一、EB病毒中早期表达的癌基因——BARF1（论文文献综述）
杨佳宁,李娜,董鸿铭,徐媛,李淑英[1]（2021）在《EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响》文中指出目的探讨爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）编码的BARF1基因对人胃上皮细胞（GES-1）增殖、迁移及细胞周期分布的影响。方法将pIRES-EGFP/BARF1重组质粒、pIRES-EGFP空载体转染GES-1细胞,通过G418筛选,获得稳定表达pIRES-EGFP/BARF1及pIRES-EGFP的GES-1细胞。在荧光显微镜下观察转染与未转染组细胞生长状况;通过逆转录PCR（Reverse Transcription-PCR,RT-PCR）检测转染细胞中BARF1基因表达情况;通过细胞计数及CCK8法评估转染与未转染三组细胞的增殖能力;通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）染色法评价不同组别细胞周期蛋白Cyclin D1的表达情况;应用划痕实验分别对稳定转染BARF1组和空载体组GES-1细胞的迁移效率进行分析评价;应用流式细胞仪检测与分析细胞周期的分布情况。结果获得稳定表达pIRES-EGFP/BARF1、pIRES-EGFP的GES-1细胞模型;稳定转染BARF1组的细胞增殖能力高于未转染组及转染空载体组,并且稳定转染BARF1组S期显着延长;稳定转染BARF1组GES-1细胞的迁移能力比转染pIRES-EGFP空载体组得到明显提升;细胞周期蛋白Cyclin D1集中表达在稳定转染BARF1组的GES-1细胞核内。结论作为EBV编码的癌基因BARF1能够促进人胃上皮细胞GES-1增殖、迁移及分裂,抑制细胞凋亡,促进胃上皮细胞的恶性转化。
郑小辉[2]（2020）在《鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究》文中指出目的:鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤,在中国南方和东南亚地区广泛流行。临床上鼻咽癌的早诊早治成为提高患者生存率、改善预后的关键突破口。寻找和建立简单可靠的生物学标志物应用于高发区鼻咽癌的早期诊断和筛查是亟待解决的重要问题。已有充分的研究表明,EB病毒（Epstein-barr virus,EBV）感染在鼻咽癌的发病中扮演着非常重要的角色,鼻咽刷取样结合EB病毒核酸标志物检测可能会为高发区鼻咽癌的诊断和筛查提供新的研究思路。我们开展该项研究的目的主要有:（1）探讨鼻咽刷取样结合EBV DNA检测对中国华南区高发的鼻咽癌是否具有较好的诊断应用价值。（2）明确鼻咽刷样本中EBV的产生来源,以确定是否是肿瘤细胞来源反应鼻咽癌的发生,为鼻咽部EB病毒核酸标志物的发掘和利用提供清晰的理论基础。（3）发掘适用于辅助鼻咽癌诊断的核酸标志物,尤其适用于在高发现场不依赖临床医生和医疗设备的盲刷取样条件下的标志物,以利于在高发现场人群筛查中的应用。方法:本项研究以鼻咽癌作为研究疾病模型,通过与地处中国华南地区鼻咽癌高发区的中山大学肿瘤防治中心人员合作开展进行,便于充分利用当地丰富的病例资源。（1）首先招募了129例的鼻咽癌患者,116例的对照受试者,58例接受治疗后的复查患者（训练集人群）,对每例受试者通过已建立的鼻咽刷取样体系刷取鼻咽部样本,对鼻咽刷样本中EBV DNA load进行q-PCR检测,对配对血液样本中的EBV VCA-IgA抗体滴度和EBV DNA load分别进行免疫酶法和q-PCR定量检测,评估鼻咽刷EBV DNA load的诊断价值。（2）进一步对上述训练集人群刷取的鼻咽刷样本,同时提取了样本中的总DNA和RNA,对获得鼻咽刷样本中的EBV DNA进行了比较PCR实验,即同时检测EBV基因组中EBNA1基因的99bp和213bp的片段,以判断DNA是否是凋亡裂解的DNA片段;对获得的RNA中EBV转录的六个潜伏期基因（包括EBER1,BART,LMP1,LMP2A,EBNA1和EBNA2）,五个裂解期基因（包括立早期ZEBRA和RTA,早期基因PK和TK以及晚期基因VCA-p18）以及转录的四个Bart miRNAs（mir-bart1-5p,mir-bart5,mir-bart16,mir-bart17-5p）的转录表达进行了q-PCR检测,与EBV DNA load进行了相关性分析,并与49例活检组织（包括36例鼻咽癌和13例黏膜炎症）中这11个EBV mRNA和4个miRNA的表达进行了比较研究;对鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区甲基化状态,包括甲基化程度（methylated degree）和甲基化类型（methylated type）进行了甲基化特异的PCR检测,通过这些实验的开展明确EBV的产生来源,以确定鼻咽刷EBV是否是鼻咽癌来源。（3）最后通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）曲线,相关性分析等分析方法确定截断值（Cut off value,COV）,评价了训练集样本中检测的EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type等多个其它核酸标志物单个及联合应用于鼻咽癌诊断的诊断准确性,并在另一包含424例样本的独立验证集人群（215例鼻咽癌患者和209例非鼻咽癌受试者）中进行验证。此外,又对38例鼻咽癌患者和48例对照受试者平行进行了不依赖内镜引导的取样,获得了配对的盲刷条件下的鼻咽刷样本,评价了这些核酸标志物在盲刷下应用于诊断的价值。结果:（1）对鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测显示在鼻咽癌组,所有的鼻咽刷样本中都显示阳性结果并且EBV DNA load显着升高（平均值为46360 copies/ng DNA,表达范围为40–1395000 copies/ng DNA）。在非鼻咽癌的对照组和现场人群对照组,EBV DNA load阳性率和拷贝数值分别为70.6%（平均值28 copies/ng DNA,表达范围0158 copies/ng DNA）和87.8%（平均值50 copies/ng DNA,表达范围0469copies/ng DNA）,治疗之后,阳性率为63.8%（平均值27 copies/ng DNA,表达范围0417 copies/ng DNA）。