一、应用引物原位标记技术检测21号染色体（论文文献综述）
张晖[1]（2021）在《LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化》文中研究说明第一部分LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布背景:既往研究表明,lncRNA NRON与心肌病、心力衰竭及肿瘤发生等相关,在细胞质中可以作为scaffold与其他蛋白质组成复合体参与蛋白质的失活、转运,或作为“sponge”隔离mi RNA,参与与调节蛋白质的功能。这些研究所关注都是的lncRNA NRON与发育完成后的心脏疾病的关系,到目前为止没有文献报道lncRNA NRON与发育中的心脏或先天性心脏病的关系。法洛四联症（TOF）是复杂先天性心脏病中表型最多且最常见的类型,可以作为和心脏发育相关的研究对象。目的:阐明lncRNA NRON与发育中的心脏及TOF的相关性,并明确其在心肌细胞中的分布。方法:（1）收集C57BL/6J小鼠胚胎期（E9.5,E10.5,E11.5,E13.5天,E14.5）,生后7天（P7）及成年（Adult）的心脏,提取RNA后RT-PCR扩增lncRNA NRON,进行DNA凝胶电泳,构建lncRNA NRON时间表达谱。（2）利用RT-qPCR技术检测lncRNA NRON在C57BL/6J小鼠不同时期的表达量差异,从而明确与小鼠心脏发育时间的关联性。（3）收集人类平均胎龄在20周的正常胚胎心脏和TOF胎儿心脏各8例,取右心室组织提取RNA后RT-qPCR检测lncRNA NRON的表达量,观察两组间是否存在差异以明确lncRNA NRON与TOF的相关性。（4）利用RNAFish及亚细胞分离技术对lncRNA NRON进行心肌细胞亚定位。结果:（1）lncRNA NRON在小鼠胚胎发育的E10.5天开始表达,此后的胚胎期至成年均稳定表达。（2）lncRNA NRON的表达量并不均一,从E10.5至P7,呈现上升趋势,此后至成年时又逐渐下降。（3）与对照组相比,TOF组胚胎心脏中lncRNA NRON呈现明显低表达,差别有统计学意义（P<0.0001）。（4）在hESCs诱导分化的心肌细胞（h ESC-CM,HCM）及AC16人心肌细胞中,80%的NRON定位在细胞核中。结论:（1）lncRNA NRON的表达时间与小鼠心脏发育关键时间窗具有部分重合性,可能参与小鼠心脏的发育。（2）lncRNA NRON低表达和TOF的发生具有相关性。（3）lncRNA NRON主要分布在心肌细胞胞核中,为研究其在胞核中的作用奠定基础。第二部分敲除LncRNA NRON抑制hESCs向正常心肌细胞分化背景:先天性心脏病的发生与心肌分化异常密不可分。既往研究表明,多个和心肌分化相关的核心转录因子（NKX2.5、TBX5、GATA4）及信号通路（Wnt信号通路、TGF-β信号通路）的异常均和TOF的发生相关,提示心肌分化异常在TOF的发生中可能占据主导地位,任何导致心肌分化异常的因素均可能成为TOF的发生原因之一。第一部分研究发现,lncRNA NRON同心脏发育及TOF发生具有相关性,但同心肌分化的关系尚未明确。目的:利用人胚胎干细胞（hESCs）可以向心肌分化的特性研究敲除lncRNA NRON对心肌分化的影响。方法:（1）利用epi CRISPR技术构建hESCs细胞lncRNA NRON敲除株（NRON-KO hESCs）及空载对照细胞株（empty-vector hESCs）,内部引物（238bp）及外部引物（292bp）PCR产物凝胶电泳挑选纯合敲除和杂合敲除株,外部引物PCR产物测序验证敲除成功。（2）对构建好的两组细胞株进行体外诱导分化,电子显微镜观察分化过程中形态差异,细胞免疫荧光观察心肌细胞标志物差异。（3）RT-qPCR检测不同分化时期标志基因的表达差异。结果:（1）从50个单克隆细胞群落中成功挑选出2个纯合敲除细胞株和45个杂合敲除细胞株,外部引物PCR产物测序结果与敲除后连接片段序列一致,证明敲除成功。（2）empty-vector hESCs组细胞在诱导分化第8天开始看到第一簇跳动的心肌细胞,到第12天几乎90%以上的细胞可以看到跳动。而NRON-KO hESCs组细胞在分化期间及结束后始终未发现可以搏动的心肌细胞。细胞免疫荧光证实仅有少数细胞可见c Tn T标记,且荧光量明显低于对照组。（3）RT-qPCR结果显示,早期中胚层标志基因T和MIXL1的表达显着受到抑制（P<0.001）;心脏发育核心转录因子基因NKX2.5、MEF2C和GATA4转录水平在第4天、第6天和第8天时均显着低于对照组（P<0.001）,由此产生的结果是诱导分化的细胞相关的心肌标志物（ANP,BNP,α-MHC,β-MHC,TNNT2及TNNT3）的表达几乎消失（P<0.0001）。结论:敲除lncRNA NRON可以阻碍hESCs向功能性心肌细胞分化,表明lncRNA NRON对hESCs向心肌细胞分化必不可少。