一、~(60)Co辐射后IL-2基因修饰肿瘤细胞生物学行为的改变（论文文献综述）
尹起亮[1]（2021）在《IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究》文中研究说明研究背景:随着对肿瘤免疫机制的深入研究,肿瘤免疫治疗成为继手术,化疗,放疗后的又一突破性治疗策略。黑色素瘤免疫治疗是近年来研究的热点,特别是针对细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4,CTLA-4）和程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1,PD-1）的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）,已取得了良好的临床疗效。疫苗作为免疫治疗领域的重要分支,在黑色素瘤中的研究甚少,gp100肽疫苗在体外可产生高水平的循环T细胞,并能识别和杀伤黑色素瘤细胞,但临床疗效仍不理想,因此,有效的肿瘤疫苗可作为黑色素瘤免疫治疗领域的重要补充。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的概念拓宽了我们对黑色素瘤的理解,根据CSCs理论,靶向黑色素瘤干细胞（melanoma stem cells,MSCs）治疗可抑制黑色素瘤的生长并降低肿瘤复发和转移的风险,因此,以MSCs为靶点的肿瘤疫苗将改善目前免疫治疗方案的疗效。然而,利用疫苗刺激机体产生抗肿瘤免疫反应仍然具有很大挑战,单纯的MSCs疫苗尚不足以诱导强烈的抗肿瘤免疫效应,目前在黑色素瘤中的MSCs疫苗研究大多是通过MSCs致敏DCs去诱导保护性抗肿瘤免疫作用,此外,免疫佐剂可增强MSCs疫苗抗肿瘤免疫应答,通过免疫佐剂IL-21基因修饰MSCs作为疫苗免疫小鼠可增强补体依赖的细胞毒活性和NK细胞毒活性。IL-33作为一种多效性免疫效应因子在激活抗肿瘤免疫中发挥重要作用,包括刺激DCs成熟,增强CD8+T细胞和NK细胞肿瘤杀伤作用,增强体内抗原特异性效应T细胞和记忆T细胞免疫反应等,能显着抑制小鼠肿瘤生长和肺转移,同样,IL-33可作为一种有效的免疫佐剂。而利用IL-33修饰的MSCs作为疫苗对黑色素瘤的影响目前尚无报道,其抗肿瘤免疫机制也有待进一步阐释。研究目的:本研究通过制备IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗,旨在研究其抑制黑色素瘤生长和转移的效果,并探索其抗肿瘤的免疫效应机制,为黑色素瘤干细胞疫苗在黑色素瘤免疫治疗中的应用奠定理论和实验基础。研究方法:1.黑色素瘤干细胞疫苗的制备（1）利用免疫磁珠技术分选细胞:利用免疫磁珠从B16F10细胞中分选出B16F10-CD44+CD133+细胞（即黑色素瘤干细胞）和B16F10-CD44-CD133-细胞。（2）分选后黑色素瘤干细胞的鉴定:通过流式细胞术测定分选前后细胞表面CD44,CD133和MHC I的表达;测定细胞克隆形成能力:将分选前后的B16F10和B16F10-CD44+CD133+细胞进行普通的二维（two dimension,2D）和三维（three dimension,3D）培养,观察细胞克隆形成能力;提取分选前后细胞的总RNA,进行RT-q PCR测定干性基因SOX-2,OCT-4和KLF-4的表达。（3）IL-33过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44+CD133+:将状态良好的B16F10-CD44+CD133+接种到6孔盘,第2天加入适当体积的病毒（HBAD-EGFP过表达对照或HBAD-IL33-EGFP）,感染8 h。（4）肿瘤细胞灭活及灭活后鉴定:（1）利用丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）50μg/ml作用肿瘤细胞4 h对其进行灭活,利用MTT法测定不同时间点细胞增殖率;（2）肿瘤细胞经MMC作用后收集细胞上清液,进行酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定IL-33的表达。2.黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价（1）建立预防性动物模型:荷瘤小鼠模型:将不同实验组灭活后的肿瘤细胞（包括等体积PBS）5×105个/次接种于C57BL/6小鼠腹股沟皮下,共免疫3次,每次间隔7天,末次免疫7天后,所有小鼠于背部皮下注射B16F10细胞5×105个,定期测量肿瘤大小;肺转移模型:免疫方式同上,末次免疫7天后,所有小鼠经尾静脉注射5×105个B16F10细胞,观察并记录肺转移情况,记录生存期。（2）肿瘤病理组织学检测:末次免疫后3周,取不同组小鼠肿瘤组织进行病理组织学检测,包括苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,CD8,Ki-67和Caspase-3的免疫组织化学染色。3.黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究（1）疫苗对DCs成熟能力的影响:将小鼠骨髓来源的DCs与不同实验组灭活后的肿瘤细胞（包括等体积PBS）利用悬挂式细胞培养小室间接共培养,共培养4天后,观察DCs形态变化并利用流式细胞术测定细胞表面成熟标志物CD11c,CD80,CD86和MHC II的表达;然后收集DCs并与CFSE标记的脾淋巴细胞以1:10的比例直接共培养6天,通过流式细胞术测定CD8+T细胞CFSE的表达,利用ELISA测定各组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α的分泌。（2）疫苗对脾脏CD8+T细胞的影响:在末次免疫后3周,取不同组小鼠脾脏淋巴细胞,进行流式细胞术,通过测定脾淋巴细胞表面CD3,CD8和CD69的表达检测疫苗对脾脏CD8+T细胞比例及活性的影响;通过测定PD-1,CTLA-4和Tim-3及中心记忆性表型CD44,CD62L和CD127的表达检测疫苗对CD8+T细胞免疫检查点及CD8+中心记忆性T细胞的影响;通过测定细胞内IFN-γ和Gzm B的表达检测疫苗对CD8+T细胞抗肿瘤效应分子表达的影响。