通过ROC曲线确定截断值,鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测应用于鼻咽癌诊断的敏感度和特异性分别达到了96%和97%,平行试验显示诊断效果优于EB病毒血清VCA-IgA抗体（敏感度89%,特异度77%）和血浆EBV DNA load（敏感度为76%,特异度为87%）的检测。与11例病人（约为8.5%）需要多次活检不同的是,这11例病例在接受首次刷检时,EBV DNA load都高于设定的截断值,有效弥补传统指标的不足。（2）对EBV DNA进行比较PCR的结果显示,104例鼻咽癌患者鼻咽刷样本中,只在12例样本中检测到EBNA1基因99bp短片段数量的显着增多,提示只有少量样本中有明显的EBV DNA的降解;对EBV六个潜伏期和五个裂解期基因的转录检测结果显示在鼻咽癌鼻咽刷样本中EBV RNA转录是典型的II型EBV潜伏感染,即高表达EBER1,BART,LMP1,LMP2A和EBNA1基因,而不表达EBNA2,同时也检测到一定频率（从31.4%到93%）的裂解期基因的表达,这与鼻咽活检组织表达情况类似,提示鼻咽刷样本标志物能反应鼻咽部鼻咽癌的生长情况。在对照组鼻咽刷样本中,主要在49.3%的样本中检测到少量的EBER1基因的表达,但同时也在0%到15.5%的样本中检测到少量的几个裂解期基因的表达。相关性分析显示无论是在鼻咽癌组还是对照组,潜伏期和裂解期基因的表达频率都与EBV DNA load具有显着的相关性,但EBV DNA load与EBV转录产物EBER1表达的相关性只在鼻咽癌患者中观察到,而在对照组两者不存在显着相关。对EBV miRNAs的检测也得到了相似的结果。EBV DNA C-promoter区甲基化检测结果显示在鼻咽癌组,鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区主要是以methylated type为主,methylated degree较高,而在对照组鼻咽刷样本中则以non-methylated type为主,methylated degree较低,结果提示鼻咽癌患者鼻咽刷样本中EBV DNA load主要来自感染EBV的肿瘤细胞贡献,而在对照组鼻咽刷样本中主要来自游离EBV的贡献。（3）基于EBV DNA load,EBV DNA methylated degree,EBV DNA methylated type和EBV miRNA在鼻咽癌和对照组中表达的显着不同,进一步分析显示EBV mir-bart1-5p（敏感度93.94%,特异度100%）,EBV DNA methylated degree（敏感度95.2%,特异度94.7%）和EBV DNA methylated type（敏感度100%,特异度81.6%）应用于鼻咽癌的诊断均具有较高的准确性。EBV mir-bart-1-5p的诊断价值在另一包含424例样本的独立人群中得到了验证,对于鼻咽癌诊断的敏感度为93.5%,特异度为100%。基于EBV DNA methylated type在鼻咽癌和对照组的性质不同,即在鼻咽癌患者中,EBV DNA C-promoter区域主要呈现甲基化的状态,即启动子区发生甲基化EBV DNA的数量（定义为A类EBV DNA）多于非甲基化DNA的数量（定义为B类EBV DNA）,即A/B>1。而在对照组中,EBV DNA C-promoter区主要呈现非甲基化的状态,即发生甲基化EBV DNA的数量（A类EBV DNA）少于非甲基化DNA的数量（B类EBV DNA）,即A/B<1。这为鼻咽刷刷检发展到不依赖于临床的盲刷取样提供了可能,我们的结果显示在盲刷的取样条件下,由于取样部位失去了电子鼻咽镜的引导,取样的精度降低,这导致鼻咽刷样本中的EBV DNA load（敏感度由95.2%下降到55.3%）和EBV DNA methylated degree（敏感度由95.2%下降到57.9%）等定量指标的诊断敏感度会有很大程度的降低,但获取的总EBV DNA中A/B是大于或小于1的特性是基本不变的（敏感度由100%变为89.5%）。结论:鼻咽部EB病毒核酸标志物,包括EBV DNA load,EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type作为高效的分子标志物,应用于鼻咽癌诊断具有较好准确性;通过对鼻咽刷样本中EBV多个潜伏和裂解期基因转录表达谱的研究,以及对EBV miRNA和EBV DNA C-promoter区甲基化的研究,间接和直接两方面充分表明鼻咽癌患者鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自潜伏感染EBV的肿瘤细胞,反应了鼻咽部鼻咽癌的生长情况,而对照组鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自裂解释放的游离EBV颗粒;基于鼻咽刷样本中EBV DNA在病例组和对照组产生途径的不同及所引起的EBV DNA C-promoter区甲基化性质的不同,我们提出检测methylated type这一适用于盲刷取样的定性标志物,突破了鼻咽刷刷检在现场广泛开展应用的瓶颈。通过开展的这三方面的研究,为中国鼻咽癌高发区的鼻咽癌诊断和筛查提供了新思路,对于完善鼻咽癌的病因理论具有重要价值。
杨爱华[3]（2019）在《胃癌患者EB病毒抗体和内皮素ET-1抗体检测及临床意义》文中指出目的:检测EB病毒相关胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）患者血清中EB病毒相关抗体、内皮素-1（endothelin 1,ET-1）及其受体ETAR、ETBR水平,探讨其在EBVaGC早期辅助诊断中的意义,分析两者间的相互关系。方法:应用原位杂交技术确认EBVaGC患者31例,同时选取临床病理资料与之匹配的EBV阴性胃癌（EBV nagtive gastric carcinoma,EBVnGC）患者40例作为对照,应用化学发光法检测EB病毒相关抗体水平,ELISA法检测内皮素-1（ET-1）及其受体ETAR和ETBR,采用阳性率、灵敏度、特异度、阳性似然比、阳性预测值等参数来评估这些指标在EBVaGC早期诊断中的价值。结果:（1）EBVaGC与EBVnGC两组患者EBV EA IgG、EBV VCA IgA阳性率比较（χ2=31.97,7.99,P<0.05）,差异显着,具有统计学意义;EBV EA IgA、EBV VCA IgM、EBV VCA IgG、EBV NA IgG阳性率比较（χ2=0.11～0.88,P>0.05）,无显着性差异。