一、Potyvirus属成员基因组全序列的简并引物PCR和RACE扩增方法（论文文献综述）
赵娜[1]（2019）在《赤瓟花叶病毒（ThDMV）的鉴定及生物学特性研究》文中认为植物病毒的流行和爆发严重威胁粮食生产和食品安全,因此人们的研究主要集中在农作物病毒传播和危害上。20世纪初以来,野生植物病毒也引起了人们的广泛兴趣,野生植物与栽培作物可能由于某些基因的一致性而共享某些病毒和传播介质种群,导致农业生产中经常出现一些奇怪现象,如一些非种子传播的病毒病,在农作物引种到新栽培区时也会发生和流行。这暗示着新栽培区附近的野生植物中潜藏着某些病毒,因此其作为中间寄主或转主寄主而引起作物病害。多年生野生植物可以在多年份、多季节获得病毒感染,成为病毒传播的中间寄主,完成病毒的安全渡夏或越冬。有研究证明作物中的病毒可以传播给野生植物,并在野生植物中贮存,但病毒是否可以从野生植物传染到栽培作物却鲜为人知。本研究采集具有典型病毒样症状的200多种多年生草本植物样品,以植物病毒中数量最多的Potyvirus属病毒作为检测对象,通过简并引物来检测已知Potyvirus属病毒的存在及发现Potyvirus属新病毒的可能性。研究过程中发现了一种Potyvirus属新病毒,继续对该病毒的生物学特性、基因组全序列及结构、检测方法及栽培作物中分布状况进行了研究。本研究结论如下:1.本研究以多年生草本植物作为研究对象,以Potyvirus病毒作为检测对象,成功在多年生野生植物赤瓟（Thladiantha dubia Bunge）中获得一株新病毒,病毒形态为弯曲线状,长度约650nm。病毒寄主范围窄。通过NIb2F/3R简并引物和病毒3’-RACE的扩增,获得病毒CP的氨基酸序列,与番木瓜畸型花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）序列同一性为79%。形态结构和CP基因特征均与Potyvirus病毒典型特征相一致,并将该病毒命名为赤瓟花叶病毒（Thladiantha dubia mosaic virus,ThDMV）。2.赤瓟花叶病毒为单链、正义链RNA病毒,通过简并引物与特异性引物相结合的方法获得基因组全长10142 nt。该病毒含有一个较大开放阅读框,编码11个蛋白。ThDMV基因组序列与Genbank报道的PLDMV海南分离株（GenBank登录号:KT633944.1）最为接近,核苷酸和氨基酸水平上的同一性分别为74%和79%。3.本研究以CP基因作为目的基因,构建pET28（a）-CP原核表达载体,通过IPTG诱导,获得高效表达CP蛋白,通过镍柱层析法进行纯化,免疫兔子并获得抗血清,间接ELISA检测其效价为1:32000。该血清特异性强、效价高,可用于ThDMV的检测。4.根据赤瓟的繁殖特征,利用PCR方法证实赤瓟植物根、茎、叶、花、果实均携带ThDMV。同时,块茎传毒率为83%,种子实生苗传毒率为20%。通过介质传播实验证实ThDMV可以通过蚜虫进行传播。5.通过对四个地区的Potyvirus属易感栽培植物进行采样调查,结果表明,仅马铃薯中检测出ThDMV病毒的存在。对黑龙江省五个主要马铃薯主产区采样调查,37.5%样品中检测到ThDMV的存在,并从马铃薯中获得了一株ThDMV病毒分离物,该分离物与来自赤瓟的分离株的核酸同源性为92.6%,氨基酸同源性为96.8%。
王红艳[2]（2017）在《烟草脉带花叶病毒和马铃薯X病毒的协生作用及二者侵染本氏烟的转录组学分析》文中提出马铃薯Y病毒属成员与马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）在生产中常常复合侵染植株产生协生作用,引起更为严重的症状。烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）是马铃薯Y病毒属的一个确定种,能够自然侵染烟草、马铃薯、番茄等茄科作物,在生产中的危害逐年加重。随着高通量测序技术的应用,利用转录组测序技术对植物转录本分析的研究逐渐成为热点,但是应用于研究病毒协生作用的分子机制方面的报道还很少。本研究以实验室自主构建的携带GFP的TVBMV侵染性克隆、将HC-Pro的CDN基序中D198突变为K并将中间区域的IGN突变为DEN而失去协生能力的弱毒突变体以及PVX侵染性克隆为基础,研究TVBMV与PVX的协生作用,并利用RNA-Seq技术研究TVBMV野生型及弱毒突变体分别与PVX复合侵染本氏烟过程中差异表达的寄主基因,研究马铃薯Y病毒属病毒与PVX协生作用影响的寄主代谢通路;利用小RNA测序技术鉴定侵染芝麻的病毒种类,克隆获得1个TVBMV芝麻分离物的全基因组序列并分析了其分子变异情况。具体结果如下:从病害症状、病毒含量等方面研究了TVBMV与PVX的协生。本氏烟接种PVX后第10天,系统叶片表现花叶症状;TVBMV与PVX共同接种本氏烟,在系统叶片引起花叶及卷曲症状,导致植株生长迟缓;弱毒突变体与PVX共同接种本氏烟,仅在植株上部叶片引起轻微的花叶症状。TVBMV与PVX共同接种后第14天,本氏烟植株出现矮化和坏死,弱毒突变体与PVX复合侵染仅引起与PVX相同的花叶症状。共同接种本氏烟后第20天,TVBMV与PVX协生加重了病害症状、显着抑制烟草植株的生长,并造成了植株顶部叶片的坏死,而无协生作用的弱毒突变体与PVX复合侵染仅造成了与PVX单独侵染相似的花叶症状。ELISA检测结果表明,TVBMV与PVX复合侵染在接种后第6天TVBMV病毒积累量开始明显升高,并且与单独接种TVBMV的本氏烟中病毒积累量相当;弱毒突变体与PVX复合侵染后TVBMV病毒积累量远低于野生型TVBMV与PVX复合侵染的本氏烟,且病毒积累量一直维持在较低水平。利用RNA-Seq技术研究了TVBMV野生型及弱毒突变体分别与PVX复合侵染过程中本氏烟的转录组变化情况。病毒在接种后第2天大量复制,接种后第2天的接种叶片及第10天的系统叶片中均含有大量的病毒RNA,clean reads能比到本氏烟参考基因组上的较少。GO富集分析显示,TVBMV与PVX的复合侵染导致大量寄主基因发生异常表达,干扰了寄主的正常代谢,影响了寄主蛋白和酶代谢相关基因、DNA复制相关基因、光合作用相关基因等,使寄主产生一系列的细胞组分、生物过程、分子功能的改变。与弱毒突变体与PVX的侵染相比,侵染前期TVBMV与PVX协生影响DNA复制通路17个基因上调表达,系统侵染后造成与细胞壁合成相关的33个基因和与光合作用相关的蛋白复合体及外周天线61个基因的下调表达以及RNA沉默途径DCL2和RDR1基因的上调表达。KEGG分析表明,与弱毒突变体与PVX的侵染相比,TVBMV与PVX协生,诱导核糖体合成相关基因的表达以帮助病毒蛋白合成;之后通过抑制光合作用相关代谢通路,抑制细胞壁合成相关酶的代谢通路,调节激素介导的信号转导通路,引起植株的花叶和坏死。同时,植物的SA信号途径受到诱导,产生大量PR蛋白以防御病毒的侵染。将从济南章丘芝麻田中采集的表现黄绿花叶、细叶及皱缩的芝麻病株叶片进行小RNA测序,检测到西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）、菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus,BCMV）和烟草脉带花叶病毒（TVBMV）等三种马铃薯Y病毒属病毒,其中TVBMV能够自然侵染芝麻系首次报道,也是TVBMV能够侵染除茄科以外作物的首次报道。进一步RT-PCR及血清学检测证实了小RNA的测序结果。利用步移扩增和5’RACE方法获得了TVBMV-Zhangqiu分离物的全基因组序列,其全基因组序列为9596个核苷酸。TVBMV-Zhangqiu分离物与山东沂源的YY分离物（JN630472）的核苷酸及氨基酸一致率最高,分别为97.89%和99.06%;系统进化分析表明,TVBMV-Zhangqiu分离物聚类到来源于中国大陆的MC组;重组分析表明TVBMV-Zhangqiu分离物是SDYS1与YN分离物的潜在重组体,属于MC组的组内重组,其基因组的主要亲本是SDYS1,8642nt-9533 nt来源于YN;TVBMV-Zhangqiu与TVBMV-HN39接种芝麻的症状存在差异,Zhangqiu分离物接种后仅表现轻花叶症状,HN39分离物接种后的芝麻植株花叶明显且生长迟缓、植株矮化。
王府民[3]（2017）在《用通用PCR和宏基因组学发现鸭和鹅的新病毒》文中提出近20年来,水禽新发传染病不断出现,给我国水禽养殖业造成了巨大的经济损失,因此,开展水禽新病毒的发掘工作有利于水禽疾病的防控。本研究旨在用微RNA病毒和嵌杯病毒的通用RT-PCR以及宏基因组学技术分别检测鹅和麻鸭的样品,以期发现可能存在的水禽新病毒。2014～2015年,从某鹅场采集肠炎病例的63份样品,用微RNA病毒通用RT-PCR进行检测,17份（27.0%）样品为阳性;用嵌杯病毒通用RT-PCR进行检测,9份（14.3%）样品为阳性。用扩增产物序列进行同源性和进化分析,结果显示,所测微RNA病毒毒株分属4类,与之氨基酸序列同源性最高的病毒分别是鸭megrivirus（DMV）（90.5-99.3%）、蝙蝠微RNA病毒3（BatPV3）（66.2%）、鸭甲肝病毒（DuckhepatitisAvirus,DHAV）（53.4%）和猿 sapelovirus1（55.5%）。所测嵌杯病毒毒株分属2类,与之同源性最高的病毒分别是Nacovirus（47.6-66.7%）和札幌病毒（42.9-46.4%）。由此可见,鹅可作为多种微RNA病毒和嵌杯病毒的储存宿主。测定了 3株（HN50-k株、W18株和HN56株）鹅源微RNA病毒的基因组序列。HN50-k株基因组全长 8059 nt,其基因组结构为5’UTR-L-p1（VP0-VP3-VP1）-P2(2AH-box/NC-2B-2CHel-P3（3A-3BVPg-3CPro-3DPol）-3’UTR-Poly（A）。同源性分析显示,HN50-k 株与嵴病毒在 P1（47.86%）和 P2（42.70%）区的氨基酸序列同源性最高,与Passerivirus在P3区的同源性最高（46.83%）。