2 dsRNA合成 |
| 2.3 显微注射 |
| 2.4 检测寄生时间的行为学实验 |
| 2.5 干扰效率检测 |
| 2.6 透射电子显微镜 |
| 2.7 qPCR检测成环的病毒粒子丰度 |
| 2.8 统计方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNAi体系的建立 |
| 3.2 整合酶和解旋酶基因的功能鉴定 |
| 3.3 病毒转录相关基因的功能鉴定 |
| 3.4 CvBV衣壳蛋白功能鉴定 |
| 3.5 CvBV囊膜蛋白功能鉴定 |
| 3.6 CvBV组装相关基因功能鉴定 |
| 3.7 CvBV组装过程的其它基因功能探究 |
| 4 讨论 |
| 第六章 20E抑制CvBV组装过程晚期基因的表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 Illumina cDNA文库构建和卵萼转录组测序 |
| 2.3 卵萼转录组数据生物信息分析 |
| 2.4 差异基因鉴定和GO、KEGG富集分析 |
| 2.5 卵巢体外培养 |
| 2.6 基因克隆和表达分析 |
| 2.7 dsRNA合成 |
| 2.8 显微注射 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卵萼转录组测序 |
| 3.2 差异基因鉴定及GO、KEGG富集 |
| 3.3 20E参与CvBV组装过程基因的调控 |
| 3.4 E93抑制衣壳蛋白及组装基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 第七章 总结 |
| 1 全文总结 |
| 2 本研究的创新之处 |
| 3 本研究的不足之处 |
| 4 今后的研究方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.2 杆状病毒的感染复制 |
| 1.3 杆状病毒的基因组成与表达 |
| 1.4 家蚕核型多角体病毒 |
| 1.4.1 家蚕血液型脓病 |
| 1.4.2 家蚕围食膜防御屏障 |
| 1.4.3 家蚕抗BmNPV相关蛋白和基因 |
| 1.4.4 BmNPV囊膜糖蛋白GP64的结构和功能 |
| 1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 BmNPV毒株和实验动物 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂(盒)商品 |
| 2.1.4 基础试剂配制 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BmNPV多角体的纯化 |
| 2.2.2 BmNPV基因组DNA提取 |
| 2.2.3 PCR扩增gp64基因 |
| 2.2.4 PCR扩增产物电泳 |
| 2.2.5 目的片段的纯化回收 |
| 2.2.6 感受态细胞制备 |
| 2.2.7 目的基因克隆 |
| 2.2.8 重组质粒提取 |
| 2.2.9 重组质粒鉴定 |
| 2.2.10 目的基因测序与序列拼接 |
| 2.2.11 序列比对和进化树分析 |
| 2.2.12 19年毒株流行分布图 |
| 2.2.13 BmNPV毒株的LD_(50)测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PCR扩增目的片段 |
| 3.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3 基因ORF测序长度 |
| 3.4 gp64基因ORF序列同源性比较 |
| 3.5 gp64基因的遗传进化树 |
| 3.6 广西BmNPV毒株的流行分布 |
| 3.7 BmNPV gp64 基因ORF单核苷酸多态性分析 |
| 3.8 密码子偏好性分析 |
| 3.9 选择压力分析 |
| 3.10 LD_(50)测定结果 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1:本研究测序的广西BmNPV毒株gp64基因核苷酸序列比对 |
| 附录2:本研究测序的广西BmNPV毒株gp64基因推导氨基酸序列比对 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 生物学膜融合及病毒膜融合蛋白 |
| 1.1.1 生物学膜融合 |
| 1.1.2 病毒感染介导的膜融合 |
| 1.1.3 病毒膜融合蛋白 |
| 1.2 杆状病毒简介 |
| 1.2.1 杆状病毒结构类型 |
| 1.2.2 杆状病毒分类 |
| 1.2.3 杆状病毒粒子 |
| 1.2.4 杆状病毒的侵染过程 |
| 1.2.5 杆状病毒的感染周期 |
| 1.2.6 杆状病毒基因表达时相 |
| 1.2.7 杆状病毒主要膜融合蛋白 |
| 1.2.8 杆状病毒的应用 |
| 1.3 杆状病毒膜融合蛋白GP64 的研究进展 |
| 1.3.1 GP64在BV感染过程中的作用 |
| 1.3.2 GP64 蛋白的三级结构 |
| 1.3.3 GP64 的结构与功能关系 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 GP64 结构域Ⅰ与结构域Ⅴ的结构与功能关系分析 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 生化试剂及相关溶液 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 聚合酶链式反应 |
| 2.2.3 目的片段的分离回收 |
| 2.2.4 限制性内切酶酶切反应 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 化学法转化 |
| 2.2.7 克隆子的筛选 |
| 2.2.8 质粒DNA的提取 |
| 2.2.9 序列测定和分析 |
| 2.2.10 甘油菌的保存 |
| 2.2.11 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建 |
| 2.2.12 瞬时表达质粒转染Sf9 细胞 |
| 2.2.13 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.14 细胞表面酶联免疫吸附 |