（2）EBV EA IgG、EBV VCA Ig A阳性似然比、阳性预测值均大于其他4项抗体（χ2=5.19～20.18,P<0.05）;EBV VCA Ig G和EBV NA IgG灵敏度虽高,但是特异度较低,EBV EA IgA特异度虽高,但是灵敏度却偏低。EBV EA IgG、EBV VCA IgA抗体检测较其他相关抗体兼具较高的灵敏度、特异度（χ2=11.65～29.62,P<0.05）。（3）EBVaGC组EBV抗体阳性模式多样化。（4）EBVaGC组ET-1、ETAR和ETBR血清水平均明显低于EBVn GC组,具显着性差异（P<0.05）。（5）EBVaGC与EBVnGC患者VCA IgM与ET-1,ETAR和ETBR之间呈正相关（r=0.323,0.290,0.325,P<0.05）。根据结果判断标准,EBVaGC患者EBV DNA阳性率明显高于EBVnGC患者（P<0.01）,且EBV DNA拷贝数与ET-1/ETAR/ETBR含量呈负性关系。结论:（1）EA IgG和VCA IgA抗体效价升高有助于EBVaGC的早期辅助诊断。（2）EBVaGC组EBV抗体阳性模式多样化,单一抗体检测的价值有限,多抗体联合检测较单一抗体检测更能提高EBVaGC诊断的准确性。（3）EBVaGC患者组ET-1、ETAR和ETBR血清水平均明显低于EBVn GC组,VCA-IgM抗体水平与ET-1、ETAR和ETBR抗体水平呈正相关,提示EBV感染早期即可促进ET-1及受体相关抗体的产生。（4）有助于我们了解EBVaGC独特的发生机制,并筛选其新的分子标志物。
张岩[4]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中指出EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
吴硕[5]（2019）在《EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究》文中研究指明目的:探讨EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染对MUS81（methl methanesulfonate and UV sensitive isolate number 81,对乙烷磺酸盐及紫外线敏感的第81号独立序列）表达的影响,研究MUS81基因在EBVaGC发生中的作用和作用机制。方法:（1）采用实时荧光定量PCR技术（Real time quantitative PCR,qRT-PCR）检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中MUS81、EME2（essential meiotic structure-specific endonuclease subunit 2,必需减数分裂结构-特异性内切酶亚基2）及其相关基因在转录水平上的差异;（2）Western blot技术检测两种细胞系中MUS81和EME2蛋白表达的差异;（3）分别构建稳定转染EBV潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein1,LMP1）、潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A,LMP2A）、EBV编码小RNA（Epstein-Barr virus coded small RNA,EBER）的SGC7901细胞系,检测外源性LMP1、LMP2A、EBER表达对MUS81表达的影响;（4）免疫组化技术检测EBV阳性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVa GC）和EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVn GC）组织中MUS81蛋白的表达;（5）亚硫酸氢盐基因组测序法（Bisulfite genomic sequencing,BGS）检测EBV阳性和阴性胃癌细胞系中MUS81基因启动子区Cp G岛甲基化状态,并用去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理BGC823、SGC7901和稳定转染LMP1的SGC7901细胞系,观察对MUS81表达的影响,分析EBV对MUS81表达和MUS81甲基化状态的影响;（6）检测si RNA靶向沉默MUS81和EME2表达后对细胞周期和凋亡的影响。结果:（1）qRT-PCR结果显示,EBV阴性胃癌细胞系中MUS81基因、EME2基因和SLX4基因转录水平明显高于EBV阳性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中SLX1基因转录水平明显高于EBV阴性胃癌细胞系;两种细胞系中EME1的转录水平没有明显差异。（2）Western blot技术检测结果显示,EBV阴性胃癌细胞系MUS81和EME2蛋白表达水平均明显高于EBV阳性胃癌细胞系。（3）与SGC7901-NC（稳定转染空载质粒的SGC7901细胞系）比较,SGC7901-LMP1、SGC7901-LMP2A和SGC7901-EBER细胞系（稳定转染LMP1、LMP2A、EBER的SGC7901细胞系）MUS81转录水平没有发生明显变化。Western blot检测显示,SGC7901-LMP1,SGC7901-LMP2A,SGC7901-EBER细胞系MUS81蛋白表达与SGC7901-NC细胞系比较没有显着性差异。（4）q RT-PCR检测结果显示,用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理SGC7901-LMP1细胞系MUS81的转录水平及蛋白表达水平没有发生明显变化。（5）EBV阴性胃癌细胞系MUS81基因启动子区甲基化水平明显高于EBV阳性胃癌细胞系。Western blot检测结果显示5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理EBV阴性胃癌细胞系后MUS81蛋白表达水平没有发生明显变化。（6）EBV阳性胃癌组织中MUS81蛋白表达水平明显低于阴性胃癌组织。（7）SGC7901细胞沉默MUS81蛋白表达,与对照组相比,细胞发生G2/M期阻滞（P<0.05）,而凋亡率无明显差异（P>0.05）;沉默EME2表达后,与对照组相比,G2/M期细胞比值增高（P<0.05）,凋亡细胞比例增高（P<0.05）。结论:（1）EBV可抑制胃癌细胞系MUS81及其异二聚体EME2表达,MUS81基因启动子区的甲基化可能不参与其蛋白表达调控。（2）外源性LMP1、LMP2A和EBER表达对MUS81转录和蛋白表达没有明显影响。（3）沉默MUS81和EME2表达可使胃癌细胞系SGC7901阻滞在G2/M期,而下调EME2表达可促进SGC7901细胞凋亡,下调MUS81表达则对SGC7901细胞凋亡无明显影响。
