一、猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究（论文文献综述）
赵歌[1]（2021）在《猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立及其应用》文中指出细胞免疫在清除病原体并维持机体稳态方面发挥重要作用。细胞免疫的研究在小鼠和人方面较为深入,有关猪的细胞免疫应答研究相对较少,阻碍了病原微生物致病机制的研究和猪相关制剂的研发。因此,建立猪的细胞免疫应答检测技术十分必要。本研究以猪为动物模型,以新鲜抗凝血为实验对象,通过条件的优化,建立了猪细胞免疫应答流式细胞检测技术,并利用此技术分析了猪霍乱沙门菌疫苗株C500免疫仔猪后诱导的免疫应答规律;然后,通过体外感染实验分析了沙门菌诱导猪上皮细胞和单核细胞的应答情况。以上分析为猪的细胞免疫应答研究提供了技术支撑,为沙门菌与猪宿主细胞的相互作用研究提供了重要数据。1.猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立流式细胞术可以实现单细胞水平的分析。本实验采用新鲜的猪抗凝血,通过Histopaque-1083分离液分离猪淋巴细胞,利用流式细胞术和CCK-8法分析发现,抗凝血在4℃放置3d后,凋亡细胞明显增加,说明抗凝血在4℃放置时间不能超过2d,最好当天使用;将当天采集分离的抗凝血细胞在体外培养1～4 d发现,随着培养时间的延长,虽然ConA刺激后活细胞率下降明显,而未刺激组的淋巴细胞活细胞率仅略有下降,说明分离的抗凝血细胞体外培养4 d后仍然具有良好的细胞活性。另外,细胞增殖是反映细胞免疫应答的重要指标。利用CFSE标记法流式细胞术分析表明,ConA刺激4 d后即能够明显地观察到淋巴细胞的增殖;利用BrdU ELISA法比较分析表明,在96孔板中每孔铺板1×105个细胞,培养48h是细胞增殖分析的最佳条件。此外,细胞因子的表达能够反映细胞免疫效应功能。利用流式细胞术分析淋巴细胞内细胞因子的表达情况表明,PMA和离子霉素刺激2h后,T淋巴细胞亚群中即有IFN-y的表达,并且随着刺激时间的延长而逐渐增加;qRT-PCR分析亦表明,ConA刺激1d后猪外周血细胞中即明显表达IFN-γ。除此之外,通过不同荧光抗体的标记,利用流式细胞术比较分析了 Histopaque-1083分离液分离和红细胞裂解法得到的猪外周血中不同细胞亚群的差异,为后续不同细胞的分离研究提供了重要数据。2.猪霍乱沙门菌C500疫苗株诱导猪细胞免疫应答规律分析为评价以上技术在猪细胞免疫应答检测中的应用效果,将猪霍乱沙门菌疫苗株C500肌肉注射（5×109 CFU/头）免疫24日龄仔猪,同时以未免疫组作为对照,用以上建立的技术分析猪细胞免疫应答规律。以不同免疫时间点的猪外周血细胞为研究对象,用灭活的C500体外刺激不同时间后,BrdU ELISA动态分析显示,体外刺激48 h后,免疫组的细胞增殖能力在免疫后第14 d显着高于未免疫组（P<0.05）;流式细胞术胞内染色分析表明,刺激12 h后,免疫组表达IFN-γ和IL-4的T淋巴细胞比例高于未刺激组。另外,不同免疫时间点的T淋巴细胞亚群分析结果表明,与对照组相比,免疫后第7d,CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞显着升高。此外,以猪外周血细胞为效应细胞,以C500感染的猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为靶细胞,共同孵育后,CTL杀伤效应表明,免疫后第21d,免疫组的CD8+T淋巴细胞具有较强的杀伤靶细胞的能力。可见,C500能够诱导仔猪产生细胞免疫应答。3.沙门菌体外感染诱导的猪上皮细胞和单核细胞应答分析为进一步分析猪的细胞免疫机制,探索不同宿主细胞对沙门菌感染的应答情况,以猪霍乱沙门菌疫苗株C500和缺失株C500ΔrfaJ为材料,以IPEC-J2和猪外周血单核细胞为研究对象,通过体外感染实验分析表明,沙门菌感染后,IPEC-J2和单核细胞在细胞活性和细胞增殖方面的应答趋势一致。在细胞活性方面,C500ΔrfaJ感染组显着高于C500感染组;在细胞增殖方面,C500ΔrfaJ感染组显着高于C500组,说明rfaJ基因的缺失降低了沙门菌对宿主细胞活性的影响。另外,在IPEC-J2细胞模型中,C500感染组的细胞凋亡率高于未感染组,但各组之间无显着差异。此外,在猪单核细胞模型中,与未感染组相比,C500感染组和C500ΔrfaJ感染组均表达IL-1β和IL-8,并且,C500ΔrfaJ感染组IL-1β和IL-8的表达显着高于C500组。说明沙门菌的rfaJ基因具有调控宿主细胞应答的能力。以上技术的建立为猪细胞免疫应答的分析奠定了基础。
姜威,朱婷,王玉霞,张振学,单俊杰[2]（2012）在《多糖佐剂在疫苗中的应用》文中研究说明佐剂长期以来用于疫苗,促进机体免疫反应,降低疫苗用量和生产成本,但至今只有铝佐剂可用于人疫苗。随着疫苗技术的快速发展,越来越多的免疫调节剂受到了研究和关注。研究发现多种天然多糖具有良好的免疫促进作用,能提高体液免疫和细胞免疫。本文综述了近年来具有疫苗佐剂的活性多糖研究,希望未来随着多糖作用机制的深入,多糖佐剂有望用于临床疫苗。
单俊杰,姜威,朱婷,王玉霞[3]（2011）在《多糖佐剂在疫苗中的应用》文中研究说明佐剂长期以来用于疫苗,促进机体免疫反应,降低疫苗用量和生产成本,但至今只有铝佐剂可用于人疫苗。随着疫苗技术的快速发展,越来越多的免疫调节剂受到了研究和关注。研究发现多种天然多糖具有良好的免疫促进作用,能提高体液免疫和细胞免疫。本文综述了近年来具有疫苗佐剂的活性多糖研究,希望未来随着多糖作用机制的深入,多糖佐剂有望用于临床疫苗。
刘栋[4]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中指出在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
张建远[5]（2009）在《猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗及与猪细胞因子联合免疫研究》文中认为猪圆环病毒病由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV2）所致,该病除表现为猪断乳后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）外,还与猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex,PRDC）、增生性坏死性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP）、先天性震颤(（CongenitaltemorAll,CT-All）等猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）有关。猪圆环病毒病在世界不同的国家与地区引致广泛流行与致病,也是我国规模式化猪场主要传染病之一,给世界养猪业造成巨大的经济损失,引起全世界高度关注。目前,国内还没有猪圆环病毒2型商品化疫苗,国外的疫苗研究也在近年来才开展。研究新型猪圆环病毒2型核酸疫苗提高疫苗免疫的效果,对于防制猪圆环病毒病有重要意义。本研究分离鉴定了猪圆环病毒2型病毒株,构建pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗和制备核酸疫苗壳聚糖复合物,开展猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗及与猪细胞因子佐剂联合免疫猪,为研制新型、高效、安全的猪圆环病毒2型核酸疫苗及测定评价筛选猪细胞因子分子免疫佐剂提供理论依据和实验数据。主要研究结果如下:1.猪圆环病毒2型病的检测及病毒株的分离鉴定。采用ELISA技术对9个规模化猪场987头猪的血清进行了猪圆环病毒2型抗体检测,结果表明:受检未免疫猪血清中,圆环病毒2型抗体阳性率为74.3%;采用PCR检测了可疑病料104头,可疑病料中PCR检测阳性率为77.9%,从病料中分离鉴定了一株猪圆环病毒2型（PCV2whn）,在透射电镜下观察到持续感染猪圆环病2型的PK15细胞胞浆及细胞核内有包涵体,以及呈晶格状排列的病毒粒子,直径18±2nm;测定了PCV2whn分离株的全基因组序列,猪圆环病毒2型分离株的基因组全长为1767bp,与我国不同地方的猪圆环病毒2型病毒的分离株基因组的同源性高达92.7-97.5%,与欧洲、美洲、南非分离株的同源率在94.2-96%之间。本研究自主分离鉴定获得新的猪圆环病毒2型分离株,为猪圆环病毒2型研究获取了新的材料。2.pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗构建及核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒制备。选用pVAX1为真核表达载体,以猪圆环病毒2型ORF2为构建目的基因,合成插入含11个CpG motif全长92bp的ISS序列,采用PCR扩增PCV20RF2片段,通过酶切及连接等操作将两段序列亚克隆到pVAX1载体中,构建了pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗,并采用酶切鉴定所构建的真核表达载体。结果显示两个片段正确插入到载体中。使用壳聚糖对pVAX1-ORF2-ISS核酸包被,通过透射电镜和胶阻滞分析,结果显示,pVAX1-ORF2-ISS与壳聚糖结合,成功构建与制备pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗壳聚糖复合物。本研究以pVAX1为优化载体,合成插入ISS序列,设计构建了含ISS与ORF2的pVAX1-ORF2-ISS新型核酸疫苗,此研究尚未见报道。3.猪白细胞介素IL-4、IL-6、IL-6/4的鉴定及其分子佐剂壳聚糖纳米颗粒的制备。选用“四川大学“动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室”提供的猪白细胞介素IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒,利用酶切方法对猪白细胞介素IL-4、IL-6、IL-6/4的真核表达载体进行了鉴定,结果证明3种白细胞介素的目的片段大小与预期大小符合。使用壳聚糖对猪白细胞介素IL-4、IL-6、IL-6/4的真核表达载体进行了包被,通过透射电镜和胶阻滞分析结果显示,真核表达质粒全部与壳聚糖结合,成功制备猪白细胞介素IL-4、IL-6、IL-6/4的分子免疫佐剂壳聚糖纳米颗粒。本研究应用成功制备的猪白细胞介素IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达分子免疫佐剂质粒与猪圆环病毒2型核酸疫苗进行的联合免疫实验,在国内外未见报道。4.猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗免疫及与猪细胞因子联合免疫猪。