| 2.2.15 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算 |
| 2.2.16 半融合及融合孔形成检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ的氨基酸特征分析 |
| 2.3.2 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体基因的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.3 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的表达分析 |
| 2.3.4 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的细胞表面定位分析 |
| 2.3.5 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的膜融合活性分析 |
| 2.3.6 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析 |
| 2.3.7 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 GP64 结构域Ⅳ的结构与功能关系分析 |
| 3.1 材料和设备 |
| 3.1.1 材料及试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建 |
| 3.2.2 蛋白免疫印迹 |
| 3.2.3 细胞表面酶联免疫吸附 |
| 3.2.4 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算 |
| 3.2.5 半融合及融合孔形成检测 |
| 3.2.6 DH10Bac(gp64~(ko))感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 重组病毒bacmid的构建 |
| 3.2.8 病毒bacmid的电击转化 |
| 3.2.9 病毒bacmid转染Sf9 细胞 |
| 3.2.10 病毒感染Sf9 细胞及病毒的扩增 |
| 3.2.11 病毒滴度测定 |
| 3.2.12 病毒生长曲线测定 |
| 3.2.13 病毒与细胞结合及病毒入侵分析 |
| 3.2.14 病毒出芽释放分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GP64 结构域Ⅳ的氨基酸特征分析 |
| 3.3.2 GP64 结构域Ⅳ突变体的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 3.3.3 GP64 突变体蛋白结构域Ⅳ的结构分析 |
| 3.3.4 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的表达分析 |
| 3.3.5 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的细胞膜表面定位分析 |
| 3.3.6 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的膜融合活性分析 |
| 3.3.7 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析 |
| 3.3.8 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析 |
| 3.3.9 表达GP64 及其突变体基因的重组bacmid的构建 |
| 3.3.10 GP64 结构域Ⅳ氨基酸突变对BV产生的影响分析 |
| 3.3.11 病毒感染条件下GP64 突变体的融合活性及构象变化分析 |
| 3.3.12 E390A,G391A,N381/K389A显着影响病毒入侵 |
| 3.3.13 E390A,G391A,N381/K389A对病毒释放没有显着影响 |
| 3.3.14 GP64 氨基酸保守性替换突变对融合活性及BV产生的影响分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 总结 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 4.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 克隆GP64 突变体的PCR引物 |
| 附录2 杆状病毒GP64 氨基酸序列比对 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 ESCRT系统的组成 |
| 1.1.1 ESCRT-0 复合体 |
| 1.1.2 ESCRT-Ⅰ复合体 |
| 1.1.3 ESCRT-Ⅱ复合物 |
| 1.1.4 ESCRT-Ⅲ复合体 |
| 1.1.5 Vps4 |
| 1.1.6 Alix |
| 1.2 晚期结构域L-domain |
| 1.3 杆状病毒简介 |
| 1.3.1 杆状病毒的分类 |
| 1.3.2 杆状病毒的形态结构 |
| 1.3.3 杆状病毒生活周期 |
| 1.3.4 杆状病毒核心基因 |
| 1.3.5 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒简介 |
| 1.4 多个影响BV产量的杆状病毒核心基因简介 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 主要实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞、菌株与质粒 |
| 2.2.2 细菌培养基 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 常用缓冲液 |
| 2.2.5 常用抗生素溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌化学感受态细胞制备 |
| 2.3.2 DH10Bac电转感受态细胞制备 |
| 2.3.3 草地贪夜蛾Sf9 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.4 ESCRT-Ⅲ组分基因的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.5 AcMNPV核心基因ac93 突变体的构建 |