进化分析结果表明,在2C和3CD进化树中,HN50-k株处于独立的进化分支;而在P1蛋白进化树上则位于嵴病毒分支。因此,将HN50-k株鉴定为微RNA病毒科嵴病毒属的一个新病毒种。42份鹅样品中,HN50-k株的阳性率为69.05%,提示鹅群感染HN50-k株的现象较为普遍。W18株和HN56株的基因组长度为9840 nt和10101 nt,其基因组结构为5’UTR-P（VP0-VP3-VP1）-P2（2A1-2A2-2A3H-box/NC-2B-2CHel）-P3（3A-3Bvpg-3CPro-3Dpol）-3’UTR-Poly（A）。在 P2 和 P3 区,W18 株和 HN56株均与DMV的氨基酸序列同源性最高（>91.7%）,表明W18株和HN56株属于Megrivirus属的成员;但在结构蛋白P1区,则分别与DMV和Mesivirus-1的同源性最高（68.5%和52.2%）。结合遗传演化分析结果,可将W18株、HN56株和DMV鉴定为同种病毒的3个不同基因型。在42份鹅样品中,Megrivirus的阳性率为90.5%,表明鹅群感染megrivirus的现象较为普遍。测定了 1株微RNA病毒（HN27株）基因组3’端3711 nt序列。在2C、3CD和P3区,HN27株均与DHAV的氨基酸序列同源性最高,但仅为48.3%、48.7%和43.9%,可能属于微RNA病毒科一个新病毒属的成员,暂将属名称为"Goalvirus"。从霍尔多巴吉鹅肠道样品HN50和HN27中检出5株嵌杯病毒,分属两类,分别以HN50-1株和HN27-1株为代表。测定了 HN50-1株基因组序列（8449nt）和HN27-1株基因组大部分序列（6273nt）。序列分析结果表明,HN50-1株和HN27-1株均具有嵌杯病毒的基因组结构特征。同源性分析结果表明,HN50-1 株与 Nacovirus 在 NS（35.83-37.64%）、Pro-Pol（47.39-50.46%）和VP1（30.34-32.62%）区氨基酸序列同源性最高,与诺如病毒的VP2（19.15-20.97%）蛋白同源性最高;HN27-1 株与 Nacovirus 在 Pro-Pol（45.72-47.25%）、VP1（32.29-33.64%）和 VP2（16.59-23.11%）区的氨基酸序列同源性最高。结合进化分析结果,HN50-1株和HN27-1株代表2个新病毒属,暂名为"Sanovirus"和"Hunovirus"。进一步分析表明,HN50-1株及另外2株相近病毒为同种病毒的3个基因型,而HN27-1株与另一株相近病毒为同种病毒的不同毒株。用宏基因组学技术检测了 2份麻鸭产蛋下降病例的肠道样品,获得1672条contig序列,其中255条（15.25%）匹配至小双节RNA病毒（Picobirnavirus,PBV）,10条（0.60%）匹配至轮状病毒（Rotavirus,RV）,2条（0.12%）匹配至微RNA病毒。从PBV序列中选全长或接近全长的基因序列进行分析,包括19株PBV的S1片段和11株PBV的S2片段。同源性分析结果显示,在衣壳蛋白区,19株PBV的氨基酸序列同源性为16.07-51.89%,与其他PBV的同源性为15.12-40.46%;在RdRp区,11株PBV的氨基酸序列同源性为47.73-70.65%。结合遗传演化分析结果,可见鸭源PBV均属基因Ⅰ群,但表现出高度变异性。测定了鸭源轮状病毒LH530株7个基因节段的部分序列。同源性分析显示,在所测基因节段,LH530株均与轮状病毒D（RVD）的氨基酸序列同源性最高,分别为 94.70-95.42%（VP1）、96.99-97.19%（VP2）、83.28-83.44%（VP3）、73.02-73.62%（VP4）、62.01-62.66%（VP7）、86.00-86.03%（NSP2）和 72.95-75.85%（NSP3）。进化分析结果表明,LH530株与鸡源RVD聚为相同的进化分支,但亦存在明显差距,属于RVD的一个新基因型。结果表明,麻鸭可感染多种RNA病毒。
王丽[4]（2013）在《甘薯病毒病害（SPVD）病原的基因组测序、检测及种传效率研究》文中认为甘薯病毒病害（Sweet potato virus disease, SPVD）是由甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）和甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV）协生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD对甘薯产量影响极大,严重时可造成90%以上的产量损失,甚至绝收,是甘薯上最严重的病毒病害之一。我国于2010年首次发现了SPVD的发生,目前主要分布在广东、江苏、四川、安徽和福建等地。为了加强对SPVD的预警和控制,防止该病的进一步蔓延危害,有必要对该病害的两个病原SPCSV和SPFMV进行深入研究。SPCSV可划分为东非（EA）和西非（WA）两个株系,目前侵染我国甘薯的主要是WA株系（SPCSV-WA）.本文以SPVD的两个主要病原SPCSV-WA和SPFMV为研究对象,完成了SPCSV-WA中国分离物的基因组全序列测定；分析了我国甘薯上SPCSV-WA的分子变异情况；建立了SPCSV-WA和SPFMV实时荧光定量PCR检测技术；对SPCSV-WA的寄主范围以及SPCSV和SPFMV的种传特性进行了初步研究,以期为SPVD的防控提供技术手段和理论依据。论文主要结果如下：1、利用RT-PCR结合3’-RACE和5’-RACE方法,成功地从传毒介体烟粉虱中克隆了SPCSV-WA江苏分离物（SPCSV-WA-JS）基因组RNA1和RNA2全长序列（GenBank登录号：KC146840和KC146841）。序列分析表明,SPCSV-WA江苏分离物RNA1全长8637nt,包含89nt的5’端非翻译区（UTR）和193nt的3’-UTR。RNA2全长8107nt,包含191nt的5’-UTR和192nt的3’-UTR。RNA1包含4个开放阅读编码框（ORF）。其中,ORFla位于90-6053nt,ORF1b位于6052-7569nt,ORF2位于7583-8272nt, ORF3位于8277-8444nt,分别编码polyprotein蛋白、RdRp. RNase3蛋白、p7蛋白。RNA2包含9个ORF,其中,ORF4位于192-329nt, ORF5位于333-467nt, ORF6位于406-534nt, ORF7位于879-2543nt, ORF8位于2565-4121nt, ORF9位于4103-4324nt, ORF10位于4352-5125nt, ORF11位于5128-7182nt,ORF12位于7187-7915nt。分别编码p5.2蛋白、p5蛋白、p5.1蛋白、Hsp70, p60蛋白、p8蛋白、CP蛋白、mCP蛋白、p28蛋白。将SPCSV-WA-JS与西班牙Can181-9分离物进行比对,RNA1和RNA2的相似性分别为98.90%和98.68%,表明SPCSV-WA的基因组序列高度保守,分子变异较小。2、利用RT-PCR获得了重庆（SPCSV-WA-CQ）和四川（SPCSV-WA-SC-8、SPCSV-WA-SC-12）等地区3个分离物的近全长序列（GenBank登录号分别为：KC888966和KC888963、KC888964和KC888961、KC888965和KC888962）。对我国不同地区SPCSV-WA分离物的基因组序列进行相似性分析,结果表明4个分离物的核苷酸序列相似性达到98%以上,核苷酸序列呈现高度保守性,分子变异较小3、依据GenBank中登录的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白（CP）基因的保守区设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了特异、灵敏、高效的SPFMV实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法只能检测到目的病毒,最低可检测到约5.46个拷贝·μL-1的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高2个数量级。本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测。4、依据GenBank中登录的SPCSV-WA核苷酸序列,分别设计两对特异性引物和一条TaqMan探针。以SPCSV-WA CP基因的重组质粒为阳性标准质粒绘制标准曲线,通过优化反应体系和反应条件,建立了SPCSV-WA的实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法只能检测到目的病毒,最低可检测到约3.31个拷贝·μL-1的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高1000倍。本研究建立的SPCSV实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测。5、采用烟粉虱传毒和实时荧光定量PCR检测的方法测定了SPCSV-WA的寄主范围。共测定4科8种植物。结果表明,经烟粉虱传毒后,胡萝卜、雍菜表现为轻微花叶,巴西牵牛表现为叶片皱缩,番茄表现为轻微花叶和叶片皱缩,普通烟、本氏烟、白菜和萝卜均不表现明显症状。实时荧光定量PCR检测结果表明,8种供试植物均呈SPCSV-WA阳性,说明SPCSV-WA能侵染所有供试的8种植物。其中,胡萝卜、雍菜、萝卜、白菜、普通烟和番茄6种植物为首次报道。对胡萝卜进行了回传实验,接种烟粉虱2周后,健康的胡萝卜上出现轻微花叶症状,实时荧光定量PCR方法检测呈SPCSV-WA阳性。6、通过烟粉虱传毒获得感染SPCSV-WA的烟草植株,以感病烟草植株上收获的种子为材料,利用NCM-ELISA检测种子实生苗的带毒率,共检测了760株烟草,SPCSV-WA的种传率为5.39%。应用实时荧光定量PCR方法检测SPCSV-WA在烟草种子和花器上的分布情况,结果表明烟草种子、花冠、雄蕊、雌蕊、花萼均携带SPCSV。7、将SPVD甘薯植株的茎蔓作为接穗嫁接到供试甘薯品种上,待其发病表现典型SPVD症状后,将其移栽至海南试验田进行种子繁育。以SPVD甘薯植株上收获的种子为材料,应用NCM-ELISA和实时荧光定量PCR方法检测种子实生苗的传毒率、SPVD甘薯植株的花器及种子不同部位带毒情况。NCM-ELISA方法共检测了1311株实生苗,2012年和2013年SPCSV的种传率分别为4.56%和0.90%,SPFMV的种传率分别为7.49%和2.59%；实时荧光定量PCR检测了55份甘薯实生苗,SPCSV和SPFMV的种传率均为100%。应用实时荧光定量PCR方法检测SPVD甘薯植株的花器及种子不同部位带毒情况,结果表明种皮、胚乳、胚、雄蕊、雌蕊、花萼均携带SPCSV和SPFMV;花冠携带SPFMV,不携带SPCSV.