使用构建和制备的猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗免疫及与猪细胞因子分子佐剂联合免疫实验猪,通过测定不同分组仔猪免疫后的特异性抗体滴度以及T淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+细胞免疫变化情况,对pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗免疫及与猪细胞因子分子佐剂联合免疫效果作出了分析和评定。同时,使用pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗在小白鼠体上做安全性实验。结果显示,pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗能够诱导仔猪产生特异性抗体和T淋巴细胞亚类的免疫应答,免疫期持续60d以上,能诱导细胞免疫并产生特异性抗体,pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗与本课题组构建保存的pVAX1-ORF2比较,其免疫效果优于pVAX1-ORF2（P＜0.05）,与空载体及空白对照组相比,差异极显着（P＜0.01）;3种猪细胞因子分子佐剂与pVAX1--ORF2-ISS核酸疫苗同时免疫仔猪能显着提高pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗的免疫效果（P＜0.05）,以IL-6、IL-6/4为佳,IL-4次之;核酸疫苗的安全性试验表明pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗安全。同类研究均以小鼠进行免疫实验,而本研究用猪圆环病毒2型新型核酸疫苗免疫及与猪细胞因子分子佐剂联合免疫猪未见报道。本研究用构建pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗和制备核酸疫苗壳聚纳米颗粒,开展的猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗及与猪细胞因子佐剂联合免疫猪研究,为研制新型、高效、安全的猪圆环病毒2型核酸疫苗及测定评价猪细胞因子分子免疫佐剂提供了理论依据和实验数据。
万超[6]（2009）在《抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究》文中研究指明猪瘟（classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）引起的、猪的一种高度致死性传染病,在世界许多国家和地区广泛流行,在国际兽医局制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列入A类16种法定传染病之一。我国也作为Ⅰ类动物疫病加以重点控制。自50年代以来,我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗（“C”株）的广泛应用,在控制猪瘟的爆发流行中发挥了重要作用。然而,猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用,并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来,我国猪瘟发生呈明显上升态势,并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留；疫苗制品质量问题；运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效；以及疫苗株毒力的回复突变等是其主要原因。因此,在欧美一些国家已明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种。我国是养猪大国,猪瘟的发生和流行,是制约农村养猪业发展的瓶颈。为满足对猪瘟预防、控制和最终根除的需要,研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统猪瘟兔化弱毒疫苗,势在必行。本研究在对猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns保护性抗原区域结构分析的基础上,利用RT-PCR技术,以猪瘟病毒石门（Shimen）株基因组RNA为模板,扩增E2和Erns抗原编码区序列,与组织纤溶酶原激活剂（tPA）信号肽cDNA序列融合,克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和ptPAs/△E2,以及使用E2信号肽构建pE2s/△E2/△Erns和pE2s/E2。转染PK15细胞,检测目的基因的表达。用所构建的重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周,设pcDNA3.1（+）及PBS阴性对照,第三次免疫2周后采血,分离血清。分别以原核表达并纯化的E2或Erns蛋白为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以纯化的E2或Erns蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A（ConcanavalinA, ConA）为刺激原,Elispot法检测IFN-y分泌情况。结果表明,除pcDNA3.1（+）和PBS对照组外,各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与对照组相比差异显着（p<0.05）。融合tPA信号肽DNA疫苗免疫组的血清OD492nm值与E2信号肽DNA疫苗免疫组相比差异显着（P<0.05）。猪瘟病毒Shimen株或E2或Ems蛋白刺激后,嵌合E2和Erns基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y和T细胞增殖效果高于单价DNA疫苗组（p<0.05）,含有tPA信号肽组高于E2自然信号肽组,融合E2和Erns的ptPAs/△E2/△Erns和pE2s/△E2/△Erns组要优于只含有E2的单基因组。以上结果表明,在诱导免疫应答方面嵌合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗,tPA信号肽组优于E2信号肽组。在小鼠实验的基础上,选取诱导免疫效果较好的ptPAs/△E2/△Erns免疫CSFV血清抗体阴性猪,pE2s/E2和pcDNA3.1（+）同时免疫作为对照,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFV Shimen强毒株经肌肉注射途径攻击。观察猪体临床症状,记录猪体体温。并分别在攻毒后第0、4、8、12天后采血分离血清,以及采集鼻拭子和频死猪组织样品。中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测猪瘟病毒在组织样品和血清样品中复制情况等。结果表明,嵌合DNA疫苗免疫后产生的血清中和抗体水平、白细胞数量明显高于非融合DNA疫苗,pcDNA3.1（+）对照组攻毒后实验猪全部死亡,pE2s/E2免疫组部分猪死亡,而ptPAs/△E2/△Erns免疫组全部猪存活,说明具有tPA信号肽的嵌合DNA疫苗ptPAs/△E2/△Erns具有针对猪瘟病毒完全的免疫保护效果,而E2信号肽单基因DNA疫苗pE2s/E2只具有针对猪瘟病毒部分的免疫保护。在此研究基础上,以p干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）作为分子佐剂和重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2同时免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周。第三次免疫2周后采血分离血清,分别以原核表达E2或Erns为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A（ConcanavalinA, ConA）为刺激原,Elispot法检测IFN-γ分泌情况。结果表明,重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2与TRIF同时免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,但与非佐剂组相比差异不显着（P>0.05）。猪瘟病毒Shimen株刺激后,TRIF和DNA疫苗共免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ数量明显高于非佐剂DNA疫苗组（p<0.05）。以上结果表明,TRIF共免疫可显着增强DNA疫苗诱导细胞免疫水平。以重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF免疫CSFV血清抗体阴性猪,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFVShimen强毒株经肌肉注射途径攻击。分别于攻毒后第0、4、8、12天采血分离血清,中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测组织样品中CSFV分布、计算白细胞数量,观察猪体临床症状并记录猪体体温变化情况等。结果表明,ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF共免疫DNA疫苗猪强毒攻毒后,白细胞数量明显高于非佐剂DNA疫苗,血清中和抗体水平与非佐剂组无明显差异,但DNA疫苗共免疫TRIF佐剂组猪只全部存活,说明TRIF能提高DNA疫苗的免疫效果,并诱导具有针对CSFV强毒株攻击的完全免疫保护。综上所述,本文首次构建了由CSFV主要抗原E2和Erns编码基因融合组成的抗猪瘟嵌合DNA疫苗,并对其在机体内诱导免疫效力进行了研究。在此基础上,研究了细胞通路信号分子TRIF共免疫对DNA疫苗免疫保护效果的影响。初步证实了抗猪瘟嵌合DNA疫苗可以诱导猪体增强的抵抗CSFV强毒株致死攻击的免疫保护,TRIF可显着提高DNA疫苗的细胞免疫应答和抗病毒作用,这些工作为新型抗猪瘟DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。
