一、ELISA假阴性结果原因分析（论文文献综述）
靳纬坤[1]（2021）在《牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用》文中研究说明研究背景及目的:片形吸虫病对畜牧业危害严重,广西地区牛大片形吸虫病感染率较高。本研究旨在利用F22及其所含的关键分子作为诊断抗原建立起牛大片形吸虫病免疫学诊断方法,并利用该方法对广西地区牛大片形吸虫病进行流行病学调查;同时对本地区使用化学药物驱虫效果进行初步评估,为广西地区牛大片形吸虫病的防控提供借鉴。此外,国内外尚缺乏牛大片形吸虫病ELISA诊断试剂盒及胶体金快速诊断试纸条,本研究可为今后牛大片形吸虫病ELISA诊断试剂盒、胶体金快速诊断试纸条的研制奠定基础。研究方法与结果:1、本研究制备了F22并对其进行质谱鉴定,从中选取Fg SAP-2、Fg Cat L2、Fg LAP三种诊断抗原候选分子进行了原核表达。2、从三种分子中筛选出r Fg SAP-2作为诊断抗原并与F22一起进行了各项反应条件的优化从而建立起牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法并进行敏感性、特异性、稳定性及早期诊断价值的检测并与传统的Fg ESP作为诊断抗原的牛大片形吸虫病间接ELISA法进行比较,表明三种诊断方法均与前后盘吸虫、巴贝斯虫无交叉反应且稳定性均较好。其中F22作为诊断抗原检测的敏感性最高,假阴性率为0%。Fg ESP、F22、r Fg SAP-2作为诊断抗原均能在感染后2周检测到抗体,其中F22在感染后2周OD450nm值最大且极显着高于Fg ESP、r Fg SAP-2的OD450nm值（P<0.01）,提示F22具有更高的早期诊断价值。3、本研究成功研制出F22作为诊断抗原的牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条并证明其具有良好的敏感性、特异性、稳定性,在感染后2周即可检测到抗体,可以应用于牛大片形吸虫病的现场快速诊断。4、利用F22和Fg ESP作为诊断抗原的间接ELISA法对广西地区牛片形吸虫病进行流行病学调查发现,阳性率分别为68.37%和57.30%。利用上述两种间接ELISA法及胶体金试纸条对A牛场牛血清进行检测,检测的阳性率分别仅为6.15%、4.31%、2.00%。利用建立的方法对A牛场的片形吸虫病用药方案进行效果评价,初步表明其用药方案具有较好的驱虫效果。结论:本研究建立了牛大片形吸虫病免疫学诊断方法,即F22作为诊断抗原的间接ELISA法及胶体金快速诊断试纸条,均具有较好的敏感性、特异性、稳定性,并能用于牛大片形吸虫病早期诊断,为今后牛大片形吸虫病ELISA试剂盒及胶体金快速诊断试纸条研制奠定了基础。利用建立的方法对广西地区牛大片形吸虫病进行流行病学调查并对A牛场的用药方案进行效果评价,结果表明广西地区牛大片形吸虫感染情况比较严重,A牛场的用药方案具有较好的驱虫效果,该用药方案可供广西地区各牛场借鉴参考。
张天琛[2]（2021）在《儿童手足口病常用实验室诊断方法的评价研究》文中进行了进一步梳理目的:肠道病毒A组71型（Enterovirus A71,EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）是我国儿童手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）的主要致病血清型。以临床诊疗为目的的实时荧光逆转录聚合酶链式反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR）检测粪便标本,和以现症感染病原谱监测为目的的联合RT-PCR检测咽拭子标本,是两种常用的HFMD分子实验室诊断方法,然而两者对EV-A71和CVA16感染的诊断一致性尚未知。酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清标本EV-A71免疫球蛋白M（Immunoglobulin M,IgM）已广泛应用于我国HFMD临床实验室诊断,但个体因素对ELISA法诊断效能的影响尚未知。本研究的目的,一是评价联合RT-PCR检测咽拭子与商品化real-time RT-PCR检测粪便标本,对诊断HFMD病例EV-A71和CVA16感染的一致性,探索影响诊断一致性的因素;二是评价商品化的ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的血清学诊断方法,对HFMD病例EV-A71感染的诊断效能及其影响因素。方法:本研究在河南省儿童医院建立“以医院为基础的儿童HFMD住院病例前瞻性专病队列”,使用结构化问卷系统地收集病例相关信息,采集病例住院期间的临床生物标本。分别采用商品化real-time RT-PCR（检测粪便标本）和联合RT-PCR（检测咽拭子标本）两种分子实验方法诊断病例EV-A71和CVA16感染,采用商品化的ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体诊断病例EV-A71感染。使用非加权的Cohen-kappa检验,评价两种分子实验方法的诊断一致性。应用两阶段Logistic回归模型探索影响诊断一致性的相关因素,并结合bootstrap方法估算kappa系数。以EV-A71阳性检出率较高的分子诊断方法为参考标准,评估商品化ELISA法的诊断效能,构建多因素Logistic回归模型探索影响诊断效能的相关因素。结果:1)本研究共招募临床诊断的HFMD儿童住院病例1840例,中位年龄1.7岁（IQR:1.3-2.8 岁）,重症 509 例（28%）,既往接种过 EV-A71 疫苗 277 例（15%）。共检测咽拭子标本1780份（97%）、粪便标本1532份（83%）和血清标本1688份（92%）。2)1483例（81%）病例均经过联合RT-PCR及商品化real-time RT-PCR的诊断。联合RT-PCR检测咽拭子标本的肠道病毒、EV-A71和CVA16阳性检出率均低于商品化real-time RT-PCR检测粪便标本（肠道病毒:86%vs.97%,P<0.001;EV-A71:10%vs.15%,P<0.001;CVA16:15%vs.24%,P<0.001）。疾病严重程度、年龄、既往EV-A71疫苗接种史、早产、住院前发热症状以及住院至咽拭子采样时间间隔是影响EV-A71和/或CVA16阳性检出率的主要因素。联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性kappa系数分别为0.65和0.59（P<0.001）。发病至住院时间间隔≤2天、住院至粪便标本采集时间间隔≤2天和危重症病例中,联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR 诊断 EV-A71 的一致性相对更高。住院至咽拭子采集时间间隔≤1 天的病例中CVA16的诊断一致性相对更高。发病至住院时间间隔≤2天的病例中,尽早采集咽拭子和粪便标本,联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR对诊断EV-A71和CVA16感染的一致性kappa系数分别为0.82-0.91和0.65-0.77。3)1413例（77%）病例均经过商品化real-time RT-PCR及商品化ELISA法的诊断。以EV-A71阳性检出率较高的商品化real-time RT-PCR诊断结果为参考标准,商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能为:灵敏度0.61（95%CI=0.54-0.68）、特异度 0.94（95%CI=0.92-0.95）、阳性预测值 0.62（95%CI=0.55-0.69）、阴性预测值 0.94（95%CI=0.92-0.95）,非 EV-A71 感染的HFMD病例中ELISA法的假阳性率为6%（74/1212）。ELISA法的灵敏度由月龄<12个月的0.74（95%CI=0.52-0.90）逐步降至≥36个月的0.49（95%CI=0.37-0.61）。随病程的延长,灵敏度由发病0-48小时内的0.54（95%CI=0.25-0.81）逐步升至发病 144 小时后的 0.74（95%CI=0.58-0.87）,而特异度由发病0-48小时内的0.97（95%CI=0.93-0.99）逐步降至发病144小时后的0.80（95%CI=0.69-0.89）。多因素Logistic回归分析显示,发病至血标本采样时间间隔、EV-A71流行季节以及个体因素,如年龄、既往EV-A71疫苗接种史、既往HFMD或疱疹性咽峡炎病史和疾病严重程度等因素,均与商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能存在显着的关联。结论:1)针对肠道病毒、EV-A71或CVA16感染的HFMD住院病例,商品化real-time RT-PCR 检测粪便标本的阳性检出率均高于联合 RT-PCR 检测咽拭子标本;在发病2日内住院的HFMD病例中,及时采集咽拭子和粪便标本,联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染具有较高的一致性。基于本研究结果,建议临床上优先选择采集病例的粪便标本开展肠道病毒的分子实验室诊断;公共卫生监测门急诊HFMD病例EV-A71和CVA16感染,建议优先选择发病2日内就诊的病例,并尽早采集咽拭子进行联合RT-PCR的诊断实验。2)该商品化ELISA试剂盒诊断HFMD病例EV-A71感染的灵敏度一般,特异度高,假阳性为6%;ELISA法的诊断效能受个体因素、流行季节、发病至采样时间的影响较大。基于本研究结果,临床开展HFMD血清学诊断时,建议在非EV-A71流行季节优先选择以EV-A71 VP1蛋白为抗原的ELISA试剂盒检测EV-A71IgM抗体;不建议在既往有EV-A71疫苗接种史、既往有肠道病毒感染史、年龄>3岁及发病72小时内的病例中开展血清EV-A71 IgM抗体的ELISA法检测,可改用分子实验室诊断方法。