王芳,高正良,周本国,许大凤,安梦楠,吴元华[5]（2013）在《烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析》文中研究指明利用引起烟草脉坏死病的马铃薯Y病毒脉坏死株系辽宁分离物（Potato virus Y—vein necrosis strain Liaoning isolate,PVYN-LN）,以GenBank中已有的PVY全序列为基础,设计特异引物。通过总RNA提取、RT-PCR、3’RACE和5’RACE扩增及序列测定,测得PVYN-LN全长基因组序列（NCBI登录号为JQ971975）包括9714个碱基（含PolyA尾）,整条序列仅包含一个由9186个碱基组成的开放读码框（ORF）,编码一条包含3061个氨基酸的多聚蛋白。对所得序列进行BLAST,利用MEGA软件对所测得的PVYN-LN全序列与GenBank中已有的PVY全序列及氨基酸进行系统进化分析,发现PVYN-LN分离物与已报道的PVYN株系具有较高的进化亲缘关系,该分离物属于PVYN株系。序列重组分析软件RDP4分析,该序列无重组。
林双庆[6]（2012）在《福建漳州水仙病毒病的病原鉴定及两病毒基因组全序列分析》文中研究指明水仙病毒病是危害水仙生产的主要病害之一。通过对福建漳州水仙的田间病害调查,发现田间发病植株主要表现为褪绿斑驳、褪绿条纹、黄条、花叶等症状。采集的水仙样品经电镜观察,可以观察到长度在550-850nm姗之间的病毒线状粒体。通过血清学方法初步检测到了水仙花叶病毒（Narcissus mosaic virus, NMV）、水仙黄条病毒（Narcissus yellow stripe virus, NYSV）和水仙迟黄病毒（Narcissus late season yellows virus, NLSYV）三种病毒。利用已报道的水仙常见病毒的特异性引物和马铃薯Y病毒属简并引物对水仙样品进行分子生物学检测,并结合生物学方法,确定了漳州水仙病毒病的病原主要包括NMV、NYSV、NLSYV、水仙潜隐病毒（Narcissus latent virus, NLV）、水仙普通潜隐病毒（Narcissus common latent virus, NCLV）和水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus, NDV）.另外在漳州水仙上还获得了两个马铃薯Y病毒属病毒分离物Y13-1和ZZ-2,其中Y13-1可能为马铃薯Y病毒属的一个新种,ZZ-2可能为NYSV的一个株系。利用基于马铃薯Y病毒属简并引物的RT-PCR和RACE扩增方法,测定了NLSYV漳州分离物（NLSYV-ZZ）和分离物ZZ-2的基因组全序列,并测定了分离物Y13-13’-端约4.6kb的基因序列。NLSYV-ZZ的基因组全序列为该病毒的首次报道（登录号为JQ326210）。基因组全长为9651个核苷酸（nt）,5’-非编码区（5’-UTR）长度为123nt,3’-非编码区（3’-UTR）长度为210nt。NLSYV-ZZ基因组全序列与亲缘关系相近的病毒比较, NLSYV-ZZ与NYSV核苷酸序列一致性最高,为69.9%,与薤花叶病毒（Scallion mosaic virus, ScaMV）的一致性为62.5%,与芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）的不同分离物一致性为58.8-59.8%。在基于多聚蛋白构建的系统进化树上,NLSYV-ZZ与NYSV、ScaMV、TuMV、日本山药花叶病毒（Japanese yam mosaic virus、JYMV）聚类在同一个分支上,表明了NLSYV-ZZ与这些病毒亲缘关系较近。分离物Y13-13’-端基因序列长为4606nt（登录号JQ911735）。将3’-端基因序列BLASTn搜索,结果表明Y13-1与NYSV序列一致性最高,其次为ScaMV和TuMV的各个分离物。将Y13-1的CP基因与其他马铃薯Y病毒属病毒比较,发现Y13-1与NLSYV-ZZ、NYSV的序列一致性最高,分别为73.3%nt（73.6%aa）和72.5%nt（77.1%）。这些数值在基因水平上符合ICTV关于马铃薯Y病毒属物种的分类标准。因此本研究初步认定Y13-1可能为新种,并暂时命名为水仙斑驳病毒（Narcissus mottle virus, NMoV）。分离物ZZ-2基因组全长为9654nt,5’-UTR长度为130nt,3’-UTR长度为206nt（登录号JQ911732）。ZZ-2的基因组核苷酸序列与NSYV一致性最高,为71.9%,与NLSYV-ZZ一致性为70.2%。在CP基因上,ZZ-2与NYSV的一致性同样是最高,为77.6%nt（84.4%aa）,高于马铃薯Y病毒属病毒分类标准的界限值76%nt（80%aa）。因此本研究认为ZZ-2属于NYSV的一个株系。
贾金磊[7]（2011）在《两个马铃薯Y病毒分离物全基因组序列测定及抗病毒dsRNA表达载体的构建》文中研究说明马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）是我国烟草上的主要病毒。甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）引起玉米矮花叶病,严重影响我国玉米产量。从山东烟草上分离得到2个PVY分离物AQ4（JN083841）和FZ10（JN083842）,在烟草上引起花叶或斑驳。测定两个分离物的全基因组序列,发现AQ4和FZ10均为N和O株系分离物的重组体。AQ4分离物1-496 nt和2497-9700 nt来源于PVYO株系的分离物Oz,497-2496 nt来源于PVYN株系的分离物CH-605。FZ10分离物1-496 nt和2497-6533 nt来源于PVYO株系的分离物SASA-110,497-2496 nt和6534-9698 nt来源于PVYN株系分离物CH-605。系统进化分析表明,AQ4属于PVYN:O亚组, FZ10属于重组的PVYNTN亚组。以前报道HC-Pro上D205、K400和E419氨基酸决定PVY烟草上引起坏死,FZ10的HC-Pro含这三个位点,但在烟草上引起花叶,这说明可能还有其它基因或位点决定PVY在烟草上引起坏死。选择PVY、CMV和TMV的核苷酸序列中适合siRNA形成的保守区域,以AQ4和实验室克隆的TMV、CMV cDNA为模板,从PVY CP、CMV RdRp和TMV CP基因上分别扩增了300 bp、250 bp和450 bp的片段。以TMV片段中部分序列作为间隔区域,将三个片段连接后以反向重复方式插入pGEM-T Easy载体,得到dsRNA表达载体。将载体导入RNaseⅢ缺失的大肠杆菌菌株HT115（DE3）,诱导表达后获得dsRNA。使用表达dsRNA的细菌培养液破碎后处理三生烟（N.tabccum cv.Samsun）,然后接种病毒,发病率下降明显,表明dsRNA培养液有良好的抗病毒效果。通过对NCBI上SCMV全基因组序列的分析,选取了位于CI、NIb和CP基因的适合siRNA形成的保守序列。以SCMV cDNA为模板扩增得到这三个片段后通过融合PCR将三者融合并构建反向重复,通过NcoI/BstEⅡ双酶切将反向重复序列插入双元表达载体pCAMBIA3301,获得RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi。
向冰冰,杨洪一,赵敏,崔岱宗[8]（2009）在《菜豆普通花叶病毒RT-PCR检测及3′末端序列分析》文中认为根据哈尔滨地区豇豆感病植株的症状,初步鉴定感染豇豆的病毒为菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic vi-rus,BCMV）。利用马铃薯Y病毒属通用引物扩增出病毒基因组3′末端序列,经BLAST检索表明该病毒为BCMV,将该序列与GenBank上的21个BCMV分离物的3′末端序列进行比较,显示其核苷酸序列与其他分离物的序列同源性为91.7%97.3%。系统进化分析显示不同分离物可聚为5个类群,并显示出一定的寄主相关性。哈尔滨分离物BCMV-X与2个浙江分离物、1个澳大利亚分离物聚为一支,且该4株分离物的寄主均为豇豆。RNA二级结构分析显示BCMV基因组3′末端非编码区形成4个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。