徐磊[7]（2009）在《猪瘟兔化弱毒细胞苗和脾淋苗细胞免疫效果的比较》文中研究表明猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒引起猪的一种高度接触性传染病,给世界养猪业造成了巨大经济损失。在我国,猪瘟依然是危害养猪业最为严重的疫病之一。目前在我国养猪业中,多应用兔化弱毒脾淋苗或细胞苗预防猪瘟。然而,在猪瘟抗体水平较高的猪群中,有的仍发生猪瘟。为评价这两种疫苗的细胞免疫效果,进行了比较研究。本试验采用常规白细胞计数、流式细胞技术、淋巴细胞转化试验、ELISA试剂盒对猪瘟兔化弱毒细胞苗免疫仔猪（以下简称细胞苗组）、脾淋苗免疫仔猪（有两组,以下分别简称脾淋苗A组、脾淋苗B组）和注射生理盐水的仔猪（简称对照组）分别进行主要免疫相关指标的测定,结果如下:1、猪外周血CD3+、CD4+、CD8+亚群分型测定免疫后第1、7、14、24和35天细胞苗组CD3+淋巴细胞比例低于两个脾淋苗组,但差异不显着;CD4+淋巴细胞亚群比例由高至低依次为:两个脾淋苗组、对照组、细胞苗组,其中于第1天差异显着;组内各时间点CD4+/CD8+比值只有细胞苗组差异显着,且细胞苗组CD4+/CD8+比值始终低于两个脾淋苗组,其中于第35天差异显着。2、猪外周血淋巴细胞增殖活性测定免疫后第1、3、7、14、24和35天植物血凝素非特异性淋巴细胞活力由高至低依次为:脾淋苗A组、脾淋苗B组、细胞苗组和对照组,其中于第3和7天差异显着;免疫后7天起猪瘟兔化弱毒特异性淋巴细胞活力由高至低依次为:脾淋苗A组、脾淋苗B组、细胞苗组和对照组,其中于第14天差异显着。3、猪外周血细胞因子水平测定免疫后第1、3、7、14、24和35天IFN-γ水平由高到低依次为:脾淋苗A组、脾淋苗B组、细胞苗组和对照组,其中于第1、3、7、14和24天差异显着;脾淋苗A组IL-3水平始终高于其他组,而对照组始终最低。细胞苗组IL-3水平于免疫后7天内低于脾淋苗B组,7天后高于脾淋苗B组。其中于第1、3、7、14、24和35天差异显着。4、血常规检测猪外周血白细胞、淋巴细胞总数组间差异不显着,且组内各日龄差异亦不显着。综合以上试验结果可见,与猪瘟兔化弱毒细胞苗相比,猪瘟兔化弱毒脾淋苗免疫猪具有高比例的CD3+和CD4+淋巴细胞亚群,高而稳定的CD4+/CD8+比值,高活力的淋巴细胞以及高水平的IFN-γ和IL-3,表明猪瘟兔化弱毒脾淋苗的细胞免疫效果更为明显,为猪瘟疫苗的选择提供了科学依据。
韩新锋[8]（2008）在《串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究》文中认为小鹅瘟（Gosling Plague）是严重危害水禽养殖业的重要传染病之一,其防制措施主要依靠疫苗接种,传统疫苗在预防和控制小鹅瘟时,存在着散毒和免疫应答不完全等缺点。基因疫苗符合未来疫苗的发展方向,具有安全和诱导全面的免疫应答等诸多优点。本研究以小鹅瘟病毒（Goose Parvovirus,GPV）VP3为研究对象,构建了VP3单基因DNA疫苗,为了增强VP3基因疫苗的免疫原性,将鹅白介素-2（Goose Interleukin-2,gIL-2）和VP3基因进行串联融合表达,还嵌入了一段CpG免疫刺激序列,将构建的三种基因疫苗分别免疫28日龄雏鹅和种鹅,并对其诱导鹅产生的体液免疫和细胞免疫进行了比较研究,为研制高效小鹅瘟病毒VP3基因疫苗打下了基础。1.为了探索GPV VP3基因构建基因疫苗的可行性,通过PCR扩增和基因重组技术克隆了GPV VP3基因并将其连接到pMD18T-Simple上,在对VP3基因分子特性、遗传特点和抗原性进行了分析之后,亚克隆到pcDNA3.1（+）CMV启动子下游的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了单独表达GPVVP3基因的基因疫苗载体pcDNA-VP3,将其转染真核细胞COS-7后,利用间接免疫荧光抗体试验可以在转染后48h检测到VP3基因的高效表达。2.通过重叠延伸PCR（Splicing by overlap extention PCR）扩增gIL2-VP3串联基因,包含缺失了TAA终止密码子的gIL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP3基因,两个基因之间以高亲水性氨基酸（Gly-Gly-Gly-Ser）编码核苷酸相连接;将gIL2-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到到pcDNA3.1（+）CMV启动子的下游HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间,构建了表达gIL2-VP3融合基因的pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗载体,可以在COS-7细胞内高效表达,表达产物的IL-2生物活性可达31.57U/ml。3.人工合成在禽体内具有免疫刺激作用的CpG序列,克隆到pMD18T-Simple载体上,然后亚克隆定向插入到pcDNA-gIL2-VP3目的基因终止密码子后的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,构建成pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗载体,对鹅外周淋巴细胞增殖具有较强的刺激活性（SI=3.06）。4.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg的不同剂量分别免疫28日龄鹅,分别于基因免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d和49d颈静脉采集免疫鹅的抗凝血,分离外周血淋巴细胞后,利用MTT比色法检测ConA对鹅外周血淋巴细胞增殖的免疫刺激作用,发现鹅在免疫pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG后第28d体内细胞免疫最强,200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫组外周血淋巴细胞的ConA刺激指数显着高于pcDNA-gIL2-VP3各组（P＜0.05）;显着高于单基因基因疫苗pcDNA-VP3各个剂量组（P＜0.05）。含有佐剂的pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG两种基因疫苗细胞免疫的峰值比单基因VP3 DNA疫苗提前7d。5.将三种基因疫苗以50μg、100μg和200μg不同剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第3d、7d、14d、21d、35d、49d、63d、77d、105d、133d、161d、189d、217d,采用间接ELISA的方法检测鹅体内IgG的动态变化规律,结果显示,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG所诱导的体液免疫水平明显高于pcDNA-VP3单基因组,这两种基因疫苗的各个剂量组均在第35d抗体水平达到最高,其中以200μg pcDNA-gIL2-VP3/CpG的ELISA水平最高,显着区别于pcDNA-VP3各剂量免疫组（P＜0.05）和极显着高于各个对照组（P＜0.01）。从pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG诱导鹅的体液免疫强度和维持时间来看,均优于pcDNA-VP3免疫鹅和GPV弱毒免疫鹅。6.将三种基因疫苗以200μg的剂量免疫28日龄鹅,分别于免疫后第15d、30d、45d、60d和75d,采用微量血清中和试验检测基因免疫所诱导的中和抗体水平,结果显示,免疫后第15d就可以检测到中和抗体,鹅血清中和抗体随时间的推移稳定中有所缓慢上升,pcDNA-gIL2-VP3和pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫后第60d的鹅血清中和抗体平均效价分别达到峰值1:178.5和1:198.2,二者之间差异不显着,但是显着高于pcDNA-VP3和GPV弱毒免疫鹅（P＜0.05）。7.将三种GPV VP3基因疫苗以200μg的剂量肌肉注射免疫开产前母鹅,分别在免疫后第7d、14d、28d、42d、56d和第70d收集免疫母鹅所产鹅蛋用作卵黄抗体的检测,另外在免疫后第14d、28d、42d取一批鹅蛋入孵用以孵化小鹅用作雏鹅攻毒保护试验。结果显示不同时间卵黄抗体和中和抗体水平与雏鹅攻毒保护率呈现一定的正相关性,三种基因疫苗以pcDNA-gIL2-VP3/CpG效果最好,具有类似于GPV弱毒苗的免疫保护效果。
高云航[9]（2007）在《猪瘟超前免疫效果综合评价》文中提出猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病，于1833年首先发现于美国的俄亥俄州。该病呈世界性流行，以流行范围广、发病率和死亡率高为主要特征，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国是猪瘟流行较严重的国家，每年因猪瘟死亡的猪约占病死猪的39.65％，经济损失达100亿元左右。1956年我国成功的研制出猪瘟兔化弱毒株疫苗，此疫苗被认为是最安全的疫苗而被全世界广泛的采用，许多国家应用此疫苗消灭了猪瘟。虽然我国在猪瘟的防控上一直采用注射猪瘟兔化弱毒苗，也取得了很大的成绩，但猪瘟仍在我国不间断地流行。在大面积注射疫苗的情况下却没有彻底控制住猪瘟疫情，这就对猪瘟疫苗的免疫效果提出了质疑。目前我国防治猪瘟主要采取注射猪瘟疫苗的人工主动免疫方法，由于国内对猪瘟超前免疫和普通常规免疫两种方法在免疫效果上的差别没有定论，且养殖场采取超前免疫措施需要大量的人力及物力，且存在一定的过敏反应，不容易广泛开展，因此各个养猪场所采取的猪瘟免疫程序各不相同。当前国际上在猪瘟的免疫研究方面不断取得新进展，但对于猪瘟免疫抗体水平监测通常只是对IgG水平的监测。由于机体的免疫能力不能够单纯凭借血清中的特异性IgG抗体滴度进行衡量，尚有IgA、IgM、T淋巴细胞、NK细胞及其它细胞因子等的综合作用。为了增强猪瘟超前免疫效果综合评价的严谨性、科学性和全面性，本试验建立了检测猪瘟疫苗的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的手段和方法。主要采用白细胞计数和分类计数、淋巴细胞转化试验等常规细胞免疫检测技术结合先进的流式细胞技术从细胞免疫的几个重要方面入手检测猪瘟超前免疫后细胞免疫的水平，并进行跟踪试验，观察其白细胞、淋巴细胞数目变化情况，淋巴细胞增殖情况，CD4+和CD8+淋巴细胞亚群及γ-IFN的动态变化规律；同时通过间接ELISA方法检测体液和黏膜中各IgG、IgM的动态变化规律，同时与普通免疫方法进行比较。试验结果表明：（1）在体液免疫方面，免疫仔猪在0～10日龄随着日龄的增加抗体水平不断上升；10日龄后抗体水平逐渐下降；但在10～35日龄，由于超免组主动抗体的产生和普免组的母源抗体被中和导致超免组的抗体水平高于普免组，但普免组的抗体水平仍在保护线上；在35～60日龄，由于普免组主动抗体的产生，导致超免组的抗体水平低于普免组，但仍在保护线上；60日龄以后，由于再次免疫，两组的抗体水平差异不显着。在抗体的检测中，IgG的水平均高于IgM。（2）在细胞免疫方面，20日龄内超免组的应答水平高于普免组；30～60日龄时，超免组的应答水平低于普免组；60日龄以后两组差异不显着。（3）在黏膜免疫方面，5日龄内超免组的黏膜抗体水平高于普免组；35～60日龄，超免组的抗体水平低于普免组；60日龄以后，两组差异不显着。从泪液、鼻液、口腔液、尿液和粪便的黏膜抗体检测中，以泪液样品最为稳定和最具代表性。（4）在体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫检测中，超免组和普免组的免疫应答水平均高于对照组，说明均为猪瘟疫苗所产生的特异性免疫应答，而且三种检测方法的动态规律基本一致。综上所述，在母猪对猪瘟疫苗免疫抗体保护的情况下，超前免疫与普通免疫的总应答效果差异不显着。这将为进一步阐明猪瘟疫苗免疫所诱导的体液、黏膜和细胞免疫反应机制，进而为猪瘟的试验室研究及目前猪瘟的免疫预防及综合防治提供一定的理论依据和参考。