| 2.3.6 ac93 及其系列突变瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.7 构建表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ各个组分的重组AcMNPV bacmid |
| 2.3.8 细胞活性测定 |
| 2.3.9 病毒缺失-补偿实验 |
| 2.3.10 病毒滴度测定 |
| 2.3.11 ac93 重组病毒的滴度测定 |
| 2.3.12 AcMNPV基因表达与基因组DNA复制检测 |
| 2.3.13 AcMNPV的入侵分析 |
| 2.3.14 AcMNPV出芽释放分析 |
| 2.3.15 免疫共沉淀分析(Co-immunoprecipitation) |
| 2.3.16 Western blotting |
| 2.3.17 双分子荧光互补分析 |
| 2.3.18 激光共聚焦显微镜分析 |
| 2.3.19 透射电子显微镜观察 |
| 2.3.20 同源重组线性片段ac93US-Cm-ac93DS的制备 |
| 2.3.21 同源重组感受态细胞DH10BAC的制备 |
| 2.3.22 电击转化同源重组 |
| 2.3.23 Bacmid DNA提取 |
| 2.3.24 重组病毒v AcIE1-GFP-PP-GFP-PP-Polh的构建 |
| 2.3.25 ac93 补回型重组病毒vAc ac93~(REP-PP-GFP-PP-Polh)的构建 |
| 2.3.26 重组病毒的PCR鉴定 |
| 2.3.27 helper质粒的去除 |
| 2.3.28 多步病毒生长曲线测定 |
| 第三章 ESCRT-Ⅲ在 AcMNPV侵染中的作用 |
| 3.1 ESCRT-Ⅲ核心基因的克隆 |
| 3.2 ESCRT-Ⅲ核心基因的氨基酸序列比对分析 |
| 3.3 ESCRT-Ⅲ核心蛋白的表达 |
| 3.4 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对感染性AcMNPV BV的影响 |
| 3.5 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对AcMNPV侵染早期阶段的影响 |
| 3.6 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对AcMNPV BV入侵的影响 |
| 3.7 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分显性-负性突变体对BV出芽释放的影响 |
| 3.8 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分显性-负性突变体对AcMNPV的子代病毒核衣壳从核膜释放的影响 |
| 3.9 小结 |
| 3.10 讨论 |
| 第四章 Ac93与ESCRT-Ⅲ亚基的相互作用 |
| 4.1 Ac93和ESCRT-Ⅲ亚基的相互作用 |
| 4.2 Ac93和Vps4 的相互作用 |
| 4.3 Ac93 与病毒核心蛋白Ac76、Ac103 的相互作用 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 Ac93 突变体与ESCRT-Ⅲ/Vps4 的相互作用 |
| 5.1 Ac93 及其同源蛋白的氨基酸序列比对 |
| 5.2 Ac93 的结构域分析 |
| 5.2.1 晚期结构域 |
| 5.2.2 亮氨酸拉链 |
| 5.2.3 核受体模序 |
| 5.2.4 MIM1 模序 |
| 5.2.5 CRAC-motif |
| 5.3 Ac93 突变体的构建 |
| 5.3.1 克隆策略 |
| 5.3.2 点突变系列瞬时表达载体的构建 |
| 5.3.3 ac93 系列点突变BIFC瞬时表达载体的鉴定 |
| 5.3.4 MIM1 模序保守的存在于几乎所有的Ac93 同源物中 |
| 5.3.5 Ac93 突变体自身相互作用 |
| 5.3.6 Ac93 突变体与Vps4 的相互作用 |
| 5.3.7 Ac93 突变体与Vps4 MIT结构域的相互作用 |
| 5.3.8 Ac93 突变体与ESCRT-Ⅲ蛋白的相互作用 |
| 5.3.9 Ac93 突变体与病毒核心蛋白Ac76和Ac103 的相互作用 |
| 5.3.10 Ac93 其突变体与ESCRT-Ⅲ组份蛋白、病毒核心蛋白的的表达 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 Ac93 突变体对Ac MNPV复制的影响 |
| 6.1 ET同源重组技术和Bac-to-Bac系统 |
| 6.2 构建ac93 缺失型重组bacmid流程 |
| 6.2.1 ac93 上游侧翼序列和下游侧翼序列的鉴定 |
| 6.2.2 重组质粒pIE-ac93US-Cm-ac93DS的鉴定 |
| 6.2.3 重组Bacmid vAc~(ac93ko)的鉴定 |
| 6.2.4 转座载体IE1-GFP-PFB、ac93p-ac93-pFB的鉴定 |
| 6.2.5 ac93 补回型重组病毒vAc~(ac93REP-PP-GFP-PP-Polh)的鉴定 |
| 6.2.6 点突变系列重组载体93p-?ac93-HApBlue的构建 |
| 6.2.7 点突变系列转座载体93p-?ac93-HA-pFB的构建与鉴定 |
| 6.2.8 补回型重组病毒vAc~(△~(ac93REP-PP-GFP-PP-Polh))的构建与鉴定 |
| 6.3 ac93 点突变重组病毒对感染性病毒粒子产量的影响 |
| 6.4 Ac93的MIM1 模序对核衣壳从核膜释放以及核内微泡的形成的影响 |
| 6.5 小结 |
| 6.6 讨论 |
| 第七章 粉纹夜蛾和草地贪夜蛾的线粒体基因组分析 |
| 7.1 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)线粒体基因组分析 |
| 7.2 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的线粒体基因组分析 |
| 7.3 小结 |
| 第八章 结论与讨论 |
| 8.1 ESCRT-Ⅲ是 AcMNPV粒子有效入侵和释放所必需的 |