（3）疫苗对小鼠脾淋巴细胞杀伤能力的影响:在末次免疫后3周,取不同组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,体外培养的B16F10细胞作为靶细胞;同样,取疫苗组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,B16F10和分选后的B16F10-CD44+CD133+及B16F10-CD44-CD133-细胞作为靶细胞,利用Calcein-AM释放实验测定脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。（4）黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133及MHC I的表达:末次免疫后3周,利用流式细胞术测定不同组小鼠黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133及MHC I的表达。（5）检测小鼠血清细胞因子水平:在末次免疫后3周,取不同组小鼠血清,利用ELISA检测不同组小鼠血清IFN-α,IL-2,TNF-α和IFN-γ的水平。研究结果:利用免疫磁珠技术成功分选出B16F10-CD44+CD133+细胞,其纯度可达到96.14%,并且B16F10-CD44+CD133+细胞的克隆形成能力较强,其干性相关基因SOX-2,OCT-4和KLF-4的表达明显增强,细胞表面MHC I的表达下降。通过IL-33过表达基因腺病毒成功感染B16F10-CD44+CD133+细胞后,利用MMC对其灭活,并测定细胞活性和IL-33的分泌,同时将灭活后的细胞接种到小鼠腹股沟皮下发现未成瘤,最后得到细胞增殖活性受到抑制但仍可分泌IL-33的B16F10-IL-33 CD44+CD133+细胞株,即黑色素瘤干细胞疫苗（以下简称“疫苗”）。在预防性小鼠模型中,疫苗可明显抑制小鼠黑色素瘤生长及肺转移,并诱导黑色素瘤细胞凋亡,荷瘤小鼠模型中疫苗组小鼠中位生存期和总生存期均明显延长（分别为40天和55天）,而在肺转移模型中疫苗组小鼠中位生存期和总生存期的延长时间更加显着（分别为55天和70天）。进一步研究疫苗抗肿瘤的免疫效应机制,我们发现:（1）疫苗可促进小鼠骨髓来源的DCs成熟,诱导DCs成熟标志物表达上调,并且疫苗作用后的DCs可激活CD8+T细胞,包括刺激CD8+T细胞增殖和促进CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α;（2）疫苗免疫小鼠3周后,发现疫苗可增加小鼠脾脏CD8+T细胞比例及活性,并降低免疫检查点的表达,此外,疫苗可诱导脾脏CD8+中心记忆性T细胞的形成并增加CD8+T细胞抗肿瘤效应分子的表达;（3）疫苗免疫小鼠3周后可明显增强小鼠脾脏淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,并且这种杀伤作用特异性强,可靶向杀伤B16F10-CD44+CD133+细胞;（4）疫苗组荷瘤小鼠肿瘤细胞CD44和CD133的表达降低,而MHC I表达增加,并且黑色素瘤组织中CD8+T细胞浸润增加;（5）疫苗可增加免疫后小鼠血清抗肿瘤细胞因子IL-2,IFN-α,TNF-α和IFN-γ的分泌。研究结论:1.从B16F10黑色素瘤细胞成功分选出高纯度、具有干细胞性质的B16F10-CD44+CD133+细胞,并制备出增殖活性受到抑制但仍可分泌IL-33的B16F10-IL-33 CD44+CD133+全细胞疫苗。2.疫苗能明显抑制小鼠黑色素瘤生长和肺转移,诱导肿瘤细胞凋亡,并延长小鼠中位生存期和总生存期。3.疫苗诱导抗肿瘤免疫作用是通过刺激DCs成熟而启动并促进CD8+T细胞增殖,同时抑制CD8+T细胞在体内分化耗竭,诱导记忆性T细胞形成。4.疫苗通过激活宿主体内细胞免疫,增加黑色素瘤组织中CD8+T细胞的浸润,启动细胞毒性T淋巴细胞免疫反应,进而特异性靶向杀伤黑色素瘤干细胞。
董曦文[2]（2021）在《牙髓干细胞对椎间盘退变与类风湿关节炎的免疫调控作用及治疗机制研究》文中研究指明椎间盘退变（IVDD）及类风湿关节炎（RA）是常见的慢性骨关节疾病。二者发病率高,治疗难度大,复发率高,给患者身体健康及生活质量带来较大威胁,为国家社会造成重大经济负担。在两者发病过程中,炎症免疫反应均发挥作用:免疫豁免丧失后,抗原物质暴露并被机体免疫系统识别,激活免疫级联反应,引起免疫病理损伤。间充质干细胞是干细胞疗法中最常见的细胞类型,具有治疗潜力大、免疫原性低、应用范围广的特点。作为间充质干细胞的重要组成类型,牙髓干细胞（DPSCs）具有较强的自我更新能力、突出的免疫调控作用和出色的成软骨/成骨特性。科室前期研究证明,DPSCs能够抑制炎症,促进组织修复,在慢性牙周病软硬组织缺损中发挥较好的治疗作用。由于自身免疫反应在牙周炎的发病过程中同样占据举足轻重的地位。由此,我们推测DPSCs对自身免疫反应相关炎症所致疾病具有潜在免疫调节作用。基于以上因素,我们考虑使用DPSCs对IVDD及RA动物模型进行治疗,分析DPSCs对二者的治疗作用;并通过分离患者原代细胞,研究DPSCs在二者中发挥作用的相关机制。本研究主要分以下四部分进行。第一部分:目的评估DPSCs对大鼠IVDD模型椎间盘结构及细胞外基质的影响。方法使用针刺髓核法构建大鼠IVDD模型,原位注射DPSCs进行治疗。使用Micro-CT对大鼠IVDD病变情况进行影像学评估。使用H&E染色、Masson染色、番红固绿染色和免疫组织化学染色以及Masuda评分和形态结构参数定量分析对大鼠椎间盘病变及细胞外基质进行组织病理学评估。结果Micro-CT结果证明:DPSCs治疗后,椎间盘高度恢复,影像学表现良好。组织病理学结果证实:DPSCs治疗后,椎间盘组织结构趋于恢复,纤维环与髓核界限清楚,髓核细胞数量恢复;软骨终板肥厚及髓核萎缩均有所缓解;髓核中II型胶原（Col II）分泌增加,细胞外基质增多。结论DPSCs促进IVDD动物模型椎间盘结构恢复及细胞外基质产生。第二部分:目的分析DPSCs培养上清对椎间盘突出患者原代髓核细胞基因表达及信号通路的影响,明确DPSCs治疗后髓核细胞变化的分子机制。方法使用DPSCs上清处理患者原代髓核细胞后进行转录组测序。通过对测序结果进行生物信息学分析,找出差异表达基因（DEGs）及富集的信号通路。使用Western blotting及免疫荧光染色验证测序结果并分析髓核细胞表型变化。