白华[10]（2007）在《猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究》文中研究表明猪瘟（classical swine fever, CSF）是一种严重威胁养猪业的疾病,目前,防治猪瘟最主要的方式为注射弱毒疫苗的免疫接种,但由于传统弱毒疫苗存在着许多不足,使得研制高效而更具特异性的新型猪瘟疫苗成为当务之急,而猪瘟病毒DNA疫苗无疑是可能的途径之一。猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）属于黄病毒科（Flaviridae）瘟病毒属（Pestivirus）,其病毒基因组RNA只有一个大的开放阅读框（ORF）,编码11个结构蛋白和非结构蛋白,其中结构蛋白E0、E1、E2为病毒囊膜糖蛋白。E2可诱导中和抗体的产生,是猪瘟病毒主要抗原蛋白,E0也能诱导产生中和抗体,且其编码序列较E2保守,因此在猪瘟的防治和诊断方面也有巨大的应用潜力,E1虽然没有抗原性,但对E0和E2的加工成熟有重要作用。本研究以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR技术首次构建了包含猪瘟病毒全部囊膜蛋白（E0、E1、E2）基因序列的真核表达重组质粒pcDNA4.0-E,并作为疫苗免疫小鼠和仔猪,以检验所构建DNA疫苗的免疫保护作用。本研究由3部分构成:1.采用RT-PCR方法克隆得到猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E0-E1-E2的基因序列,并将其定向插入真核表达质粒pcDNA4.0多克隆位点,琼脂糖电泳和测序表明,成功地构建了包含猪瘟病毒全部囊膜蛋白基因序列的重组质粒pcDNA4.0-E,从而为动物免疫试验奠定了基础。2. pcDNA4.0-E重组质粒转化E.coli JM109后,经过提取和纯化,小鼠后肢胫前肌注射100μg/只（50μg/腿）,共2次,间隔15 d。第2次免疫后第10 d、20 d、30 d分别采血并捕杀小鼠,间接ELISA法检测血清抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾脏和外周血中淋巴细胞转化增殖。结果显示,血清抗体水平从第2次免疫后的第10 d开始逐渐升高,且极显着高于空白对照组(p<0.01=;对淋巴细胞转化增殖试验的数据进行统计分析结果显示,与空白对照组相比,所得重组质粒也能够显着增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞增殖（p<0.05）。这些说明所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生特异性抗体和增强细胞免疫。3. pcDNA4.0-E重组质粒转化E.coli JM109后,经过提取和纯化,仔猪四肢肌肉注射,共注射2次,第1次免疫完成后第15 d进行第2次免疫,每猪每次注射4 mg（1 mg/腿）。1免后第0 d开始,每隔5 d以ELISA试剂盒检测抗体水平,结果表明1免后第20 d开始,pcDNA4.0-E免疫组抗体水平均显着高于空白对照组（p<0.05）,说明pcDNA4.0-E可以诱导产生特异性抗体。1免后第40 d以猪瘟病毒石门株强毒进行攻毒试验,结果显示与空白对照组猪相比,免疫组猪体温升高时间普遍推迟,在临床症状和大体剖检变化方面也较轻微,病理组织学检查也显示免疫组试验猪组织病变程度较空白对照组猪轻微。空白对照组猪全部死亡而免疫组猪2头存活,这说明pcDNA4.0-E对试验猪具有一定的保护作用。如何提高重组质粒的保护效力尚需进一步研究。
二、猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究（论文提纲范文）
（1）猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 猪抗沙门菌免疫应答的研究进展 |
| 1 猪的免疫系统 |
| 2 猪感染沙门菌的发病机制 |
| 3 沙门菌诱导的天然免疫 |
| 4 沙门菌诱导的获得性免疫 |
| 4.1 T细胞的作用 |
| 4.2 B细胞的作用 |
| 5 细胞免疫检测方法 |
| 6 猪的细胞免疫研究进展 |
| 第一章 猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 利用Histopaque-1083分离液分离猪外周血细胞 |
| 1.3 细胞活性分析 |
| 1.4 细胞增殖分析 |
| 1.5 流式细胞术检测细胞因子 |
| 1.6 qRT-PCR检测细胞因子的表达水平 |
| 1.7 流式细胞术检测细胞亚群 |
| 1.8 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪外周血细胞活性分析结果 |
| 2.2 ConA刺激猪外周血细胞增殖分析结果 |
| 2.3 细胞因子分析结果 |
| 2.4 猪外周血细胞亚群分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 猪霍乱沙门菌C500诱导仔猪细胞免疫应答分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细菌培养 |
| 1.3 猪的免疫及样品采集 |
| 1.4 猪外周血淋巴细胞悬液的制备 |
| 1.5 BrdU ELISA法分析猪外周血淋巴细胞的增殖 |
| 1.6 流式细胞术分析猪外周血T细胞亚群 |
| 1.7 特异性CTL杀伤分析 |
| 1.8 利用流式细胞术分析胞内细胞因子分泌 |
| 1.9 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫与采样 |
| 2.2 仔猪饲养记录 |
| 2.3 细胞增殖分析结果 |
| 2.4 胞内染色分析结果 |
| 2.5 细胞亚群分析结果 |
| 2.6 CTL效应分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 沙门菌体外感染诱导猪上皮细胞和单核细胞应答分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 单核细胞的制备 |
| 1.3 细菌感染 |
| 1.4 细胞活性分析 |
| 1.5 细胞增殖分析 |
| 1.6 细胞因子的表达分析 |
| 1.7 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞活性分析结果 |
| 2.2 细胞增殖分析结果 |
| 2.3 细胞凋亡分析结果 |
| 2.4 细胞因子的mRNA水平分析结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果目录 |
| 致谢 |
（2）多糖佐剂在疫苗中的应用（论文提纲范文）
| 1 抗病毒疫苗 |
| 1.1 新城疫病毒 |
| 1.1.1 黄芪多糖 |
| 1.1.2 灵芝菌丝体多糖 |
| 1.1.3 板蓝根多糖 |
| 1.1.4 怀牛膝多糖 |
| 1.1.5 硫酸化香菇多糖 |
| 1.1.6 姬松茸多糖 |
| 1.1.7 枸杞多糖 |
| 1.1.8 酵母多糖 |
| 1.2 传染性腔上囊病病毒 (IBDV) |
| 1.2.1 黄芪多糖 |
| 1.2.2 硫酸化黄芪多糖 |
| 1.2.3 米糠多糖 |
| 1.3 流感病毒 |
| 1.3.1 当归多糖 |
| 1.3.2 淫羊藿多糖 |
| 1.3.3 壳聚糖 |
| 1.3.4 茯苓多糖 |
| 1.4 甲肝和乙肝病毒 |
| 1.4.1 猪苓多糖 |
| 1.4.2 葡寡糖 |
| 1.4.3 枸杞多糖 |
| 1.5 狂犬病病毒 |
| 1.6 猪瘟和兔瘟 |
| 1.6.1 黄芪多糖 |
| 1.6.2 苜蓿多糖 |
| 1.6.3 灵芝多糖 |
| 1.7 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) |
| 1.7.1 黄芪多糖和白花蛇舌草多糖 |
| 1.7.2 马尾藻多糖 |
| 1.8 口蹄疫病毒 |
| 1.9 鸭肠炎病毒 |
| 2 抗细菌疫苗 |
| 2.1 Ⅰ型鸭疫里氏杆菌 |
| 2.2 幽门螺杆菌 (Hp) |
| 2.3 肺炎球菌 |
| 2.4 肺结核分枝杆菌 |
| 2.5 真菌 |
| 3 抗寄生虫疫苗 |
| 3.1 日本血吸虫 |
| 3.1.1 香菇多糖 |
| 3.1.2 多糖FQ2 |
| 3.1.3 香菇菌多糖和茶叶多糖 |
| 3.2 艾美尔球虫 |
| 3.2.1 香菇多糖、银耳多糖和黄芪多糖 |
| 3.2.2 甘露寡糖 |
| 3.3 足衣虫 |
| 4 抗肿瘤疫苗 |
| 4.1 肝癌 |
| 4.1.1 猪软骨多糖 |
| 4.1.2 甘露聚糖 |
| 4.2 黑色素瘤 |
| 4.3 乳头瘤 |
| 5 结语 |
（4）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（5）猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗及与猪细胞因子联合免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 猪圆环病毒病国内外流行情况及研究进展 |
| 1.1 猪圆环病毒病原学特点 |
| 1.2 猪圆环病毒病国内外的流行情况 |
| 1.3 猪圆环病毒2型分子流行病学 |
| 1.4 潜在的公共卫生学意义 |
| 1.5 猪圆环病毒病防治中存在的问题 |
| 2 猪圆环病毒疫苗研究进展 |
| 3 ISS增强核酸疫苗免疫原性研究进展 |
| 4 猪细胞因子分子免疫佐剂研究进展 |
| 5 壳聚糖及包被技术研究进展 |
| 6 本研究的创新点 |
| 7 本研究目的与意义 |
| 第一章 猪圆环病毒2型病毒株的分离鉴定 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪圆环病毒2型感染临床症状及病理变化概况 |
| 1.2 猪圆环病毒2型基因组研究概况 |
| 1.3 猪圆环病毒分离鉴定方法及目的基因的选择 |
| 2 材料 |
| 2.1 病料 |
| 2.2 细胞及培养基 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 猪场猪圆环病毒2型ELISA抗体检测 |
| 3.2 PCV2 ORF2基因的PCR检测 |
| 3.2.1 病料的采集和处理 |
| 3.2.2 病料总DNA的提取 |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 PCR扩增 |
| 3.2.5 PCR产物的酶切鉴定 |
| 3.3 PCV2病毒的分离培养及电镜观察 |