第三部分LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化背景:shp2蛋白在细胞核中可去磷酸化Parafibromin,促进其与β-catenin形成复合体,从而激活经典Wnt信号通路。我们采用的体外分化方案是通过使用小分子物质调控Wnt/β信号通路即可完成hESCs向心肌分化,且心肌细胞分化效率高达98%。前两部分研究结果提示,lncRNA NRON主要定位在心肌细胞胞核中,敲除lncRNA NRON后hESCs不能分化成功能性心肌细胞。根据分化方案推测敲除lncRNA NRON可能对Wnt/β-catenin信号通路产生了干扰而导致hESCs无法向心肌细胞分化。目的:验证lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控及可能参与的蛋白质,进一步研究NRON参与心肌细胞发育调控及其潜在的机制。方法:（1）RT-qPCR检测诱导分化4天时敲除组与对照组中Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录水平,包括cyclin D1,Myc及Axin2。（2）构建NRON过表达质粒载体（pc DNA-NRON）,利用双荧光素酶报告基因检测lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。同时将构建好的NRON-KO hESCs和empty-vector hESCs细胞株分别提取RNA送测序。（3）提取AC16人心肌细胞胞核蛋白,利用RNA Pulldown及质谱分析技术（MS）寻找细胞核内与lncRNA NRON互作的蛋白质,Western blot（WB）验证结果。（4）WB检测对照组与敲除组中与NRON互作的蛋白质表达的差异。（5）利用双荧光素酶报告基因检测与NRON互作蛋白质的抑制剂对lncRNA NRON激活的Wnt/β-catenin信号通路的作用。（6）在AC16人心肌细胞中过表达lncRNA NRON,通过激光共聚焦观察对NRON互作蛋白细胞定位的影响。结果:（1）与empty-vector hESCs相比,Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因cyclin D1,Myc以及Axin2在NRON-KO hESCs组均表现为明显的下调,差别有统计学意义（P<0.001）,而β-catenin的表达未受影响（P>0.05）。（2）与仅转染β-catenin的细胞相比,同时转染pc DNA-NRON和β-catenin的HEK293T细胞的TOPflash活性提高了2倍,差别有统计学意义（P<0.01）。这一现象在仅转染pc DNA-NRON的细胞中也可以见到。（3）对敲除组和空载组细胞进行RNA-seq及KEEG富集分析,发现在NRON-KO hESCs细胞株中表达下调的基因在Wnt信号通路富集。（4）RNA Pulldown-MS发现shp2蛋白与NRON特异性结合,这一结果得到了WB的支持。（5）双荧光素酶报告实验显示由NRON过表达增加的TOPflash活性,在加入shp2的强效抑制剂TNO155后,TOPflash活性急剧下降了10倍以上,且差别有统计学意义（P<0.001）。（6）WB分析显示,shp2蛋白表达量在empty-vector h ESC组与NRON-KO h ESC组之间无差异,提示shp2可能不是NRON的靶基因（target gene）,而是一个伙伴基因（partner gene）。（7）激光共聚焦结果显示在同样密度的AC16心肌细胞中转染pc DNA-NRON,shp2主要聚集在细胞核内,而在转染空载的AC16细胞中,shp2主要聚集在细胞质内。结论:（1）lncRNA NRON可以激活经典的Wnt信号通路。（2）lncRNA NRON在细胞核内与shp2相互作用,通过促进shp2核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与调控心肌分化。
许文彦,郭奇伟,胡平,朱宇宁,张雪梅,郑欣怡,张海霞,周裕林[2]（2020）在《相似序列高分辨熔解曲线技术在常见染色体三体产前诊断中的应用》文中研究指明目的为探讨相似序列高分辨熔解曲线（SD-HRM）技术在21三体、18三体和13三体产前诊断中的临床应用价值。方法于2014年9月至2016年8月从南京市妇幼保健院、浙江大学附属妇产科医院、四川大学华西第二医院/华西妇产儿童医院和厦门市妇幼保健院共采集1 152例进行产前诊断孕妇的羊水细胞,同时采用SD-HRM技术和染色体核型分析技术进行平行检测,计算SD-HRM技术的敏感度、特异度,并分析两项技术检测结果的一致性,计算Kappa值。结果 1 152例孕妇经SD-HRM技术检测出21三体161例,18三体60例,13三体5例,敏感度和特异度均为100%,与染色体核型分析结果一致（Kappa=1）。结论在常见染色体三体的产前诊断中,SD-HRM技术与染色体核型分析的准确率相当,作为快速产前诊断的一种新方法具有较好的应用前景。