吴承春[9]（2009）在《侵染蕌头的病毒种类鉴定及其部分病毒序列基因组特性分析》文中研究表明藠头（Allium chinense G.Don）为百合科葱属多年生植物,其起源地为亚洲,是一种具有极高的经济价值的传统蔬菜作物。而藠头病毒病是致使藠头产量和品质大幅降低的主要因素。本文在田间病害调查的基础上,利用生物学、血清学以及病毒粒子形态和感病植物细胞病理特征观察,结合分子生物学方法,对来自武汉江夏区的藠头病毒样品进行了种类鉴定,并对所获病毒克隆基因组部分序列特性进行了分析,确定了该藠头产区侵染的病毒至少包括三个属4种病毒,主要研究结果如下:1.明确发生在江夏区藠头存在复合感染现象。通过在湖北省武汉市江夏区藠头田间病害调查,发现田间藠头植株表现为花叶、褪绿条纹、植株扭曲、黄化等症状;通过汁液摩擦接种到6种指示植物上,确定部分藠头病毒病的繁殖寄主为昆诺藜;利用4个不同感病样品的粗提液,经负染后电镜观察,发现有3种不同的病毒粒子形态,包括杆状、线型（歪曲和直线型）;直接采取感病藠头叶片制作超薄切片,经电镜观察发现感病寄主细胞质内含有大量的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员特异的风轮状（横切）或柱状（纵切）内含体。2.首次发现侵染我国藠头的马铃薯Y病毒属OYDV病毒分离物。利用马铃薯Y病毒属内成员基因组简并引物,结合通用引物M4,获得该属基因组3′端序列大小约1.7kb的扩增片段,对该片段进行了克隆和序列测定,其全长为1625个核甘酸,包括部分NIb（636bp）、全长CP基因（771bp）和3′端UTR序列。将所获克隆基因组3′端核甘酸序列在数据库比对分析,发现所获病毒克隆基因组3′端区域与洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus,OYDV）相同区域的核甘酸同源性最近,最高达99%。外壳蛋白基因的核甘酸和推测氨基酸序列与已报道的OYDV分离物CP相应区域同源性分别为80%-99%和87%-99%;构建了CP基因核甘酸和编码外壳蛋白氨基酸序列进化树,结果显示,所获克隆基因组CP序列与来自大蒜上的OYDV云南分离物OYDV-YN2（GenBank登录序列号AJ409313）、两个江苏分离物OYDV-JS2（登录序列号AJ409310）、OYDV-JS1（登陆序列号AJ293278）及日本分离物OYDV-Gzm（登录序列号AB000840）相同区域同源性均很高（≥97%）,聚成一簇。将该分离物暂命名为OYDV-WH,这是OYDV病毒侵染我国藠头的首次报道。3.首次发现侵染我国藠头的香石竹潜隐病毒属7个不同克隆。利用香石竹潜隐病毒属内成员基因组简并引物,结合引物M4,获得该属基因组3′端核甘酸序列,共9个克隆,大小为1808-1812个核甘酸,序列特性分析表明,其包含病毒RNA基因组全长的第3-6共4个阅读框（ORF）。序列比对显示,这些克隆与现有报道的大蒜潜隐病毒（Garlic latent virus,GLV）基因组3′端相同区域的核苷酸序列最为接近,同源性分别在75%-82%之间,9个克隆中有7个克隆在该区域的核苷酸差异比较大,同源性在77%-93%之间。CP序列比对分析表明,所获得克隆基因组CP序列与目前报道的GLV基因组CP核苷酸和氨基酸同源性分别在75%-87%和88%-97%之间,其中克隆P2和carl-5基因组序列结构最相似,与日本藠头上的分离物GLV-Rjpn（登录序列号AB004565）氨基酸同源性最接近,达97%。本研究获得的具有较大序列差异的7个克隆之间基因组CP核苷酸和氨基酸的同源性分别76%-89%和88%-100%。外壳蛋白核甘酸序列进化树分析表明,7个克隆分别与其他GLV分离物共形成4个不同进化族,其中P4克隆CP核甘酸进化树上形成独立一族,且其核甘酸数量也有较大差异,因此,推测该克隆很可能为香石竹潜隐病毒属的一个新种。将所获的克隆基因组序列第3个ORF（编码蛋白TGB2）、第4个ORF（编码蛋白TGB3）和第6个ORF（编码核酸结合蛋白NABP）分别与已知报道的GLV基因组对应区域序列进行比对分析表明,氨基酸序列同源性分别为71%-90%、59%-85%、82%-95%。ORF3、ORF4、ORF6基因变异比ORF5基因变异要大些,其中ORF4变异最大,而ORF5变异主要发生在其编码氨基酸的N末端。根据Carlavirus属分类标准-不同病毒CP氨基酸同源性小于68%,同一病毒不同株系间为75%-90%。因此推断本研究所获得的克隆是属于GLV不同的分离物。这是我国藠头上的首次发现侵染GLV病毒。利用所获病毒克隆基因组RNA3′端序列设计RNA基因组部分中间片段下游特异性简并引物pCarl-2dW（-）和上游简并引物pCare-2（+）,RT-PCR扩增获得包含病毒GLV基因组的第2个ORF2及部分ORF1的片段。序列结构分析发现,ORF1和ORF2之间有30个核甘酸的非编码区。ORF2与ORF3有23个核苷酸重叠区域。ORF2共含有708个核苷酸,编码TGB1蛋白,将所获病毒克隆基因组ORF2区域序列片段与现有报道的相关病毒相同区域比对分析,结果显示该病毒基因组ORF2也存在较大的变异,核甘酸和氨基酸同源性分别在72%-78%和76%-83%。4.首次发现侵染我国藠头的利用葱X病毒属2个不同病毒。利用葱X病毒属内成员基因组简并引物,结合引物M4,获得该属基因组3′端序列约1.0kb扩增片段,共8个克隆。其中克隆pGTdw-8基因组3′端序列含有939个核甘酸,其它7个克隆均为949个核甘酸（代号为pGTdw-15）,包括部分CP基因（441个核甘酸）、完整NABP全长基因381个核甘酸和3′端非编码区。经数据库Blast序列分析表明,克隆pGTdw-8基因组3′端序列与现有报道的葱X病毒属我国大蒜上发现的大蒜病毒E（GarV-E,AJ292230）分离物相同区域核甘酸序列最相似,同源性达94%。另一个克隆pGTdw-15与大蒜病毒X韩国分离物（GarV-X,U89243）相同区域核甘酸序列最相似,具有91%的同源性,序列系统进化树表明,本研究所获葱X病毒属相关病毒克隆基因组3′端的核甘酸进化树与完整的NABP核甘酸进化树存在较大的进化族相关性和一致性。同时,基因组3′端UTR非翻译区序列的比对结果显示,本研究所得克隆pGTdw-8基因组3′端UTR与分离物Garv-E相同区域同源性达94%,另一类病毒克隆pGTdw-15基因组3′端UTR与分离物Garv-X相同区域同源性高达98%,根据国际病毒分类委员会发表的Allexivirus属分类标准是CP氨基酸同源性小于90%,3′端UTR核甘酸同源性小于90%。因此,认为本研究获得的2种克隆pGTdw-8和pGTdw-15分别属于葱X病毒属两种病毒Garv-E和Garv-X的分离物,这是我国藠头上的首次发现这两种葱X病毒属病毒。
王红艳[10]（2008）在《芜菁花叶病毒与烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定及分析》文中研究表明芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）、烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）和甜菜花叶病毒（Beet mosaic virus,BtMV）均为世界性分布的病毒,分别是危害十字花科蔬菜、茄科作物和藜科植物的主要病毒。本研究克隆了2个TuMV分离物和1个TVBMV分离物的全基因组序列,分析了这2种马铃薯Y病毒属病毒的分子变异情况,并首次报道了BtMV能自然侵染莴苣。芜菁花叶病毒（TuMV）:从山东泰安和潍坊的萝卜上分离得到2个TuMV分离物WFLB06和TANX2,测定了它们的全基因组序列。生物学实验表明2个TuMV分离物均属于BR致病型,能同时侵染芸薹属和萝卜属植物,系统进化树分析表明它们均属于basal-BR组,这是中国basal-BR组分离物全基因组序列的首次报道。通过RDP重组软件进行分析,发现这2个TuMV分离物均存在多次重组。其中WFLB06分离物是发生在P1基因、NIb基因和CI基因上的basal-BR与Asian-BR谱系间的重组,TANX2分离物是发生在P1基因、6K2基因、VPg基因上的basal-BR谱系内的重组。而且,这2种重组类型均是与先前报道的37种类型不同的新的重组类型。核苷酸及氨基酸的一致率比较发现,中国和日本分离物来源于相同的种群,中国的TuMV basal-BR组的分离物可能来源于日本。分析中国TuMV分离物的遗传多样性,发现中国TuMV分离物的编码区在进化过程中氨基酸非常保守,处于负向或纯化选择。烟草脉带花叶病毒（TVBMV）:本研究获得了我国烟草脉带花叶病毒主流株系代表分离物HN39的全基因组序列,HN39的全基因组序列为9570个核苷酸,这是世界上获得的TVBMV的第二个全基因组序列。TVBMV-HN39全基因组序列与水茄花叶病毒（Wild tomato mosaic virus,WTMV）一致率最高,基因组的不同区段与不同马铃薯Y病毒属病毒的相应区段有最高的序列一致率,说明TVBMV-HN39的不同基因可能由不同的祖先进化而来。甜菜花叶病毒（BtMV）:从泰安郊区菜田中表现花叶、矮化的莴苣病株上得到病毒分离物SD,血清学检测结果表明SD分离物是马铃薯Y病毒属病毒。利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物,通过RT-PCR技术获得了其3′-端约1.7 kb片段。Blast分析证明该分离物为BtMV。Western blotting结果进一步证实了这一结论。BtMV-SD与其它BtMV分离物3′-端基因序列的一致率为91.1-98.8%。这是BtMV在自然条件下侵染莴苣的首次报道。
二、Potyvirus属成员基因组全序列的简并引物PCR和RACE扩增方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Potyvirus属成员基因组全序列的简并引物PCR和RACE扩增方法（论文提纲范文）
（1）赤瓟花叶病毒（ThDMV）的鉴定及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 野生植物病毒研究现状 |
| 1.2 野生植物中Potyvirus属病毒的研究 |
| 1.3 未知植物病毒检测方法 |
| 1.3.1 基于传统分子生物学的未知病毒检测方法 |
| 1.3.2 基于新型测序技术的未知病毒检测方法 |