陈秋雨[6]（2019）在《临床用血中EB病毒的检测及基因分型》文中研究指明目的爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种嗜淋巴细胞疱疹病毒,其原发感染可导致传染性单核细胞增多症,也与多种恶性肿瘤及免疫性疾病有关。EBV主要是通过唾液传播,也可通过输血和器官移植感染易感人群。本研究旨在了解呼和浩特市临床用血中EBV的病毒血症率以及被感染血制品的基因分型情况,讨论是否有必要将EBV的筛查同HBV、HCV、HIV及TP的常规检测一样列入合格献血者的评价标准之内,降低经输血感染EBV的可能,进一步明确EBV感染的预防及治疗意义。方法（1）收集2016年8月至2017年2月份之内蒙古呼和浩特地区HBV、HCV、HIV及TP筛查结果为阴性的献血者所献去白悬浮红细胞,从中随机抽取500例,取血袋小辫作为检测样本,制备外周血单个核细胞（PBMC）样本,采用PCR技术检测样本中EBV核酸定量,根据其不同的病毒载量进行统计,分别算出其样本数及比例。（2）根据EBNA2与EBNA3C基因的连锁多态性以及BamHI基因某些片段的保留与缺失通过PCR联合限制性片段长度多态性的检测对EBV阳性样本进行A/B,F/f,C/D分型,分别计算出各型别的样本例数及比例,统计临床血制品感染EBV的主要类型。结果（1）随机抽取的500例合格临床用血中分离出的PBMC检出EBV DNA的阳性标本有44例,阳性率为8.8%（44/500）。44例EBV DNA阳性血样中,根据不同的病毒载量统计:5.0E+021.0E+03copies/ml 37例;1.0E+031.0E+04copies/ml 4例;1.0E+041.0E+05copies/ml 2例;1.0E+051.0E+06 copies/ml 1例。（2）进一步对44例EBV DNA阳性标本进行分型,其中A/B分型各型别检出率分别为:A型为36.36%（16/44）,B型为63.64%（28/44）;F/f分型各型别检出率分别为:F型为79.55%（35/44）,f型为20.45%（9/44）;C/D分型各型别检出率分别为:C型为70.45%（31/44）,D型为29.55%（13/44）。结论（1）输血可以导致EBV的感染,我国呼和浩特地区临床用血的EBV病毒血症的检出率为8.8%。（2）EBV阳性的样本中,绝大多数以B型、F型、C型EBV感染为主。（3）建议对献血者常规检测EBV DNA携带情况,减少输血感染性疾病的发生。
张音洁,王晰程[7]（2018）在《EBV相关性胃癌发病机制及治疗》文中进行了进一步梳理EBV相关性胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）是一种具有独特临床病理学特征的胃癌亚型。近年来,越来越多的研究关注到EBVaGC的发病机制,也为EBVaGC的诊断、治疗和预防提供了一定的理论依据。本文通过总结相关文献,就EBV感染方式、EBV致癌机制、临床病理学特征及针对此型患者的治疗策略进行综述。
李睿[8]（2018）在《基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究》文中进行了进一步梳理鼻咽癌是我国的高发恶性肿瘤之一,发病率居耳鼻咽喉部位恶性肿瘤之首。因发病部位解剖结构复杂,鼻咽癌一般不适合手术,而是首选放射治疗。目前放射治疗对早期鼻咽癌患者的治愈率己高达90%以上,但由于早期筛查方法的局限性,大部分鼻咽癌确诊患者已发展到临床中晚期,常伴发远端转移;另外,部分鼻咽癌患者在放射治疗后容易复发。总之,此类临床晚期、转移性或复发性的鼻咽癌严重拉低患者的五年生存率。因此,探索更高效特异的鼻咽癌诊治用的生物靶标日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。鼻咽癌与EBV关系密切,在鼻咽癌患者中EBV以II型潜伏态存在,表达一种核心蛋白EBNA1和两种重要的膜蛋白LMP1和LMP2。其中,LMP1和LMP2作为主要的癌蛋白,被认为与鼻咽癌的发生发展密切相关。自90年代起,许多研究人员己提出LMP1和LMP2可作为重要的鼻咽癌诊治用靶标蛋白,但至今未能在临床中获得有效应用。本研究拟以LMP1和LMP2作为研究对象,通过免疫原制备探索和特异性单克隆抗体的筛选鉴定,以期获得适合鼻咽癌诊治用的特异性抗体,为LMPs作为鼻咽癌诊治靶标的探索提供科学依据。本论文的第一部分旨在利用小鼠单克隆抗体筛选平台,从免疫原制备方式比较、免疫佐剂和免疫方案组合比较、抗体筛选方法比较以及抗体性能评价等方面探索LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的筛选策略。首先,通过LMPs的氨基酸序列分析确定出LMP1和LMP2各胞外区的氨基酸序列组成,采用多肽化学合成、多肽串联原核表达、全序列昆虫细胞真核表达、全序列哺乳动物细胞表达等不同方式制备出一系列LMPs免疫原,发现LMPs胞外区序列的疏水性严重影响合成肽的合成质量和重组抗原的活性。其次,利用上述制备的LMPs抗原,结合弗氏佐剂、铝佐剂、CpG佐剂以及多糖类、小分子激动剂等免疫佐剂,设计了多种免疫方案进行小鼠免疫,通过常规ELISA和条带Western Blot评价不同免疫方案下的LMPs特异性抗体应答效果,发现合成肽SPL1-3偶联组和有目的抗原表达的全细胞免疫组能诱导出LMPs特异性抗体应答,但不同免疫佐剂的免疫应答比较未见显着差异。再次,比较了全细胞裂解液和膜蛋白包被ELISA与细胞ELISA、ELISPOT以及基于多肽的流式分选等不同筛选方法,发现基于多肽的B细胞分选特异性较差,而细胞ELISA检测灵敏度高且操作方便,是适合细胞膜抗原高通量抗体筛选的最佳筛选策略。最后,对筛选到的98株LMPs抗体进行性质鉴定和应用探索,发现4株LMP1胞内区特异性单抗具有良好的天然抗原结合能力,其识别表位为首次报道;组织学分析显示anti-LMP1单抗9F2和anti-LMP2单抗3A7在免疫组化检测中有良好的灵敏度和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断新工具;另外,发现单抗9F2转染入胞后能显着降低LMP1阳性细胞内NF-κB水平,对细胞的生长具有一定的抑制作用,显示出潜在的治疗价值。据报道,兔单抗与小鼠单抗相比,其识别的表位更加丰富,对于多肽或小分子等低免疫原性的抗原具有更好的识别能力。