孙子琪[3]（2021）在《新型冠状病毒SARS-CoV-2免疫学检测方法的建立》文中提出新冠肺炎自爆发以来,已造成人类生命财产重大损失。专家评估认为新型冠状病毒SARS-Co V-2可能长期和人类共存,因此,早期诊断、早期治疗的技术与产品成为临床医学、生命科学以及药学领域学者和各企业关注的热点。本文以市售的SARS-Co V-2抗原及抗体为原料,以免疫学原理作为检测方法学基础,构建新型冠状病毒血清学的三种检测方法,分别是胶体金免疫层析检测方法、酶联免疫吸附检测方法和磁珠化学发光免疫检测方法,对三种方法的实验条件进行优化,研究三种方法的线性相关范围、特异性、灵敏性以及批间批内的重复性等。实验结果表明,胶体金免疫层析检测方法,检测抗体Ig M、Ig G的最低浓度为12 ng/m L,同批次内与不同批次之间的变异系数均小于5%,与其他干扰物质不发生交叉反应,临床应用性能评估结果符合标准,实现了良好的定性检测。ELISA检测方法,在浓度为0.25-16 ng/m L时的相关性较好,其线性回归方程为y=0.3163x+0.8556,相关系数为R2=0.996,最低可检测到0.25 ng/m L的抗原,没有与其他的蛋白产生交叉反应,回收率为99.25%,批间批内C.V值小于10%,符合要求,具有临床应用价值。磁微珠化学发光检测方法的线性浓度在0.125-16ng/m L区间内,线性回归方程是y=331.72+11725,相关系数为0.9961,检测抗原的最低浓度为0.125 ng/m L,和干扰物不发生交叉反应,批间批内变异系数均小于10%,回收率达到99%以上,未出现假阴性“HOOK”现象。本文的研究为临床快速检测提供了实验室基础。
高海岗[4]（2021）在《孔雀石绿纳米抗体的制备及其免疫层析检测方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理孔雀石绿（malachite green,MG）,极易溶于乙醇等有机溶剂但不溶于水。常被水产养殖业用来预防和控制多种疾病如真菌病、寄生虫病、细菌性疾病等,或者用于水产品的长途运输或存放的保鲜,保证水产品的存活率。而孔雀石绿及其代谢产物（隐色孔雀石绿,LMG）能长期残留在动物组织肾脏、皮下脂肪、肌肉、肝和血液中,人类食用后,会通过蓄积中毒,导致人致癌等毒副作用,危害人的生命健康。但由于孔雀石绿价格低廉、且目前没有同等价格的替代药,并且防治效果好,使其在水产养殖、水产品运输及贮存过程中仍被广泛滥用。包括我国在内的多个国家己经将孔雀石绿列为禁用药物,但是因为其价格便宜,药效好,在市场上仍然违规使用。目前孔雀石绿的最终确证法为国家认可的液质联用方法,检测仪器价格高,检测费时长,操作人员需要进行专门培训,操作复杂。所以,建立一个准确、高灵敏度的孔雀石绿快速检测方法是迫在眉睫的。免疫学方法是目前常用的快速检测方法,价格便宜,敏感度高。抗体是免疫检测的核心,但孔雀石绿本身分子量很小,空间结构不复杂,不具有免疫原性,所以必须先制备具有免疫原性的完全抗原,然后通过免疫动物的方法制备抗体,采取竞争抑制的原理建立小分子物质免疫学检测的方法。1.孔雀石绿抗原制备及纳米抗体的筛选本文先通过化学方法设计合成羧基化的隐性孔雀石绿,将得到的羧基化孔雀石绿和载体蛋白BSA或OVA偶联到一起从而制得完全抗原。经核磁共振、紫外分析和SDS-PAGE电泳鉴定,发现成功制备孔雀石绿偶连蛋白MG-BSA（MG-OVA）,蛋白紫外吸收峰发生偏移,SDS-PAGE发现偶连产物蛋白略大于载体BSA（OVA）,证实得到具有免疫原性的孔雀石绿抗原。通过小鼠免疫实验,证明该抗原获得了良好的免疫效果,抗血清效价大于1:64000、血清抑制浓度小于10 ng/mL,为下一步纳米抗体的制备提供了抗原的保障。本文选择免疫库筛选孔雀石绿纳米抗体。先取健康羊驼作为免疫动物,免疫后,取20 mL外周血,通过淋巴细胞提取液提取淋巴细胞,提取总mRNA并鉴定纯度,以oligoDT12为引物,转录成cDNA,以转录的cDNA为模板,进行巢氏PCR扩增,获得编辑羊驼抗体VHH的基因片段,与噬菌粒载体体外重组,转化到表达系统,通过辅助噬菌体M13的救援,使得目的基因与外壳蛋白基因融合表达,从而使得目的蛋白展示在噬菌体表面,构建了免疫文库。通过体外筛选噬菌体文库,获得含有目的基因的单个噬菌粒,插入到表达细胞中,体外表达。最后采用HIS纯化的方法,得到抗孔雀石绿纳米抗体,通过SDS-PAGE电泳鉴定,大小为15 kd左右。2.孔雀石绿胶体金免疫层析检测试纸条的制备及鉴定本文采用胶体金免疫层析法制备孔雀石绿胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠法制备还原氯化金溶液,得到40纳米左右的胶体金溶液。通过竞争抑制的原理,金标记纳米抗体,在NC膜的质控线（C线）处标记C抗体,在NC膜的检测线（T线）处包被孔雀石绿偶连抗原（MG-BSA）。当样品中无孔雀石绿时,金标记抗体在T线处,与偶连抗原（MG-BSA）形成抗原抗体复合物显色。当样品中含有孔雀石绿时,与偶连抗原竞争金标抗体,当含量足够高时,完全抑制偶连抗原与标记抗体结合,T线处不显色。T线的显色深度与孔雀石绿的含量成反比。通过正交实验,确定了最佳的抗原抗体比例,即抗体标记量为10 μg/mL、每孔金标抗体量为12 μL/孔、NC膜抗原量为0.5mg/mL,二抗浓度为0.4mg/mL。通过此配比研制的胶体金试纸条,取前处理得到的样品,上样后反应15分钟,根据C、T线色度对比,判定。检测试纸条检测15分钟,检测限0.5 ng/mL,判定速度快,灵敏度高,达到国家检测标准。满足了农业部、食品药品监督管理局的检测要求,为打击违法使用孔雀石绿提供了技术保障。3.孔雀石绿胶体金免疫层析检测试纸条的验证及其应用针对国家标准要求,对同一品种、同一规格的孔雀石绿快速检测试纸条,试制了3批不同批号产品。每批产品提供140份次,随机抽70份次进行产品检测。盲样制备中,孔雀石绿含量分别为临界值要求的0%,50%和100%的浓度水平,其中,0%和50%的浓度水平检测产品的假阳性率,100%的浓度水平考察产品的假阴性率。其中,0%和50%样本数各15份,定性值100%浓度水平的样本30份。实际样本的浓度残留含量与定性临界值的要求相当,不超过定性临界值要求的10%。通过样本的设置,在规定的检测时间内,做到检测试纸条满足国家检测部门的检测要求,来判定产品的灵敏度、稳定性是否满足基层检测的需要。在符合国家要求的条件下,将检测试纸条在江苏、浙江、江西等地第三方检测市场进行基层应用,共计检测12179份,样品涵盖市场养殖水样、各类水产品,包括草鱼、鲫鱼、昂刺鱼、鳜鱼、鲤鱼、甲鱼、黄鳝、泥鳅、河虾、罗氏沼虾、螃蟹、白贝、花甲等。其中,大部分检测结果为阴性,共检测出38份阳性样本,检测结果与国标对比,符合率98.1%。此产品的推广,节省了大量的人力、物力,同时能快速的检出结果,为保证农产品使用安全提供了有效的技术保障。
李俚[5]（2020）在《水貂阿留申病流行病学调查及EvaGreen荧光定量PCR方法的建立与应用》文中研究表明水貂阿留申病（Aleutian Disease of Mink,AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus,AMDV）感染水貂而引起的一种高度传染性疾病,该病可降低水貂的生产性能,增加仔貂的死亡率,使水貂毛皮品质下降,从而引起水貂业巨大的经济损失。我国水貂主要从国外引进,尽管引进过程中,海关部门对水貂全群进行了严格的检疫,但在此后的一年左右时间,几乎所有进口水貂场都发现了AMDV的感染。一些水貂场利用对流免疫电泳（Counter-immunoelectrophoresis,CIEP）技术对群体水貂进行检疫,并以此淘汰染病水貂,对貂场实施净化,然而效果并不理想。因此,本研究拟对进口水貂场AMDV的来源进行分析,探讨CIEP方法检疫净化失败的原因,并建立一种适用于我国水貂AMD检测的手段,为AMD防控工作提供必要的理论依据和技术支撑。本研究的内容分为以下6部分:（1）选择位于水貂主要养殖地区（黑龙江、辽宁、山东和河北）的四个水貂场开展AMDV流行情况的调查。四个水貂场中的三个为进口水貂场。2015年～2017年,四个水貂场收集共计442,180份血液样品,于不同时期用CIEP对AMDV的感染情况进行监测,并根据监测结果对其中两个进口水貂场实施净化。结果发现,这两个水貂场AMDV的抗体阳性率呈波浪式逐年递增,表明利用CIEP检疫并淘汰阳性水貂的策略虽可减缓AMD的扩散,但无法借以实现对该病的净化,CIEP检测方法可能存在敏感性不足的问题。另外,通过对比各场水貂的年平均产仔数发现,当群体AMDV感染率较低的情况下,水貂年平均产仔数几乎未受到影响;但随着场内AMDV感染率的上升,水貂的年均产仔数呈下降的趋势;在相同感染率的情况下,进口水貂养殖场相比本地的水貂年均产仔数受AMD的影响更大,因此有必要加强对进口水貂AMD的防控。（2）为研究不同检测方法监测AMD的效果,本研究分别利用CIEP、免疫胶体金（Immune colloidal gold technique,GICT）和PCR方法,对50只水貂来源的样品进行了检测。结果显示,CIEP的检出率为44%,GICT的检出率为42%,两者的阳性符合率是61.90%。常规PCR检测阳性检出率为84%,CIEP和GICT与PCR方法的阳性符合率分别为54.76%和42.85%。不同方法之间符合率较低,应与AMDV感染水貂后,水貂体内产生抗体和病毒血症的复杂性有关。（3）为探讨CIEP在应用过程中检出率低的原因,本研究从四个地区来源的样品中分离了12株AMDV毒株,分别对这些分离毒株的全基因组、NS1基因和VP2基因,以及各毒株的VP2蛋白进行了分析。结果显示,目前我国流行的AMDV毒株相互间的遗传关系较近,而与国外报道的毒株间遗传关系较远,进口水貂场感染的AMDV应源自国内,感染的途径应与水貂的频繁跨省串种有关。通过比较AMDV VP2的氨基酸序列发现,VP2基因共编码645-647个氨基酸,12个分离毒株与其它参考毒株间共存在37个位点变异,在232-242位氨基酸之间存在一段氨基酸高变区,不同来源毒株差异较大。