| 8.2 MIM1模序参于Ac93蛋白与Ac93蛋白、ESCRT-Ⅲ/Vps4蛋白和其他病毒蛋白的互作 |
| 8.3 MIM1 模序在Ac MNPV侵染中发挥重要的作用 |
| 8.4 Ac93蛋白与Ac93蛋白、ESCRT-Ⅲ/Vps4蛋白和其他病毒蛋白的互作主要发生在核膜 |
| 8.7 粉纹夜蛾和草地贪夜蛾线粒体基因组分析 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bm11基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 杆状病毒复制周期 |
| 1.1.3 杆状病毒包涵体衍生型病毒粒子研究简介 |
| 1.1.4 ODV病毒粒子形成所需的相关基因 |
| 1.1.5 杆状病毒编码整合膜蛋白及内核膜分选基序 |
| 1.1.6 真核生物转录因子及其研究方法 |
| 1.2 本研究的目的与科学意义 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 BmNPV bm11基因的生物信息学分析、表达规律与定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 bm11在基因组中的位置 |
| 2.3.2 Bm11的蛋白质序列特征 |
| 2.3.3 Bm11氨基酸序列比对和进化树分析 |
| 2.3.4 Bm11转录时相分析 |
| 2.3.5 Bm11在病毒感染晚期表达 |
| 2.3.6 Bm11的亚细胞定位 |
| 2.3.7 Bm11在液油两相中的分布 |
| 2.3.8 Bm11在病毒粒子结构组分中的定位 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 BmNPV bm11基因的功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组病毒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 病毒复制分析 |
| 3.3.3 bm11基因敲除对病毒DNA复制的影响 |
| 3.3.4 bm11敲除对病毒多角体粒子产量的影响 |
| 3.3.5 bm11敲除对虫体感染的影响 |
| 3.3.6 对虫体内病毒感染力及多角体产量的影响 |
| 3.3.7 透射电子显微镜观察 |
| 3.3.8 bm11敲除对病毒ODV粒子包埋的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Bm11蛋白关键氨基酸位点的确定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分段截短型和恢复型重组病毒的构建 |
| 4.3.2 Bm11不同的片段截短与恢复对OB产量的影响 |
| 4.3.3 Bm11不同的片段截短与恢复对ODV包埋的影响 |
| 4.3.4 生物学分析 |
| 4.3.5 Bm11突变氨基酸位点确定及突变型重组病毒构建 |
| 4.3.6 单个氨基酸位点突变对ODV包埋的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 BmNPV Bm11蛋白入核机制的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm11的细胞内定位 |
| 5.3.2 酵母双杂交载体的构建和自激活检测 |
| 5.3.3 Bm11截短体与整合膜蛋白互作的酵母双杂交验证 |
| 5.3.4 免疫共沉淀验证蛋白质互作 |
| 5.3.5 Bm11与PIF4在核膜上相互作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 BmNPV bm11基因的转录调控分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 bm11敲除对病毒基因转录的影响 |
| 6.3.2 荧光素酶表达载体构建与鉴定 |
| 6.3.3 不同基因启动子的活性检测 |
| 6.3.4 最佳转染剂量的确定 |
| 6.3.5 最佳酶活测定时间的确定 |
| 6.3.6 bm11对不同基因启动子活性的调节 |
| 6.3.7 蚕体液化现象分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论、创新点和工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 发表论文 |
| 博士期间获得荣誉 |
| 致谢 |
（6）苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac75功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文中用到的缩写词 |
| 1. 研究背景与意义 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.1.2 杆状病毒生活周期 |
| 1.2 杆状病毒分子生物学研究 |
| 1.2.1 杆状病毒基因组特征 |
| 1.2.2 杆状病毒表达时序性 |
| 1.2.3 杆状病毒结构蛋白基因 |
| 1.3 AcMNPV的特点和应用 |
| 1.3.1 Ac75基因背景简介 |
| 1.3.2 本论文的研究意义和目的 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细菌菌株和昆虫细胞 |
| 2.1.2 病毒及重组质粒 |
| 2.1.3 酶和分子量标准 |
| 2.1.4 抗生素 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验常用溶液 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 引物 |
| 2.5 本文构建的重组质粒和BACMD |
| 2.6 实验方法 |
| 2.6.1 制备化学感受态DH5A |
| 2.6.2 提取质粒 |
| 2.6.3 PCR获得目的片段或进行验证 |
| 2.6.4 使用琼脂糖凝胶回收DNA片段 |
| 2.6.5 载体和片段的双酶切及回收 |
| 2.6.6 酶连与转化 |
| 2.6.7 制备电转化感受态细胞: |
| 2.6.8 敲除目的基因 |
| 2.6.9 验证敲除是否成功 |