鉴于LMPs抗原在小鼠中的免疫原性较弱,本研究的第二部分工作旨在建立一个高效的兔单抗筛选平台,探索LMPs在实验兔中的抗体应答情况,为筛选更好的LMPs特异性单抗奠定基础。首先,确定了兔B细胞群的流式细胞分选方案。第二,构建了兔B细胞的单细胞PCR方法,抗体的轻重链基因扩增成功率为60-100%。第三,建立了兔B细胞体外刺激培养方法和最佳的兔B细胞体外培养条件,在该条件下兔B细胞体外培养阳性率（OD值>0.5）平均为38.75%。第四,构建了兔单抗体外重组表达载体pRVRCH/pRVRCL,可满足兔抗体基因在HEK293表达系统中的高效表达。第五,基于此技术平台,分别制备了特异识别戊肝病毒和轮状病毒的两种兔单克隆抗体,验证了兔单抗筛选平台的可行性,并发现实验兔较实验鼠表现出免疫应答速度更快、滴度更高,倾向于产生更高的亲和力的抗体的优越性。最后,本研究利用兔单抗筛选平台对LMPs特异性抗体应答进行了初步探索,结果显示细胞抗原和LMP2A的N端重组抗原能够在实验兔中产生明显的抗体应答,尤其是重组抗原在实验兔中的抗体应答滴度较其在实验鼠中的应答滴度提升10-100倍,为进一步筛选LMPs兔单抗奠定坚实基础。综上所述,本论文针对EB病毒潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2的胞内和胞外区特异性抗体的筛选策略进行了全面的探索,成功获得了具有应用潜力的胞内区抗体,证实LMPs特定的合成肽和有目的抗原表达的全细胞抗原可以在小鼠体内诱导出针对LMPs膜外区的抗体应答,建立了高效的兔单克隆抗体筛选和表达平台,为LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的开发奠定了基础。
杜云,俞霞,季明芳[9]（2017）在《EBV相关性胃癌中EB病毒基因表达研究进展》文中进行了进一步梳理EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是胃癌发生的生物学病因之一,EBV相关性胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）具有独特的临床病理学特征,其预后相对较好,因此EBV导致胃癌的机制研究也备受关注。近年来,随着分子生物学技术的发展,EBVaGC组织中EBV病毒基因表达的研究逐渐增多,为EBVaGC的诊断、治疗和预防提供了一定的理论依据。本文就EBVaGC组织中EBV病毒基因的表达进行综述。
丁真[10]（2017）在《电磁辐射暴露诱发细胞恶性转化作用机制及电磁防护研究》文中研究说明电磁辐射正在改变人类生存环境的物理性质,人类暴露于电磁辐射的强度、时间和复杂性与日俱增,对人类健康的危害也日益彰显。深入研究电磁辐射损伤效应,阐明损伤机理,提出危害防治措施,是目前亟待解决的重要问题。本文主要从电磁辐射对致病性病毒的激活作用,长期电磁辐射致细胞恶性转化作用,长期电磁辐射致细胞恶性转化作用基因表达谱分析,维生素C、维生素E和富氢水的电磁辐射防护作用,进行了深入研究。主要研究内容如下:（1）研究了1800 MHz电磁暴露对EB病毒激活作用。研究表明,暴露于SAR值为4.0 W/kg的1800 MHz电磁辐射,在辐照2h/d,持续辐照2、5、8天,均未能显着激活Raji细胞中的EB病毒,EB病毒激活关键基因表达量未有显着变化;1800 MHz电磁辐射能明显激活B95-8细胞中的EB病毒,EB病毒激活相关关键基因表达量显着增加,并且基因表达随着电磁辐射辐照时间增长而表达量显着升高。（2）研究了SAR值为8.0 W/kg的长期1800 MHz电磁暴露致Balb/c-3T3细胞恶性转化作用。研究表明表明,暴露于1800 MHz电磁辐射40天、60天和80天时,细胞增殖能力显着增强,细胞周期分布发生一定变化,细胞克隆形成能力和迁移能力大大增强。暴露40天、60天的Balb/c-3T3细胞的细胞发生恶性转化,能够在SCID小鼠体内形成肿瘤。暴露80天的Balb/c-3T3细胞具有一定恶性转化能力,这种能力尚不能在SCID小鼠体内形成肿瘤。（3）研究了长期1800 MHz电磁暴露过程致Balb/c-3T3细胞恶性转化作用机制研究。在暴露40天、60天和80天过程中,持续变化显着的基因为Angpt4、P2rx3和Ctca。其他表达显着改变的基因为:Dhcr24、Temem200b、Mvd、Tubb2b、Kdm7a、Ermp1、Lss和Ltbp4。找出了基因编码蛋白作用网络中关键基因Ubc。对暴露40天、60天和80天的差异表达显着的基因表达基因数量、基因功能、基因富集性进行分析,找出变化基因所参与的生物过程、所在细胞位置和具有的分子功能;通过GOEAST分析发现,细胞暴露40天时,1800MHz电磁辐射主要通过影响细胞的有机物代谢,来影响的基因位置锁定为内质网,主要参与影响蛋白质合成的过程。当Balb/c-3T3细胞暴露于1800 MHz电磁辐射60天时,主要影响细胞核中反应过程,对核苷酸的结合功能产生显着性影响,最终影响嘌呤、核糖核苷和ATP结合功能。暴露80天时,不仅能够影响RNA代谢,还能通过影响高分子代谢和DNA代谢两种途径对DNA复制过程产生显着性影响,同时也对细胞凋亡和分化有一定作用。找出变化基因编码蛋白作用网络中的关键蛋白及关键信号通路,包括肿瘤相关信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、细胞骨架信号通路、细胞粘附信号通路等。其他涉及的通路还包括细胞周期、细胞凋亡、m TOR信号通路、JAK-Stat信号通路等。（4）研究维生素C、维生素E和富氢水的电磁防护作用。结果表明1800MHz电磁辐射暴露1h可引起Balb/c-3T3细胞的凋亡率降低,细胞周期分布无显着影响,细胞内活性氧含量升高。维生素C、维生素E和富氢水均能够显着降低Balb/c-3T3细胞的凋亡率和细胞内活性氧的含量。富氢水对Balb/c-3T3细胞的周期分布影响较大,引起G0/G1期比例下降,S期和G2/M期比例显着升高。（5）900 MHz电磁辐射长期辐照细胞能够诱导NIH/3T3细胞显着的早期和晚期凋亡。G0/G1期在12天内无明显变化,而S期在12天时出现明显阻滞。本文研究了短期电磁暴露细胞生物学效应、长期电磁暴露的细胞恶性转化作用及分子机制,研究了1800 MHz电磁辐射对致病性病毒的激活作用,以及维生素C、维生素E和富氢水的电磁防护作用。为后续进一步研究电磁暴露的细胞生物学效应机理研究及电磁防护产品的开发,提供了有效依据。
二、EB病毒中早期表达的癌基因——BARF1（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EB病毒中早期表达的癌基因——BARF1（论文提纲范文）