岑妙兰[3]（2020）在《NIPT在IVF孕妇群体产前筛查中的应用研究》文中进行了进一步梳理近年来NIPT（Non-Invasive Prenatal Testing,无创产前基因检测技术）得到广泛应用,而NIPT技术针对以体外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization And Embryo Transfer,IVF-ET,以下简称IVF）方式受孕孕妇的检测在国内外的报道仍然缺乏大数据的支撑。NIPT检测IVF孕妇的检出效果尚不明确,各国产前诊断专家建议慎用或不作为NIPT检测适用人群。然而,IVF孕妇在产前筛查中比自然受孕孕妇更为复杂,在进行产前血清标记物筛查时,表现出更高的假阳性率。作为IVF受孕得到的“珍贵儿”,孕妇极不愿意进行有创的产前诊断来增加流产的风险。因此,IVF孕妇亟待一项准确性更高的产前筛查技术,减少有创性产前诊断带来的流产风险。本研究采用NIPT检测技术对11455例IVF孕妇的外周血DNA进行高通量全基因组低深度测序及分析,结果表明:1本研究的11455例文库检测的目的片段均在260～320bp要求范围内,文库浓度均≥2ng/μL,且DNB（DNA纳米球,DNA nanoball）浓度均≥8ng/μL,表明11455例IVF孕妇外周血DNA成功构建文库及制备DNB;通过全基因组0.1X测序,11455例文库测序的有效数据量均≥3.5 M,Q30≥85%,表明11455例IVF孕妇外周血DNA成功建库并测序,满足测序质量的要求。2利用NIPT的方法,对11349例IVF孕妇的测序数据进行了分析,结果显示:1)阴性样本共11266例;21-三体阳性46例;18-三体阳性28例;13-三体阳性9例。经确诊后显示21-三体假阳0例,18-三体假阳3例,13-三体假阳2例,并经出生随访确认结果,假阴样本0例。2)对NIPT检测方法的灵敏度、特异性、准确率和Kappa值做了详细分析发现:a)IVF孕妇的21-三体综合征的灵敏度为100%,特异性为100%,准确率为100%,Kappa（K）为1;b)IVF孕妇的18-三体综合征的灵敏度为100%,特异性为99.97%,准确率为99.97%,Kappa（K）为0.9432;c)IVF孕妇的13-三体综合征的灵敏度为100%,特异性为99.98%,准确率为99.98%,Kappa（K）为0.8749。3基于NIPT的IVF孕妇中妊娠单胎和双胎的检测及其灵敏度、特异性、准确率、Kappa值分析,结果显示:1)阴性样本共11266例,单胎7763例,双胎3503例;阳性样本共有83例,其中T21阳性46例,单胎35例,双胎11例;T18阳性28例,单胎20例,双胎8例;T13阳性9例,单胎6例,双胎3例。经确诊后显示21-三体假阳0例;18-三体单胎假阳2例,双胎假阳1例;13-三体单胎假阳1例,双胎假阳1例;并经出生随访确认结果,假阴样本0例。2)对NIPT检测IVF孕妇中妊娠单胎和双胎的灵敏度、特异性、准确率和Kappa值做了详细分析发现:a)IVF孕妇的21-三体综合征灵敏度、特异性、准确率在单胎及双胎均为100%,Kappa（K）为1,单胎vs双胎的准确率P=1;b)IVF孕妇的18-三体综合征单胎灵敏度、特异性、准确率、Kappa（K）分别为100%,99.97%,99.97%,0.9472;双胎灵敏度、特异性、准确率、Kappa（K）分别为100%,99.97%,99.97%,0.9332,单胎vs双胎的准确率P=0.54;c)IVF孕妇的13三体综合征单胎灵敏度、特异性、准确率、Kappa（K）分别为100%,99.98%,99.98%,Kappa（K）为0.9090;双胎灵敏度、特异性、准确率、Kappa（K）分别为100%,99.97%,99.97%,0.800,单胎vs双胎的准确率P=0.40。4对NIPT在IVF孕妇中的检测准确性进行了进一步分析发现:a)通过对NIPT在自然妊娠孕妇与IVF妊娠孕妇中检测得到妊娠男胎含Y染色体的胎儿浓度进行了方差分析,表明NIPT技术在自然妊娠孕妇和IVF妊娠孕妇中的未见差异;b)对本研究出现的所有假阳性和检测失败样本进行了深入分析,确认NIPT在IVF孕妇中出现的假阳性及检测失败的主要原因与自然妊娠孕妇出现的主要原因一致。综上所述,本研究采用NIPT对IVF孕妇的检测表现出了高灵敏度、高特异性、高准确率和较高Kappa值,表明该技术检测IVF孕妇的21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征是可行及可靠的,提示该方法可用于IVF孕妇的产前筛查,从而减少有创性产前诊断带来的流产风险。