结果转录组测序结果证明:DPSCs上清处理后,炎症相关基因如IL6、CCL7、IL1RL1、TNFAIP6等明显下调,髓核细胞功能相关基因如PIK3R1、ITGA10、IGFBP2和LEP等明显上调;GO分析提示,炎性因子分泌及结合过程减弱,细胞外基质分泌增强;Pathway富集分析提示,上调基因主要富集到与细胞外基质分泌相关的信号通路（如弹性纤维和胶原蛋白产生相关信号通路）,下调基因主要富集与炎症相关的信号通路（如Jak-STAT信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路等）。Western blotting结果证实:DPSCs上清处理后,髓核细胞IL-6分泌减少,Col II分泌增加,细胞凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3表达降低;NF-κB及STAT3信号通路活化降低,Akt信号通路活化增加。免疫荧光染色证明:DPSCs培养上清处理后,髓核细胞F-actin组成的丝状骨架结构相对完整,降解较少,细胞凋亡水平降低,功能保持完好。结论DPSCs上清处理抑制髓核细胞炎症相关信号通路活化,减少炎性因子释放,保护髓核细胞存活及功能。第三部分:目的评估HGF修饰的DPSCs（DPSCs-HGF）及对照基因修饰的DPSCs（DPSCs-Null）治疗对小鼠胶原诱导关节炎（CIA）模型临床表现、病理学和影像学的影响。方法使用腺病毒载体在DPSCs中过表达具有免疫调控及免疫耐受重建作用的HGF分子,构建DPSCs-HGF细胞。静脉注射DPSCs-HGF细胞、对照细胞DPSCs-Null细胞或PBS治疗CIA模型。对CIA小鼠临床表现进行评分。使用H&E染色及Kreen评分标准对CIA小鼠关节滑膜炎进行组织病理学评估。使用Micro-CT对关节骨质破坏情况进行影像学评估。结果临床评分结果证明:DPSCs-Null治疗组小鼠关节肿胀相对较轻,关节表面红疹较少;DPSCs-HGF治疗组早期,小鼠临床评分较低,在治疗中后期小鼠关节炎评分迅猛升高。组织病理学结果证实:DPSCs-Null治疗组能够有效降低滑膜炎的严重程度;DPSCs-HGF治疗组实验终点关节腔内浸润炎症细胞增多,关节滑膜衬里层增厚,滑膜局部细胞密度增加。Micro-CT结果证明:DPSCs-Null及DPSCs-HGF治疗后,骨质破坏均有所缓解,二者无统计学差异。结论DPSCs-Null治疗能够减轻CIA小鼠临床表现,改善关节滑膜炎;DPSCs-HGF治疗早期对CIA小鼠临床症状有益,后期发生病情反弹,总体并无较好收益。第四部分:目的明确DPSCs-HGF治疗CIA小鼠关节炎后期发生病情反弹的机制。方法使用流式细胞术分析治疗后不同时间点CIA小鼠外周血免疫细胞亚型。使用多因子检测技术分析治疗后不同时间点CIA小鼠外周血炎症因子表达水平变化。使用免疫组织化学染色分析治疗后CIA小鼠关节局部IL-6分子表达。分离患者原代滑膜细胞后,使用HGF和/或抑制剂进行处理。通过细胞克隆形成实验、Western blotting及细胞周期染色实验分析髓核细胞增殖活性、凋亡情况、细胞周期等生物学特性变化。结果CIA小鼠外周血及关节免疫分析结果证明:DPSCs-HGF治疗后,小鼠外周血Treg细胞比例较早出现升高,但维持时间较短;且外周血Th1/Th2细胞比例升高;血清及关节局部IL-6分子在治疗后期迅猛增加;DPSCs-Null治疗后,小鼠Treg细胞比例升高现象出现相对晚,但升高幅度大,维持时间长;外周血Th1/Th2细胞比例较低;血清及关节IL-6保持较低水平。滑膜细胞离体实验证明:HGF分子以时间和剂量依赖性的方式促进滑膜细胞IL-6的分泌;DPSCs-HGF培养上清或外源补充HGF分子通过活化c-Met受体及下游Akt信号通路,诱导Survivin分子表达,增强滑膜细胞克隆形成能力和凋亡抵抗能力;使用抑制剂抑制c-Met、Akt分子活化或减少Survivin分子表达后,滑膜细胞出现G2/M期阻滞,CDK1及Cyclin B1分子表达降低,HGF引起的滑膜细胞克隆形成能力提高和凋亡抵抗能力增强被有效抑制。结论DPSCs-HGF治疗CIA模型,在疾病早期诱导Treg细胞上调,减少IL-6细胞因子分泌,控制关节炎临床表现;在疾病中后期,HGF分子通过激活c-Met受体,活化下游Akt信号通路,诱导Survivin蛋白表达,促进滑膜增殖及凋亡抵抗,加速关节炎的恶化。基于上述内容,本研究系统阐明:（1）DPSCs通过抑制髓核细胞炎症相关信号通路活化,减少炎性因子释放,保护髓核细胞存活及功能以及促进椎间盘结构恢复,发挥治疗IVDD的潜在作用。（2）DPSCs通过增加免疫抑制性Treg细胞,降低炎性Th1细胞比例及IL-6分泌水平以及控制滑膜炎症,发挥治疗RA的潜在作用。（3）HGF在治疗早期通过抑制免疫系统,发挥控制关节炎的作用;在治疗中后期,HGF通过激活滑膜细胞c-Met受体,活化下游Akt信号通路,促进滑膜细胞增殖及凋亡抵抗,发挥促进关节炎进展的作用。
曹韪凡[3]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中提出近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
李浩淼[4]（2020）在《LncRNA SNHG1调控食管鳞状细胞癌发展进程的机制研究》文中提出食管癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率在全世界恶性肿瘤发病率中排名第八位。食管癌在我国也具有较高的发病率。依据食管癌病理类型的不同,可将其分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）。其中,我国约有 90%的食管癌患者为ESCC。由于食管癌早期发病症状不明显,并且缺乏有关食管癌的早期筛查方法,多数患者在就诊时就已经处于中晚期,患者治疗疗效和预后较差。目前,食管癌的发病机制尚不十分明确,因此,深入研究食管癌发病机制并寻找早期诊断的分子生物标记物和临床治疗的潜在作用靶点,对提高食管癌患者生存质量和改善预后具有十分重要的意义。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）是一类长度大于200个核苷酸但不编码蛋白质的RNA,可在转录、转录后、表观异常等多个水平调控基因表达。