| 3.3.1 PCV2病毒的分离 |
| 3.3.2 电镜观察 |
| 3.4 PCV2分离株全基因组序列测定与分析 |
| 3.4.1 全序列引物的设计 |
| 3.4.2 PCR扩增 |
| 3.4.3 PCR扩增序列片段的回收 |
| 3.4.4 PCV2全序列T克隆的连接反应 |
| 3.4.5 连接物的转化 |
| 3.4.6 重组质粒DNA的提取 |
| 3.4.7 重组质粒的酶切鉴定及PCR检测 |
| 3.4.8 序列测定 |
| 3.4.9 序列分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 病料的PCR与ELISA检测结果 |
| 4.2 PCV2 ORF2基因的PCR检测结果 |
| 4.3 PCV2病毒的分离培养及电镜观察结果 |
| 4.4 PCV2分离株全基因组序列测定与分析结果 |
| 4.4.1 PCV2分离株的全基因组的PCR扩增 |
| 4.4.2 PCV2全序列T克隆重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.4.3 PCV2分离株的全序列测定与分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 猪圆环病毒分离鉴定及感染 |
| 5.2 PCV2的电镜观察 |
| 5.3 PCV2全基因组序列特征分析 |
| 6 小结 |
| 第二章 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗构建及核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒的制备 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 pVAX1表达载体的特点 |
| 1.2 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗构建的目的基因的选择 |
| 1.3 ISS分子免疫增强剂选用与效果 |
| 1.4 核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒制备方法 |
| 2 材料 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器及耗材 |
| 3 方法 |
| 3.1 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗的构建 |
| 3.1.1 引物设计 |
| 3.1.2 PCV2 ORF2基因的PCR扩增 |
| 3.1.3 扩增产物(目的基因)的纯化 |
| 3.1.4 感受态细胞的准备 |
| 3.1.5 酶切、连接和转化 |
| 3.1.6 重组质粒pVAX1-ORF2的酶切鉴定 |
| 3.1.7 重组质粒pVAX1-ORF2的PCR鉴定 |
| 3.1.8 质粒pVAX1-ORF2-ISS的构建 |
| 3.2 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒的制备 |
| 3.2.1 质粒提取 |
| 3.2.2 壳聚糖包裹质粒 |
| 3.2.3 纳米粒的形态、粒径及Zeta电位测定 |
| 3.2.4 凝胶阻滞分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗鉴定结果 |
| 4.1.1 pVAX1-ORF2-ISS的PCR扩增 |
| 4.1.2 pVAX1-ORF2-ISS的酶切鉴定和测序结果 |
| 4.2 pVAX1-ORF2-1SS核酸疫苗壳聚糖纳米颗粒的制备 |
| 5 讨论 |
| 5.1 pVAX1优化载体的选择与常用表达载体的异同 |
| 5.2 壳聚糖的特点与功能 |
| 5.3 ISS分子免疫佐剂选用 |
| 5.4 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗制备材料壳聚糖的选择 |
| 6 小结 |
| 第三章 猪IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒鉴定及其壳聚糖纳米颗粒的制备 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪白细胞介素的选择与鉴定方法 |
| 1.2 壳聚糖包被技术在细胞因子真核表达质粒中应用 |
| 2 材料 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器及耗材 |
| 3 方法 |
| 3.1 猪IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒的鉴定 |
| 3.2 猪IL-4、IL-6、IL-6/4分子佐剂壳聚糖纳米颗粒的制备 |
| 3.2.1 质粒提取 |
| 3.2.2 壳聚糖包裹质粒 |
| 3.2.3 纳米粒的形态、粒径及Zeta电位测定 |
| 3.2.4 凝胶阻滞分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 猪IL-4、IL-6、IL-6/4真核表达质粒的鉴定结果 |
| 4.2 猪IL-4、IL-6、IL-6/4的分子佐剂壳聚糖纳米颗粒制备结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 三种白细胞介素(IL-6、IL-4、IL6/4)的功能特点 |
| 5.2 猪细胞因子壳聚糖纳米颗粒的制备鉴定 |
| 5.3 壳聚糖纳米颗粒包被技术的优点 |
| 6 小结 |
| 第四章 猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗免疫及与猪细胞因子佐剂联合免疫猪 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪圆环病毒2型疫苗研究概况与免疫效应指标的选择 |
| 1.2 ISS序列免疫佐剂效应研究概况 |
| 1.3 猪细胞因子分子佐剂免疫效应研究概况 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 试验猪 |
| 3 方法 |
| 3.1 仔猪免疫试验及分组 |
| 3.2 免疫仔猪血清中特异性抗体含量的检测 |
| 3.3 免疫仔猪T淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+的检测 |
| 3.3.1 外周血淋巴细胞的预处理 |
| 3.3.2 T淋巴细胞的荧光标记 |
| 3.3.3 FACS检测及数据处理 |
| 3.4 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗在小鼠体内的分布的检测 |
| 3.4.1 样品总DNA的抽提 |
| 3.4.2 pVAX1-ORF2-ISS动态分布的检测 |
| 3.5 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗的安全性检测 |
| 3.5.1 组织DNA的分离纯化 |
| 3.5.2 PCR检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 免疫仔猪血清中特异性抗体含量的检测结果 |
| 4.1.1 0.25mg剂量免疫仔猪后特异性抗体检测结果 |
| 4.1.2 0.5mg剂量免疫仔猪后特异性抗体检测结果 |
| 4.2 免疫仔猪T淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+的检测结果 |
| 4.2.1 0.25mg剂量免疫仔猪后CD~3+、CD~4+、CD~8+T细胞亚类数量 |
| 4.2.2 0.5mg剂量免疫仔猪后CD~3+、CD~4+、CD~8+T细胞亚类数量 |
| 4.3 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗在小鼠体内的分布检测结果 |
| 4.4 pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗安全性检测结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 猪圆环病毒2型核酸疫苗的免疫效应 |
| 5.2 ISS对猪圆环病毒核酸疫苗的佐剂效应 |
| 5.3 细胞因子的佐剂效应 |
| 5.4 免疫剂量对核酸疫苗免疫效果的影响 |
| 5.5 核酸疫苗的分布检测结果分析 |
| 5.6 核酸疫苗的安全性检测结果分析 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒病国内外的流行情况及研究进展 |
| 1.1 猪圆环病毒分类地位和形态 |
| 1.2 猪圆环病毒理化特征 |
| 1.3 猪圆环病毒的细胞培养特征 |
| 1.4 猪圆环病毒的基因组特征 |
| 1.5 猪圆环病毒ORF2基因的研究进展 |
| 1.6 猪圆环病毒核定位序列 |
| 1.7 猪圆环病毒潜在的抗原位点 |
| 1.8 猪圆环病毒致病机理 |
| 1.9 猪圆环病毒流行病学 |
| 1.9.1 流行情况及分布 |
| 1.9.2 易感动物 |
| 1.9.3 传播方式及途径 |
| 1.9.4 猪圆环病毒2型分子流行病学 |
| 1.9.5 动物感染试验 |
| 1.10 潜在的人畜共患病评估 |
| 1.11 猪圆环病毒防制中存在的问题 |
| 2 猪圆环病毒疫苗的研究进展 |
| 2.1 猪圆环病毒2型常规疫苗的研究概况 |
| 2.1.1 PCV灭活疫苗 |
| 2.1.2 弱毒疫苗 |
| 2.2 猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究概况 |
| 2.2.1 核酸疫苗 |
| 2.2.2 重组疫苗 |
| 2.2.3 活载体疫苗 |
| 2.3 核酸疫苗的优点与存在问题 |
| 2.3.1 核酸疫苗的优点 |
| 2.3.2 核酸疫苗存在的问题 |
| 3 ISS增强核酸疫苗免疫原性研究进展 |
| 3.1 ISS基序的作用机理及免疫学作用 |
| 3.2 ISS基序对核酸疫苗免疫原性的影响 |
| 3.3 ISS-DNA作为疫苗佐剂的应用 |
| 3.4 ISS-DNA在DNA疫苗中的作用 |
| 3.5 ISS-DNA作为核酸疫苗佐剂的发展前景 |
| 4 猪细胞因子分子免疫佐剂的研究进展 |
| 4.1 介导天然免疫的细胞因子 |
| 4.1.1 Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ) |
| 4.1.2 白细胞介素-1(IL-1) |
| 4.1.3 白细胞介素-6(IL-6) |
| 4.1.4 白细胞介素-8(IL-8) |
| 4.1.5 肿瘤坏死因子(TNF) |
| 4.2 调节淋巴细胞活化、生长和分化的细胞因子 |
| 4.2.1 白细胞介素-2(IL-2) |
| 4.2.2 白细胞介素-4(IL-4) |
| 4.2.3 白细胞介素-10(IL-10) |