王晓华[4]（2019）在《唐氏综合征现有筛查技术的分析及新标志基因的筛选》文中指出唐氏综合征（Down syndrome,DS）,又名21三体综合征或先天愚型,是发现最早、最重要的染色体病,也是最常见的严重出生缺陷病之一[1]。该病的新生儿发病率在1.25‰左右,目前还没有有效的治疗方法,出生后给家庭及社会造成巨大的经济负担和精神损害,所以预防患儿出生为临床主要策略。目前在该病的预防上临床应用主要以血清学筛查技术在孕早、中期进行筛查,再通过羊水、绒毛穿刺等细胞遗传学技术来确诊。但是这种应用流程存在筛查率较高、诊断率较低等问题。因此,本研究的重点是对现有筛查诊断技术进行梳理,研究各类筛查诊断技术在唐氏综合征预防中的适用范围及检测指征,并从转录组水平探索新的筛查途径,以寻找新的筛查因子,为今后建立更为有效的筛查诊断方法提供理论依据。一、唐氏综合征常用筛查方法的性能分析本研究通过对临床上所有入组孕妇进行孕中期血清学筛查检测,对高危孕妇（包括高龄、超声异常、筛查高风险等）群体实施无创胎儿基因检测（non-invasive prenatal testing,NIPT）筛查,应用羊水穿刺染色体核型分析作为诊断标准,辅助荧光原位杂交技术（interphase fluorescence in-situ hybridization,FISH）和微阵列基因芯片技术（chromosomal microarray analysis,CMA）进行补充诊断,研究结果显示如下:1、对41267例孕妇进行血清学筛查,筛出阳性孕妇1621例,初筛阳性率3.93%。最终554例孕妇（34.18%）接受了羊水穿刺检测,诊断21三体患者37例,确诊率为6.68%。血清学筛查操作简便且易于推广,孕妇群体接受率最高,达94.09%,但是筛查效率较低,阳性预测值仅为1.32%。2、对2667例孕妇进行NIPT筛查,初筛阳性19例,初筛阳性率7.12%。初筛阳性孕妇均接受了羊水穿刺检查,确诊21三体患者18例,确诊率为94.73%,确诊率提高了14.18倍。NIPT筛查效率较高,阳性预测值高达94.74%。但是NIPT筛查技术实验难度大,费用较高,难于用于普筛,知情同意率仅为21.97%。3、利用诊断金标准的羊水细胞培养技术,统计237例标本,结果失败3例,检测失败率为1.27%,漏诊1例非整倍体型21三体。该技术培养周期较长,平均时间为21d,且实验技术不易掌握,需要分子学检测技术进行补充。4、统计FISH技术与羊水穿刺技术同时检测的237例标本,FISH技术检测成功率100%,检测周期2448h。弥补了羊水穿刺培养时间长、培养失败率高的问题。但FISH技术漏检1例嵌合型21三体,存在应用范围较为局限等缺点。5、利用CMA技术与羊水穿刺技术同时检测了60例羊水标本,CMA检测出7例21三体,包括1例羊水穿刺技术漏诊的非整倍体型21三体,相对羊水穿刺技术提高了1.66%的阳性诊断率,具有更高的分辨率和敏感性。但CMA对检出的一些染色体拷贝数的微缺失和微重复,临床难以判读和解释,因此只能作为诊断的补充手段。二、妊娠唐氏综合征的孕妇血液及胎盘转录组学研究上述分析结果显示,目前的筛查诊断技术虽可相互补充,但各有局限,依然不能彻底解决诊断率低的问题。基因组测序技术的快速发展为更有效的筛查诊断方法的建立提供了一种新的途径。因此本研究进一步选取妊娠21三体患儿的高龄孕妇、妊娠21三体患儿低龄孕妇、高龄对照和低龄对照四类人群的血液和胎盘进行转录组测序,在转录组水平上筛选与唐氏综合征发病可能相关的基因。1、转录组测序共获得30.07Gb数据,Clean Reads所占比例为98.15%,转录组测序数据达标。结果分析各组基因差异表达较为明显,血液分组中21三体高龄组与健康高龄组之间的差异表达基因个数多于21三体低龄组与健康低龄组之间的差异表达基因个数;胎盘分组中21三体低龄组与健康低龄组之间的差异表达基因个数多于21三体高龄组与健康高龄组之间的差异表达基因个数;胎盘四组之间以及血液组中的高龄组之间,差异表达基因都是以上调居多。疾病组高龄与低龄之间胎盘组织的差异表达基因多于血液。2、比较得到的所有表达差异基因进行GO功能分析。患病组与健康组比较,血液和胎盘两类样品的所有差异基因共富集出3987条GO term,其中生物过程3102条,细胞组分336条,分子功能549条。四组比较共同富集出的条目有138条,其中生物过程87条,细胞组分35条,分子功能16条。3、通过KEGG分类,四组共富集104条通路。妊娠21三体与健康组之间显着富集3条,分别是:补体和凝血级联、疟疾和ECM-受体相互作用信号通路。高龄组血液和胎盘特异富集4条,分别是尼古丁成瘾、环磷酸腺苷、心肌细胞肾上腺素能与醛固酮的合成和分泌信号通路。低龄组血液和胎盘特异富集2条,分别是自身免疫性甲状腺疾病和花生四烯酸代谢信号通路。4、筛选出高龄21三体（血液、胎盘）重点相关的基因有4个,分别为:CRIP2、NR4A1、PFKFB3和FAM118A。低龄21三体（血液、胎盘）重点相关的基因有2个,分别为:HLA-DRB5和GNLY。21三体血液（高龄、低龄）重点相关的基因有2个,分别为:FCGR3B和HLA-DRB4。经q-PCR验证认为这些基因的表达水平与转录组测序结果一致。5、选择上述8个基因经过临床样本的验证,其中的四个基因CRIP2、NR4A1、HLA-DRB5和HLA-DRB4可以作为备选基因,为进一步研究唐氏综合征的无创检查提供了新的潜在标志物。