| 1.4 赤瓟的研究概况 |
| 1.5 本文的研究目的和主要内容 |
| 2 赤瓟花叶病毒的鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 所需主要试剂及试剂配制 |
| 2.1.4 所设计引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品的采集与存放 |
| 2.2.2 病毒的致病性检测 |
| 2.2.3 病毒颗粒的纯化 |
| 2.2.4 病毒颗粒的电子显微镜观察 |
| 2.2.5 植物样品总RNA的提取 |
| 2.2.6 利用简并引物NIb进行RT-PCR扩增 |
| 2.2.7 病毒基因组3'末端的扩增 |
| 2.2.8 序列的克隆与鉴定 |
| 2.2.9 病毒的寄主范围 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 样品采集 |
| 2.3.2 病毒的致病性 |
| 2.3.3 病毒颗粒纯化及SDS-PAGE鉴定结果 |
| 2.3.4 病毒颗粒电子显微镜观察结果 |
| 2.3.5 分子生物学检测与分析 |
| 2.3.6 病毒的寄主范围 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 ThDMV的全基因组测序及生物信息学分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验所需引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 基因组全序列总策略 |
| 3.2.2 3'-RACE序列扩增 |
| 3.2.3 简并引物及中间病毒序列PCR扩增 |
| 3.2.4 5'-RACE序列扩增 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因片段扩增与序列鉴定 |
| 3.3.2 基因组结构分析 |
| 3.3.3 与马铃薯Y病毒属其他成员的序列比较 |
| 3.3.4 系统进化树分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 ThDMV检测方法的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验所需仪器 |
| 4.1.2 实验所需试剂 |
| 4.1.3 实验所需引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组表达载体的构建 |
| 4.2.2 外源蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.2.3 抗血清的制备 |
| 4.2.4 ELISA检测方法的建立 |
| 4.2.5 样品检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组表达载体的鉴定 |
| 4.3.2 外源蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 外源蛋白的纯化与定量 |
| 4.3.4 抗血清的制备与效价测定 |
| 4.3.5 Western blot鉴定结果 |
| 4.3.6 赤瓟样品检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 ThDMV传播途径初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验样品 |
| 5.1.2 实验仪器和试剂 |
| 5.1.3 实验所需引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 赤瓟不同部位带毒检测 |
| 5.2.2 赤爬块茎实生苗传毒率检测 |
| 5.2.3 种子传毒率的检测 |
| 5.2.4 介质传播 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 赤瓟不同部位带毒检测结果 |
| 5.3.2 块茎毒率的检测结果 |
| 5.3.3 种子传毒率的检测结果 |
| 5.3.4 介质传播结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 ThDMV在栽培作物中的调查 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 不同栽培植物的田间调查 |
| 6.2.2 黑龙江地区马铃薯田间调查研究 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 不同栽培植物的田间调查结果 |
| 6.3.2 黑龙江地区马铃薯田间调查研究结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）烟草脉带花叶病毒和马铃薯X病毒的协生作用及二者侵染本氏烟的转录组学分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 烟草脉带花叶病毒 |
| 1.1.1 发生与危害 |
| 1.1.2 全基因组序列与结构 |
| 1.1.3 蛋白序列及功能的研究 |
| 1.2 马铃薯X病毒 |
| 1.3 病毒的相互作用 |
| 1.3.1 协生作用 |
| 1.3.2 拮抗作用 |
| 1.4 二代测序在植物病毒研究中的应用 |
| 1.4.1 二代测序技术研究病毒与寄主植物的互作 |
| 1.4.2 二代测序技术鉴定植物病毒 |
| 1.5 芝麻病毒病 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品及毒原 |
| 2.1.2 供试植物 |
| 2.1.3 菌株 |
| 2.1.4 血清 |
| 2.1.5 生化试剂、试剂盒与酶 |
| 2.1.6 寡聚核苷酸引物 |
| 2.1.7 主要实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 侵染性克隆的接种 |
| 2.2.2 间接ELISA法检测病毒积累量 |
| 2.2.3 RT-PCR检测病毒 |
| 2.2.4 本氏烟的转录组数据分析 |
| 2.2.5 芝麻病叶的小RNA测序 |
| 2.2.6 验证小RNA测序结果 |
| 2.2.7 TVBMV芝麻分离物全基因组序列测定 |
| 2.2.8 TVBMV芝麻分离物全基因组序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TVBMV与PVX的协生 |
| 3.1.1 TVBMV野生型及弱毒突变体T-HCM与PVX侵染本氏烟的症状 |
| 3.1.2 检测TVBMV野生型及弱毒突变体与PVX侵染本氏烟病毒的积累量 |
| 3.2 TVBMV野生型及弱毒突变体与PVX复合侵染的转录组学分析 |
| 3.2.1 RNA样品的提取及质量检测 |
| 3.2.2 测序数据的初步分析 |
| 3.2.3 基因表达水平分析 |
| 3.2.4 基因差异表达分析 |
| 3.2.5 差异基因的GO富集分析 |
| 3.2.6 差异基因的KEGG富集分析 |
| 3.2.7 荧光定量RT-PCR验证RNA-seq数据的准确性 |
| 3.2.8 荧光定量PCR验证关键通路基因 |
| 3.2.9 协生引起的病害症状的相关因子 |
| 3.3 感病芝麻样品的小RNA测序及分析 |
| 3.3.1 感病芝麻样品的田间症状 |
| 3.3.2 RNA样品的提取及质量检测 |
| 3.3.3 序列处理 |
| 3.3.4 小RNA测序结果 |
| 3.3.5 RT-PCR检测芝麻样品中的TVBMV |
| 3.3.6 序列测定及分析 |
| 3.3.7 Western blotting检测芝麻样品TVBMV蛋白表达水平 |
| 3.4 TVBMV芝麻分离物全基因组测序及分析 |
| 3.4.1 RT-PCR结果 |
| 3.4.2 序列测定 |
| 3.4.3 基因组结构 |
| 3.4.4 核苷酸和氨基酸一致率 |
| 3.4.5 系统进化关系 |
| 3.4.6 重组分析 |
| 3.4.7 生物学性状 |
| 3.4.8 全基因组序列 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病毒的协生作用 |
| 4.2 病毒复合侵染本氏烟引起的转录组变化 |
| 4.3 协生作用与单独侵染本氏烟的转录组数据比较 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）用通用PCR和宏基因组学发现鸭和鹅的新病毒（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 微RNA病毒目 |
| 1.2 微RNA病毒科 |
| 1.3 嵌杯病毒 |
| 1.4 小双节RNA病毒 |
| 1.5 轮状病毒 |
| 1.6 热不对称交错PCR |
| 1.7 病毒宏基因组学 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鹅源微RNA病毒和嵌杯病毒的分子检测 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 鹅源Megrivirus的分子检测和鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鹅源新嵌杯病毒的分子鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鹅源嵴病毒样微RNA病毒的分子鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 用病毒宏基因组学分析麻鸭肠道RNA病毒群落多样性 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.3 方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论 |