利用IEDB在线分析工具分析VP2氨基酸的抗原性,共获得22个预测的B细胞表位。其中,6个表位在不同毒株之间完全一致,7个表位位点存在1个氨基酸差异,2个表位位点存在2个氨基酸差异,4个表位位点存在3个氨基酸差异,3个表位位点存在4个氨基酸差异。氨基酸变异多存在于预测的抗原表位上,可能是导致AMDV免疫原性发生变化的主要原因,具体哪些位点起到主要作用还需要进一步研究。（4）为了建立可靠的AMDV检测方法,针对NS1基因保守区域设计引物,建立了Eva Green荧光定量PCR方法,该方法最低可检测到1拷贝/μL的AMDV基因组和3pg/μL的病毒DNA样品,且具有良好的特异性和重复性。分别用Eva Green荧光定量PCR、常规PCR方法和进口Taq Man荧光定量PCR试剂盒对83例水貂临床血样进行检测,Eva Green荧光定量PCR的检出率为97.59%,常规PCR方法和Taq Man荧光定量PCR的检出率分别是89.15%、0.00%。为探究Taq Man试剂盒未检出阳性样品的原因,本研究使用试剂盒中的引物和探针混合液,利用Eva Green染料法对上述样品进行了再次的检测,该方法的阳性检出率为95.18%。通过分析其扩增产物序列发现,试剂盒不工作的原因是因为Taq Man探针与国内分离的AMDV基因序列不匹配,所以进口Taq Man试剂盒不适用于我国AMDV的检测。而Eva Green荧光定量PCR不仅能够检测到国内的病毒分离株,还能检测到美国的ADV-G病毒株,是一种通用型的检测技术。（5）为评价Eva Green荧光定量PCR方法在环境样品检测中的应用效果,本研究利用该方法对不同水貂场的环境样品进行了检测。结果显示,AMDV感染水貂场中不同类别物品表面AMDV的污染程度不同。消毒物品未检出AMDV,或检出数量很低;与水貂直接接触的物品,如水貂笼、水槽、捉貂手套以及粪坑土中AMDV的污染程度相对较高;而间接接触的物品,如工作鞋底、场内地面、车辆轮胎表面的污染程度相对较低;对于场外环境,如场外地面、工人自用鞋底,尽管污染的程度很低,但仍有AMDV被检出,表明AMDV可随人员及物品的流动散播。对于清空了水貂但未经消毒的感染水貂场,其场内环境中仍有AMDV检出,因此建议旧场在引入健康水貂前必须彻底消毒。（6）为评价Eva Green荧光定量PCR在AMD净化中的应用效果,本研究采用Eva Green荧光定量PCR与GICT联合检疫的方法,对AMDV感染率在23.71%的水貂场开展检疫净化工作。第二年同期该场AMD的感染率为17.24%,较上一年同期有显着下降,表明Eva Green荧光定量PCR可用于AMD的检疫净化。综上,本研究对位于我国主要养殖地区水貂场的AMD流行情况开展了调查,分析了四个省份AMDV流行毒株的遗传进化特征,明确了进口水貂场所感染的AMDV应源自国内,探讨了CIEP漏检造成的“AMD净化困难”,并在此基础上建立了敏感性、特异性和重复性良好的Eva Green荧光定量PCR方法。该方法的初步应用结果表明,Eva Green荧光定量PCR不仅能够应用于AMD的检疫净化,还可以用于水貂进境前的场地选址,新引进水貂的群体感染状况和水貂场环境污染的监测工作中,为防控AMD提供了有效的技术手段。
周从宇[6]（2020）在《六安市2016-2018年疑似HIV感染病例的确诊及流行特征分析》文中研究指明目的（1）通过收集六安市2016-2018年疑似HIV感染病例的HIV抗体筛查和确证检测报告单,分析阳性标本的来源、初筛和确证实验的阳性符合率、阳性/不确定标本确证条带特点及对应基因分布,初步了解近三年六安市HIV感染情况和各初筛实验室检测能力。并选取本市应用最广的两种HIV初筛试剂进行质量评估,验证其临床价值,探讨试剂选用的策略,为提高HIV初筛检查结果的质量与可靠性奠定实验依据。（2）调查六安市2016-2018年HIV确诊感染病例的网报资料,结合社会人口学特征、行为特征及其变化情况,系统分析六安市艾滋病疫情近三年在不同人群中的流行因素,确定重点干预人群,寻找切实有效的防治模式,为制定科学控制策略和措施提供依据。方法（1）收集六安市2016-2018年经过HIV初筛实验得到的疑似HIV感染病例血清标本,逐一进行确证实验。挑选出由70份HIV-Ab阳性标本和122份HIV-Ab阴性标本组成的血清盘,以HIV确证实验结果作为判断真阳性和真阴性的金标准,使用本市应用最广的两种HIV初筛试剂对血清盘进行平行测定,对比分析两种试剂的敏感度、特异度、功效率、约登指数、阳性预测值、阴性预测值。（2）调查六安市2016-2018年确诊HIV感染病例在中国疾病预防控制系统艾滋病综合防治信息系统中网报的报告卡、附卡、个案随访表,应用Excel 2007软件对病例报告时间、报告地区、病例户籍、一般人口学特征（性别、年龄、民族、婚姻状况、文化程度、职业）、感染途径等资料进行双录入,使用SPSS 16.0对数据进行统计学处理。组间比较采用c2检验,P<0.05为差异有统计学意义。采用描述性流行病学方法对六安市2016-2018年报告HIV感染病例的时间分布、地区分布、人群分布、感染途径特点分别进行描述。结果（1）六安市2016-2018年确证实验室累计检测疑似HIV感染病例血样739份,结果为HIV-1型阳性的总共477份,不确定结果97份,阴性结果165份;HIV-2型全部阴性。确证阳性标本按送检机构分主要是医疗机构（303份）和疾控机构（153份）,按检测类别分主要是住院检测（214份）和自愿咨询检测（VCT）（110份）。三年筛查实验与确证实验阳性总符合率为64.55%（477/739）,每年分别为63.37%、66.29%、63.97%。阳性符合率按标本送检机构分最高为疾控机构（89.47%）,按标本检测类别分最高为自愿咨询检测（92.44%）。阳性条带结果共有33种类型,排在前三位的分别是gp160gp120gp41p66p51p31p24p17（44.44%）、gp160gp120gp41p66p51p55p31p24p17（16.14%）、gp160gp120gp41p31p24p17（9.64%）;出现全条带和次全带（≥6条带）共计397份（83.23%）;其中p24出现频率最高（99.37%）,p55出现频率最低（16.35%）。97份不确定结果的带型中p24出现概率最高（43.30%）,其次是p17（35.05%）。六安市应用最广的两种HIV初筛试剂检测原理分别是第三代和第四代HIV ELISA法,第三代试剂敏感度、特异度、功效率、约登指数、阳性预测值、阴性预测值分别为100.00%、99.18%、99.48%、97.66%、98.59%、100.00%,第四代则分别100.00%、98.36%、98.96%、96.32%、97.22%、100.00%。（2）六安市2016-2018年每年、各县区均有HIV确诊感染病例报告,累计477例。2016年为128例,2017年为175例,2018年为174例。报告居前三位的县区为:金安区（212例）、裕安区（106例）、霍邱县（55例）,病例的外地户籍比例（59.54%）高于本地户籍（40.46%）。男性病例（376例）多于女性（101例）,男女性别比3.72:1。病例年龄最小为8岁,最大91岁,主要集中在2049岁年龄段（61.64%）,其次是50岁以上年龄段（35.01%）。450个是汉族（94.34%）。婚姻状况以在婚者居多,占53.25%。文化程度以初中（24.32%）和小学（15.51%）为主。职业分布主要是农民（31.66%）,其次是家政、家务及待业（12.55%）和工人（9.85%）。传播途径以性传播为主（85.95%）。结论（1）2016-2018年六安市医疗和疾控机构是HIV抗体初筛检测的主要部门。三年确证阳性符合率稳定在60%70%之间,提示基层初筛实验室存在技术误差,检测能力有待提高。HIV感染病例的确证带型有33种,p24、gp160和gp41检出率（均>90%）高,p55检出率低（<20%）,说明抗env基因编码的包膜蛋白抗体是确诊HIV感染的必要条件。不确定结果占比13.13%,对该类样本24周后需进行随访复查。六安市两种应用最广的HIV初筛试剂评估均比较理想,效果无明显差异,满足抗体筛查要求,其中第四代试剂窗口期短,更值得临床推广。（2）2016-2018年六安市HIV确诊感染病例已波及全市所有县区,重点关注男性、青壮年、已婚、低学历、农民工、流动人群。今后艾滋病防控宣传应提高针对性,加强性安全教育和推广使用安全套迫在眉睫。
王琳[7]（2020）在《基于流式平台的淋巴细胞交叉配型及PRA实验在肾移植患者中的应用》文中指出[目 的]人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen,HLA）是诱导移植排斥反应的主要成分,受体免疫细胞对移植物表面HLA抗原识别后可产生针对移植物的抗HLA抗体,有效检出抗HLA抗体是降低移植排斥反应的关键。淋巴细胞交叉配型实验与群体反应性抗体（Panel Reactive Antibody,PRA）实验可判断受体预存抗HLA抗体状况,对预测移植排斥反应发生风险具有重要意义。目前,临床常用的补体依赖性细胞毒实验（Complement Dependent Cytotoxicity,CDC）、ELISA法的PRA实验由于方法学的限制,检测灵敏度较低。在实际工作中,可能会出现假阴性结果,影响移植患者的诊疗。为提高检测方法的灵敏度,本研究建立了基于流式平台的淋巴细胞交叉配型及PRA实验新方法,并在肾移植患者中进行应用。[方 法]1.研究对象及样本来源（1）淋巴细胞交叉配型实验供体标本来自于2019年3月至2020年1月我院器官获取组织（OPO）开展的30例捐献者,受体标本来自同期在我院进行移植手术的48例受体,阴性对照血清来自随机抽取的我院2例AB型男性健康体检人员混合血清,阳性对照血清来自我院20例PRA阳性患者混合血清。（2）PRA实验标本来自于2016年9月至2019年4月门诊及住院患者2947例。2.流式细胞交叉配型（Flow Cytometry Crossmatch,FCXM）实验方法的建立及方法学比对采用密度梯度离心法或免疫磁珠法（负选法）分离供体淋巴细胞,比较两种不同方法分离淋巴细胞的纯度、提取率,选择分离效果更好的方法作为淋巴细胞分离方法。