黄元河,冯治,潘乔丹[5]（2013）在《引物原位标记技术在人类染色体非整倍体嵌合体诊断中的应用》文中研究说明目的:探讨快速和准确诊断人类染色体非整倍体嵌合体的新方法。方法:采用引物原位标记（PRINS）技术和染色体G显带技术检测2例21三体嵌合体和3例Turn综合征嵌合体,并比较其结果。结果:在间期核和中期分裂相中,PRINS技术均能特异性地检测出21号和X染色体,其标记率分别为90%和89%;PRINS技术检测的21三体嵌合体和Turn综合征嵌合体100个细胞中,异常核型细胞数目高于染色体G显带技术检测。结论:PRINS技术能够快速、准确地检测染色体数目异常,与染色体G显带技术相结合,可提高人类染色体非整倍体嵌合体诊断的准确性。
冯治,黄元河[6]（2009）在《引物原位标记技术及其在人类染色体病诊断中的应用现状》文中研究说明
朱一剑,刘涤石,丁显平[7]（2008）在《引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性》文中指出染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型,经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。文章应用引物原位标记（Primed in situ labeling,PRINS）技术快速检测人类染色体非整倍性,率先采用更新的非ddNTP阻断的多色PRINS技术,对人类外周血淋巴细胞和精子等多种样本进行标记;然后对不同靶标序列的标记效率及不同荧光色素的发光特点通过实验进行评估,获得关于PRINS技术的多项反应原理参数,并筛选标记顺序以获得均一稳定的标记效果,最后进行临床FISH探针与PRINS的标记比较实验。通过实验比较PRINS技术与传统FISH技术之间的标记特点与差别,评估PRINS的实际应用效果。在2.5h内标记了同一精子核内的多条染色体,单色以上标记达到99%。同时在人类外周血淋巴细胞中也得到较好的标记效果。与FISH技术相比,PRINS的这些优点使得它成为诊断染色体非整倍性变异的首选技术。
魏萍,丁显平,聂涌[8]（2008）在《引物原位标记合并荧光原位杂交技术在人类中期染色体分析中的应用》文中提出[目的]建立检测人类外周血淋巴细胞中期染色体的引物原位标记合并荧光原位杂交技术,并进行其在产前诊断中的可行性分析。[方法]采用单色引物原位标记合并单色荧光原位杂交技术同时对正常人外周血淋巴细胞18号染色体的着丝粒α-卫星序列和21号染色体长臂的单拷贝序列进行双色标记。[结果]成功地在淋巴细胞培养的中期分裂相上同时获得了18号和21号染色体的标记,其中18号标记为绿色信号,21号标记为橙红色信号,标记率分别达96.2%和93.6%,双标记率达到91.3%。[结论]应用该技术对人类外周血淋巴细胞染色体进行标记结合了引物原位标记和荧光原位杂交技术各自的优点,增加了检测靶点的多样性,为其在产前诊断中的应用奠定了基础。
刘涤石,丁显平,魏萍,王欢[9]（2007）在《多色引物原位标记技术快速检测精子染色体》文中研究说明目的:探索和评估应用于精子染色体数目异常检测的多色引物原位标记技术。方法:采用NaOH溶液对精子核进行去浓缩和变性,以非ddNTP阻断的单色及三色引物原位标记技术对正常男性精液标本的4条染色体进行检测。结果:成功地在2.5h内标记了同一精子核内的多条染色体,最佳的染色体同时标记通量为3条,单色以上标记达到99%。结论:该快速多色引物原位标记技术优化了之前的单色精子标记技术,在提高了检测通量的同时,检测也更为简便快速和经济可靠。
刘涤石[10]（2007）在《多色引物原位标记技术快速检测人类精子染色体数目异常》文中研究指明目的染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型，经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。引物原位标记技术同时结合了FISH和PCR技术的优势，已经成为替代FISH的一项技术用于染色体数目异常的检测。自引物原位标记技术广泛引入人类基因组研究和临床染色体检查以来，特异染色体引物的设计和评估主要基于特定染色体alpha卫星重复序列单元的克隆信息。至2001年，人类基因图谱的绘制完成，人们可以方便的在互联网上任意调取人类的全基因组序列，并通过新的计算机—互联网工具，快速准确地分析DNA序列和比对整个基因组序列，设计和验证引物。今天人们可以用更新更完整的基因组信息和技术回顾传统的引物序列，对其有效性和可靠性进行重新的评估。本文试图用新的基因组工具检验和完善非ddNTP阻断的多色引物原位标记技术，探索一种更为合理的多色PRINS系统程序，并针对精子染色体异倍性的研究进行可靠性分析。方法首先我们将传统引物都与最新的人类基因组信息进行了比对。BLAST比对结果在大多数情况下验证了这些经典引物的退火有效性。随后在人类外周血淋巴细胞中建立了一个稳定的多色PRINS标记方法并评估其标记效率。