随着研究的深入,发现LncRNA在多种肿瘤中异常表达,这些异常表达的LncRNA可影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为,与肿瘤的发生发展关系密切,可用作肿瘤诊断的分子标志物以及判断患者预后。研究显示,LncRNA SNHG1在结肠癌、肺癌和前列腺癌等多种肿瘤中高表达,参与肿瘤发生发展过程。但是,SNHG1是否调控ESCC的发展过程及作用机制的相关研究还很少见。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一类长度为18～25个核苷酸的单链小分子RNA,其可与特定的mRNA结合或者调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因的表达,广泛的参与各种生理和病理过程。miR-204定位与人9号染色体,在乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、食管癌等多种肿瘤中异常表达,参与肿瘤的发生和发展。近年来研究表明,LncRNA和miRNA之间还存在密切的相互作用,两者共同参与疾病的发生和发展。通过生物信息网站预测发现,SNHG1与miR-204基因序列存在结合位点,miR-204可能是SNHG1的靶基因。SNHG1能否调控miR-204表达影响ESCC细胞的生物学行为也还未知。生物信息学软件预测还显示,同源异型盒基因8（HOXC8）是miR-204的靶基因。研究显示,HOXC8参与非小细胞肺癌、等肿瘤细胞的增殖、生长和迁移,与肿瘤发生发展密切相关。有报道称,HOXC8高表达的ESCC患者中位生存时间显着低于HOXC8低表达患者,HOXC8表达是ESCC患者预后的独立影响因素,可用作ESCC的预后标志物。但是,HOXC8在ESCC组织和细胞中表达水平及其对ESCC细胞生物学行为的影响也还未知。因此,为了明确SNHG1在ESCC中的作用及可能的作用分子机制,本研究进行了以下三部分研究:第一部分:首先检测了 SNHG1在ESCC组织中的表达,分析了其表达与患者临床病理特征的关系;检测ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150和Eca109中SNHG1的表达水平,并观察下调SNHG1表达对EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响;第二部分:以miR-204/HOXC8轴为切入点,探究SNHG1影响EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭的分子机制;第三部分:通过建立食管鳞癌移植瘤裸鼠模型,探讨了 SNHG1对食管鳞癌移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。第一部分SNHG1在ESCC中的表达及其对细胞生物学行为的影响背景:LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,其在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。研究显示,肿瘤中异常表达的lncRNA与患者临床病理特征以及预后密切相关,可作为肿瘤诊断、预后判断的分子生物学标记物。研究显示,SNHG1在结直肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤的发生和发展过程,是肿瘤诊治的潜在生物学标志物。目前,SNHG1在食管鳞状细胞癌中表达的研究相对较少。目的:探索LncRNA SNHG1在食管鳞癌组织及细胞中的表达情况及对食管鳞癌细胞的生物学行为的影响。方法:收集53例ESCC患者的癌组织及对应癌旁组织标本,qRT-PCR法检测SNHG1在ESCC癌组织和癌旁组织中的表达水平。根据ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平的均值,将ESCC患者分为SNHG1高表达组和低表达组,卡方检验分析SNHG1表达与ESCC患者年龄、性别、TNM分期、肿瘤位置及预后的相关性。比较不同年龄、性别、TNM分期和肿瘤位置ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平。体外培养正常食管上皮细胞Het-1A和ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平,qRT-PCR检测细胞中SNHG1表达水平。EC9706和KYSE150细胞分为空白组、si-NC组和si-SNHG1组,si-NC组和si-SNHG1组分别转染si-NC、si-SNHG1,空白组不做任何处理。应用qRT-PCR法检测转染后细胞中SNHG1表达水平,流式细胞术检测转染后EC9706和KYSE150细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭。结果:（1）qRT-PCR结果显示,ESCC组织中SNHG1表达水平显着高于对应癌旁组织（P<0.05）。（2）SNHG1表达与ESCC患者TNM分期及预后关系密切（P<0.05）,与ESCC患者年龄、性别和肿瘤位置无关（P>0.05）。（3）ESCC患者TNM分期越高,癌组织中SNHG1表达水平越高。而不同年龄、性别和肿瘤位置的ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平比较无统计学意义（P>0.05）。（4）与 Het-1A 细胞比,ESCC 细胞系 EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平均显着升高（P<0.05）。并且ESCC细胞系之间比较,EC9706和KYSE150细胞中SNHG1表达水平相对较高,因此,选择EC9706和KYSE150细胞作为后续实验研究对象。（5）与 si-NC 组相比,si-SNHG1组EC9706 和 KYSE150 细胞中 SNHG1 表达水平显着降低（P<0.01）,G0-G1期细胞百分比显着升高（P<0.01）,S期显着降低（P<0.01）,细胞凋亡率显着升高（P<0.001）,细胞0D值显着降低（P<0.001）,细胞迁移和侵袭数量显着减少（P<0.01）。