一、日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究（论文文献综述）
余慧[1]（2013）在《云南大理日本血吸虫部分线粒体基因序列的初步研究》文中研究指明[目的]研究分析云南省大理市日本血吸虫的线粒体CO1、 Cytb、 ND1、 ND4L和ND6五个基因序列,为我国日本血吸虫的种群遗传结构和种间关系以及对进一步了解日本血吸虫的生物学特性奠定基础。[方法]采集云南省大理市马久邑村的阳性钉螺,逸出尾蚴；用腹部贴片法感染昆明小鼠,每只小鼠感染20-30条,感染45天后进行解剖；用灌注法取出小鼠体内的成虫。用DNA提取试剂盒提取日本血吸虫成虫的基因组DNA,用PCR技术对线粒体五个基因CO1、 Cytb、 ND1、 ND6、 ND4L的序列进行扩增并送生物公司测序。使用NCBI的ORF Finder程序和TFSEARCH程序对五个基因序列作基因生物信息学分析。用DNAstar和Mega4.0软件将测定得到的序列与GeneBank中已发表的血吸虫线粒体CO1、 Cytb、 ND1、 ND6、 ND4L基因序列绘制分子进化树。[结果]获得了马久邑村日本血吸虫的线粒体CO1、 Cytb、 ND1、 ND6和ND4L片段的基因序列。分子进化树的结果显示本实验研究的日本血吸虫与曼氏血吸虫、马来血吸虫、湄公血吸虫和埃及血吸虫有明显的分支,但是与GeneBank中已经发表的其他地区品系日本血吸虫的线粒体序列相比较并不能构成单独的分支,表明本实验所研究的日本血吸虫样本仍归属于日本血吸虫大陆品系。[结论]得到云南大理日本血吸虫线粒体CO1、 Cytb、 ND1、 ND4L和ND6基因。构建的分子进化树结果表明本实验的日本血吸虫归属于日本血吸虫大陆品系。与马来血吸虫、埃及血吸虫、湄公血吸虫、曼氏血吸虫在分子树上有明显的分支,有种间区别。
向进平[2]（2013）在《日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的构建及免疫应答的动态观察》文中指出目的日本血吸虫病是由日本血吸虫（Schistosoma japonicum, Sj）引起的一种危害人体健康的地方性人兽共患寄生虫病。由于该病危害大，因此研发有效的疫苗防治该病已是势在必行。本研究拟构建Sj重组两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗，并研究其免疫BALB/c小鼠后免疫应答的动态变化，以期为Sj的免疫预防提供一条新途径。方法从我室保存的BL21（DE3）（pET28α-Sj26GST-Sj32）重组菌中抽提质粒pET28α-Sj26GST-Sj32，PCR扩增Sj26GST-Sj32融合基因，将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32。将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中，抽提质粒并进行双酶切，鉴定载体片段及目的基因片段长度。用电穿孔法将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32转化至Bb，构建Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗，抽提质粒进行PCR鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导后以SDS-PAGE及Western-blot对表达产物进行鉴定。将96只BALB/c小鼠随机分为2组，每组48只，用重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗分别经口服灌胃和鼻腔粘膜两种途径免疫小鼠，在免疫后0～22周每两周两组分别剖杀4只小鼠，分离血清，ELISA法测定血清抗体及细胞因子；取脾并分离脾细胞，用Sj成虫抗原（SjAWA抗原）和刀豆蛋白A（ConA）刺激培养，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测免疫小鼠脾细胞增殖反应，同时设原液组对照；用流式细胞术（FCM）检测免疫小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比；脾细胞经SjAWA抗原及ConA刺激培养，收集培养的上清液，双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清液的IL-10及IL-12水平，设原液组（stock group）作为对照；脾细胞经ConA培养，流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率，并设原液组作为对照。结果PCR成功扩增出长度为1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；双酶切证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入质粒pGEX-1λT中；PCR证实从重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗中扩增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；SDS-PAGE分析显示将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32在E.coli BL21中经IPTG诱导表达后，得到分子量约85kDa的条带，其中以5～7h处表达水平较高； Western-blot发现重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32表达产物可被Sj感染的兔血清识别。口服免疫（per os，PO）组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分别在免疫后6、8、8、4、6、12和6周达峰值；血清IL-10和IL-12水平分别在免疫后12、6周达峰值。鼻腔粘膜（intranasal，IN）组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分别在免疫后4、2、6、2、4、8和8周达峰值；血清IL-10和IL-12水平分别于免疫后6周达峰值。PO组增殖水平于免疫后4w达高峰，而IN组于免疫后12w达高峰。PO组脾CD4+T细胞亚群于免疫后4w达最高水平，IN组CD4+T细胞亚群于免疫后12w达最高水平；PO组脾CD8+T细胞亚群于10w达峰值，IN组CD8+T细胞亚群于免疫后6w达最高水平。PO组和IN组小鼠脾细胞IL-10水平均于免疫后6w达最高；PO组小鼠脾细胞IL-12水平于免疫后6w达最高，IN组脾细胞IL-12水平于12w达最高水平。PO组小鼠脾细胞凋亡率于免疫后6w达最高，而IN组脾细胞凋亡率于12w达最高水平。结论成功构建日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗；该疫苗在免疫早期可诱导小鼠产生有效地Th1和Th2型混合性免疫应答。