通过双色PRINS预实验，分析不同的靶标序列和荧光色素的标记特点以确定PRINS标记顺序；随后，采用非ddNTP阻断的三色PRINS方法，对外周血中期淋巴细胞的18号，21号，X和Y染色体构建了更为稳定的多色标记体系。同时，一个克氏综合征（47，XXY）的特殊外周血样本用来证明信号与染色体的数目匹配性，评估多色PRINS方法应用于染色体数目异常快速诊断的可行性。根据相关文献，PRINS技术应该比FISH更适于精子核的标记。本文精子实验中，在PRINS反应之前，我们采用3M NaOH溶液进行4-5分钟的预处理，以达到对精子核同时去浓缩和变性的目的。在单色精子PRINS预实验和双色淋巴细胞PRINS预实验的指导下，引物的使用条件（包括浓度和温度等）以及靶标—dUTP—荧光色素的标记组合使用顺序得到了优化，最终在外周血淋巴细胞获得了均一的多色荧光标记信号，反应时间限制在3.5个小时内。我们对2份正常男性精液标本的4条染色体（含18号，21号两条常染色体和X，Y两条性染色体）进行了分析。结果成功地在2.5小时内标记了同一精子核内的多条染色体，最佳的染色体同时标记通量为3条，单色以上标记率达到99％。对每条染色体的评估都至少分析5000个精子核（性染色体则更多）。精子染色体中常染色体的平均二体率为18号染色体的0.125％到21号染色体的0.152％，性染色体的平均二体率为XX二体的0.085％到XY二染色体的0.102％。与外周血淋巴细胞二色PRINS的检测结果类似，21号染色体的二体率比其他染色体略高。尽管从结果来看常染色体的二体率比性染色体稍高，但没有显着的统计学意义。二倍体率则由0.035％到0.083％浮动，也没有统计得到显着的异质性（P＜0.05）。同时在实验中观察到二体率比二倍率要高的情况，这可能意味着在精子形成的减数分裂过程中，二体更易（或有更多的机会）形成。结论引物原位标记技术看起来是检测人类外周血淋巴细胞中期染色体和精子染色体数目异常的一项经济简便和快速可靠的高通量检测方法。我们建议在引用某些经典引物之前，与人类全基因组的BLAST比对能够推断其反应的有效性，有着很强的指导意义和必要性。同时也需要引物标记预实验来考察匹配不清的引物效果，甚或重新设计引物。PRINS应用于染色体检测，预实验和严格的反应条件控制是不可缺少的。
二、应用引物原位标记技术检测21号染色体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用引物原位标记技术检测21号染色体（论文提纲范文）
（1）LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 敲除LncRNA NRON抑制hESC向正常心肌细胞分化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 唐氏综合征相关先天性心脏病发生分子机制研究进展 |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间完成的学术论文和研究成果 |
（3）NIPT在IVF孕妇群体产前筛查中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 产前筛查及诊断的发展 |
| 1.2 NIPT技术的发展 |
| 1.3 IVF技术的发展 |
| 1.4 测序技术的介绍 |
| 1.4.1 第一代测序技术 |
| 1.4.2 第二代测序技术 |
| 1.4.3 第三代测序技术 |
| 1.5 本研究的现状及意义 |
| 1.5.1 国内外研究现状 |
| 1.5.2 本研究的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究材料及物料设备 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 耗材 |
| 2.1.3 主要设备 |
| 2.1.4 实验样本来源 |
| 2.1.5 样本收集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验设计 |
| 2.2.2 血浆分离 |
| 2.2.3 血浆游离DNA提取 |
| 2.2.4 文库构建 |
| 2.2.5 文库定量 |
| 2.2.6 文库混合(pooling) |
| 2.2.7 单链环化 |
| 2.2.8 DNB制备 |
| 2.2.9 DNB加载 |
| 2.2.10 测序 |
| 2.2.11 数据质控和信息分析 |
| 2.2.12 样本结果的后续跟踪 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 11455例IVF孕妇外周血DNA文库的构建及测序质控分析 |
| 3.1.1 文库浓度及DNB定量结果表明符合高通量测序要求 |
| 3.1.2 测序质控结果 |
| 3.2 IVF孕妇进行NIPT检测的准确率评估 |
| 3.2.1 基于NIPT的 IVF孕妇检测结果及其灵敏度、特异性、准确率、Kappa值分析 |