| 4.2.4 白细胞介素-12(IL-12) |
| 4.2.5 白细胞介素-15(IL-15) |
| 4.2.6 转化生长因子β(TGFβ) |
| 4.3 活化炎性细胞的细胞因子 |
| 4.3.1 干扰素-γ(IFN-γ) |
| 4.3.2 白细胞介素-18(IL-18) |
| 4.4 未成熟白细胞生长和分化的细胞因子 |
| 4.4.1 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) |
| 4.4.2 白细胞介素-7(IL-7) |
| 5 壳聚糖及包被技术研究进展 |
| 6 猪圆环病毒2型诊断技术 |
| 6.1 病毒的分离鉴定 |
| 6.2 PCR技术(PCR) |
| 6.3 病毒抗体的检测技术 |
| 6.3.1 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 6.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 参考文献 |
| 缩写语及中英文对照 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文、出版着作、科研成果 |
（6）抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1.1 猪瘟简介 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 猪瘟病毒的分子生物学特性 |
| 1.2 猪瘟诊断方法的研究进展 |
| 1.2.1 血清学诊断技术 |
| 1.2.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.3 猪瘟的免疫预防 |
| 1.4 猪瘟疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 猪瘟病毒传统疫苗的研究 |
| 1.4.2 猪瘟病毒新型疫苗的研究 |
| 1.5 开展本论文研究的目的和意义 |
| 第二章 DNA疫苗研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 DNA疫苗作用机制 |
| 2.3 增强DNA疫苗免疫效果 |
| 2.3.1 免疫方式及途径的优化对DNA疫苗的增强作用 |
| 2.3.2 质粒载体序列的优化对DNA疫苗的增强作用 |
| 2.4 细胞因子佐剂对DNA疫苗的增强作用 |
| 2.4.1 IL-2 |
| 2.4.2 IL-12 |
| 2.4.3 GM-CSF |
| 2.5 展望 |
| 第三章 抗猪瘟病毒单基因及双基因融合DNA疫苗的初步研究 |
| 3.1 材料和实验动物 |
| 3.1.1 载体、病毒和细胞 |
| 3.1.2 血清与二抗 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要溶液和培养基的配制 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 猪瘟病毒基因组RNA的提取和RT-PCR |
| 3.2.2 引物的设计 |
| 3.2.3 目的基因的扩增 |
| 3.2.4 重组质粒DNA的构建操作 |
| 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 质粒的转化 |
| 3.2.7 质粒的小量制备 |
| 3.2.8 DNA片段的回收和纯化 |
| 3.2.9 细胞传代培养 |
| 3.2.10 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.11 脂质体介导的真核细胞转染 |
| 3.2.12 细胞接毒 |
| 3.2.13 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.14 重组质粒在PK-15细胞中的瞬时表达 |
| 3.2.15 间接免疫荧光检测目的蛋白表达 |
| 3.2.16 Western Blot检测目的蛋白表达 |
| 3.2.17 重组质粒的大量提取 |
| 3.2.18 动物DNA免疫接种 |
| 3.2.19 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定 |
| 3.2.20 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 |
| 3.2.21 免疫小鼠IFN-γ水平的测定 |
| 3.2.22 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定 |
| 3.2.23 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定 |
| 3.2.24 免疫猪体攻毒前后猪体白细胞数量的测定 |
| 3.2.25 免疫猪体攻毒前后猪体血清中特异性抗体的测定 |
| 3.2.26 免疫猪体攻毒前后猪体组织RT-PCR检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组表达载体的构建及酶切鉴定 |
| 3.3.2 目的片段的序列分析 |
| 3.3.3 免疫荧光检测结果 |
| 3.3.4 Western Blot检测结果 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清特异性抗体的检测 |
| 3.3.6 免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖 |
| 3.3.7 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌 |
| 3.3.8 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定 |
| 3.3.9 免疫猪体白细胞数量变化 |
| 3.3.10 免疫猪体特异性抗猪瘟病毒E2或E~(rns)蛋白抗体水平 |
| 3.3.11 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状观察及体温的测定 |
| 3.3.12 免疫猪体攻毒后猪体血毒和鼻拭子载毒量的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 TRIF对抗猪瘟DNA疫苗免疫效果的增强作用研究 |
| 4.1 材料和实验动物 |
| 4.1.1 载体、病毒和细胞 |
| 4.1.2 血清与二抗 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 4.2.2 TRIF重组质粒的鉴定 |
| 4.2.3 动物分组及DNA免疫接种 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定 |
| 4.2.5 免疫小鼠IFN-γ水平的测定 |
| 4.2.6 免疫猪体攻毒前后血清中特异性中和抗体的测定 |
| 4.2.7 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定 |
| 4.2.8 免疫猪体攻毒前后猪体白细胞数量的测定 |
| 4.2.9 免疫猪体攻毒前后猪体血清中特异性抗体的测定 |
| 4.2.10 免疫猪体攻毒前后猪体血清和鼻拭子样品的RT-PCR检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.3.2 免疫荧光检测结果 |
| 4.3.3 pRK-TRIF对IFN-β和NF-κB启动子活性影响 |
| 4.3.4 免疫小鼠血清特异性抗体的检测 |
| 4.3.5 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况 |
| 4.3.6 免疫猪体特异性中和抗体的检测 |
| 4.3.7 免疫猪体攻毒前后猪体临床症状的观察及体温的测定 |
| 4.3.8 免疫猪体白细胞数量的检测 |
| 4.3.9 免疫猪体特异性抗猪瘟病毒E2或E~(rns)蛋白抗体的检测 |
| 4.3.10 免疫猪体攻毒后猪体血毒和鼻拭子载毒量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 病毒样品及增殖 |
| 5.1.2 引物和探针序列 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 病毒的培养 |
| 5.2.2 病毒DNA提取 |
| 5.2.3 临床标本的处理 |
| 5.2.4 常规PCR(第一次PCR) |
| 5.2.5 标准品的制备 |
| 5.2.6 荧光定量PCR |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 标准曲线的建立 |
| 5.3.2 特异性检测 |
| 5.3.3 重复性检测 |
| 5.3.4 细胞培养法和常规PCR法检测检测PRV |
| 5.3.5 临床标本的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 硕博连读期间发表与待发表的文章 |
| 致谢 |
（7）猪瘟兔化弱毒细胞苗和脾淋苗细胞免疫效果的比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 绪论 |
| 1 猪瘟的概述 |
| 1.1 猪瘟的简介 |
| 1.2 猪瘟的危害 |
| 1.3 猪瘟的流行情况 |
| 1.4 猪瘟的防治 |
| 1.5 猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV） |
| 2 猪瘟免疫的研究进展 |
| 2.1 猪瘟与体液免疫 |
| 2.2 猪瘟与细胞免疫 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二部分 正文 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 血常规结果 |
| 2.2 流式细胞仪检测CD3~+、CD4~+、CD8~+亚群结果 |
| 2.3 外周血淋巴细胞增殖活性检测结果 |
| 2.4 猪外周血细胞因子浓度检测结果 |
| 2.5 仔猪循环抗体检测结果 |
| 2.6 生长性能 |
| 2.7 猪主要病毒病的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于选择试验动物的问题 |
| 3.2 关于本试验中统计学的问题 |
| 3.3 关于试验中血液样本的处理 |
| 3.4 关于淋巴细胞亚群变化的问题 |
| 3.5 关于淋巴细胞增殖试验 |
| 3.6 关于细胞免疫的问题 |
| 3.7 关于疫苗的理性选择 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 本文创新性研究工作 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 小鹅瘟的研究进展 |