| 2.6.10 通过转座构建重组BACMID |
| 2.6.11 转染 |
| 2.6.12 感染 |
| 2.6.13 测定病毒滴度 |
| 2.6.14 QPCR |
| 2.6.15 制取透射电镜样品 |
| 2.6.16 BV和ODV的分离纯化 |
| 2.6.17 荧光素酶活性的测定 |
| 2.6.18 亚细胞定位实验重组质粒构建 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 AcMNPV Ac75序列分析 |
| 3.2 AC75在病毒结构上定位 |
| 3.3 AC75表达时相 |
| 3.4 Ac75突变体的构建 |
| 3.4.1 Ac75的敲除 |
| 3.4.2 含绿色荧光或多角体标记的Ac75突变体的构建 |
| 3.5 Ac75敲除对病毒增殖的影响 |
| 3.5.1 Ac75缺失突变体转染SF9细胞的光学显微镜观察结果 |
| 3.5.2 AC75缺失及其回复突变体感染SF9细胞的光学显微镜观察结果 |
| 3.5.3 Ac75缺失及其回复突变体感染SF9细胞的病毒滴度 |
| 3.5.4 Ac75缺失突变体转染SF9细胞BV释放情况 |
| 3.5.5 Ac75敲除不影响病毒基因组复制 |
| 3.5.6 Ac75敲除不影响晚期基因表达 |
| 3.6 Ac75缺失对病毒形态发生的影响 |
| 3.7 AC75亚细胞定位分析 |
| 4. 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 致谢 |
（7）昆虫杆状病毒的经口感染因子研究概况（论文提纲范文）
| 1 杆状病毒经口感染因子 |
| 1.1 已发现的经口感染因子 |
| 1.2 不同经口感染因子的特征与功能 |
| 1.2.1 经口感染因子P74 (PIF0) |
| 1.2.2 经口感染因子PIF1 |
| 1.2.3 经口感染因子PIF2 |
| 1.2.4 经口感染因子PIF3 |
| 1.2.5 经口感染因子PIF4 |
| 1.2.6 经口感染因子PIF5 (ODV-E56) |
| 1.2.7 经口感染因子PIF6 (AC68) |
| 1.3 不同经口感染因子的特征比较 |
| 2 经口感染因子复合物及其相关蛋白质 |
| 2.1 经口感染因子复合物 |
| 2.2 与复合物相关的蛋白质 |
| 3 研究展望 |
（8）家蚕核型多角体病毒ORF79基因（bm79）的结构和蛋白互作分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的形态与结构 |
| 1.1.3 杆状病毒的生活周期 |
| 1.2 杆状病毒的分子生物学特征 |
| 1.2.1 杆状病毒的基因组序列 |
| 1.2.2 杆状病毒的基因组复制与转录 |
| 1.2.3 杆状病毒的保守基因及功能 |
| 1.3 杆状病毒侵染路径 |
| 1.3.1 杆状病毒侵染路径 |
| 1.3.2 杆状病毒侵染相关基因 |
| 1.4 分子荧光互补(BiFC)与蛋白相互作用研究 |
| 1.4.1 BiFC原理 |
| 1.4.2 BIFC的优缺点及应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 bm79基因克隆及转录分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 数据和材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液及配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 计算机软件分析方法 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 RNA提取方法 |
| 3.2.4 RNA的反转录成cDNA |
| 3.2.5 cDNA的完整性检测 |
| 3.2.6 PCR扩增检测bm79在病毒感染后不同时间点的转录情况 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 bm79的核苷酸及其编码的氨基酸的序列特征 |
| 3.3.2 BM79的同源性分析 |
| 3.3.3 bm79基因转录时相分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BM79蛋白表达及核定位信号鉴定 |
| 4.1 材料、试剂和仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液及配制 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 构建BM79蛋白表达载体 |
| 4.2.2 昆虫细胞培养技术 |
| 4.2.3 细胞转染及免疫荧光技术 |
| 4.2.4 构建BM79蛋白截短突变载体 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 BM79蛋白在宿主细胞中的亚细胞定位 |
| 4.3.2 BmNPV感染对BM79蛋白在细胞中分布的影响 |
| 4.3.3 BM79蛋白的核定位信号鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 BM79蛋白与其他蛋白的相互作用 |
| 5.1 实验材料与主要试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要溶液及配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 构建BiFC载体质粒 |
| 5.2.2 CaCl_2法制备新鲜感受态细胞 |
| 5.2.3 转座 |
| 5.2.4 重组病毒Bacmid DNA的提取 |
| 5.2.5 重组病毒Bacmid DNA的PCR鉴定 |
| 5.2.6 重组病毒Bacmid DNA对昆虫细胞的的转染 |
| 5.2.7 BV病毒的收取及滴度的测定 |
| 5.2.8 病毒虫体感染增殖 |
| 5.2.9 免疫共沉淀(Co-IP)方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组病毒转座载体的构建与鉴定 |
| 5.3.2 BiFC重组病毒的构建与鉴定 |
| 5.3.3 BiFC重组病毒感染BmN-SWU1细胞后阳性荧光信号检测 |