（1）EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.3 确定G418筛选浓度 |
| 1.2.4 G418抗性单细胞克隆筛选 |
| 1.2.5 RT PCR鉴定 |
| 1.2.5.1 提取细胞RNA |
| 1.2.5.2 逆转录PCR(RT-PCR) |
| 1.2.5.3 BARF1的PCR检测 |
| 1.3 BARF1基因表达效果分析 |
| 1.3.1 细胞增殖活力分析 |
| 1.3.1.1 细胞计数法 |
| 1.3.1.2 CCK8法 |
| 1.3.2 细胞迁移能力分析 |
| 1.3.3 细胞周期检测 |
| 1.3.4 细胞周期蛋白Cyclin D1表达情况的评估 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 GES-1细胞质粒转染效果分析 |
| 2.2 G418耐药性单克隆细胞的获得 |
| 2.3 BARF1基因表达情况的鉴定 |
| 2.4 细胞增殖能力测定 |
| 2.4.1 细胞计数法 |
| 2.4.2 CCK8法 |
| 2.5 IHC法检测细胞周期蛋白Cyclin D1的表达状况 |
| 2.6 划痕实验评估各组细胞划痕愈合能力 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞周期分布情况 |
| 3 讨 论 |
（2）鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽部EBV DNA load的检测及其作为鼻咽癌诊断标志物的准确性评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼻咽部EBV的产生来源研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼻咽部EB病毒其它核酸标志物的诊断价值评价及在盲刷取样下分子标志物的发掘 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（3）胃癌患者EB病毒抗体和内皮素ET-1抗体检测及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.外周血标本的采集与处理 |
| 3.仪器与试剂 |
| 4.原位杂交筛选EB病毒相关胃癌 |
| 5.EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测 |
| 6.EB病毒相关抗体检测 |
| 7.人内皮素1(ET-1)及其受体ETAR和 ETBR检测 |
| 8.统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBV阳性标本的鉴定 |
| 2 EBVaGC与 EBVn GC患者EBV特异性抗体检测结果 |
| 3 EBVaGC患者EB病毒各抗体效果评价 |
| 4 EBVaGC患者EBV抗体阳性模式出现的概率 |
| 5 EBVaGC和 EBVn GC患者ET-1,ETAR和 ETBR检测结果 |
| 6 EBV DNA载量的检测结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用液体的配制 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.2.1 实验前准备 |
| 1.2.2 细胞复苏 |
| 1.2.3 培养液更换 |
| 1.2.4 细胞传代 |
| 1.2.5 去甲基化药物处理细胞 |
| 1.3 基因甲基化状态检测 |
| 1.3.1 NA的提取 |
| 1.3.2 NA样本的重亚硫酸盐处理 |
| 1.3.3 甲基化特异性PCR(BGS) |
| 1.4 MUS81 及相关基因mRNA检测 |
| 1.4.1 RNA的提取 |
| 1.4.2 去g NA处理 |
| 1.4.3 逆转录合成c NA |
| 1.4.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 MUS81 及相关基因蛋白检测 |
| 1.5.1 蛋白质的提取 |
| 1.5.2 蛋白质浓度的测定 |
| 1.5.3 Western blot检测目的基因的表达 |
| 1.5.4 免疫组化实验检测MUS81 蛋白表达 |
| 1.6 细胞学实验 |
| 1.6.1 siRNA靶向沉默 |
| 1.6.2 细胞凋亡实验 |
| 1.6.3 细胞周期实验 |
| 结果 |
| 2.1 实时荧光定量PCR检测MUS81 及其相关基因的转录表达 |
| 2.2 Western blot检测MUS81和EME2 蛋白表达 |
| 2.3 外源性LMP1、LMP2A和 EBER对 MUS81 表达的影响 |
| 2.4 MUS81启动子区甲基化状态检测结果 |
| 2.5 去甲基化药物处理对 MUS81 基因转录的影响 |
| 2.6 去甲基化药物处理对 MUS81 蛋白表达的变化 |
| 2.7 LMP1 对 MUS81 转录表达的影响 |
| 2.8 MUS81和EME2 基因对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 2.8.1 检测siMUS81和siEME2 的沉默效率 |
| 2.8.2 MUS81和EME2 表达沉默对SGC7901 细胞系细胞周期和凋亡的影响 |
| 2.9 胃癌组织中MUS81 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（6）临床用血中EB病毒的检测及基因分型（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 攻读学位期间科研情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）EBV相关性胃癌发病机制及治疗（论文提纲范文）
| 1 EBV病毒和感染细胞的机制 |
| 2 EBV潜伏期重要基因及蛋白与胃癌的关系 |
| 2.1 LMP2A致癌机制 |
| 2.2 EBERS和EBNA-1 |
| 2.3 BARF1 |
| 3 表观遗传异常与EBV相关胃癌关系 |
| 4 微小RNA调控 |
| 5 EBV相关性胃癌的检测方法和病理学特点 |
| 6 EBV相关性胃癌潜在治疗策略 |
| 6.1上调病毒抗原表达——诱导EBV病毒基因裂解疗法 |
| 6.2 增强被感染细胞的免疫应答——免疫疗法 |
| 6.3 逆转病毒相关细胞的生存——靶向及去甲基化治疗 |