李晔[3]（2010）在《抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究》文中研究指明日本血吸虫病（Schistosomiasis japonicium）是一种严重危害人、畜健康,影响社会和经济发展的人、畜共患寄生虫病。近年来我国血吸虫病防治工作取得了一定的成绩,但在两湖地区血吸虫病流行仍较严重。由于钉螺孳生环境没有改变,灭螺效果难以持久和巩固,并可能造成生态环境污染;长期使用吡喹酮进行扩大化疗,有产生耐药性的危险。作为灭螺、药物防治和其他综合防治措施的重要补充,血吸虫病疫苗的研究就显得十分必要。迄今研制的一些日本血吸虫亚单位基因工程疫苗保护效果还不够理想,多价多表位疫苗是探索提高疫苗保护效果的有效途径之一。本论文应用基因工程技术研制了日本血吸虫表膜蛋白二价多表位重组抗原疫苗,通过小鼠日本血吸虫病免疫保护试验评估疫苗所诱导的免疫保护效果,以期找出具有较好保护力的抗日本血吸虫病疫苗。应用荧光实时定量PCR分析Sj23和Sj-Tsp2基因在血吸虫童虫和成虫的表达情况,并利用生物信息学技术分析其抗原性和亲水性等特性,PCR扩增Sj23（EC1）、Sj23（EC2）、Sj-Tsp2（EC2）具有较高抗原性多表位的DNA片段,构建pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）和pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）原核表达质粒,转化E.coli BL21（DE3）并用IPTG诱导表达融合蛋白,His柱亲和层析法纯化重组蛋白。蛋白印迹法（western blotting）分析该重组蛋白的免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠4次后,各组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染6周后,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝脏虫卵数,计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周和剖杀时收集血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平;荧光实时定量PCR技术分析目的基因在免疫后的转录变化水平。荧光实时定量PCR结果显示,Sj23和Sj-Tsp2基因在日本血吸虫各个时期都有转录,且在童虫期转录较高;免疫pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）蛋白组收集的虫体为模板,与PBS空白组虫体的模板相比,Sj23和Sj-Tsp2基因在血吸虫转录都明显下降了,同时pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）组Sj23和Sj-Tsp2基因的转录也下降。构建的重组蛋白pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）和pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）相对分子质量（Mr）分别为32.08kDa和37.5kDa。western blotting分析结果表明,该重组蛋白具有良好的抗原性。小鼠免疫保护试验结果显示: pET32a（+）-Sj23（EC2）组, pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）组和pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）组分别获得27.66%,33.47%和41.66%减虫率和35.87%,55.31%和41.16%肝脏减卵率,与空白组相比都有显着差异（P<0.05）。间接ELISA试验结果表明,用重组蛋白免疫后小鼠血清特异性抗体都显着升高。本文在分析Sj23和Sj-Tsp2表达时相和生物信息学分析其特性的基础上,成功构建了2个日本血吸虫表膜蛋白的二价多表位疫苗,在大肠杆菌中成功表达并纯化得到具有较高抗原性的重组蛋白,在实验动物中诱导了显着的免疫保护效果,免疫机制研究表明疫苗的保护作用可能和其免疫诱导的高水平的抗体和转录下降有关。本文为抗日本血吸虫病多价多表位疫苗的研制成功探索了方法,结果证明具有潜在的应用价值。
汪世平,陈秀春,高冬梅[4]（2009）在《我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景》文中研究表明血吸虫病疫苗研究一直是WHO/TDR热带病防治和我国血防研究的热点内容,近年来我国有关血吸虫病疫苗的研究取得了重要进展。随着蛋白质组学和分子生物学技术的发展,我国血吸虫病疫苗研究已发展到基因工程疫苗研制阶段。其中DNA疫苗已成为当前我国血吸虫病疫苗研究的主流方向。同时,新的有效疫苗抗原分子的筛选鉴定及其配伍与优化,混合疫苗、多价疫苗的构建及其与佐剂的联用,为提高疫苗免疫保护效果提供了新的途径。
付光伟[5]（2009）在《日本血吸虫表膜结构蛋白Annexin基因克隆、表达与免疫保护效果评估》文中研究指明日本血吸虫病是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫疾病。由于中间宿主钉螺难以消灭,治疗药物“吡喹酮”不能解决重复感染的难题,并且有可能诱导产生抗药性,因此有必要研制高效、安全的抗血吸虫病疫苗和新治疗药物。血吸虫能够在终末宿主体内生活十几年甚至几十年,一定具有逃避宿主免疫应答的有效方式;血吸虫的体表被膜是由复杂的多层结构组成的合胞体层,它直接受到宿主免疫系统的攻击,血吸虫之所以具有很强的自身保护能力,与其表膜密切相关,因此深入研究血吸虫表膜蛋白及其抗原组成及变化是研究血吸虫与宿主之间相互作用、揭示血吸虫免疫逃避机制的关键。本研究克隆了日本血吸虫表膜蛋白Annexin的编码基因,并对这个基因进行了表达及生物学功能的初步研究。作者利用已经公布的曼氏血吸虫表膜蛋白Annexin基因序列,在日本血吸虫EST库中搜索到一个相应的EST片段（GeneBank登录号AY812989）,根据该EST序列,设计特异性引物,利用PCR技术克隆获得日本血吸虫表膜蛋白Annexin编码基因Sjan。序列分析表明Sjan基因的ORF含1023bp,编码341个氨基酸,理论分子量39.4KD。并成功构建该基因的重组表达质粒pET28a（+）-Sjan,在大肠杆菌BL21（DE3）系统中成功表达,分子量为42.9KD;应用纯化的重组蛋白rSjan免疫BALB/c小鼠,获得了23.27%的减虫率和35.04%的肝组织减卵率。本文克隆了编码日本血吸虫表膜蛋白Annexin的基因,成功将Sjan在大肠杆菌中表达,并在小鼠中初步评估了该重组蛋白诱导的免疫保护效果。本研究为深入探讨日本血吸虫抵抗宿主免疫系统的攻击、揭示日本血吸虫的免疫逃避机制提供了基础,也为研制高效、安全的抗血吸虫病疫苗和新的治疗药物提供了新思路。
袁仕善,孙文霞,杨盛清,唐小异[6]（2008）在《日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达》文中研究指明目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a（+）,转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a（+）,在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。