将细胞与受体血清进行孵育,加入anti-CD3-PE、anti-CD19-APC、anti-IgG-FITC等荧光抗体对B淋巴、T淋巴、抗HLA IgG抗体进行识别,通过流式细胞仪对数据进行分析。采集14例供体淋巴细胞及48例受体血清,同时进行FCXM及CDC实验,比较两种方法的一致性。同期,将受体血清按照流式荧光法PRA结果进行分组,比较FCXM及CDC两种方法与PRA结果的符合率。3.流式荧光法检测PRA实验方法的建立及方法学比对将受体血清与吸附有HLA抗原的荧光微球进行孵育,使受体血清中的抗HLA抗体与相应的抗原结合,加入R-藻红蛋白标记的羊抗人IgG抗体,对结合在微球上的抗HLA抗体进行识别,通过Luminex 200对数据进行分析。采集2907例患者血清,其中1142例血清采用ELISA法进行检测,1765例血清采用流式荧光法进行检测。同期抽取40例患者血清,同时采用两种方法进行检测。4.实验数据统计分析采用SPSS V22.0统计学软件进行统计分析,计量资料结果根据数据类型采用t检验、单因素方差分析、卡方检验、Mann-Whitney U检验等方法进行统计分析。计数资料率的组间比较采用卡方检验。配对计数资料采用McNemar检验与Kappa检验。[结 果]1.FCXM实验方法的建立及方法学比对（1）免疫磁珠法（负选法）分离淋巴细胞的纯度、提取率分别为95.1±1.9%、84.1±7.8%,密度梯度离心法分离淋巴细胞的纯度、提取率分别为77.0±9.2%、14.5±7.7%,免疫磁珠法（负选法）纯度、提取率明显高于密度梯度离心法（P<0.01）。（2）FCXM实验T淋巴细胞Anti-IgG-FITC的Cutoff值为222.5,B淋巴细胞 Anti-IgG-FITC 的 Cutoff 值为 210.1。（3）PRA阴性组,CDC与PRA结果一致性为100%（7/7）,FCXM与PRA结果一致性为42.9%（3/7）;PRA阳性组,CDC与PRA结果一致性为8%（4/50）,FCXM 与 PRA 结果一致性为 48%（24/50）。（4）采用FCXM与CDC方法同时进行57次交叉配型实验,CDC阳性的有4例,其中FCXM阳性2例,阴性2例;CDC阴性的有53例,其中FCXM阴性27例,阳性26例。两种方法的一致性较差。（McNemar检验P值<0.01;Kappa 值<0.4）。2.流式荧光法检测PRA实验方法的建立及方法学比对（1）ELISA法 PRAⅠ 类、Ⅱ类及总阳性率分别为 9.0%（103/1142）、8.1%（92/1142）、13.7%（156/1142）,流式荧光法分别为 22.9%（404/1765）、21.9%（387/1765）、34.3%（606/1765）,流式荧光法阳性率明显高于 ELISA 法（P<0.01）。（2）采用流式荧光法及ELISA法同时对40例患者PRA进行检测,ELISA法PRA阳性的有4例,其中流式荧光法阳性4例,阴性0例;ELISA法PRA阴性的有36例,其中流式荧光法阴性2例,阳性34例。两种方法的一致性较差。（McNemar P 值<0.01;Kappa 值<0.4）。[结 论]1.淋巴细胞分离纯度和提取率,免疫磁珠法（负选法）均高于密度梯度离心法。2.FCXM实验的灵敏度高于CDC实验,实验结果的判读受到实验操作人员主观因素的影响较小,易于标准化。3.PRA实验,流式荧光法检测灵敏度高于ELISA法。流式荧光法检测程序所需时间更短,适用于批量标本检测。
蔡卓轩[8]（2019）在《奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备》文中提出奶牛早期妊娠诊断是牛生殖管理计划中的重要组成部分,尽早区分出未孕牛能为奶牛养殖场创造经济效益。牛妊娠相关糖蛋白（Pregnancy-Associated Glycoprotein,PAG）是一种与母体妊娠密切相关的早期妊娠诊断标志物,基于PAG建立的奶牛早期妊娠诊断方法具有良好的临床应用前景。目的:通过对美国爱德士公司生产的奶牛快速可视孕检试剂盒与直肠检查方法比较,评估基于PAG建立的奶牛早期妊娠诊断方法在实际生产应用价值,利用真核表达系统获得融合蛋白PAG-1,制备抗PAG-1单克隆抗体,验证获得单抗的反应原性,为研发基于PAG-1的奶牛早孕诊断方法提供生物材料。方法:1.选择22头奶牛进行人工授精,人工授精16d、22d、28d后使用PAG-ELISA试剂盒检测实验牛妊娠情况,人工授精75d采用直肠检查复检,以直肠检查结果为依据评估PAG-ELISA试剂盒在早期妊娠各时间段的应用价值;2.使用基因合成法获得牛PAG-1基因,与真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-）A连接,连接产物转入大肠杆菌DH5α,酶切、测序比对确认重组质粒的正确性。提取PAG-1质粒转染至HEK293细胞,取转染的细胞培养液纯化得到PAG-1蛋白,SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹实验对其进行鉴定,爱德士快速可视孕检试剂盒检测其反应原性;3.使用PAG-1融合蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测其血清抗体效价,达到融合水平后,取小鼠脾脏获取免疫脾细胞,使用杂交瘤细胞方法获得可分泌抗PAG-1抗体的细胞株。小鼠腹腔注射阳性细胞,制备腹水抗体,测定抗体效价,Western Blot方法鉴定单克隆抗体与PAG-1的反应性,鉴定单克隆抗体的抗体亚型及抗体结合的抗原表位。结果:1.人工授精75d后直肠检查共检出妊娠奶牛5头,未妊娠奶牛17头;人工授精后28d后PAG-ELISA试剂盒检测应用价值最高,两种检测方法的Kappa值为0.681,牛PAG-ELISA试剂盒妊娠诊断的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为100%、82.4%、62.5%、100%、86.4%;2.酶切检测及测序比对证明PAG-1真核表达载体构建正确,SDS-PAGE成功检测到重组质粒转染后的细胞培养液中PAG-1的表达,SDS-PAGE、Western Blot实验鉴定到大小为41.97kDa的条带,与预期相符,爱德士快速可视孕检试剂盒证明PAG-1融合蛋白具有良好的反应原性;3.免疫后BALB/c小鼠血清抗体效价达2×105以上,达到融合水平;成功获得杂交瘤细胞1F5E9C8-2、2F10H1D4-2,腹水抗体效价大于7.29×105;Western Blot表明2株单克隆抗体对PAG-1融合蛋白均有特异性反应。2株单克隆抗体的重链亚型均为IgG2a,轻链亚型均为Kappa,其结合的抗原表位十分相近。结论:1.人工授精28d后使用PAG-ELISA试剂盒与直肠检查进行奶牛早期妊娠诊断结果的一致性高,PAG-ELISA方法具有较高的应用价值;2.成功构建PAG-1真核表达载体,纯化后获得了融合蛋白PAG-1,具有良好的纯度及免疫原性;3.获得2株抗PAG-1的单克隆抗体,2株单抗均特异性结合融合蛋白PAG-1,反应灵敏性和特异性较好,为研发奶牛早期妊娠诊断试剂提供了候选材料。
王金花[9]（2019）在《犬、猫心丝虫病诊断和治疗及流行病学研究》文中研究指明犬、猫心丝虫病是由犬心丝虫感染引起的严重的致命的寄生虫病,主要由蚊子传播。在中国的海南省和一些滨海城市如深圳、杭州、上海,关于犬、猫心丝虫病的流行和分布很少有报道。本研究应用了抗原检测方法和两种PCR法检测了位于华南的海南省、深圳市和华东的上海市,杭州市的心丝虫感染情况和流行率。从2014年10月到2017年5月,共采集了未采取心丝虫防治措施的狗的1038份血样和猫的51份血样。其中869份狗血样和所有猫血样均采自海南岛,55份狗血样来自深圳,69份狗血样来自上海,45份狗血样来自杭州。所有狗血样采用商品化的诊断试纸条（Canine SNAP 4Dx Plus test kit,IDEXX,USA）进行抗原检测,心丝虫抗原检测的感染率海南为0.5%（4/869）,深圳为 0%（0/55）,上海为 1.5%（1/69）,杭州的感染率则为 0%（0/45）。所有的狗血样使用PCR方法检测心丝虫的16S rRNA基因和心丝虫专性共生体-沃尔巴克氏菌的表面蛋白（WSP）基因。通过扩增心丝虫虫体16S rRNA基因检测心丝虫的感染率其中海南为7.4%（64/869）,深圳为0%（0/55）,上海为1.5%（1/69）,杭州为0%（0/45）。通过扩增犬心丝虫沃尔巴克氏菌的WSP基因检测心丝虫的感染率海南犬感染率为5.3%（46/869）,深圳犬心丝虫感染率为0%（0/55）,上海的犬心丝虫感染率为1.5%（1/69）,杭州的心丝虫感染率为0%（0/45）。通过扩增心丝虫16S rRNA基因检测海南的猫心丝虫的感染率为9.8%（5/51）,而通过扩增心丝虫沃尔巴克氏菌的WSP基因检测海南猫心丝虫的感染率为5.9%（3/51）。当前研究表明,海南岛的犬猫存在心丝虫感染的现象,用PCR方法检测的流行率高于用抗原方法检测流行率,通过扩增心丝虫16S rRNA基因检测海南的心丝虫的感染率高于扩增沃尔巴克氏菌的状SP基因的结果。上海、杭州和深圳三个滨海城市犬心丝虫感染率较低。再通过扩增心丝虫16S rRNA基因调查海南省各市县的犬心丝虫的感染率和分布,心丝虫感染率从0%—25%不等。其中琼海市心丝虫感染率最高为25.00%,三亚次之,感染率为17.57%,再次是屯昌县,犬心丝感染率为12.5%,儋州感染率最低为3.5%,海口和文昌也都有不同程度的心丝虫感染,分别是6.9%和3.9%。在澄迈、临高、昌江、乐东和陵水也做了相应的调查,检测到阳性率均为0%。为了筛选更好的疫苗和诊断的候选基因,提供犬恶丝虫免疫相关蛋白,对犬心丝虫沃尔巴克氏菌WSP基因进行克隆、原核表达。以含有沃尔巴克WSP基因片段的犬全血总DNA为模板进行PCR扩增。目的基因连接至pMD18t载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。