空白组与si-NC组各检测指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:SNHG1在ESCC患者癌组织中呈高表达,其高表达与患者TNM分期及预后关系密切。SNHG1在ESCC细胞系中呈高表达,下调SNHG1表达可阻滞EC9706和KYSE150细胞周期进程,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第二部分SNHG1对ESCC细胞生物学特性影响的机制研究背景:LncRNA和miRNA均作为重要的基因表达调控分子在肿瘤的发生和发展中扮演重要角色,它们之间还存在密切的相互作用,两者之间的相互作用参与了众多疾病的发生和发展。研究发现,LncRNA可作用于miRNA影响肿瘤的发生和发展过程。通过生物信息网站预测发现,SNHG1与miR-204基因序列存在结合位点,miR-204可能是SNHG1的靶基因。生物信息学软件预测还显示,同源异型盒基因8（HOXC8）是miR-204的靶基因。同源异型盒基因（HOX基因）起初是在研究果蝇胚胎发育的过程中发现的,目前,已被鉴定出的HOX基因有39个。HOX基因家族成员均编码其对应的转录因子,在一系列基因的表达过程中发挥调控作用。HOX基因编码的蛋白质形成一个转录因子调控网络。在机体正常的生命活动中,参与细胞的通讯过程,当HOX基因编码的蛋白质发生改变后可导致肿瘤的产生。HOXC8在ESCC组织和细胞中表达水平及其对ESCC细胞生物学行为的影响以及miR-204能否通过调控HOXC8表达影响ESCC细胞的生物学行为还未知。目的:以miR-204/HOXC8轴为切入点,探讨SNHG1对ESCC细胞系EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响的分子机制。方法:qRT-PCR法检测ESCC组织和癌旁组织中miR-204和HOXC8 mRNA表达水平。体外培养正常食管上皮细胞Het-1A和ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平,qRT-PCR法检测细胞中miR-204和HOXC8 mRNA表达水平。Starbase生物信息学软件预测SNHG1与miR-204序列存在结合位点,HOXC8的3’UTR与miR-204序列存在结合位点。双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀（RIP）实验验证EC9706和KYSE150细胞中SNHG1与miR-204及miR-204与HOXC8的靶向调控关系。EC9706和KYSE150细胞分为pcDNA组（转染空载体）、SNHG1组（转染SNHG1过表达载体）、si-NC组（转染乱序无意义阴性序列）和si-SNHG1组（转染SNHG1小干扰RNA）,qRT-PCR法检测上调或下调SNHG1对细胞中miR-204表达水平的影响。EC9706 和 KYSE150 细胞分为 miR-204 组（转染 miR-204 模拟物 mimics）、miR-NC 组（转染 mimics 对照序列）、si-SNHG1+anti-miR-204 组（共转染 SNHG1小干扰 RNA 和 miR-204 抑制剂）和 si-SNHG1+anti-miR-NC 组（共转染 SNHG1小干扰RNA和抑制剂阴性对照序列）,流式细胞术检测各组EC9706和KYSE150细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8检测各组细胞增殖,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭。EC9706 和 KYSE150 细胞分为 miR-204 组（转染 miR-204 模拟物 mimics）、miR-NC组（转染mimics对照序列）、anti-miR-204组（转染miR-204抑制剂）和ani-miR-NC组（转染抑制剂阴性对照序列）,Western Blot检测上调或下调miR-204对细胞中HOXC8蛋白表达的影响。EC9706 和 KYSE150 细胞分为将 miR-204+pcDNA 组（共转染 miR-204 mimics 与空载体）和 miR-204+HOXC8 组（共转染 miR-204 mimics 与 HOXC8过载体载体）,Western Blot检测各组细胞中HOXC8蛋白表达水平,流式细胞术检测各组细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8检测各组细胞增殖,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭。结果:（1）与 Het-1A 细胞比,ESCC 细胞系 EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中miR-204表达水平均显着降低（P<0.05）,HOXC8 mRNA表达水平均显着升高（P<0.05）。与癌旁组织相比,ESCC癌组织miR-204表达水平均显着降低（P<0.05）,HOXC8 mRNA表达水平均显着升高（P<0.05）。（2）双荧光素酶报告基因结果显示,与质粒SNHG1-WT共转染,miR-204组的荧光素酶活性显着低于miR-NC组（P<0.001）;与质粒SNHG1-MUT共转染,miR-204组的荧光素酶活性与miR-NC组比较无统计学意义（P>0.05）。RNA免疫共沉淀（RIP）实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-204组捕获的SNHG1量显着升高（P<0.001）。（3）与pcDNA组相比,SNHG1组EC9706和KYSE15细胞中miR-204表达水平显着降低（P<0.001）;与si-NC组相比,si-SNHG1组EC9706和KYSE150细胞中miR-204表达水平显着升高（P<0.001）。（4）与 miR-NC 组相比,miR-204 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中 miR-204 表达水平显着升高（P<0.01）,G0-G1期细胞百分比显着升高（P><0.01）,S期显着降低（P<0.01）,细胞凋亡率显着升高（P<0.001）,OD值显着降低（P<0.001）,细胞迁移和侵袭数量显着减少（P<0.01）。