| 6.4 其他 |
| 7 结论 |
（8）基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学概况 |
| 1.1.2 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.3 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒简介 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的形态和结构特征 |
| 1.2.3 EB病毒的生命周期 |
| 1.2.4 EB病毒与肿瘤 |
| 1.3 EB病毒潜伏膜蛋白研究进展 |
| 1.3.1 潜伏期膜蛋白1(LMP1) |
| 1.3.2 潜伏期膜蛋白2(LMP2) |
| 1.4 肿瘤治疗性抗体药物研究进展 |
| 1.4.1 单克隆抗体制备技术 |
| 1.4.2 抗体药物治疗肿瘤的作用机制 |
| 1.4.3 肿瘤抗体药物的靶点(胞内、胞外) |
| 1.5 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 引物与多肽 |
| 2.3.7 免疫佐剂 |
| 2.3.8 其他常规试剂 |
| 2.3.9 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 分子生物学实验常规溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 ELISA检测用溶液 |
| 2.4.4 免疫组化相关液体的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 小鼠单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.5.4 小鼠淋巴细胞的流式分选与检测 |
| 2.5.5 小鼠杂交瘤细胞的抗体可变区基因钓取 |
| 2.5.6 兔单抗平台相关实验 |
| 2.5.7 免疫学相关试验方法 |
| 2.5.8 其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 基于小鼠单抗筛选平台对LMPs相关抗体筛选的探索 |
| 3.1 LMPs相关的抗原研究 |
| 3.1.1 合成肽及其偶联抗原 |
| 3.1.2 原核重组表达抗原 |
| 3.1.3 真核表达系统的重组抗原 |
| 3.1.4 抗原表达细胞株 |
| 3.1.5 核酸免疫抗原的制备 |
| 3.2 LMPs胞外、胞内区抗体筛选免疫方案的制定 |
| 3.3 LMPs相关免疫效果评价 |
| 3.3.1 合成肽免疫组 |
| 3.3.2 原核表达重组抗原免疫组 |
| 3.3.3 细胞与核酸免疫组 |
| 3.4 Anti-LMPs抗体筛选方案探索 |
| 3.4.1 基于抗原表达细胞的筛选 |
| 3.4.2 基于抗原特异性记忆B细胞的流式分选 |
| 3.5 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定与应用 |
| 3.5.1 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定 |
| 3.5.2 Anti-LMPs抗体在免疫组化方面的应用 |
| 3.5.3 Anti-LMP1抗体在鼻咽癌治疗方面的初步探索 |
| 3.6 第一部分小结 |
| 第二部分 兔单抗筛选平台的建立及LMPs特异性兔单抗筛选的探索 |
| 3.7 基于兔B细胞特异性分选的兔单抗筛选平台的建立 |
| 3.7.1 兔抗原特异性B细胞染色方案制定 |
| 3.7.2 兔B细胞单细胞PCR平台的建立 |
| 3.7.3 兔B细胞体外刺激培养平台 |
| 3.7.4 抗体重组表达载体构建 |
| 3.8 兔单抗筛选平台的应用 |
| 3.9 LMPs特异性兔单克隆抗体筛选探索 |
| 3.10 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌特异性诊断治疗性抗体开发的必要性和重要性 |
| 4.2 多次跨膜膜蛋白特异性抗体筛选的挑战 |
| 4.3 LMPs膜内区抗体在鼻咽癌个性化诊断及治疗中的潜力 |
| 4.4 基于流式分选的兔单克隆抗体筛选平台的重要性 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（9）EBV相关性胃癌中EB病毒基因表达研究进展（论文提纲范文）
| 1 EBV的生物学特性 |
| 2 EBV感染与胃癌的关系 |
| 3 EBVa GC组织中病毒基因的表达 |
| 3.1 EBVa GC组织中EBV潜伏期基因表达 |
| 3.1.1 EBV的潜伏类型 |
| 3.1.2 EBNA |
| 3.1.3 LMP |
| 3.1.4 EBER |
| 3.2 EBVa GC组织中EBV裂解期基因表达 |
| 3.2.1 BZLF1 |
| 3.2.2 早期抗原 |
| 3.2.3 BARF1 |
| 3.2.4 BRLF1 |
| 3.2.5 BHRF |
| 3.2.6 Bc LF1 |
| 4 结语 |
（10）电磁辐射暴露诱发细胞恶性转化作用机制及电磁防护研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 电磁辐射 |
| 1.2.1 电磁场与生物的关系 |
| 1.2.2 比吸收率 |
| 1.3 电磁辐射已经成为危害人类健康的环境公害 |
| 1.3.1 电磁辐射已成为新的环境公害 |
| 1.3.2 电磁辐射是新的致病危险因素 |
| 1.4 电磁辐射生物效应研究进展 |
| 1.4.1 流行病学研究进展 |
| 1.4.2 体内体外实验研究进展 |
| 1.5 选题意义及主要研究内容 |
| 第2章 1800MHz辐射对Epstein-Barr病毒激活作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 EB病毒 |
| 2.1.2 EB病毒相关疾病 |
| 2.1.3 EB病毒基因 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 细胞 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.3 SXC-1800MHZ电磁辐射辐照系统 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养实验技术 |
| 2.4.2 细胞辐照方式 |