| 3.2.2 基于NIPT的 IVF孕妇中妊娠单胎和双胎的检测及其灵敏度、特异性、准确率、Kappa值分析 |
| 3.3 IVF孕妇和自然受孕孕妇NIPT检测的准确性对比分析 |
| 3.3.1 IVF孕妇与自然受孕孕妇外周血中胎儿游离DNA浓度未见差异 |
| 3.3.2 基于NIPT检测的IVF孕妇假阳样本与自然受孕样本结果一致 |
| 3.3.3 基于NIPT的 IVF孕妇的检测失败原因与自然受孕一致 |
| 第四章 展望与总结 |
| 4.1 本研究的优缺点 |
| 4.2 研究总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）唐氏综合征现有筛查技术的分析及新标志基因的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 缩略词表 第一章 文献综述 分子生物学技术在唐氏综合征诊断中的应用 |
| 引言 |
| 1 Down综合征的症状及核型分类 |
| 2 唐氏综合征的传统产前诊断方式 |
| 3 快速分子遗传学检测技术在唐氏综合征检测中的应用 |
| 4 新一代测序技术在唐氏综合征检测中的应用 第二章 唐氏综合征常用筛查方法的性能分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 血清学筛查结果 |
| 2.2 NIPT筛查结果 |
| 2.3 羊水染色体核型诊断结果 |
| 2.4 FISH检测结果分析 |
| 2.5 CMA检测结果分析 |
| 2.11 血清学筛查、FISH、NIPT、CMA和核型分析的比较结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 血清学筛查在唐氏综合征检测中的应用价值 |
| 3.2 NIPT技术在唐氏综合征筛查中的应用价值 |
| 3.3 羊水穿刺技术在唐氏综合征诊断方面的优势及劣势 |
| 3.4 FISH检测技术应用在唐氏综合征诊断方面的优势及劣势 |
| 3.5 CMA检测技术应用在唐氏综合征诊断方面的应用 |
| 3.6 血清学筛查、FISH、NIPT、CMA和核型分析优缺点的比较结果 第三章 妊娠唐氏综合征孕妇血液及胎盘转录组学研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 孕妇血液和胎盘RNA提取检测结果 |
| 2.2 测序及数据过滤结果 |
| 2.3 参考基因组比对结果 |
| 2.4 测序样本比对基因位置的随机性评估结果 |
| 2.5 测序样本比对转录本的覆盖度评估结果 |
| 2.6 测序样本测序饱和度评估结果 |
| 2.7 测序样本基因表达定量结果 |
| 2.8 测序样本相关性 |
| 2.9 差异表达基因检测 |
| 2.10 差异表达基因GO功能分析结果 |
| 2.11 KEGG Pathway分类和富集 |
| 2.12 特殊基因筛选 |
| 2.13 PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 健康组与患病组基因表达分析 |
| 3.2 病毒性心肌炎(Viral-myocarditis)信号通路与HLA-DRB5 基因 |
| 3.3 自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune thyroid disease)信号通路与HLA-DRB4基因 |
| 3.4 库欣综合征(Cushing syndrome)信号通路与NR4A1 基因 |
| 3.5 富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich Protein2,CRIP2)基因 结论 参考文献 致谢 攻读博士期间发表的论文 |
（6）引物原位标记技术及其在人类染色体病诊断中的应用现状（论文提纲范文）
| 1 PRINS技术的建立及发展 |
| 2 PRINS技术的基本原理及步骤 |
| 2.1 PRINS技术的基本原理: |
| 2.2 PRINS技术的基本步骤 |
| 2.2.1 寡核苷酸引物的设计: |
| 2.2.2 制备细胞标本: |
| 2.2.3 蛋白酶消化处理: |
| 2.2.4 进行PRINS反应: |
| 2.2.5 反应结果观察: |
| 3 PRINS技术在人类染色体疾病诊断中的应用 |
| 3.1 代替FISH在产前诊断中快速检测染色体数目异常: |
| 3.2 鉴别一些环状、易位和双着丝粒染色体: |
| 3.3 诊断染色体亚末端和微缺失综合征: |
| 3.4 检测染色体上特异性的单拷贝序列: |
| 3.5 肿瘤的染色体异常研究: |
| 4 结语 |
（7）引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样本处理 |
| 1.2.2 单色FISH |
| 1.2.3 单色精子PRINS |
| 1.2.4 双色PRINS反应 |
| 1.2.5 三色PRINS反应 |