再将目的基因克隆至原核表达质粒PTYB12中,构建重组表达载体PTYB12-WSP,双酶切鉴定。将其转入大肠埃希菌（E.coli）BL21感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-R4GE）分析表达的重组蛋白,再进行透析纯化,获得重组蛋白。结果表明WSP基因片段PCR扩增产物约为750 bp,测序结果与cDNA文库中筛选得到的序列一致。重组表达载体PTYB12-WSP双酶切鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导后重组蛋白PTYB12-WSP表达,相对分子质量（Mr）约为750,与预期大小一致。本实验成功克隆并表达了犬恶丝虫WSP重组蛋白。阿福拉纳米尔贝肟咀嚼片（赛可信）咀嚼片是一种犬用口服抗体内外寄生虫药,临床用于预防和治疗犬跳蚤、蜱虫及胃肠道线虫和预防犬心丝虫感染。为探究赛可信咀嚼片对犬心丝虫的预防效果,并评估该产品的临床使用安全性。将135只犬设置为两种试验模型。一种是在控制环境条件下开展试验,其中受试药物组（赛可信）30只,对照药物组（大宠爱）30只,阴性不给药犬10只,阳性不给药犬6只。另一种在田间自然环境下开展试验,其中受试药物组（赛可信）30只,对照药物组30只（大宠爱）。在180天的实验周期内,分别在-6天、120天、150天、180天对实验犬只的心丝虫抗原检查、微丝蚴镜检以及实验室PCR检测,观察心丝虫病原体对实验犬的感染情况变化,以验证该药物对犬只心丝虫病的临床预防疗效。每个月进行安全评价,分别在第0天、120天和150天给药时,观察犬给药后的临床表现,并从赛可信和大宠爱组各随机挑选10只犬分别在试验前-6天、试验120天和150天采血,进行血常规和血液生化指标检测。结果表明试验进行到150天时,在环境控制实验组中,阴性不给药的犬只出现一只PCR检测犬心丝虫阳性犬,并在180天时,PCR结果再次确证。而其它实验组均未出现心丝虫阳性犬。在整个实验过程中所有犬只未出现临床异常状况,体温、呼吸和心率均在正常生理范围内波动,血常规和生化指标均在正常范围波动,与给药前无统计学差异。说明阿福拉纳米尔贝肟咀嚼片是一种安全有效的预防犬心丝虫感染的口服产品。
王晔[10]（2018）在《幽门螺杆菌CagL抗原双抗体夹心ELISA试剂盒的建立》文中提出目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种重要的致病菌,具有很高的感染性,全球的感染率达到了50%。CagL蛋白是HP的一种伴侣蛋白,是HPⅣ型分泌系统的一种表面蛋白,由hp0539基因序列编码,在启动异常细胞通路引起病理性的临床改变上都起到了重要的作用。本实验利用CagL单克隆抗体和多克隆抗体,建立了可用于检测人粪便样品中的CagL抗原的双抗体夹心ELISA方法,制备并组装了试剂盒,为检测HP的感染提供了有效工具。方法:本实验制备了兔源CagL多克隆抗体,利用CagL单克隆抗体作为一抗包被酶标板,并进行封闭,兔源CagL多克隆抗体作为二抗,再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗家兔IgG抗体与二抗进行反应,通过加入底物显色以检测样品中是否含有CagL抗原。采用棋盘方阵滴定法,确定一抗的最佳包被浓度及二抗和酶标抗体的最佳稀释度,从而使抗原抗体进行更充分的反应。并且对初步制成的试剂盒进行敏感性、特异性、重复性、稳定性测试,判断试剂盒是否研制成功。结果:采用棋盘滴定法确定一抗的最佳包被浓度为0.048μg/mL,二抗和酶标抗体的最佳稀释度分别为1:32000和1:4000。试剂盒的敏感性试验表明:该方法判读的最低蛋白浓度为9.75μg/ml;特异性试验:表明该方法的特异性较好,不与粪便中的其他菌群发生交叉反应;重复性试验:对10份检测样品进行重复检验,结果显示批内重复和批间重复性均较好,批内变异系数在1.65%10.5%之间,批间变异系数在1.3%9.35%之间,基本满足变异系数小于10%,说明该试剂盒的重复性良好;稳定性试验:将包被好的酶标板分别存于37℃和4℃放置105d,每隔15d取出试剂盒对相同样本进行检测,观测其吸光度值的变化。结果表明该试剂盒在105d内检测P/N值均大于2.1满足了该试剂盒的判断标准。以上结果表明,本实验所建立的CagL双抗体夹心ELISA抗原检测方法基本满足敏感性高、特异性强、稳定性好等优点,可进一步应用于临床研究。
二、ELISA假阴性结果原因分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ELISA假阴性结果原因分析（论文提纲范文）
（1）牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病概述 |
| 1.1.1 片形吸虫的病原特性 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行状况及危害 |
| 1.2 片形吸虫病的诊断 |
| 1.3 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.3.1 虫体可溶性抗原 |
| 1.3.2 被膜抗原 |
| 1.3.3 分泌排泄产物(ESP)抗原 |
| 1.3.4 纯化抗原 |
| 1.3.5 重组抗原 |
| 1.4 片形吸虫病诊断试剂盒的研究 |
| 1.5 片形吸虫病的治疗与防控 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫诊断抗原的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂耗材 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 F22的制备 |
| 2.2.2 F22的质谱分析 |
| 2.2.3 蛋白分子的生物信息学分析 |
| 2.2.4 蛋白分子的原核重组表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 F22的制备结果 |
| 2.3.2 F22的质谱结果 |
| 2.3.3 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP生物信息学分析结果 |
| 2.3.4 rFgSAP-2、rFgCatL2、rFgLAP制备结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 F22的制备及质谱鉴定 |
| 2.4.2 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP的生物信息学分析 |
| 2.4.3 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP的原核重组表达 |
| 第三章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 血清及其他样品来源 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.2.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.3.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.4.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.4.3 F22作为诊断抗原的牛大片形吸虫病间接ELISA法与胶体金试纸条诊断效果的比较分析 |
| 第四章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.1.4 血清 |
| 4.1.5 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查 |
| 4.2.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清的检测 |
| 4.2.3 广西地区牛片形吸虫病用药情况调查及用药试验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行病学调查 |
| 4.3.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清检测 |
| 4.3.3 广西地区针对牛片形吸虫用药情况调查 |
| 4.3.4 用药试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查 |
| 4.4.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清检测 |
| 4.4.3 广西地区针对牛片形吸虫用药情况调查 |
| 4.4.4 用药试验 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 项目资助 |
（2）儿童手足口病常用实验室诊断方法的评价研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 HFMD的流行现状 |
| 1.1.2 HFMD的疾病负担 |
| 1.1.3 肠道病毒的病原学特征 |
| 1.1.4 临床常用的肠道病毒实验室诊断方法 |
| 1.1.5 其他肠道病毒实验室诊断方法及其临床应用局限性 |
| 1.1.6 HFMD早期实验室诊断的临床意义 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 基于RT-PCR的分子实验对肠道病毒诊断效能的影响因素研究 |
| 1.2.2 ELISA法检测血清EV-A71 IgM抗体诊断效能的研究 |
| 1.3 尚未解决的科学问题及研究目的 |
| 1.3.1 尚未解决的科学问题 |
| 1.3.2 研究目的 |