| 5.3.4 免疫共沉淀鉴定蛋白质间的相互作用 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 硕士在读期间发表的文章及参研课题情况 |
（9）家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒分类 |
| 1.2 杆状病毒生活史 |
| 1.3 杆状病毒基因组及核心基因 |
| 1.4 杆状病毒ODV囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5 病毒多角体结构及组装机制研究进展 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第2章 家蚕核型多角体病毒ODV-E56的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 家蚕核型多角体病毒BmP95的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 BmNPV多角体包埋外源蛋白的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 发表论文、专利 |
| 博士期间获得荣誉 |
（10）可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 图表清单 |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 家蚕、杆状病毒与食品 |
| 1.1.1 家蚕与食品的关系 |
| 1.1.2 杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.3 杆状病毒杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.4 重组杆状病毒杀虫剂 |
| 1.2 杆状病毒概况 |
| 1.2.1 杆状病毒分类及生活周期 |
| 1.2.2 杆状病毒与宿主的相互作用 |
| 1.2.3 杆状病毒宿主范围 |
| 1.2.4 杆状病毒的应用 |
| 1.3 家蚕核刑多角体病毒 |
| 1.3.1 家蚕核型多角体病毒简介 |
| 1.3.2 家蚕核型多角体病毒的多样性 |
| 1.3.3 AcMNPV与BmNPV的基因组比较 |
| 1.3.4 BmNPV基因的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 研究的技术路线 |
| 2 Bm65基因生物信息学分析 |
| 2.1 分析软件及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bm65的核苷酸及氨基酸的序列特征 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 Bm65的原核表达、真核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种、载体、实验动物 |
| 3.1.2 酶和化学试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 缓冲液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计及PCR |
| 3.2.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 目的蛋白的割胶纯化 |
| 3.2.5 抗血清的制备 |
| 3.2.6 SDS-PAGE及免疫印迹分析 |
| 3.2.7 pAc~(Bm65-egfp)的构建 |
| 3.2.8 细胞转染 |
| 3.2.9 转染上清感染sf9细胞 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bm65的克隆 |
| 3.3.2 Bm65基因的原核表达及检测 |
| 3.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.4 Bm65蛋白多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.5 Bm65真核表达基因的克隆 |
| 3.3.6 HTB-ie1-egfp-Bm65z-SV40的构建及鉴定 |
| 3.3.7 pAc~(Bm65-egfp) bacmid的构建及鉴定 |
| 3.3.8 pAc~(Bm65-egfp)转染sf9细胞 |
| 3.3.9 免疫印迹检测Bm65的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Bm65在BmN细胞中的转录分析和蛋白定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和试剂 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 5’-RACE分析 |
| 4.2.4 免疫荧光观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Bm65的转录分析 |
| 4.3.2 Bm65的表达时相 |
| 4.3.3 Bm65的亚细胞定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 Bm65缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、菌株、试剂 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 抗生素配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Bm65基因打靶线性化片段的制备 |
| 5.2.2 电转化感受态DH10Bac细胞制备 |
| 5.2.3 电击转化同源重组 |
| 5.2.4 含有pBm~(Bm65KO)的菌株中pBAD-gbaA质粒的去除 |
| 5.2.5 供体质粒pFB1-polh-gfp-Bm65的构建 |
| 5.2.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建 |
| 5.2.7 细胞转染 |
| 5.2.8 转染上清感染BmN细胞 |
| 5.2.9 病毒滴度测定 |