刁薇[7]（2008）在《东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的筛选和验证》文中认为日本血吸虫病（schistosomiasis japonica）作为人兽共患寄生虫病,在我国仍然是一个重要的公共卫生问题。现阶段我国实行的是“以控制传染源”为主、综合治理的血吸虫病防治策略。其中,吡喹酮群体化疗是目前血吸虫病防治措施的基础,但血吸虫病仍在向新的地区蔓延,并且吡喹酮化疗也有一定的局限性,群体化疗并不能防止重复感染,还可能会产生吡喹酮抗性株。因此,在血吸虫病防治策略中,疫苗策略已被认为将是吡喹酮化疗措施的重要补充。目前已有酶性、肌性、膜相关性等多种疫苗候选抗原的基因得到了克隆和表达,并且开展了动物保护性实验,虽然取得了一定的预期效果,但继续寻找新的候选抗原分子以及提高候选疫苗分子的免疫原性仍是血吸虫病疫苗研究的重要方向,通过免疫筛选cDNA文库去发掘更有效的疫苗候选分子是获得新的候选抗原分子的有效途径。发展疫苗的主要目的是降低虫荷和虫卵在肝组织的沉积,因此疫苗的效应应多针对童虫阶段和成虫产卵。东方田鼠（Microtus fortis,Mf）是一种感染日本血吸虫后不致病的哺乳类动物。血吸虫童虫可能是宿主免疫系统较为适合的靶子,若能找到童虫阶段的特异性抗原分子,将血吸虫消灭在此阶段或阻止其生长、发育、成熟、产卵和致病,这不仅可以减轻血吸虫病所造成的病理损害,还可有效地阻止其传播。因此用东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库中,以寻找相关的疫苗候选分子,可能会获得令人满意的结果,并为东方田鼠天然抗日本血吸虫机制的研究提供信息。精氨酸甲基化在血吸虫基因表达调节中起着重要的作用。这是一种翻译后修饰,它参与了多种细胞功能,包括RNA加工处理、细胞信号转导、蛋白亚细胞定位、转录后调节和DNA修复。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）参与基因转录、复制、重组与修复。胞外HMGB1是一种重要的晚期炎症介质,它可以激活巨噬细胞释放TNF-α和IL-13等早期炎症因子。在血吸虫感染中,TNF-α和IL-13对虫卵周围肉芽肿的形成起着重要的免疫诱导作用,可能是宿主感染后免疫调节的关键分子。HMGB1与一些感染性疾病的发病密切相关。本研究从日本血吸虫童虫cDNA文库筛选得到的阳性克隆中选择了蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）编码基因进行研究。首先通过生物信息学分析获得其完整的开放阅读框,然后通过分子克隆技术对这2个基因进行了克隆表达。随后,对纯化重组蛋白reSjcHMGB1开展了动物免疫保护性试验,评价其作为疫苗候选抗原的价值。一、东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的免疫筛选用日本血吸虫天然抗性东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库,将3次复筛获得的阳性克隆转入大肠杆菌（E.coil）BM25.8环化成质粒,抽提质粒DNA,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定,插入片段进行核苷酸序列测序,并进行生物信息学分析。结果,经3次复筛后获得32个阳性克隆,插入片段为300 bp～1 100 bp之间,测序结果经同源性分析,共获得26个不同分子基因:高迁移率族蛋白B1（HMGB1）部分基因,蛋白质精氨酸甲基转移酶部分编码基因,细胞色素b部分编码基因,线粒体编码区基因,16个日本血吸虫未知蛋白编码基因,6个日本血吸虫未知新基因。本研究用东方田鼠血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,获得一批新的日本血吸虫疫苗候选分子的编码基因,为研究血吸虫病疫苗和血吸虫病免疫诊断奠定了基础。二、日本血吸虫蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）1编码基因的克隆、表达和分析依据电子延伸得到的SjPRMT1基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHⅠ酶切位点,下游引物引入XhoⅠ酶切位点。以日本血吸虫成虫总RNA为模板,经反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。纯化PCR产物与pGEM-T载体连接后转化感受态大肠杆菌JM109,抽提重组质粒DNA用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切及核苷酸序列测序进行鉴定。选择阅读框正确的克隆,纯化重组质粒中目的基因双酶切片段,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-SjPRMT1,转化DH5α感受态菌,重组质粒经双酶切和核苷酸序列鉴定后,阳性克隆质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达并获得纯化的重组蛋白（简称为reSjPRMT1）,采用SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定该重组蛋白。运用Gene Runner软件预测reSjPRMT1蛋白的二级结构、功能位点及表位特征。结果,RT-PCR扩增出一大小与预期一致的基因片段。TA克隆插入目的片段经核苷酸序列测定,cDNA全长1083 bp,编码360个氨基酸。序列分析表明该片段与SmPRMT1基因序列同源性为87%,推导的氨基酸序列同源性为95%。表达蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析显示,reSjPRMT1重组蛋白的分子质量约43 kDa（包括6个组氨酸）,以可溶性方式表达,可被日本血吸虫感染小鼠血清和抗His-G HRP抗体识别。SjPRMT1基因的克隆、表达获得成功,并获得纯化的重组蛋白,为今后进一步研究其生物学特性以及免疫原性奠定了基础。三、日本血吸虫高迁移率族蛋白B1（HMGB1）编码基因的克隆、表达和免疫保护性研究依据公布的SmHMGB1基因序列设计一对简并引物,上游引物引入BamHⅠ酶切位点,下游引物引入SalⅠ酶切位点。以日本血吸虫成虫总RNA为模板,经反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。纯化PCR产物与pGEM-T载体连接后转化感受态大肠杆菌JM109,抽提重组质粒DNA用BamHⅠ和SalⅠ双酶切及核苷酸序列测序进行鉴定。选择阅读框正确的克隆,纯化重组质粒中目的基因双酶切片段,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-SjHMGB1,转化DH5α感受态菌,重组质粒经双酶切和核苷酸序列鉴定后,阳性克隆质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达并获得纯化的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定该重组蛋白。