| 1.3.3 研究的必要性 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 研究设计概述 |
| 2.1.1 主要研究内容 |
| 2.1.2 研究的技术路线 |
| 2.2 研究地点 |
| 2.3 研究对象 |
| 2.3.1 病例定义及纳入、排除标准 |
| 2.3.2 病例纳入及管理 |
| 2.3.3 病例资料收集 |
| 2.3.4 标本采集及转运 |
| 2.4 实验室检测 |
| 2.4.1 联合RT-PCR检测咽拭子标本 |
| 2.4.2 商品化real-time RT-PCR检测粪便标本 |
| 2.4.3 商品化ELISA试剂盒检测血清标本 |
| 2.5 统计分析 |
| 2.5.1 描述性统计分析 |
| 2.5.2 阳性检出率的统计分析 |
| 2.5.3 诊断一致性评价的统计分析 |
| 2.5.4 诊断效能评价的统计分析 |
| 2.6 质量控制 |
| 2.7 伦理审批 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 纳入病例的基本特征 |
| 3.1.1 病例的纳入 |
| 3.1.2 纳入病例的基本特征 |
| 3.2 标本采集、检测及诊断结果概况 |
| 3.2.1 标本采集及检测情况 |
| 3.2.2 病例的诊断结果 |
| 3.2.3 病例诊断结果的比较 |
| 3.3 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性评价 |
| 3.3.1 纳入分析病例的基本特征及诊断结果 |
| 3.3.2 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR对EV-A71和CVA16的阳性检出率及其影响因素 |
| 3.3.3 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性及其影响因素 |
| 3.4 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能评价 |
| 3.4.1 纳入分析病例的基本特征 |
| 3.4.2 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的阳性检出率及其影响因素 |
| 3.4.3 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能评价及其影响因素 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 研究小结 |
| 4.2 结果的比较和解释 |
| 4.2.1 联合RT-PCR与商品化real-time RT-PCR诊断EV-A71和CVA16感染的一致性 |
| 4.2.2 商品化ELISA试剂盒检测血清EV-A71 IgM抗体的诊断效能评价 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论与建议 |
| 5.2 创新性 |
| 5.3 研究结果的科学和公共卫生意义 |
| 5.4 局限性 |
| 5.5 未来研究展望 |
| 附录 |
| 附录1 手足口病病例住院调查表 |
| 附录2 感染科院内临床记录表 |
| 附录3 PICU院内临床记录表 |
| 附录4 出院结局记录表 |
| 附录5 主要仪器设备 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童手足口病的肠道病毒实验室诊断研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果简介 |
| 致谢 |
（3）新型冠状病毒SARS-CoV-2免疫学检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 冠状病毒 |
| 1.2 新型冠状病毒 |
| 1.3 SARS-CoV-2 的检测方法 |
| 1.3.1 CT检测 |
| 1.3.2 核酸检测 |
| 1.3.3 病毒分离测序 |
| 1.3.4 蛋白检测 |
| 1.4 胶体金免疫层析检测方法 |
| 1.5 酶联免疫吸附检测方法(ELISA) |
| 1.6 化学发光免疫检测方法 |
| 1.6.1 磁珠在化学发光检测技术中的应用 |
| 1.7 本课题的研究目的及意义 |
| 第二章 SARS-CoV-2 抗体胶体金免疫层析检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验设备仪器 |
| 2.1.2 实验药品 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 胶体金溶液的制备及检测过程 |
| 2.2.2 胶体金-鼠抗人 IgM及鼠抗人 IgG抗体结合物的制备 |
| 2.2.3 试剂卡材料的筛选 |
| 2.2.4 金稀液成分的选择 |
| 2.2.5 试剂卡C线包被浓度的选择 |
| 2.2.6 试剂卡T线包被浓度的选择 |
| 2.2.7 试剂卡的性能评估 |
| 2.2.8 临床应用验证 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 胶体金溶液的制备及检测过程 |
| 2.3.2 胶体金-鼠抗人 IgM及鼠抗人 IgG抗体结合物的制备 |
| 2.3.3 试剂卡材料的筛选 |
| 2.3.4 金稀液成分的选择 |
| 2.3.5 试剂卡C线包被浓度的选择 |
| 2.3.6 试剂卡T线包被浓度的选择 |
| 2.3.7 试剂卡的性能评估 |
| 2.3.8 临床应用验证 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 SARS-CoV-2 酶联免疫吸附检测方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备仪器 |
| 3.1.2 实验药品 |
| 3.1.3 实验试剂的配置 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.2.1 SARS-CoV-2 ELISA检测方法步骤 |
| 3.2.2 包被抗原与抗体最佳工作浓度的确定 |
| 3.2.3 包被缓冲液的筛选 |
| 3.2.4 最佳包被条件的确定 |
| 3.2.5 发光底物最佳工作时间的确定 |
| 3.2.6 建立标准曲线 |
| 3.2.7 性能评估 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 包被抗原与抗体最佳工作浓度的确定 |
| 3.3.2 包被缓冲液的筛选 |
| 3.3.3 最佳包被条件的确定 |
| 3.3.4 发光底物最佳工作时间的确定 |
| 3.3.5 建立标准曲线 |
| 3.3.6 性能评估 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SARS-CoV-2 磁珠化学发光免疫检测方法的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要使用仪器 |
| 4.1.2 主要使用化药 |
| 4.1.3 主要使用试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫磁珠的制备过程 |
| 4.2.2 磁珠化学发光检测方法的操作步骤 |
| 4.2.3 磁珠偶联抗体含量的确定 |
| 4.2.4 反应孵育时间的确定 |
| 4.2.5 化学发光底物反应时间的确定 |
| 4.2.6 化学发光免疫检测方法标准曲线的建立 |
| 4.2.7 磁珠化学发光免疫检测方法性能分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 磁珠偶联抗体含量的确定 |
| 4.3.2 反应孵育时间的确定 |
| 4.3.3 化学发光底物反应时间的确定 |
| 4.3.4 化学发光免疫检测方法标准曲线的建立 |
| 4.3.5 磁珠化学发光免疫检测方法性能分析 |
| 4.3.6 “HOOK”实验 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（4）孔雀石绿纳米抗体的制备及其免疫层析检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 孔雀石绿的化学性质及杀虫机理 |
| 2 孔雀石绿的代谢过程及其危害 |
| 3 孔雀石绿残留现状 |
| 4 常规检测方法及特点 |
| 4.1 液相色谱-串联质谱和高效液相色谱方法 |
| 4.2 激光拉曼光谱法 |
| 4.3 量子点分子印迹比率荧光探针 |
| 4.4 酶联免疫吸附法(ELISA) |
| 4.5 时间分辨荧光免疫层析 |
| 4.6 胶体金免疫层析法 |
| 5 抗体及其制备技术的发展 |
| 5.1 什么是抗体? |
| 5.2 抗体研究技术的发展 |
| 5.3 纳米抗体制备技术的研究 |
| 6 孔雀石绿快速检测试剂盒现状及需要解决的问题 |
| 6.1 孔雀石绿快速检测试剂盒标准的建立 |
| 6.2 快检产品质量参差不齐,造成监管乏力 |
| 6.3 快速,便捷的快检技术,抗体是产品关键技术 |
| 7 纳米抗体的获得及检测方法的建立 |
| 7.1 完全抗原的构建 |
| 7.2 纳米抗体的筛选 |
| 7.3 免疫层析检测卡的制备 |
| 8 研究意义 |
| 8.1 制备小分子纳米抗体,为检测残留药物的抗体筛选提供方向 |
| 8.2 纳米抗体试纸条为建立药物残留快速检测提供新方法 |
| 8.3 纳米抗体改造技术,方便更多的科研产品走向临床生产 |
| 第一章 孔雀石绿抗原制备及纳米抗体的筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器与耗材 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原制备 |