| 第八章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）甘薯病毒病害（SPVD）病原的基因组测序、检测及种传效率研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| CONTENTS |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甘薯病毒病研究进展 |
| 1.1.1 甘薯病毒病发生概况 |
| 1.1.2 几种主要甘薯病毒的研究进展 |
| 1.2 甘薯病毒检测方法研究进展 |
| 1.2.1 症状学诊断法 |
| 1.2.2 生物学检测法 |
| 1.2.3 电子显微镜技术 |
| 1.2.4 血清学检测法 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.3 植物种传病毒研究进展 |
| 1.3.1 种子传毒的危害及国内外研究概况 |
| 1.3.2 种传病毒的类型和机理 |
| 1.3.3 种子传毒率检测研究 |
| 1.3.4 影响种子传毒的因素 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 甘薯褪绿矮化病毒西非株系中国分离物基因组全序列测定及分子变异研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 甘薯病毒样品的采集 |
| 2.1.2 带毒烟粉虱 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物设计及合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基本的分子生物学方法 |
| 2.2.2 SPCSV-WA基因组全长序列的克隆策略 |
| 2.2.3 SPCSV-WA基因组近全长序列的克隆方法 |
| 2.2.4 SPCSV-WA江苏分离物(SPCSV-WA-JS)基因组全长序列的克隆与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 SPCSV-WA4个分离物基因组近全长序列的克隆与序列测定 |
| 2.3.2 SPCSV-WA-JS基因组全长序列的克隆与序列测定 |
| 2.3.3 SPCSV-WA-JS基因组全长序列的分析与比较 |
| 2.3.4 SPCSV-WA不同分离物的分子变异分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 甘薯羽状斑驳病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒和甘薯病毒材料 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 引物和探针的设计与合成 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 NCM-ELISA检测 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR的初步应用 |
| 3.2.4 实时荧光定量PCR产物的克隆和序列测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组质粒标准品的制备 |
| 3.3.2 引物、探针浓度及循环条件的优化 |
| 3.3.3 标准曲线的建立 |
| 3.3.4 荧光定量PCR与常规PCR检测方法的灵敏度比较 |
| 3.3.5 特异性试验 |
| 3.3.6 重复性试验 |
| 3.3.7 荧光定量PCR方法的初步应用 |
| 3.3.8 荧光定量PCR扩增产物的鉴定 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒和甘薯病毒材料 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 引物和探针的设计与合成 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 NCM-ELISA检测 |
| 4.2.2 SPCSV-WA CP基因的克隆与序列测定 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 4.2.4 实时荧光定量PCR的初步应用 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR产物的克隆和序列测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 标准质粒的制备 |
| 4.3.2 引物、探针浓度及反应条件的优化 |
| 4.3.3 标准曲线的建立 |
| 4.3.4 荧光定量PCR与常规PCR检测方法的灵敏度比较 |
| 4.3.5 特异性试验 |
| 4.3.6 重复性试验 |
| 4.3.7 实时荧光定量PCR的初步应用 |
| 4.3.8 实时荧光定量PCR产物的克隆和序列测定 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 甘薯褪绿矮化病毒西非株系的寄主范围研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 烟粉虱 |
| 5.1.2 毒源植物 |
| 5.1.3 供试植物 |
| 5.1.4 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 烟粉虱传毒试验 |
| 5.2.2 实时荧光定量PCR检测 |
| 5.2.3 实时荧光定量PCR产物的克隆与序列测定 |
| 5.2.4 胡萝卜的回传实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 供试植物的症状观察 |
| 5.3.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 5.3.3 实时荧光定量PCR产物的克隆和序列测定 |
| 5.3.4 胡萝卜回传实验结果 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 甘薯褪绿矮化病毒与甘薯羽状斑驳病毒的种传效率研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 主要试剂与仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 病毒接种及感病甘薯植株种子的繁育 |
| 6.2.2 感病烟草植株种子的获得 |
| 6.2.3 种子播种及苗期调查 |
| 6.2.4 NCM-ELISA检测 |
| 6.2.5 甘薯实生苗中SPCSV与SPFMV的实时荧光定量PCR检测 |
| 6.2.6 种子不同部位病毒检测 |
| 6.2.7 花器不同部位病毒检测 |
| 6.2.8 实时荧光定量PCR产物的克隆与序列测定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 SPCSV在烟草上的种传效率 |
| 6.3.2 甘薯种子传播SPCSV和SPFMV的研究 |
| 6.3.3 SPCSV与SPFMV在甘薯种子及花器上的分布 |
| 6.3.4 荧光定量PCR扩增产物的鉴定 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物 |
| 1.2.2 植物RNA提取 |
| 1.2.3 反转录 |
| 1.2.4 PCR扩增 |
| 1.2.5 3’RACE |
| 1.2.6 5’RACE |
| 1.2.7 PCR产物纯化与测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 PVY PCR扩增 |
| 2.2 产物纯化与测序 |
| 2.3 3’RACE |
| 2.4 5’RACE |
| 2.5 序列测定与分析 |
| 3 结果与讨论 |
（6）福建漳州水仙病毒病的病原鉴定及两病毒基因组全序列分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 水仙病毒病研究概况 |
| 1.2 侵染水仙的主要病毒研究进展 |
| 1.2.1 水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus, NMW) |
| 1.2.2 水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus,NYSV) |
| 1.2.3 水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV) |
| 1.2.4 水仙迟黄病毒(Narcissus late season yellows virus,NLSYV) |
| 1.2.5 水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus,NDV) |
| 1.2.6 水仙顶端坏死病毒(Narcissus tip necrosis virus,NTNV) |
| 1.2.7 水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus,NCLV) |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒源 |