运用Gene Runner软件预测reSjHMGB1的二级结构、功能位点及表位特征。在免疫保护性实验中,雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,分别为感染对照组、弗氏佐剂对照组、MontanideISA206佐剂对照组、reSjcHMGB1加弗氏佐剂免疫组、reSicHMGB1加MontanideISA 206佐剂免疫组。感染对照组不注射任何抗原和佐剂,两种佐剂对照组小鼠注射乳化的生理盐水加弗氏或Montanide ISA 206佐剂,两免疫组每只小鼠经背部皮下多点注射乳化的20μg reSjcHMGB1加弗氏或Montanide ISA 206佐剂,共免疫3次,间隔2周。末次免疫后2周,小鼠经腹部感染日本血吸虫尾蚴30±1条,攻击感染后6周剖杀小鼠,进行成虫和虫卵计数。并分别于免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清,ELISA检测血清中特异性IgG抗体。结果,RT-PCR扩增的目的片段经琼脂糖凝胶电泳观察,与预计的一致。TA克隆插入目的片段经核苷酸序列测定,cDNA全长531 bp,编码176个氨基酸。序列分析表明该片段与SmHMGB1基因序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为93%。表达蛋白经SDS-PAGE分析显示,reSjHMG重组蛋白的分子质量约30 kDa（包括6个组氨酸）,以可溶性方式表达。免疫印迹结果显示,日本血吸虫感染小鼠血清、重组抗原免疫小鼠血清和抗His-G HRP抗体均可识别该重组蛋白。生物信息学分析表明该蛋白包含两个保守的结构域（A盒和B盒）及含酸性氨基酸的C末端,同时存在多个潜在的抗原决定簇。在免疫保护性实验中,ELISA结果表明,免疫后重组抗原加两种佐剂免疫组小鼠的特异性IgG抗体水平均显着高于感染对照组和佐剂对照组（P＜0.05）。reSjcHMGB1加弗氏佐剂免疫组减虫率和肝组织减卵率分别为17.9%和17.6%,其虫荷数和每克肝组织虫卵数（EPG）与感染对照组相比均无统计学意义（P＞0.05）。reSjcHMGB1加Montanide ISA 206佐剂免疫组减虫率和肝组织减卵率分别为分别为33.2%和11.3%,其虫荷数与感染对照组相比有统计学意义（P＜0.05）,但与ISA 206佐剂对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。本研究成功克隆、表达SjHMGB1,并获得纯化的重组蛋白。在动物保护性实验中,重组抗原并未诱导小鼠产生明显的抗感染和抗生殖免疫保护作用。
蔡鹏飞[8]（2008）在《日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定》文中提出血吸虫病是世界上严重危害人类健康的寄生虫病之一,流行于世界上76个国家和地区,目前有2亿感染者。流行于我国的日本血吸虫病是所有血吸虫病中防治难度最大的一种。利用吡喹酮治疗在控制该病的过程中起到重要作用,但治疗后的反复感染,及反复化疗可能产生抗药性问题,使得仅靠单一药物治疗无法从根本上控制血吸虫病的传播。研发安全有效的抗血吸虫疫苗,单独使用或结合化疗将极大地推动血吸虫病的防治工作。但早期研制的疫苗,从安全性或保护效果来看并不令人满意。因此,新型抗原的鉴定和新型疫苗的研制是一项十分紧迫的任务。本研究通过生物信息学方法,从日本血吸虫的8个关键抗原中筛查18个表位,其中5个在日本血吸虫中鉴定,其余13个为曼氏血吸虫中鉴定的表位在日本血吸虫中的同源序列。利用表位改组技术成功构建5个不同长度的随机串联多表位人工抗原文库,并证明文库具有良好的表位串联多态性。不同文库免疫小鼠后抗体水平的检测,表明多表位基因的长度对文库的抗原性具有显着的影响。保护性实验结果显示5个文库的保护效果并不理想,可能与所选的多数表位并未在日本血吸虫中得到有效证实有关。文库L2取得部分的抗生殖作用,表明只有合适长度的多表位基因文库才有可能诱导较好的免疫保护作用。通过上述工作,证实新型表位改组技术能应用于不同病原体多表位文库的构建,确定可能诱导保护性免疫反应的多表位基因长度;同时提示要构建具有高保护性的日本血吸虫多表位人工抗原文库,仍有待于保护性表位的鉴定。曼氏血吸虫表膜四次跨膜蛋白家族成员被认为是具有保护潜力的抗原分子,其中是曼氏血吸虫新型抗原TSP-2更是获得高达～60%的保护力,本研究对Sm-TSP-2在日本血吸虫中的同源分子展开鉴定和评估。研究证实日本血吸虫Sj-TSP-2分子存在广泛变异,根据C、D变异区不同,可分为七个亚类,同时存在不同亚类之间重组的杂合分子;三级结果预测显示主要变异区暴露于分子的表面,表明此分子受正选择作用,并提示其配体的多样性;单一成虫RT-PCR显示Sj-tsp-2亚类表达谱在个体成虫中存在极大的差异,以上研究结果提示Sj-stp-2可能参与日本血吸虫的免疫逃避。半定量RT-PCR表明Sj-tsp-2基因在日本血吸虫尾蚴、童虫、雌雄成虫和虫卵中都有不同水平的转录;但Western blot分析显示Sj-TSP-2蛋白并不在虫卵期表达。免疫荧光定位实验表明Sj-TSP-2定位于肺期童虫的表膜,但在天然状态下并不暴露;而活体成虫及冰冻切片免疫荧光实验则证实Sj-TSP-2分子暴露于雌雄成虫的体表。免疫保护实验显示单一Sj-TSP-2亚类重组蛋白不能获得任何的保护效果,所有亚类重组蛋白的混合物也只获得较低的保护力,再次提示Sj-TSP-2分子与免疫逃避相关,变异如此广泛的Sj-TSP-2并不适合成为日本血吸虫的候选抗原。以上工作显示表膜蛋白TSP-2在曼氏血吸虫和日本血吸虫中极大的差异性,说明曼氏血吸虫的保护性抗原,其在日本血吸虫中的同源分子并不一定同样具有保护性;提示在不同环境压力下,日本血吸虫可能采取了不同于曼氏血吸虫的免疫逃避策略,在一定程度上佐证了前一部分的结果,进一步强调日本血吸虫特异的保护性抗原和表位的鉴定对于日本血吸虫疫苗的研制的重要性。
李林[9]（2008）在《Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选》文中指出业已证明,日本血吸虫31/32kDa天然分子抗原,不仅是一种优势诊断抗原,可用于免疫诊断,同时也具有较好的抗雌虫生殖免疫的效果。为了对Sj31/32kDa分子抗原进一步深入分析,我们采用蛋白质组学研究技术,我们建立了日本血吸虫成虫可溶性抗原二维电泳图谱。对Sj31/32kDa附近的蛋白质斑点进行肽指纹图谱、质谱分析,在Sj31/32kDa附近获得了3个同源性较高的蛋白质斑点（11,20,23号）,分别与日本血吸虫-3-磷酸甘油脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate）、曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（Cathepsin B endopeptidase）、曼氏血吸虫肌动蛋白-2（Actine-2）相匹配。有报道表明,血吸虫组织蛋白酶B内肽酶参与对宿主血红蛋白的降解,与血吸虫的生长发育有关,具有潜在的血吸虫病疫苗价值。目前国内外尚未见对该基因研究的相关报道。