| 5.2.10 qPCR分析Bm65缺失后对病毒DNA复制的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm65基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 5.3.2 重组质粒pUC18-Bm65US-Cm-Bm65DS的酶切鉴定 |
| 5.3.3 Bm65缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm65的构建及鉴定 |
| 5.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 5.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)在BmN细胞上的复制分析 |
| 5.3.7 病毒DNA复制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 Bm91基因生物信息学分析 |
| 6.1 分析软件及方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Bm91的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 Bm91的多克隆抗体制备、转录分析及蛋白定位 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 BV的纯化 |
| 7.2.2 多角体的纯化 |
| 7.2.3 ODV的纯化 |
| 7.2.4 BV/ODV囊膜蛋白的分离纯化 |
| 7.2.5 BV/ODV核衣壳的分离纯化 |
| 7.2.6 N-糖基化抑制实验 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 Bm91的克隆 |
| 7.3.2 Bm91基因的原核表达及检测 |
| 7.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 7.3.4 Bm91蛋白的多克隆抗体制备及抗体的检测 |
| 7.3.5 Bm91的转录分析 |
| 7.3.6 Bm91的表达时相 |
| 7.3.7 Bm91的亚细胞定位 |
| 7.3.8 Bm91蛋白在病毒结构中的定位 |
| 7.3.9 N-糖基化抑制实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 Bm91缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的构建 |
| 8.2.2 重组病毒半数致死剂量(50% lethal dose,LD_(50))的测定 |
| 8.2.3 重组病毒半数致死时间(50% lethal time,LT_(50))的测定 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 Bm91基因打靶线性化片段的PCR扩增 |
| 8.3.2 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的酶切鉴定 |
| 8.3.3 Bm91缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 8.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm91的构建及鉴定 |
| 8.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 8.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)在RmN细胞上的复制 |
| 8.3.7 Bm91缺失病毒的生物学分析 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 总结和展望 |
| 9.1 总结 |
| 9.2 展望 |
| 9.2.1 Bm65的进一步分析 |
| 9.2.2 Bm91的进一步分析 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 发表的研究论文 |
| 导师指导下主持课题 |
| 参与课题 |
四、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒囊膜蛋白odv-e66基因及其邻近区域的序列分析（论文参考文献）
- [1]菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究[D]. 周悦南. 浙江大学, 2021(01)
- [2]家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究[D]. 龙羽燕. 广西大学, 2020(07)
- [3]苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究[D]. 于乾龙. 西北农林科技大学, 2019
- [4]宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用[D]. 刘婷婷. 西北农林科技大学, 2019
- [5]家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bm11基因的研究[D]. 王海萍. 浙江大学, 2019(11)
- [6]苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac75功能研究[D]. 郭亚君. 华中师范大学, 2016(01)
- [7]昆虫杆状病毒的经口感染因子研究概况[J]. 张健家,沈运旺,吴小锋. 蚕业科学, 2014(04)
- [8]家蚕核型多角体病毒ORF79基因（bm79）的结构和蛋白互作分析[D]. 陈雪梅. 西南大学, 2013(12)
- [9]家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究[D]. 相兴伟. 浙江大学, 2013(08)
- [10]可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析[D]. 唐琦. 江苏大学, 2013(07)