| 2.1.2 供试寄主 |
| 2.1.3 菌株与质粒 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 dsRNA提取相关溶液及E.coli DH5a培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 接种寄主 |
| 2.2.2 电镜观察 |
| 2.2.3 血清学检测 |
| 2.2.4 Trizol法提取总RNA |
| 2.2.5 dsRNA的微量提取 |
| 2.2.6 cDNA合成 |
| 2.2.7 PCR扩增技术 |
| 2.2.8 PCR产物纯化 |
| 2.2.9 分子克隆技术 |
| 2.2.10 序列测定及分析 |
| 2.2.11 5'-RACE技术 |
| 第三章 福建水仙病毒病的毒源种类鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 毒源 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 接种寄主 |
| 3.1.4 电镜观察 |
| 3.1.5 ELISA检测 |
| 3.1.6 RT-PCR检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 水仙病株症状 |
| 3.2.2 水仙汁液电镜观察 |
| 3.2.3 样品血清学检测 |
| 3.2.4 马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒RT-PCR检测 |
| 3.2.5 水仙花叶病毒(NMV)的RT-PCR检测 |
| 3.2.6 水仙潜隐病毒(NLV)RT-PCR检测 |
| 3.2.7 水仙普通潜隐病毒(NCLV)的RT-PCR检测 |
| 3.2.8 水仙退化病毒(NDV)的RT-PCR检测 |
| 3.3 小结和讨论 |
| 第四章 NLSYV漳州分离物(NLSYV-ZZ)的基因组全序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 毒源与dsRNA提取 |
| 4.1.2 NLSYV-ZZ基因组全长扩增引物 |
| 4.1.3 病毒基因组全长扩增策略 |
| 4.1.4 RT-PCR反应 |
| 4.1.5 5'-RACE |
| 4.1.6 PCR产物回收和分子克隆 |
| 4.1.7 序列测定及分析 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 NLSYV-ZZ分离物基因组全序列扩增结果 |
| 4.2.3 序列分析 |
| 4.2.4 NLSYV-ZZ与Potyvirus其他病毒进化关系 |
| 4.2.5 NLSYV-ZZ CP蛋白和其他NLSYV分离物的进化关系 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 漳州水仙分离物Y13-1 3’-端基因的克隆及序列分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 毒源与dsRNA提取 |
| 5.1.2 分离物Y13-1 3’-端基因扩增引物 |
| 5.1.3 RT-PCR反应 |
| 5.1.4 PCR产物回收和分子克隆 |
| 5.1.5 序列测定及分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 5.2.2 序列分析 |
| 5.2.3 Y13-1与Potyvirus病毒进化关系 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 漳州水仙分离物ZZ-2的基因组全序列分析 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 毒源与dsRNA提取 |
| 6.1.2 分离物ZZ-2基因组全长扩增引物 |
| 6.1.4 分离物ZZ-2基因组全长扩增策略 |
| 6.1.5 RT-PCR反应 |
| 6.1.6 5'-RACE |
| 6.1.7 PCR产物回收和分子克隆 |
| 6.1.8 序列测定及分析 |
| 6.2 结果和分析 |
| 6.2.1 分离物ZZ-2的初步分子鉴定 |
| 6.2.2 分离物ZZ-2的基因组全序列扩增结果 |
| 6.2.3 序列分析 |
| 6.2.4 分离物ZZ-2与Potyvirus病毒进化关系 |
| 6.2.5 水仙上分离的potyviruses间进化关系 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写词和英汉对照 |
| 致谢 |
（7）两个马铃薯Y病毒分离物全基因组序列测定及抗病毒dsRNA表达载体的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 1.1 植物病毒及其危害 |
| 1.2 植物病毒的分类 |
| 1.3 马铃薯Y 病毒属 |
| 1.3.1 马铃薯Y 病毒属病毒的生物学特性 |
| 1.3.2 马铃薯Y 病毒属病毒的分子生物学特性 |
| 1.3.3 马铃薯Y 病毒属病毒全基因组序列的研究 |
| 1.4 植物病毒的遗传变异 |
| 1.4.1 突变 |
| 1.4.2 重组 |
| 1.4.3 重排 |
| 1.5 植物病毒的鉴定 |
| 1.5.1 生物学鉴定 |
| 1.5.2 形态学鉴定 |
| 1.5.3 血清学鉴定 |
| 1.5.4 分子生物学鉴定 |
| 1.6 RNA 介导的病毒抗性 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 2. 两个马铃薯Y 病毒全基因组序列的测定与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 多重PCR 检测 |
| 2.2.2 PVY 分离纯化 |
| 2.2.3 生物学特性 |
| 2.2.4 PVY 分离物基因组的分段扩增 |
| 2.2.5 重组质粒的筛选 |
| 2.2.6 PVY 分离物的基因组结构 |
| 2.2.7 一致率分析 |
| 2.2.8 重组及进化分析 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 3. 利用大肠杆菌表达的dsRNA 防治烟草病毒病 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 dsRNA 表达载体的构建 |
| 3.2.2 dsRNA 的提取 |
| 3.2.3 dsRNA 的防治效果 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 4. 防治玉米矮花叶病的RNAi 表达载体的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 单片段的扩增 |
| 4.2.2 正向片段的融合扩增 |
| 4.2.3 反向片段的扩增 |
| 4.2.4 RNAi 载体p3301-SCMVCIN161CPRi 的构建 |
| 4.2.5 载体转化农杆菌的检测 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（8）菜豆普通花叶病毒RT-PCR检测及3′末端序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 总RNA的提取 |
| 1.3 cDNA第一链的合成 |
| 1.4 PCR扩增 |
| 1.5 PCR产物纯化、克隆测序与序列分析 |
| 1.6 豇豆种子中BCMV RT-PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒鉴定与种子检测 |
| 2.2 系统进化分析 |
| 2.3 RNA二级结构分析 |
| 3 讨论 |
（9）侵染蕌头的病毒种类鉴定及其部分病毒序列基因组特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1 课题的提出 |
| 2 葱属植物病毒病的研究概况 |
| 3 侵染葱属植物的主要病毒种类、基本特性及其相关研究进展 |
| 3.1 马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus) |
| 3.1.1 基本特性 |
| 3.1.2 研究进展 |
| 3.2 香石竹潜隐病毒属(genus Carlavirus) |
| 3.2.1 基本特性 |
| 3.2.2 研究进展 |
| 3.3 青葱X病毒属(genus Allexivirus) |
| 3.3.1 基本特性 |
| 3.3.2 研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 侵染藠头的病毒普通生物学和血清学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物病毒来源 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 生物学鉴定 |
| 1.3.2 电镜观察 |
| 1.3.3 血清学检测 |
| 1.3.4 病毒粗提物制备 |
| 1.3.5 病毒粗提物蛋白SDS-PAGE检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 田间感病寄主症状 |
| 2.2 生物学特性 |
| 2.2.1 指示植物感病症状 |
| 2.2.2 病毒繁殖寄主筛选 |
| 2.3 血清学特性分析 |
| 2.4 病毒粒子特点及病毒提取效果分析 |
| 2.5 细胞病理学特征 |
| 3 讨论 |