研究目的确定日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（SjCB）是否能作为抗血吸虫病天然分子基因疫苗的靶标,及其在血吸虫体内是否有期特异性,获得针对日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶的特异性单链抗体,为抗血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原诊断血吸虫病的研究奠定基础。研究方法1.收集尾蚴感染后32d的日本血吸虫成虫,制备成虫可溶性蛋白,经一维电泳、固相pH梯度双向凝胶电泳分离,选取31/2kDa附近的蛋白点进行质谱分析鉴定,凝胶图像分析软件对结果进行处理。2.以血吸虫cDNA文库为模板,设计引物扩增得到目的基因,亚克隆至pcDNA3.0载体;以成虫和尾蚴真核重组质粒分别免疫小鼠,观察其免疫保护性效果。3.将目的基因亚克隆至pQE30载体,将重组质粒转化至感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达融合蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。His-tag标签柱亲和纯化融合蛋白。4.用日本血吸虫成虫可溶性抗原（AWA）免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏RNA,RT-PCR法扩增得到全套VH和VL基因,经重叠PCR法扩增得到scFv片段,将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化至感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07拯救,即获得日本血吸虫成虫可溶性抗原表面呈现单链抗体库。以纯化的目的融合蛋白为靶抗原,分别筛选成虫可溶性抗原单链抗体库和UV-致弱尾蚴单链抗体库,以获得相应的特异性单链抗体。研究结果1.二维电泳结果显示Sj31/32kDa附近有13个蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定及分析,发现3个蛋白分子分别与曼氏血吸虫Actine-2,日本血吸虫3磷酸甘油脱氢酶,曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶有高度的同源性。2.真核重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示二者基因序列具有99%的同源性;动物实验结果表明重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.99%,每雌减卵率为34.45%,每克肠道减卵率为40.18%,每克肝脏减卵率为43.24%;重组质粒尾蚴pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.36%,每雌减卵率为41.00%,每克肠道减卵率为39.30%,每克肝脏减卵率为44.87%,与对照组比较有显着差异（P＜0.05）。而重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB组和尾蚴pcDNA3.0/SjCB组减虫率和减卵率无显着差异（P＞0.05）。3.原核重组质粒成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示融合蛋白表达正确,并得以有效纯化。分别被成虫可溶性粗抗原免疫血清和UV-致弱尾蚴免疫血清识别,而不被正常鼠血清识别。4.构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,库容为4.3×108,重组率为90%,且BstNI酶切图谱呈多样性,初步筛选出了针对成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB表达的融合蛋白的特异性重组噬菌体。结论1.成功构建了成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒以及成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB原核重组质粒,成虫及尾蚴SjCB基因序列无差异;原核重组蛋白具有很好的免疫反应性。2.动物实验结果表明,成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒免疫小鼠后,能诱导产生部分抗日本血吸虫免疫的保护力,证明了日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶是抗日本血吸虫病有效的候选分子之一。3.成功构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,为抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原用于血吸虫病诊断的研究奠定了基础。
翟军军[10]（2007）在《柔嫩艾美耳球虫杨凌株cDNA文库的免疫学筛选及其3-1E基因的克隆与表达》文中研究说明鸡球虫病是由一种或几种鸡艾美耳球虫引起的以肠道病变为主要特征的细胞内寄生虫病,严重危害养鸡业的发展。在各种艾美耳球虫中,寄生在盲肠中的柔嫩艾美耳球虫致病性最强。目前,控制球虫病主要依靠化学药物。然而,由于球虫对许多抗球虫药出现了严重的抗药性,加之药物或抗生素在家禽产品中的残留问题越来越受到消费者的关注,迫使人们寻求防治的新途径。本研究采用免疫学方法对本实验室已经构建的柔嫩艾美耳球虫杨凌株（Eimeria tenella YL）子孢子cDNA表达文库进行筛选,并对克隆的抗原基因进行表达、功能分析和动物免疫保护试验,获得了以下结果。1.利用E. tenella YL阳性血清和兔抗鸡E. tenella YL阳性血清对E. tenella YL子孢子cDNA表达文库进行免疫学筛选,共获得3个阳性克隆,经鉴定,其中一个阳性克隆基因的开放阅读框（ORF）长为513 bp,共编码170个氨基酸。登陆GenBank比较发现,与已报道的E. tenella甘肃株（GS）和E. tenella美国株（US）的3-1E基因ORF序列同源性分别为99.8%和99.4%,与二者氨基酸的同源性分别为98.8%和98.2%,由此确定所获得的目的基因为E. tenella YL的一个新基因。该新基因在GenBank的登录号为:EF069437,被命名为:Eimeria tenella strain YL 3-1E。2.按照pGEX-4T-1载体的特点和克隆位点,设计了含EcoR I和Xho I酶切位点的3-1E基因的特异性表达引物,将3-1E基因克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建了pGEX-3-1E的融合表达的重组载体,转化BL21寄主菌并诱导表达, SDS-PAGE蛋白电泳分析显示,成功地表达了约44.7 ku的融合蛋白,与预测的分子质量大小一致,表达量达到30.0%以上。3.用获得的重组表达抗原免疫雏鸡,观察其对球虫感染的免疫保护效果,结果表明,以可溶性形式表达的重组抗原pGEX-3-1E免疫保护效果相对较好,而pGEX-3-1E包涵体免疫保护效果相对较差。这为研制鸡球虫的基因工程疫苗奠定了基础。