与si-SNHG1+anti-miR-NC组相比,si-SNHG1+anti-miR-204 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中 miR-204 表达水平显着降低（P<0.01）,G0-G1期细胞百分比显着降低（P<0.01）,S期显着升高（P<0.01）,细胞凋亡率显着降低（P<0.001）,OD值显着升高（P<0.001）细胞迁移和侵袭数量显着增多（P<0.01）。（5）双荧光素酶报告基因结果显示,与质粒HOXC8-WT共转染,miR-204组的荧光素酶活性显着低于miR-NC组（P<0.001）;与质粒HOXC8-MUT共转染,miR-204组的荧光素酶活性与miR-NC组比较无统计学意义（P>0.05）。RNA免疫共沉淀（RIP）实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-204组捕获的HOXC8表达量显着升高（P<0.001）。（6）与 miR-NC 组相比,miR-204 组 EC9706 和 KYSE15 细胞中 HOXC8 蛋白表达水平显着降低（P<0.001）;与 anti-miR-NC 组相比,anti-miR-204 组EC9706和KYSE150细胞中HOXC8蛋白表达水平显着升高（P<0.001）。（7）与 miR-204+pcDNA 组相比,miR-204+HOXC8 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中HOXC8蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,G0-G1期细胞百分比显着降低（P<0.01）,S期显着升高（P<0.01）,细胞凋亡率显着降低（P<0.001）,OD值显着升高（P<0.001）细胞迁移和侵袭数量显着增多（P<0.01）。结论:miR-204在ESCC组织和细胞系中均呈低表达,HOXC8 mRNA呈高表达。EC9706和KYSE15细胞中SNHG1靶向负调控miR-204表达,miR-204靶向负调控HOXC8表达。下调SNHG1通过靶向miR-204下调HOXC8蛋白表达,阻滞ESCC细胞周期进程,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第三部分SNHG1对食管鳞状细胞癌裸鼠体内移植瘤影响背景:食管鳞状细胞癌的发生发展多是由于基因的异常表达引起的。随着人类基因技术的快速进步,通过对基因分子水平的改变及不同基因间的相互关系的研究,探讨某种基因变化与肿瘤发生和发展之间的关系,直接通过调控异常表达的基因可达到治疗肿瘤的目的。短发夹状干扰RNA（shRNA）技术是一种新兴的基因治疗技术,其在基因分子水平沉默异常表达的癌基因,进而实现能够有效且特异性抑制肿瘤生长的作用。自shRNA技术被发现以来,已经在肿瘤基因治疗研究领域被广泛的应用。目的:通过构建重组慢病毒表达载体sh-SNHG1,进一步进行裸鼠体内研究实验,旨在说明SNHG1被干扰抑制后对食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的生长有无影响。方法:建立食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠分为Empty组:接种EC9706细胞;sh-NC组:接种转染sh-NC的EC9706细胞;sh-SNHG1组:接种转染sh-SNHG1 的 EC9706 细胞。观察裸鼠皮下移植瘤生长,每周测量移植瘤长、短径计算瘤体体积,并绘制移植瘤生长曲线。5周后脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤并称重。qRT-PCR检测移植瘤组织中SNHG1和miR-204表达,Western blot法和免疫组化法检测移植瘤组织中HOXC8蛋白表达。结果:（1）与Empty组、sh-NC组相比,sh-SNHG1组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,瘤体体积和重量显着减小（P<0.05）。（2）与Empty组、sh-NC组相比,sh-SNHG1组裸鼠皮下移植瘤组织中SNHG1表达水平显着降低（P<0.05）,miR-204表达显着升高（P<0.05）,HOXC8蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。结论:沉默SNHG1通过上调miR-204表达进而抑制HOXC8蛋白表达,抑制食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的生长。全文结论:（1）LncRNA SNHG1在食管鳞癌组织以及食管鳞癌细胞系中高表达,属于促癌基因;（2）LncRNA SNHG1通过靶向miR-204表达,进而促进HOXC8蛋白表达,促进ESCC细胞的细胞周期进程、增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡。
于兰[5]（2020）在《食管癌阴性淋巴结数目与患者预后相关性以及食管癌免疫治疗相关研究》文中研究说明中文摘要第一部分胸段食管鳞癌根治术后阴性淋巴结数目与患者预后的相关性分析研究背景食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率以及死亡率分别占全世界恶性肿瘤的第七位和第六位。亚洲以及非洲东、南部地区高发。2015年,我国新诊断食管癌患者47.79万例和食管癌相关死亡患者37.5万例。食管癌的主要病理类型是腺癌和鳞癌,以鳞癌为主,中国患者鳞癌占90%以上。近年来,尽管食管癌在多学科综合治疗方面取得了较大进展,但手术根治切除仍是目前唯一能治愈食管癌的治疗方式。目前研究已证实,淋巴结转移的数目是食管癌患者重要的独立预后因素。而术中淋巴结的清扫程度反映了淋巴结转移数目的准确性,同时一定程度上反映了术后病理分期的准确性。虽然第七版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）分期系统建议,为了更准确地对食管癌根治术后患者进行分期,至少清扫15个淋巴结,但目前对于食管癌根治术中淋巴结清扫的最佳范围和数目仍存在争议。