| 1 小鹅瘟病毒的病原学特征 |
| 1.1 小鹅瘟病毒的理化特征 |
| 1.2 小鹅瘟病毒的宿主范围和培养特性 |
| 1.3 基因组分子生物学 |
| 1.4 蛋白质分子生物学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状和病理变化 |
| 3.1 肠道变化 |
| 3.2 其他组织器官的变化 |
| 4 小鹅瘟诊断方法 |
| 5 小鹅瘟病毒的基因克隆以及体外编码蛋白的研究 |
| 6 综合防制 |
| 7 研究展望 |
| 第二章 增强基因疫苗免疫效果的策略 |
| 1 基因疫苗的免疫学优势和所存在的问题 |
| 1.1 基因疫苗的免疫学优势 |
| 1.1.1 诱导全方位的免疫应答 |
| 1.1.2 不同血清亚型的交叉免疫 |
| 1.1.3 嵌合免疫、多重免疫及联合免疫 |
| 1.1.4 长期免疫 |
| 1.1.5 性质稳定,安全性好,受母源抗体影响小 |
| 1.2 制约基因疫苗免疫效果的因素 |
| 1.2.1 依赖宿主产生抗原 |
| 1.2.2 宿主细胞内外屏障 |
| 1.2.3 抗原表达量低 |
| 2 增强基因疫苗免疫效果的一些策略 |
| 2.1 基因疫苗质粒的优化 |
| 2.1.1 选择强的转录启动子 |
| 2.1.2 注意密码子的偏嗜 |
| 2.1.3 构建双向或双顺反子质粒 |
| 2.1.4 载体中的免疫刺激性序列(ISS) |
| 2.1.5 其它元件 |
| 2.2 免疫接种系统和途径的选择 |
| 2.2.1 接种方法 |
| 2.2.2 接种途径 |
| 2.2.3 免疫动物的预处理 |
| 2.3 克服细胞内、外屏障 |
| 2.3.1 使用脂质体、亚精胺和核酸酶抑制剂 |
| 2.3.2 抗原蛋白的泛素化表达 |
| 2.3.3 内质网转运信号序列 |
| 2.3.4 基因疫苗的细菌传送系统 |
| 2.4 优化免疫应答趋向类型 |
| 2.4.1 和细胞因子共表达 |
| 2.4.2 共刺激信号分子 |
| 2.4.3 初次免疫和加强免疫使用相同抗原的不同类型的疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 小鹅瘟病毒VP3基因的克隆和分子特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒及核酸 |
| 1.2 试验动物和鹅胚 |
| 1.3 质粒与感受态细胞 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 GPV CHv-1强毒株的增殖 |
| 2.2 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 VP3基因的PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的凝胶试剂盒回收和纯化 |
| 2.6 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 |
| 2.7 VP3基因加A尾以及与T载体的连接 |
| 2.8 重组质粒的转化 |
| 2.9 碱裂解法小量抽提重组质粒 |
| 2.10 重组质粒的酶切鉴定及PCR鉴定 |
| 2.11 VP3基因序列测定 |
| 2.12 VP3基因及推导蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR结果 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 CHv-1株VP3基因测序结果及其与标准株的比较分析 |
| 3.4 GPV VP3基因的遗传特点 |
| 3.5 GPV CHv-1 VP3基因推导蛋白质二级结构预测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于GPV VP3基因的PCR扩增 |
| 4.2 GPV CHv-1株VP3基因的序列测定和结果分析 |
| 4.3 GPV VP3基因用于构建基因疫苗的可行性 |
| 5 小结 |
| 第四章 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其在真核细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 毒株、细胞及鸭胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 T载体的酶切和VP3基因片段的纯化回收 |
| 2.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切和线性化 |
| 2.3 VP3基因回收片段和线性化pcDNA3.1(+)的连接(亚克隆) |
| 2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.5 真核重组表达载体的转化 |
| 2.6 阳性重组真核表达质粒的小量抽提和鉴定 |
| 2.7 GPV病毒提纯及兔抗GPV多克隆抗体的制备 |
| 2.8 pcDNA-VP3转染COS-7真核细胞 |
| 2.9 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-VP3在真核细胞的瞬时表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 VP3基因的亚克隆 |
| 3.2 兔抗GPV IgG的纯化结果 |
| 3.3 真核表达质粒在COS-7细胞上的瞬时表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 构建小鹅瘟基因疫苗的必要性 |
| 4.2 构建基因疫苗的一些影响因素 |
| 4.3 GPV VP3基因疫苗在真核细胞的表达 |
| 5 小结 |
| 第五章 串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3融合基因DNA疫苗的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重叠延伸引物的设计 |
| 2.2 碱裂解法小量抽提pMD18T-gIL2和pMD18T-VP3 |
| 2.3 gIL-2基因的PCR扩增 |
| 2.4 VP3基因的PCR扩增 |
| 2.5 gIL-2和VP3基因PCR产物的回收和纯化 |
| 2.6 gIL2-VP3融合基因的SOE PCR扩增 |
| 2.7 融合基因PCR产物的纯化和回收 |
| 2.8 克隆至pMD18T-Simple载体和转化受体菌 |
| 2.9 融合基因gIL2-VP3的亚克隆 |
| 2.10 融合基因真核表达载体的鉴定 |
| 2.11 融合蛋白的生物信息学分析 |
| 2.12 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞上的表达 |
| 2.13 pcDNA-gIL2-VP3表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 gIL2-Linker的初次PCR结果 |
| 3.2 GPV的Linker-VP3初次PCR结果 |
| 3.3 gIL2-VP3融合基因的PCR结果 |
| 3.4 融合基因的T载体克隆和测序结果 |
| 3.5 pcDNA-gIL2-VP3真核表达载体的构建结果 |
| 3.6 gIL2-VP3融合基因的生物信息学分析 |
| 3.7 间接免疫荧光抗体法检测pcDNA-gIL2-VP3在真核细胞中的表达 |
| 3.8 表达蛋白的gIL-2生物学活性测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于鹅白介素-2(gIL-2)的佐剂效应 |
| 4.2 关于重叠延伸PCR |
| 4.3 融合基因gIL2-VP3的分子结构特点 |
| 4.4 gIL-2信号肽引导的分泌表达 |
| 5 小结 |
| 第六章 CpG序列嵌入串联鹅IL-2的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗中的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CpG的合成及T载体克隆 |
| 2.2 pMD18 T-CpG的酶切和回收 |
| 2.3 pcDNA-gIL2-VP3的酶切和回收 |
| 2.4 CpG和线性pcDNA-gIL2-VP3的连接 |
| 2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 pcDNA-gIL2-VP3/CpG重组质粒的筛选 |
| 2.8 pcDNA-gIL2-VP3/CpG真核表达质粒在真核细胞的表达 |
| 2.9 pcDNA-gIL2-VP3/CpG对鹅外周血淋巴细胞的免疫刺激作用 |
| 3 结果 |
| 3.1 pMD18 T-CpG的测序结果 |
| 3.2 pMD18T-CpG的酶切鉴定 |
| 3.3 pcDNA-gIL2-VP3/CpG的构建及其鉴定 |
| 3.4 间接免疫荧光抗体试验检测pcDNA-gIL2-VP3/CpG在真核细胞的表达 |
| 3.5 CpG序列对鹅外周血淋巴细胞的增殖效应 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于CpG ODN的设计和嵌入质粒的构建 |
| 4.2 CpG序列的免疫佐剂效应 |
| 5 小结 |
| 第七章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅细胞免疫的比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因疫苗的大量制备 |
| 2.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗质粒 |
| 2.3 雏鹅的分组免疫及血样采集 |
| 2.4 鹅外周血(PBMC)淋巴细胞增殖试验(MTT法) |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 样品检测及数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因疫苗免疫动物后健康状况 |
| 3.2 鹅免疫GPV VP3基因疫苗后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.3 pcDNA-VP3基因疫苗免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.4 pcDNA-gIL2-VP3免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.5 pcDNA-gIL2-VP2/CpG免疫鹅后外周血淋巴细胞增殖试验结果 |
| 3.6 GPV VP3基因疫苗免疫鹅后外周淋巴血细胞增殖试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞免疫对于防治感染性疾病的重要性 |