二、日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究（论文提纲范文）
（1）云南大理日本血吸虫部分线粒体基因序列的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的构建及免疫应答的动态观察（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗构建及其表达效率 |
| 第一节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 日本血吸虫重组质粒 pGEX-Sj26GST-Sj32 在大肠埃希菌 BL21(DE3)表达效率的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠免疫应答的动态观察 |
| 第一节 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫BALB/c鼠血清抗体及细胞因子的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞增殖的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞因子动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五节 日本血吸虫重组 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾细胞凋亡的动态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（3）抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1 日本血吸虫疫苗研究进展 |
| 1.1 虫源性疫苗 |
| 1.2 基因工程苗 |
| 1.3 核酸疫苗 |
| 1.4 表位疫苗 |
| 1.5 抗独特性抗体疫苗(antiidiotype antibody vaccine) |
| 2 血吸虫病疫苗研究的问题和展望 |
| 2.1 疫苗研究面临的问题 |
| 2.2 血吸虫病疫苗研究展望 |
| 3 血吸虫体被蛋白的研究 |
| 3.1 体被蛋白结构 |
| 3.2 血吸虫体被的功能 |
| 3.3 体被一些重要的膜蛋白 |
| 3.4 结语 |
| 第二章 日本血吸虫pET32a(+)-Sj23(EC1-EC2) 和pET32a(+)-Sj23(EC2)-Tsp2(EC2)的构建、克隆与表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 日本血吸虫与尾蚴 |
| 1.3 文库、质粒及菌种 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 荧光实时定量PCR 检测Sj23(Genebank ID：BU717012)和Sj-Tsp2(Genebank ID:EF553319)基因的转录时相 |
| 2.2 生物信息学分析 Sj23(Genebank ID：BU717012)和 Sj-Tsp2(Genebank ID:EF553319) |
| 2.3 Sj23(EC1-EC2) 和Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)基因克隆与鉴定 |
| 2.4 pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21, pET32a-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21 的诱导表达 |
| 2.5 融合蛋白pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21, pET32a-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21的western blotting 鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 Sj23 和Sj-Tsp2 基因转录时相的荧光定量PCR 检测结果 |
| 3.2 PCR 扩增目的片段及构建质粒酶切鉴定 |
| 3.3 核酸序列比对 |
| 3.4 目的基因核苷酸序列推测氨基酸序列 |
| 3.5 诱导目的蛋白的表达 |
| 3.5.1 诱导表达pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21 |
| 3.5.2 诱导表达pET32a-SjTsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21 |
| 3.6 pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21 和 pET32a-SjTsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21 蛋白的纯化 |
| 3.7 表达产物抗原性的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫体被蛋白重组抗原的免疫保护试验 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 工程菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫抗原制备 |
| 2.2 重组蛋白免疫BALB/c 小鼠试验 |
| 2.3 小鼠的攻击感染和减虫率，减卵率的计算 |
| 2.4 间接ELISA 方法检测小鼠血清特异性IgG 抗体水平 |
| 2.5 Real-time PCR 分析免疫后虫体目的基因转录 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物免疫保护试验结果 |
| 3.2 间接ELISA 检测小鼠血清IgG 水平 |
| 3.3 Real-time PCR 分析免疫后虫体目的基因转录 |
| 4 讨论 |
| 第四章 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（4）我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景（论文提纲范文）
| 1 疫苗候选抗原分子的筛选与鉴定 |
| 2 DNA疫苗 |
| 3 鸡尾酒疫苗 |
| 4 疫苗佐剂 |
| 5 疫苗研究与我国当前血防控制传染源策略相一致 |
| 6 结语 |
（5）日本血吸虫表膜结构蛋白Annexin基因克隆、表达与免疫保护效果评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 日本血吸虫表膜蛋白的研究 |
| 1.1 日本血吸虫在我国的基本状况 |
| 1.2 疫苗研究尚未突破 |
| 1.3 血吸虫体表被膜的研究进展 |