| 第三章 侵染藠头的病毒种类分子鉴定及其序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物病毒来源 |
| 1.2 主要试剂与仪器设备 |
| 1.3 转化菌株及载体 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 病毒RNA抽提 |
| 1.4.2 逆转录 |
| 1.4.3 PCR扩增引物设计 |
| 1.4.4 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.4.5 PCR产物切胶回收 |
| 1.4.6 T-A连接 |
| 1.4.7 转化 |
| 1.4.8 阳性克隆筛选 |
| 1.4.9 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒的分子鉴定 |
| 2.1.1 3′末端RT-PCR扩增 |
| 2.1.2 菌液PCR鉴定 |
| 2.1.3 质粒PCR和双酶切鉴定 |
| 2.1.4 序列分析 |
| 2.2 香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)病毒的分子鉴定 |
| 2.2.1 Carlavirus基因组3′-末端RT-PCR |
| 2.2.2 菌液PCR鉴定 |
| 2.2.3 质粒PCR和双酶切鉴定 |
| 2.2.4 基因组3′端序列分析 |
| 2.2.5 Carlavirus属病毒基因组部分中间片段的扩增 |
| 2.3 葱X病毒属(Allexivirus)病毒的分子鉴定 |
| 2.3.1 Allexivirus基因组3'端RT-PCR扩增 |
| 2.3.2 菌液PCR鉴定 |
| 2.3.3 序列测定及序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录A:主要试剂和溶液的配制 |
| 附录B:利用Carlavirus属内成员基因组简并引物扩增所获得不同克隆基因组3′端核甘酸序列信息比对 |
| 附录C:博士研究生期间已发表或已接收的文章 |
| 致谢 |
（10）芜菁花叶病毒与烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定及分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 马铃薯Y 病毒属病毒的生物学特性 |
| 1.1 马铃薯Y 病毒属病毒的形态特性 |
| 1.2 寄主范围 |
| 1.3 病毒的传播 |
| 1.4 细胞病理 |
| 2. 马铃薯Y 病毒属病毒的分子生物学特性 |
| 2.1 病毒基因组的结构 |
| 2.2 病毒基因的功能 |
| 2.2.1 5′-非翻译区（5′-UTR） |
| 2.2.2 3′-非翻译区（3′-UTR） |
| 2.2.3 P1 蛋白 |
| 2.2.4 HC-Pro 蛋白 |
| 2.2.5 P3 蛋白 |
| 2.2.6 6K1 蛋白 |
| 2.2.7 CI 蛋白 |
| 2.2.8 6K2 蛋白 |
| 2.2.9 NIa-Pro 和NIa-VPg 蛋白 |
| 2.2.10 NIb 蛋白 |
| 2.2.11 CP 蛋白 |
| 3. 马铃薯Y 病毒属病毒的分类 |
| 4. 马铃薯Y 病毒属病毒全基因组序列的研究 |
| 5. 本研究的目的和意义 |
| 第二章 两个芜菁花叶病毒中国分离物的全基因组序列测定及分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒样品的采集 |
| 1.1.2 菌株和载体 |
| 1.1.3 生化及分子生物学试剂 |
| 1.1.4 引物合成 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 生物学测定 |
| 1.2.2 植物总RNA 的提取 |
| 1.2.3 引物设计 |
| 1.2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和5'-RACE 扩增 |
| 1.2.5 PCR 产物回收 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌 |
| 1.2.9 改良碱裂解法提取质粒DNA |
| 1.2.10 重组质粒鉴定 |
| 1.2.11 序列测定与分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 TuMV 分离物的 RT-PCR 结果 |
| 2.3 重组质粒的电泳鉴定及PCR 鉴定 |
| 2.4 TuMV 分离物的核苷酸与氨基酸序列分析 |
| 2.5 与其它TuMV 分离物序列一致率分析比较 |
| 2.6 TuMV 分离物的分子变异 |
| 2.6.1 系统进化树分析 |
| 2.6.2 重组分析 |
| 2.6.3 中国TuMV 分离物变异分析 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第三章 烟草脉带花叶病毒 HN39 分离物全基因组序列测定及分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒样品的采集和分离纯化 |
| 1.1.2 菌株和载体 |
| 1.1.3 生化及分子生物学试剂 |
| 1.1.4 引物合成 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 生物学测定 |
| 1.2.2 植物总RNA 的提取 |
| 1.2.3 引物设计 |
| 1.2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和5'-RACE 扩增 |
| 1.2.5 PCR 产物回收 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌 |
| 1.2.9 改良碱裂解法提取质粒DNA |
| 1.2.10 重组质粒鉴定 |
| 1.2.11 序列测定与分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 生物学测定 |
| 2.2 TVBMV 分离物的 RT-PCR 结果 |
| 2.3 重组质粒的电泳鉴定及PCR 鉴定 |
| 2.4 序列分析 |
| 2.5 与TVBMV-YND 分离物序列比较 |
| 2.6 TVBMV-HN39 与其它potyviruses 的关系 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第四章 甜菜花叶病毒莴苣分离物3'-末端基因的克隆及序列分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒样品的采集和分离纯化 |
| 1.1.2 菌株和载体 |
| 1.1.3 生化及分子生物学试剂 |
| 1.1.4 引物合成 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 SDS-琼脂免疫双扩散试验 |
| 1.2.2 植物总RNA 的提取 |
| 1.2.3 引物设计 |
| 1.2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR） |
| 1.2.5 PCR 产物回收 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌 |
| 1.2.9 改良碱裂解法提取质粒DNA |
| 1.2.10 重组质粒鉴定 |
| 1.2.11 序列测定与分析 |
| 1.2.12 Western blotting 分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 病株田间症状 |
| 2.2 血清学鉴定 |
| 2.3 基因的扩增及克隆 |
| 2.4 序列测定与分析 |
| 2.5 Western blotting 分析 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 附彩图 |
四、Potyvirus属成员基因组全序列的简并引物PCR和RACE扩增方法（论文参考文献）
- [1]赤瓟花叶病毒（ThDMV）的鉴定及生物学特性研究[D]. 赵娜. 东北林业大学, 2019(01)
- [2]烟草脉带花叶病毒和马铃薯X病毒的协生作用及二者侵染本氏烟的转录组学分析[D]. 王红艳. 山东农业大学, 2017(08)
- [3]用通用PCR和宏基因组学发现鸭和鹅的新病毒[D]. 王府民. 中国农业大学, 2017(08)
- [4]甘薯病毒病害（SPVD）病原的基因组测序、检测及种传效率研究[D]. 王丽. 沈阳农业大学, 2013(10)
- [5]烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析[J]. 王芳,高正良,周本国,许大凤,安梦楠,吴元华. 中国烟草学报, 2013(04)
- [6]福建漳州水仙病毒病的病原鉴定及两病毒基因组全序列分析[D]. 林双庆. 福建农林大学, 2012(03)
- [7]两个马铃薯Y病毒分离物全基因组序列测定及抗病毒dsRNA表达载体的构建[D]. 贾金磊. 山东农业大学, 2011(08)
- [8]菜豆普通花叶病毒RT-PCR检测及3′末端序列分析[J]. 向冰冰,杨洪一,赵敏,崔岱宗. 植物保护, 2009(03)
- [9]侵染蕌头的病毒种类鉴定及其部分病毒序列基因组特性分析[D]. 吴承春. 华中农业大学, 2009(07)
- [10]芜菁花叶病毒与烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定及分析[D]. 王红艳. 山东农业大学, 2008(02)