| 2.2 完全抗原的鉴定 |
| 2.3 纳米抗体的筛选 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗原鉴定 |
| 3.2 小鼠免疫效价测定 |
| 3.3 羊驼血清效价鉴定 |
| 3.4 羊驼外周血白细胞总RNA的质量评价 |
| 3.5 VHH基因的扩增 |
| 3.6 噬菌体文库鉴定 |
| 3.7 孔雀石绿纳米抗体的淘选与鉴定 |
| 3.8 纳米抗体的表达与纯化 |
| 4 讨论 |
| 第二章 孔雀石绿胶体金免疫层析检测试纸条的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 设备与耗材 |
| 1.3 试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 胶体金试纸条制备 |
| 2.2 样品制备工艺的确定 |
| 2.3 胶体金试纸条的优化 |
| 3 结果 |
| 3.1 胶体金质量鉴定 |
| 3.2 最佳pH值测定 |
| 3.3 最佳标记量 |
| 3.4 样品前处理方法的确定 |
| 3.5 胶体金垫材料选择 |
| 3.6 样品垫材料选择结果 |
| 3.7 NC膜选择结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胶体金颗粒的制备 |
| 4.2 纳米抗体胶体金标记 |
| 4.3 免疫层析试纸条关键技术 |
| 4.4 样品制备的关键 |
| 第三章 孔雀石绿胶体金免疫层析检测试纸条的验证及其应用 |
| 1 试剂和耗材 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 设备与耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 快速检测试剂盒的组装 |
| 2.2 试验样品 |
| 2.3 具体检测步骤 |
| 2.4 结果综合判定原则 |
| 2.5 孔雀石绿胶体金免疫层析试纸条在检测市场的运用 |
| 3 结果 |
| 3.1 假阳/阴性试验验证 |
| 3.2 灵敏度试验 |
| 3.3 稳定性试验 |
| 3.4 检测用时统计 |
| 3.5 第三方检测市场检测结果 |
| 3.6 阳性结果复证 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）水貂阿留申病流行病学调查及EvaGreen荧光定量PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 AMD概述 |
| 1.2 AMD病原学 |
| 1.2.1 病原分类地位 |
| 1.2.2 AMDV的形态结构和理化特征 |
| 1.3 AMDV分子生物学特征 |
| 1.3.1 AMDV的基因组结构 |
| 1.3.2 AMDV的蛋白及功能 |
| 1.4 AMDV的致病机理 |
| 1.5 AMD的流行病学 |
| 1.5.1 流行情况 |
| 1.5.2 传播途径和宿主范围 |
| 1.5.3 临床症状和发病机理 |
| 1.6 AMD诊断方法的研究进展 |
| 1.6.1 AMD的血清学检测方法 |
| 1.6.2 AMD的病原学检测方法 |
| 1.7 AMD的预防和控制 |
| 1.8 水貂进境的检疫监管流程 |
| 1.9 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 水貂场的选择 |
| 2.1.2 血清、病毒、质粒 |
| 2.1.3 细胞与实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 2015~2017年四个水貂场AMDV的流行病学调查 |
| 2.2.2 AMDV的分离鉴定与序列分析 |
| 2.2.3 EvaGreen荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.2.4 EvaGreen荧光定量PCR在水貂中的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 2015~2017年四个水貂场AMD的流行病学调查 |
| 3.1.1 各水貂场AMDV的感染率 |
| 3.1.2 各水貂场的平均产仔数 |
| 3.1.3 CIEP、GICT、PCR的结果比较 |
| 3.2 AMDV的分离鉴定与序列分析 |
| 3.2.1 病毒分离与电镜观察结果 |
| 3.2.2 AMDV对小鼠的感染性试验 |
| 3.2.3 基因的扩增与测序 |
| 3.2.4 AMDV全基因序列的比对分析 |
| 3.2.5 AMDV NS1基因序列的比对分析 |
| 3.2.6 AMDV VP2基因序列的比对分析 |
| 3.2.7 不同毒株AMDV VP2蛋白抗原性分析 |
| 3.3 EvaGreen荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.3.1 全血作为检测样品的确定 |
| 3.3.2 最优引物的选择 |
| 3.3.3 两种荧光定量PCR的标准曲线 |
| 3.3.4 EvaGreen荧光定量PCR的特异性 |
| 3.3.5 两种荧光定量PCR的敏感性 |
| 3.3.6 EvaGreen荧光定量PCR的重复性 |
| 3.3.7 不同核酸检测方法结果的分析 |
| 3.4 EvaGreen荧光定量PCR在水貂场中的应用 |
| 3.4.1 环境中AMDV的监测 |
| 3.4.2 检疫后不同时期水貂场AMDV的感染率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 2015~2017年四个水貂场AMD的流行病学调查 |
| 4.2 AMDV的分离鉴定及基因组序列分析 |
| 4.3 EvaGreen荧光定量PCR方法的建立 |
| 4.4 EvaGreen荧光定量PCR在水貂场中的应用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）六安市2016-2018年疑似HIV感染病例的确诊及流行特征分析（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| HIV 抗体检测方法研究进展 |
| 参考文献 |
（7）基于流式平台的淋巴细胞交叉配型及PRA实验在肾移植患者中的应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 抗人类白细胞抗原抗体检测技术在肾移植患者中的临床应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 牛早期妊娠诊断的研究进展 |
| 1.2 PAG的研究进展 |
| 2 研究目的与意义 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 PAG早孕诊断ELISA试剂盒在奶牛早孕诊断应用价值研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PAG-ELISA试剂盒应用价值的研究 |
| 3.2 PAG-ELISA试剂盒准确性分析 |
| 4 结论 |
| 实验二 PAG-1 蛋白的真核表达、纯化及反应原性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 转染级质粒抽提结果鉴定 |
| 2.3 PAG-1 蛋白质的纯化 |
| 2.4 PAG-1 蛋白质的鉴定 |
| 2.5 PAG-1 反应原性检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PAG-1 的表达 |
| 3.2 目的基因的选择 |
| 3.3 宿主细胞的选择及PAG-1 反应原性检测 |
| 4 结论 |
| 实验三 PAG-1 单克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠血清抗体效价的检测 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 腹水抗体纯化 |
| 2.4 抗体效价测定 |
| 2.5 WB测定抗体对PAG-1 的反应性 |
| 2.6 抗体亚型鉴定 |
| 2.7 抗体结合表位初步分析 |
| 2.8 竞争ELISA方法初步探索 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.2 单克隆抗体抗原表位分析 |
| 3.3 ELISA方法的初步探索 |
| 4 结论 |
| 第三章 全文总结 |
| 第四章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（9）犬、猫心丝虫病诊断和治疗及流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 犬心丝虫病在中国的流行分布 |
| 第二章 心丝虫共生体-沃尔巴克氏体的研究进展 |
| 第三章 心丝虫诊断方法的研究进展 |
| 3.1 微丝蚴虫体检测 |
| 3.2 免疫学诊断方法 |
| 3.3 分子生物学方法 |
| 第四章 犬心丝虫预防治疗方法的研究进展 |
| 4.1 药物预防治疗 |
| 4.2 外科治疗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犬猫心丝虫病不同检测方法的比较研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 动物的选择和血样的采集 |
| 1.2 血清学的检测 |
| 1.3 血液总DNA的提取 |
| 1.4 不同基因PCR检测 |
| 1.4.1 犬心丝虫16S rRNA基因PCR检测 |
| 1.4.2 犬心丝虫沃尔巴克氏菌基因PCR检测 |