| 1.3.1 被膜在血吸虫生长发育过程的演变 |
| 1.3.2 被膜与血吸虫的免疫逃避可能有关联 |
| 1.3.3 表膜蛋白的研究受到重视 |
| 1.3.4 重要的国内外已经研究报道过的日本血吸虫表膜相关蛋白 |
| 1.4 总结与展望 |
| 第二章 日本血吸虫Annexin 基因的克隆、表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 日本血吸虫（中国大陆株）成虫 |
| 2.1.3 菌种、质粒和主要试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Sjan 基因克隆 |
| 2.2.2 Sjan 基因原核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 Sjan 基因的表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Sjan 基因的克隆 |
| 2.3.2 重组原核表达质粒Sjan/pET28a 的构建 |
| 2.3.3 Sjan 基因在大肠杆菌中的表达和重组蛋白的纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫Sjan 重组融合蛋白的免疫保护效果评估 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 免疫抗原制备 |
| 3.1.3 小鼠的免疫保护实验 |
| 3.1.4 数据处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的筛选和验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分: 东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的免疫筛选 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 日本血吸虫蛋白质精氨酸甲基转移酶1编码基因的克隆、表达和分析 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 日本血吸虫高迁移率族蛋白B1编码基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 1. pGEM-T easy-SjcPRMT1测序图 |
| 2. pET28a-SjcPRMT1测序图 |
| 3. pGEM-T easy-SjcHMGB1测序图 |
| 4. pET28a-SjcHMGB1测序图 |
| 5. 综述 |
（8）日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 一、基本材料 |
| 1 主要化学试剂及部分耗材 |
| 2 生物学试剂 |
| 3 引物 |
| 4 合成肽 |
| 5 质粒载体 |
| 6 菌株 |
| 7 阳性钉螺 |
| 8 实验动物 |
| 9 血清 |
| 二、主要仪器设备 |
| 三、分析软件 |
| 四、主要溶液配制 |
| 实验方法 |
| 1 常用的分子生物学方法 |
| 2 表位基因DNA人工合成及克隆 |
| 3 多表位基因的随机重组表达文库的构建 |
| 4 多肽合成 |
| 5 RT-PCR |
| 6 日本血吸虫尾蚴、肺期童虫、成虫及虫卵的分离收集 |
| 7 日本血吸虫尾蚴、肺期童虫、成虫及虫卵膜蛋白抽提与分离 |
| 8 SWAP(Soluble worm antigen preparation)制备 |
| 9 重组蛋白表达以及纯化前的细菌处理 |
| 10 蛋白质去内毒素 |
| 11 蛋白质浓度的检测 |
| 12 多克隆抗血清的制备和纯化 |
| 13 普通SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 14 Western Blot |
| 15 酶联免疫吸附测定 |
| 16 间接免疫荧光分析 |
| 17 细胞生物学方法 |
| 18 酶联免疫斑点(ELISPOT) |
| 19 免疫及保护性评估 |
| 实验结果 |
| 第一部分:日本血吸虫随机重组多表位抗原文库构建及保护性评估 |
| 1 单表位基因的选择、设计及克隆 |
| 2 表达B表位-乙肝核心抗原重组蛋白进行表位抗原性分析 |
| 3 利用人工合成多肽分析B表位抗原性 |
| 4 多表位基因的随机组装 |
| 5 多表位基因真核表达文库的构建 |
| 6 多表位基因文库的免疫原性 |
| 7 多表位基因文库的保护性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分:日本血吸虫新型表膜蛋白TSP-2鉴定、表征及评估 |
| 1 日本血吸虫Sj-tsp-2分子的克隆和序列分析 |
| 2 单个成虫Sj-tsp-2亚类转录谱分析 |
| 3 Sj-tsp-2分期转录 |
| 4 Trx-TSP-2亚类重组蛋白的表达和纯化 |
| 5 多克隆抗体制备 |
| 6 各期表膜蛋白制备及Western Blot |
| 7 Sj-TSP-2在肺期童虫和成虫中的定位 |
| 8 免疫学评价 |
| 9 保护性评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一:血吸虫候选抗原表位鉴定 |
| 文献综述二:四次跨膜蛋白分子相互作用及其功能研究进展 |
| 附录Ⅰ:本论文所用的英文缩略语 |
| 附录Ⅱ:硕博连读期间发表的文章和参加的会议 |
| 致谢 |
（9）Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 日本血吸虫31/32kDa抗原的质谱分析及相关编码基因的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶真核质粒的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶真核表达质粒的DNA疫苗免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶原核质粒的构建及初步鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶融合蛋白对SjAWA单链抗体库的初步筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 血吸虫核酸疫苗候选分子的研究进展 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间主要研究成果 |
（10）柔嫩艾美耳球虫杨凌株cDNA文库的免疫学筛选及其3-1E基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 寄生虫CDNA 文库的研究进展 |
| 1.1 CDNA 文库的构建 |
| 1.1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 |
| 1.1.2 对cDNA 文库的分析 |
| 1.2 CDNA 文库的类型 |
| 1.2.1 经典cDNA 文库 |
| 1.2.2 标准化cDNA 文库 |