| 2.4.3 免疫酶检测 |
| 2.4.4 Q-PCR检测 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 1800MHz电磁辐射处理的Raji和B9_(5-8)细胞免疫酶检测结果 |
| 2.5.2 EB病毒激活关键基因的Q-PCR检测 |
| 2.6 结果讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第3章 长期1800MHz射频电磁辐射诱发Balb/c-3T3细胞恶性转化作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 辐照方式 |
| 3.3.2 细胞转化实验 |
| 3.3.3 细胞生长曲线 |
| 3.3.4 细胞周期 |
| 3.3.5 平板克隆 |
| 3.3.6 软琼脂克隆 |
| 3.3.7 细胞划痕实验 |
| 3.3.8 Transwell实验 |
| 3.3.9 小鼠致瘤 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 细胞转化 |
| 3.4.2 细胞生长曲线 |
| 3.4.3 细胞周期 |
| 3.4.4 平板克隆 |
| 3.4.5 软琼脂克隆 |
| 3.4.6 划痕实验 |
| 3.4.7 Transwell实验 |
| 3.4.8 SCID小鼠致瘤 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 1800MHz电磁辐射致Balb/c-3T3细胞恶性转化作用基因表达谱研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与试剂 |
| 4.2.1 细胞 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞辐照方法 |
| 4.3.2 基因芯片检测 |
| 4.3.3 基因表达上下调分析 |
| 4.3.4 差异基因Gene Ontology（GO）富集性分析 |
| 4.3.5 GOEAST分析 |
| 4.3.6 差异基因层次聚类分析 |
| 4.3.7 差异表达基因的相互作用网络分析 |
| 4.3.8 差异基因信号通路分析 |
| 4.3.9 变化差异共表达分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 基因表达上下调分析 |
| 4.4.2 Geneontology（GO）富集性分析 |
| 4.4.3 GOEAST分析 |
| 4.4.4 差异基因聚类分析 |
| 4.4.5 String分析 |
| 4.4.6 KEGG富集性分析 |
| 4.4.7 GO与KEGG共表达分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 维生素C、维生素E和富氢水的电磁防护作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与试剂 |
| 5.2.1 细胞 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞暴露方法 |
| 5.3.2 细胞凋亡检测 |
| 5.3.3 细胞周期检测 |
| 5.3.4 活性氧检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 细胞凋亡 |
| 5.4.2 细胞周期 |
| 5.4.3 活性氧 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 实验结论 |
| 第6章 长期900MHz射频电磁辐射对NIH/3T3细胞凋亡与周期的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验试剂与仪器 |
| 6.2.1 细胞 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 实验试剂 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 sXc 900MHz电磁辐射系统 |
| 6.3.2 细胞暴露 |
| 6.3.3 细胞凋亡检测 |
| 6.3.4 细胞周期检测 |
| 6.3.5 统计学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 900MHz电磁辐射参数分析 |
| 6.4.2 对照组与900MHz电磁辐射处理组的NIH/3T3细胞凋亡检测 |
| 6.4.3 对照组与900MHz电磁辐射处理组的NIH/3T3细胞周期检测 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、EB病毒中早期表达的癌基因——BARF1（论文参考文献）
- [1]EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响[J]. 杨佳宁,李娜,董鸿铭,徐媛,李淑英. 中国人兽共患病学报, 2021(12)
- [2]鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究[D]. 郑小辉. 新疆医科大学, 2020(07)
- [3]胃癌患者EB病毒抗体和内皮素ET-1抗体检测及临床意义[D]. 杨爱华. 青岛大学, 2019(01)
- [4]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)
- [5]EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究[D]. 吴硕. 青岛大学, 2019(03)
- [6]临床用血中EB病毒的检测及基因分型[D]. 陈秋雨. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [7]EBV相关性胃癌发病机制及治疗[J]. 张音洁,王晰程. 肿瘤综合治疗电子杂志, 2018(04)
- [8]基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究[D]. 李睿. 厦门大学, 2018(06)
- [9]EBV相关性胃癌中EB病毒基因表达研究进展[J]. 杜云,俞霞,季明芳. 中国肿瘤临床, 2017(09)
- [10]电磁辐射暴露诱发细胞恶性转化作用机制及电磁防护研究[D]. 丁真. 北京工业大学, 2017(11)