| 1.2.6 精子三色PRINS |
| 1.2.7 信号检测与图像分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单色FISH |
| 2.2 单色PRINS |
| 2.3 双色PRINS结果 |
| 2.4 三色PRINS结果 |
| 2.5 精子单色PRINS |
| 2.6 精子三色PRINS |
| 3 讨论 |
| 3.1 精子染色体检测与多色PRINS |
| 3.2 PRINS技术与FISH技术的标记比较 |
| 3.3 染色体异常的统计 |
| 3.4 操作步骤与荧光标记 |
（9）多色引物原位标记技术快速检测精子染色体（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 样本准备 |
| 1.2 引物与试剂 |
| 1.3 单色精子PRINS程序 |
| 1.4 快速三色PRINS程序 |
| 1.5 信号检测与图像分析 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 精子染色体检测与多色PRINS |
| 3.2 操作步骤与荧光效果 |
| 3.3 染色体异常的统计 |
（10）多色引物原位标记技术快速检测人类精子染色体数目异常（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 培养的人类外周血淋巴细胞单色PRINS标记及与FISH的比较 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 结果 |
| 2.2 讨论 |
| 第二部分 培养的人类外周血淋巴细胞双色PRINS标记 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 结果 |
| 2.2 讨论 |
| 第三部分 克氏综合征患者外周血淋巴细胞培养后的三色PRINS标记 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 结果 |
| 2.2 讨论 |
| 第四部分 正常男性精子的PRINS标记与异倍体分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 结果 |
| 2.2 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 引物原位标记技术趋势与进展 |
| 1 PRINS技术简介 |
| 2 PRINS技术的优势与不足 |
| 2.1 特点与优势 |
| 2.2 不足与弥补 |
| 2.3 FISH与PRINS，竞争者还是互补者 |
| 3 PRINS技术的应用 |
| 3.1 染色体病的检测 |
| 3.2 基因的诊断 |
| 3.3 肿瘤病因分析 |
| 3.4 端粒等重复序列的标记 |
| 3.5 基因组比较与进化分析 |
| 4 衍生技术与发展趋势 |
| 4.1 更快的标记速度 |
| 4.2 更高的标记通量 |
| 4.3 更强的标记信号 |
| 4.4 更小的标记单元 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间参加的科研工作与成果 |
| 致谢 |
四、应用引物原位标记技术检测21号染色体（论文参考文献）
- [1]LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化[D]. 张晖. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]相似序列高分辨熔解曲线技术在常见染色体三体产前诊断中的应用[J]. 许文彦,郭奇伟,胡平,朱宇宁,张雪梅,郑欣怡,张海霞,周裕林. 中华检验医学杂志, 2020(07)
- [3]NIPT在IVF孕妇群体产前筛查中的应用研究[D]. 岑妙兰. 华南理工大学, 2020(02)
- [4]唐氏综合征现有筛查技术的分析及新标志基因的筛选[D]. 王晓华. 内蒙古大学, 2019(09)
- [5]引物原位标记技术在人类染色体非整倍体嵌合体诊断中的应用[J]. 黄元河,冯治,潘乔丹. 中国妇幼保健, 2013(04)
- [6]引物原位标记技术及其在人类染色体病诊断中的应用现状[J]. 冯治,黄元河. 吉林医学, 2009(23)
- [7]引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性[J]. 朱一剑,刘涤石,丁显平. 遗传, 2008(08)
- [8]引物原位标记合并荧光原位杂交技术在人类中期染色体分析中的应用[J]. 魏萍,丁显平,聂涌. 现代预防医学, 2008(10)
- [9]多色引物原位标记技术快速检测精子染色体[J]. 刘涤石,丁显平,魏萍,王欢. 生殖与避孕, 2007(05)
- [10]多色引物原位标记技术快速检测人类精子染色体数目异常[D]. 刘涤石. 四川大学, 2007(05)