| 4.2 细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.3 分子免疫佐剂对基因疫苗诱导的细胞免疫反应的影响 |
| 4.4 免疫途径、剂量对细胞免疫的影响 |
| 5 小结 |
| 第八章 串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗诱导鹅体液免疫的比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、质粒及疫苗 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鹅血清IgG的纯化 |
| 2.2 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.3 间接ELISA的操作方法 |
| 2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 2.6 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清IgG水平的检测 |
| 2.7 GPV CHa弱毒株TCID_(50)的测定 |
| 2.8 GPV VP3基因疫苗免疫雏鹅后血清中和抗体水平的检测 |
| 2.9 种鹅的分组免疫及所产蛋卵黄ELISA抗体和中和抗体的检测 |
| 2.10 免疫种鹅所产蛋孵出的小鹅攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔抗鹅HRP酶标抗体的制备 |
| 3.2 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.3 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 3.4 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后的IgG动态变化结果 |
| 3.5 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-VP3后IgG动态变化 |
| 3.6 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3基因疫苗后IgG动态变化 |
| 3.7 间接ELISA检测鹅免疫pcDNA-gIL2-VP3/CpG基因疫苗后IgG动态变化 |
| 3.8 间接ELISA检测鹅免疫GPV VP3基因疫苗后IgG动态变化结果 |
| 3.9 病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.10 鹅基因免疫后血清中和抗体试验检测结果 |
| 3.11 母鹅卵黄抗体ELISA检测结果和中和抗体试验结果 |
| 3.12 雏鹅攻毒保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ELISA标准方法的建立 |
| 4.2 关于GPV VP3基因疫苗诱导的体液免疫 |
| 4.3 免疫佐剂对体液免疫的影响 |
| 4.4 雏鹅攻毒保护试验 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 第五部分 附件材料 |
| 附录一 主要溶液试剂的配制 |
| 附录二 雏鹅攻毒保护试验中发病鹅的主要临床症状和病变 |
| 附录三 测序报告 |
| 1.pMD18T-VP3测序结果 |
| 2.pMD18T-gIL2-VP3测序结果 |
| 3.pMD18T-CpG测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）猪瘟超前免疫效果综合评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 猪瘟病毒研究进展 |
| 1 猪瘟概述 |
| 2 猪瘟病毒理化特性与基因组结构 |
| 3 CSFV致宿主细胞病变的遗传机制 |
| 4 CSFV的免疫反应机制 |
| 5 猪瘟病毒的进化和遗传分型 |
| 综述二 猪瘟诊断与防治研究进展 |
| 1 猪瘟诊断研究进展 |
| 2 CSFV疫苗的研究 |
| 3 猪瘟超前免疫研究进展 |
| 4 猪瘟防治研究进展 |
| 第二章 猪瘟超前免疫的体液免疫检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪瘟超前免疫的细胞免疫检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪瘟超前免疫的黏膜免疫检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 英文缩写词表 |
（10）猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪瘟的研究进展 |
| 1.1 猪瘟的流行病学特点与分布 |
| 1.2 猪瘟的临床症状和病理变化 |
| 1.3 猪瘟的致病机理 |
| 1.4 猪瘟的诊断和控制 |
| 1.4.1 猪瘟的诊断 |
| 1.4.2 猪瘟的防控 |
| 第二章 猪瘟病毒的研究进展 |
| 2.1 猪瘟病毒的形态及理化性质 |
| 2.2 猪瘟病毒基因组结构及其研究进展 |
| 2.3 猪瘟病毒的毒力与血清分型 |
| 2.4 猪瘟病毒基因组编码蛋白的结构与功能 |
| 2.4.1 猪瘟病毒结构蛋白及其功能 |
| 2.4.2 猪瘟病毒非结构蛋白及其功能 |
| 2.5 猪瘟病毒的侵入与复制 |
| 2.6 猪瘟病毒致病的细胞学机制研究 |
| 2.7 猪瘟病毒的抗原性研究 |
| 2.8 猪瘟病毒的遗传分型与进化 |
| 第三章 新型猪瘟疫苗的研究进展 |
| 3.1 传统弱毒猪瘟疫苗研究概述 |
| 3.2 猪瘟病毒全长cDNA 标记疫苗研究 |
| 3.3 猪瘟抗原蛋白亚单位疫苗研究 |
| 3.4 猪瘟病毒活载体重组疫苗研究 |
| 3.5 猪瘟基因缺失型弱毒疫苗研究 |
| 3.6 猪瘟病毒DNA 疫苗研究 |
| 3.7 其它疫苗研究 |
| 3.8 猪瘟新型疫苗研究展望 |
| 第四章 CSFV 囊膜蛋白E0-E1-E2 基因序列的RT-PCR 及重组质粒的构建 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RT-PCR 产物电泳鉴定 |
| 4.2.2 质粒载体的双酶切电泳鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 猪瘟病毒抗原基因的选择 |
| 4.3.2 本研究所构建重组质粒的特点 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 pcDAN4.0-E 重组质粒注射小鼠的免疫学研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 质粒和菌种 |
| 5.1.2 试验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 pcDNA4.0-E 重组质粒的大量提取与纯度测定 |
| 5.1.6 试验小鼠分组及采样 |
| 5.1.7 淋巴细胞转化增殖试验（MTT 法） |
| 5.1.8 血清抗体ELISA 检测 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 注射质粒后小鼠临床观察和剖检变化 |
| 5.2.2 淋巴细胞最佳培养条件的确定 |
| 5.2.3 pcDNA4.0-E 重组质粒免疫对小鼠外周血淋巴细胞转化增殖的影响 |
| 5.2.4 pcDNA4.0-E 重组质粒免疫对小鼠脾脏淋巴细胞转化增殖的影响 |
| 5.2.5 血清抗体ELISA 检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 淋巴细胞转化增殖试验最佳试验条件的选择 |
| 5.3.2 注射pcDNA4.0-E 重组质粒对小鼠机体免疫机能的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 pcDAN4.0-E 重组质粒对仔猪的免疫保护试验 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 质粒和菌种 |
| 6.1.2 种毒 |
| 6.1.3 试验动物 |
| 6.1.4 主要试剂 |
| 6.1.5 主要仪器 |
| 6.1.6 pcDNA4.0-E 重组质粒的大量提取与纯度测定 |
| 6.1.7 试验仔猪分组及免疫程序 |
| 6.1.8 注射pcDNA4.0-E 重组质粒对试验猪体重增长的影响 |
| 6.1.9 CSFV 抗体水平检测 |
| 6.1.10 试验猪的攻毒程序 |
| 6.1.11 攻毒后试验猪体温的变化 |
| 6.1.12 攻毒后试验猪的临床症状和病理学观察 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 注射pcDNA4.0-E 重组质粒对试验猪体重增长的影响 |
| 6.2.2 注射pcDNA4.0-E 重组质粒后试验猪抗体水平的变化 |
| 6.2.3 攻毒后试验猪体温的变化 |
| 6.2.4 攻毒后试验猪的临床症状和病理学变化 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究（论文参考文献）
- [1]猪外周血细胞免疫流式细胞术检测方法的建立及其应用[D]. 赵歌. 扬州大学, 2021(08)
- [2]多糖佐剂在疫苗中的应用[J]. 姜威,朱婷,王玉霞,张振学,单俊杰. 中国新药杂志, 2012(13)
- [3]多糖佐剂在疫苗中的应用[A]. 单俊杰,姜威,朱婷,王玉霞. 2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集, 2011
- [4]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [5]猪圆环病毒pVAX1-ORF2-ISS核酸疫苗及与猪细胞因子联合免疫研究[D]. 张建远. 四川农业大学, 2009(07)
- [6]抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究[D]. 万超. 武汉大学, 2009(04)
- [7]猪瘟兔化弱毒细胞苗和脾淋苗细胞免疫效果的比较[D]. 徐磊. 福建农林大学, 2009(12)
- [8]串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究[D]. 韩新锋. 四川农业大学, 2008(01)
- [9]猪瘟超前免疫效果综合评价[D]. 高云航. 吉林农业大学, 2007(02)
- [10]猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究[D]. 白华. 西北农林科技大学, 2007(06)