| 1.5 测序 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同基因PCR扩增结果 |
| 2.2 犬心丝虫沃尔巴克体氏菌FtsZ基因亲缘性分析结果 |
| 2.3 三种不同检测方法检测犬猫心丝虫病的效果比较研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PCR检测心丝虫16SrRNA基因和沃尔巴克氏菌基因 |
| 3.2 FtsZ基因亲缘性分析结果讨论 |
| 3.3 三种不同检测方法检测犬猫心丝虫病的效果比较研究 |
| 第二章 海南和其它三个滨海城市犬猫心丝虫感染流行情况调查 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 调查对象和样本量 |
| 1.2 血液总DNA的提取 |
| 1.3 犬心丝虫16S rRNA基因PCR检测 |
| 1.4 测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同饲养方式犬群和海南及其它三个滨海城市犬心丝感染率调查 |
| 2.2 海南不同的市县犬、猫心丝虫感染率调查 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同饲养方式犬群和海南及其它三个滨海城市犬心丝感染率调查 |
| 3.2 海南不同的市县犬、猫心丝虫感染率调查 |
| 第三章 犬心丝虫内共生体沃尔巴克氏菌WSP基因的克隆与原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 PCR扩增目的基因及连接克隆载体 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 1.2.4 目的基因的诱导表达 |
| 1.2.5 重组蛋白纯化(透析) |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒PTYB12-WSP的鉴定 |
| 2.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.3 重组蛋白纯化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 阿福拉纳米尔贝肟(赛可信)对犬心丝虫病预防效果和安全性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及分组 |
| 1.1.1 来源 |
| 1.1.2 品种和数量 |
| 1.1.3 病例入选标准 |
| 1.1.4 试验分组 |
| 1.1.5 病例淘汰 |
| 1.1.6 动物剖检 |
| 1.2 心丝虫检测方法 |
| 1.2.1 爱得士(IDEXX SNAP~(?) 4DXTM plus)试剂盒检测法 |
| 1.2.2 分子生物学检测方法(PCR法) |
| 1.2.3 微丝蚴镜检法 |
| 1.3 试验药物 |
| 1.3.1 受试药物和对照药物及来源 |
| 1.3.2 给药方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 2 实验结果与分析 |
| 2.1 赛可信对犬心丝虫感染预防效果药效学研究 |
| 2.1.1 第-6天使用不同检测方法检测135只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.1.2 第120天不同检测方法检测70只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.1.3 第150天不同检测方法检测130只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.1.4 第180天不同检测方法检测130只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.2 阿福拉纳米尔贝肟安全性评价实验 |
| 2.2.1 一般临床检查结果 |
| 2.2.2 实验犬血常规指标检测结果 |
| 2.2.3 血液生化学检查结果 |
| 2.3 实验结果分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 总结、创新与展望 |
| 1 主要结论 |
| 1.1 结论1 |
| 1.2 结论2 |
| 1.3 结论3 |
| 1.4 结论4 |
| 2 创新之处 |
| 3 建议与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）幽门螺杆菌CagL抗原双抗体夹心ELISA试剂盒的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 幽门螺杆菌简介 |
| 1.1.2 幽门螺杆菌致病岛的研究 |
| 1.1.3 CagL蛋白简介 |
| 1.2 幽门螺杆菌诊断技术的进展 |
| 1.2.1 胃粘膜细菌培养 |
| 1.2.2 快速尿素酶试验（RUT） |
| 1.2.3 病理组织学检测 |
| 1.2.4 PCR及荧光原位杂交 |
| 1.2.5 ~(13)C-尿素呼气试验（~(13)C-UBT） |
| 1.2.6 ~(14)C-尿素呼气试验 (~(14)C-UBT ) |
| 1.2.7 血清抗幽门螺杆菌抗体检测 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 幽门螺杆菌CagL蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物的免疫接种 |
| 2.2.2 阴性血清的采集 |
| 2.2.3 阳性血清的采集 |
| 2.2.4 血清的纯化 |
| 2.2.5 蛋白质含量的测定 |
| 2.2.6 多克隆抗体效价的测定 |
| 2.2.7 多克隆抗体的Western Blot验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 多克隆抗体蛋白含量的测定 |
| 2.3.2 多克隆抗体效价的测定 |
| 2.3.3 多克隆抗体的Western Blot验证 |
| 第三章 双抗体夹心ELISA方法的建立及试剂盒的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 3.1.3 主要试剂配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 双抗体夹心ELISA方法的基本操作步骤 |
| 3.2.2 双抗体夹心ELISA法中各类抗体最佳工作浓度的确定 |
| 3.2.3 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 3.2.4 封闭液及封闭时间的确定 |
| 3.2.5 酶标抗体作用时间的选择 |
| 3.2.6 底物显色时间的选择 |
| 3.2.7 阴阳性判断标准的确立 |
| 3.2.8 敏感性试验 |
| 3.2.9 重复性试验 |
| 3.2.10 特异性试验 |
| 3.2.11 稳定性试验 |
| 3.2.12 试剂盒的组装 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 双抗体夹心ELISA法中抗体对最佳工作浓度的确定 |
| 3.3.2 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 3.3.3 封闭液及封闭时间的确定 |
| 3.3.4 酶标抗体作用时间的选择 |
| 3.3.5 底物显色时间的选择 |
| 3.3.6 阴阳性判断标准的确立 |
| 3.3.7 敏感性试验 |
| 3.3.8 重复性试验 |
| 3.3.9 特异性试验 |
| 3.3.10 稳定性试验 |
| 3.3.11 CagL双抗体夹心ELISA试剂盒的初步临床应用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 双抗体夹心ELISA方法的优越性 |
| 3.4.2 双抗体夹心ELISA方法在操作中的常见影响因素 |
| 3.4.3 CagL双抗体夹心ELISA试剂盒的临床应用评价 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、ELISA假阴性结果原因分析（论文参考文献）
- [1]牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用[D]. 靳纬坤. 广西大学, 2021
- [2]儿童手足口病常用实验室诊断方法的评价研究[D]. 张天琛. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [3]新型冠状病毒SARS-CoV-2免疫学检测方法的建立[D]. 孙子琪. 长春理工大学, 2021(02)
- [4]孔雀石绿纳米抗体的制备及其免疫层析检测方法的建立与应用[D]. 高海岗. 扬州大学, 2021(02)
- [5]水貂阿留申病流行病学调查及EvaGreen荧光定量PCR方法的建立与应用[D]. 李俚. 东北农业大学, 2020(07)
- [6]六安市2016-2018年疑似HIV感染病例的确诊及流行特征分析[D]. 周从宇. 安徽医科大学, 2020(02)
- [7]基于流式平台的淋巴细胞交叉配型及PRA实验在肾移植患者中的应用[D]. 王琳. 昆明医科大学, 2020(02)
- [8]奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备[D]. 蔡卓轩. 石河子大学, 2019(05)
- [9]犬、猫心丝虫病诊断和治疗及流行病学研究[D]. 王金花. 海南大学, 2019(06)
- [10]幽门螺杆菌CagL抗原双抗体夹心ELISA试剂盒的建立[D]. 王晔. 江苏大学, 2018(01)