| 1.2.3 消减cDNA 文库 |
| 1.2.4 染色体区域特异性cDNA 文库 |
| 1.2.5 PCR cDNA 文库与RACE cDNA 文库 |
| 1.2.6 固相cDNA 文库 |
| 1.3 CDNA 文库的应用 |
| 1.3.1 原虫 |
| 1.3.2 蠕虫 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 鸡球虫功能基因组学的研究进展 |
| 2.1 虫体的管家基因 |
| 2.1.1 rRNA 基因 |
| 2.1.2 热休克蛋白基因 |
| 2.2 阶段性虫体抗原基因 |
| 2.2.1 未孢子化卵囊 |
| 2.2.2 孢子化卵囊 |
| 2.2.3 子孢子 |
| 2.2.4 裂殖子 |
| 2.2.5 大配子体 |
| 2.3 细胞器抗原基因 |
| 2.3.1 棒状体 |
| 2.3.2 折光体 |
| 2.3.3 微线蛋白 |
| 2.4 虫体表面抗原基因 |
| 2.4.1 TA4 基因 |
| 2.4.2 3-1E 基因 |
| 2.4.3 cSZ1 基因 |
| 2.4.4 gx5401 基因 |
| 2.4.5 Eam 20 和Eam 45 基因 |
| 2.4.6 Omz5-7 基因 |
| 2.4.7 cmz-8 基因 |
| 2.4.8 1pmc-61f 基因 |
| 2.4.9 p 250 基因 |
| 第三章 球虫疫苗的研究进展 |
| 3.1 鸡球虫疫苗的种类 |
| 3.2 鸡球虫苗免疫的作用特点 |
| 3.3 鸡球虫苗的研究概况 |
| 3.3.1 强毒苗 |
| 3.3.2 弱毒苗 |
| 3.3.3 亚单位疫苗 |
| 3.3.4 重组疫苗 |
| 3.3.5 核酸疫苗 |
| 3.4 展望 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫CDNA 表达文库的免疫学筛选与基因克隆 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂、NC 膜和阳性血清 |
| 4.1.2 仪器和设备 |
| 4.1.3 培养液、培养基及溶液的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 宿主菌的培养 |
| 4.2.2 噬菌体的准备 |
| 4.2.3 免疫学筛选 |
| 4.2.4 目的片段与克隆载体的连接 |
| 4.2.5 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.6 目的片段的序列分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性克隆的筛选结果 |
| 4.3.2 阳性噬斑PCR 扩增结果 |
| 4.3.3 阳性克隆的重组质粒鉴定结果 |
| 4.3.4 目的片段的序列测定及分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 3-1E 基因的表达与功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株、载体和酶 |
| 5.1.2 试剂、NC 膜和阳性血清 |
| 5.1.3 仪器与设备 |
| 5.1.4 培养基和溶液的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 3-1E 基因重组表达载体的构建 |
| 5.2.2 3-1E 基因的诱导表达 |
| 5.2.3 3-1E 基因表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测 |
| 5.2.4 3-1E 基因表达条件的优化 |
| 5.2.5 3-1E 基因编码蛋白结构的预测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组表达质粒pGEX-3-1E 的构建及鉴定 |
| 5.3.2 3-1E 基因表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 5.3.3 不同诱导条件下基因编码蛋白的表达结果 |
| 5.3.4 3-1E 基因及其编码蛋白的结构预测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 外源蛋白质融合表达策略 |
| 5.4.2 外源蛋白质表达部位选择策略 |
| 5.4.3 生物信息学技术分析预测编码蛋白的结构与功能策略 |
| 5.4.4 3-1E 外源蛋白融合表达的特点 |
| 第六章 重组表达抗原对鸡球虫感染的免疫保护效果研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 可溶性蛋白的Western-blotting 分析结果 |
| 6.2.2 蛋白含量 |
| 6.2.3 增重变化 |
| 6.2.4 每克盲肠内容物卵囊数 |
| 6.2.5 盲肠病变记分情况 |
| 6.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语英汉对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究（论文参考文献）
- [1]云南大理日本血吸虫部分线粒体基因序列的初步研究[D]. 余慧. 昆明医科大学, 2013(02)
- [2]日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的构建及免疫应答的动态观察[D]. 向进平. 重庆医科大学, 2013(03)
- [3]抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究[D]. 李晔. 扬州大学, 2010(02)
- [4]我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景[J]. 汪世平,陈秀春,高冬梅. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2009(05)
- [5]日本血吸虫表膜结构蛋白Annexin基因克隆、表达与免疫保护效果评估[D]. 付光伟. 福建农林大学, 2009(12)
- [6]日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达[J]. 袁仕善,孙文霞,杨盛清,唐小异. 湖南师范大学学报(医学版), 2008(04)
- [7]东方田鼠日本血吸虫天然抗性相关基因的筛选和验证[D]. 刁薇. 中国疾病预防控制中心, 2008(05)
- [8]日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定[D]. 蔡鹏飞. 中国协和医科大学, 2008(07)
- [9]Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选[D]. 李林. 中南大学, 2008(01)
- [10]柔嫩艾美耳球虫杨凌株cDNA文库的免疫学筛选及其3-1E基因的克隆与表达[D]. 翟军军. 西北农林科技大学, 2007(06)