近年来,阴性淋巴结（negative lymph nodes,NLNs）数目在乳腺癌、胃癌以及结直肠癌中被证实比转移的阳性淋巴结数目更准确的判断患者预后,成为预测患者预后的重要指标。部分研究者分析了 NLNs数目和食管癌患者生存预后的关系,Greenstein等研究发现对于淋巴结阴性的食管腺癌患者,NLNs计数的增加与患者长期生存有关,而对于鳞癌患者,NLNs计数的增加与患者长期生存无关。另一项研究表明,在淋巴结阳性的食管癌患者中,NLNs计数的增加是患者预后的有利因素,而在淋巴结阴性的患者中则未显示NLNs计数与患者预后相关。吴等对429例接受二野淋巴结清扫术的食管癌患者进行了分析研究,结果显示NLNs是淋巴结阴性食管癌患者的独立预后指标。这些研究结果之间存在差异性,结论存在争议。因此,本研究通过对食管癌根治术后胸段鳞癌患者的回顾性分析,探讨NLNs数目与患者预后的相关性,探索NLNs在食管癌术后患者中的临床作用。方法本研究回顾性分析了 2009年1月至2012年12月在山东大学齐鲁医院胸外科接受根治性食管癌切除术的579例胸段食管鳞癌患者。入组标准:患者年龄40～70岁;经组织病理学证实为胸段食管鳞癌;术前未接受过放疗、化疗和/或靶向治疗;无第二原发肿瘤病史;术前检查完善,包括上消化道造影、胸腹部增强计算机体层摄影（computed tomography,CT）、颈部超声、胃镜以及颅脑磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）;手术完全切除（R0）;临床资料完整,至少随访3年或者患者死亡;生存期>3个月。排除标准:非食管癌相关性死亡患者;非R0切除;颈段食管癌;失访患者。根据患者NLNs数目不同,将患者分为4组,分别为0～9、10～14、15～19和≥2 0。随访时间截止到2015年12月30日。采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析。对数秩（Log-rank）检验进行单因素分析,Cox回归模型进行多因素分析。单变量分析变量包括年龄、性别、肿瘤长度、肿瘤分化程度、肿瘤位置、T分期、N分期以及NLNs数目。多因素分析包括肿瘤长度、T分期、N分期和NLNs数目。患者生存时间定义为自手术日期到患者随访截止或死亡日期。生存分析采用Kaplan-Meier方法。所有P值双侧检验,P值<0.05表示具有统计学意义。结果1.患者生存情况所有患者均接受了随访,中位随访时间为36个月（3～80个月）。患者中位生存时间（median survival time,MST）36 个月,3 年生存率（overall survival,OS）为 50.8%。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者 3 年 OS 分别为 86.1%、53.7%、31.6%（χ2=67.604,P=0.000）。579例患者中0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为13个月、27个月、39个月和47个月,3年OS分别为21.7%、40.0%、61.2%和77.5%（χ2=120.475,P=:0.000）。淋巴结阴性组患者344例,0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为18个月、36个月、42.5月和48个月,3年 OS 分别为 34.9%、50.9%、65.6%和 89.0%（χ2=35.284,P=0.000）。淋巴结阳性组患者235例,0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为12个月、22个月、36个月和45个月,3年OS分别为14.3%、19.3%、51.8%和68.9%（χ2=67.604,P=0.000）。2.患者预后因素分析单因素分析显示,性别（P=0.023）、肿瘤长度（P=0.000）、肿瘤分化程度（P=0.011）、T 分期（P=0.000）、N 分期（P=0.000）以及 NLNs（P=0.000）是影响胸段食管鳞癌术后患者3年总生存率的显着因素。多因素分析显示,肿瘤长度（P=0.042）、T 分期（P=0.000）、N 分期（P=0.000）和 NLNs（P=0.000）是影响胸段食管鳞癌术后患者3年总生存率的显着因素。结论NLNs数目是影响胸段食管鳞癌根治术后患者生存的独立预后指标。建议在控制手术并发症前提下,增加食管癌淋巴结清扫数目,以提高患者的生存。中文摘要第二部分EpCAM在食管癌中的表达以及与免疫治疗相关性研究研究背景食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,对于可手术切除的食管癌,治疗以根治性切除术为主,但局部复发和远处转移是术后患者治疗失败的主要原因。而且约2/3的患者在确诊时已为局部晚期或出现远处转移,失去手术机会,全身化疗联合局部放疗是目前晚期食管癌的主要治疗手段,然而全身化疗后很快出现耐药和治疗失败,患者预后差,总体5年生存率（overall survival,OS）仍保持在15～25%。研究报道食管癌干细胞的存在是肿瘤放化疗抵抗以及治疗失败的主要原因。这部分细胞亚群具有无限增殖、高侵袭性、高致瘤性和多重耐药性等干细胞特性,导致治疗失败。因此,寻找有效的药物针对这部分放化疗抗拒的细胞亚群是治疗食管癌这一致命癌症的关键。上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）目前被认为是重要的癌症生物标志物之一,主要表达在上皮肿瘤中表达,同时也过表达于某些肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）,也被认为是某些恶性肿瘤干细胞的标记物。而EpCAM在食管癌干细胞中的表达情况尚不清楚。Solitomab是一种EpCAM/CD3双特异性单链抗体构建体,可同时与表达EpCAM的肿瘤细胞和T细胞相结合,从而激活机体免疫系统的T细胞,起到杀伤肿瘤细胞的目的。研究已经显示Solitomab对结肠癌、胰腺癌以及子宫肉瘤等细胞系有杀伤抑制作用。然而关于Solitomab对食管癌细胞的作用,目前尚未见报道。因此,本研究选取以无血清培养基诱导的食管癌Eca109细胞球为研究对象,分别进行食管癌细胞球的体外增殖、克隆、侵袭性和多药耐药实验以及EpCAM表达水平的检测,并进步观察双特异性抗体Solitomab联合γδT细胞对食管癌细胞球的细胞毒性作用,从而探索有效的食管癌免疫药物。方法1.无血清成球培养法培养Eca109细胞球,镜下和流式细胞仪比较野生型Eca109细胞和Eca109细胞球细胞形态的区别;2.3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4,5-DimethylthiaZOL-2-y1）-2,5-DIPHenyltetrazolium bromide,MTT）法和克隆形成实验检测并比较两组细胞的体外增殖能力;3.Transwell侵袭实验检测并比较两组细胞的侵袭能力;4.MTT法检测并比较两组细胞在纳米白蛋白结合型紫杉醇（Nab-PTX）和顺铂作用后的细胞存活比例;5.流式细胞仪检测EpCAM在两组细胞中的表达水平;6.流式细胞仪检测双特异性抗体Solitomab联合γδT细胞对野生型Eca109细胞和Eca109细胞球的细胞毒性作用。结果1.Eca109细胞在无血清培养基中培养3天后逐渐形成悬浮生长的细胞球,培养至第12天可传代,第2代细胞球形成时间比第1代快,而且体积小,形态规则。流式细胞仪分析可见Eca109细胞球较野生型Eca109细胞的FSC和SSC值偏低,提示Eca109细胞球细胞体积较小,细胞内颗粒较少。2.MTT法和克隆形成实验显示Eca109细胞球细胞的体外细胞增殖率和>50个细胞数的克隆形成率均明显高于野生型Eca109细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Eca109细胞球细胞较野生型Eca109细胞穿过Matrigel基质胶到达滤膜的细胞数多,差异存在统计学意义（P<0.05）。4.MTT法显示不同浓度Nab-PTX和顺铂作用下,Eca109细胞球细胞的存活率均比野生型Eca109细胞高,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.流式细胞仪检测显示野生型Eca109细胞和Eca109细胞球细胞均表达EpCAM,细胞球细胞的表达水平高于野生型Eca109细胞。6.将培养γδ T细胞分别与野生型Eca109细胞以及Eca109细胞球细胞共培养,结果显示不加Solitomab时,γδ T细胞对野生型Eca109细胞或Eca109细胞球细胞的细胞毒作用无明显差别（P>0.05）;加入Solitomab后,γδT细胞能够显着增强对二者杀伤的同时,γδ T细胞对Eca109细胞球细胞的毒性作用明显高于野生型Eca109细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.食管癌Eca109细胞球具有较强的增殖、侵袭能力以及多药耐药等干细胞特性,可能含有较高比例的食管癌干细胞;2.食管癌Eca109细胞球高表达EpCAM,EpCAM可能是食管癌干细胞的标志物之一;3.EpCAM可能是潜在的食管癌免疫治疗分子靶点,Solitomab有可能成为化疗抗拒的食管癌免疫治疗的有效药物。
黄艳平[6]（2019）在《K562工程细胞系的构建及对NK-92细胞体外扩增的研究》文中研究说明目的:用分子克隆技术构建3种慢病毒载体,并用以它们为媒介制备的基因修饰的K562细胞系作为饲养层细胞,在体外扩增出高细胞毒活性的NK-92细胞,为后续CAR-NK-92细胞的体外扩增提供实验依据。方法:在慢病毒载体pWPI含有报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的基础上,分别插入目的基因白细胞介素-15（Interleukin-15,IL-15）、白细胞介素-21（Interleukin-21,IL-21）和4-1BB配体（4-1BB ligand,4-1BBL）,构建出3种慢病毒表达载体。慢病毒包膜蛋白质粒VSV-G、包装质粒ps PAX2、慢病毒表达载体4-1BBL分别和慢病毒表达载体IL-15、IL-21共转染HEK293FT细胞,浓缩2种细胞培养上清液,得到慢病毒液,并用慢病毒液感染K562细胞。利用显微注射技术挑选并扩大培养得到能够稳定表达GFP基因的K562细胞,经丝裂霉素C（Mitomycin C,MMC）处理后作为饲养层细胞,体外扩增NK-92细胞。通过CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测体外扩增后NK-92细胞毒性,乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放法检测NK-92细胞活性,酶联免疫分析（ELISA）检测NK-92细胞上清中γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）的水平,验证扩增后NK-92细胞的功能及安全性。结果:酶切鉴定和测序结果证明3种慢病毒载体构建成功;通过荧光显微镜观察到2组慢病毒表达载体转染HEK293FT细胞以及慢病毒液感染K562细胞后GFP的表达;流式结果显示两组细胞中,4-1BBL的阳性表达率均较高;终浓度为10μg/ml的MMC溶液处理K562细胞3 h可以得到良好的饲养层细胞;IL-15组K562细胞作为饲养层细胞扩增出更多数量的NK-92细胞;CCK-8结果显示随着效靶比的逐渐增加,IL-15组作为饲养层细胞扩增后的NK-92细胞毒性高于其余各组（P<0.05）;效靶比为10:1时,IL-15组细胞上清中LDH的活性、IFN-γ的含量有所升高（P<0.05）。结论:构建含有报告基因GFP和目的基因IL-15、IL-21、4-1BBL的慢病毒载体与慢病毒包装载体制备的慢病毒液感染K562细胞后,表达绿色荧光蛋白和目的基因IL-21/4-1BBL的K562细胞系构建成功。IL-15和4-1BBL联用制备出的K562细胞作为饲养层可体外扩增出高细胞毒活性和有效抗肿瘤细胞A549细胞活性的NK-92细胞。
文钦[7]（2017）在《CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制》文中研究表明背景:造血干细胞移植是治疗急性白血病的有效手段,自体造血干细胞移植具有适用范围广、费用较少、安全性高等优点,但是移植后患者的复发率较高。微小残留病（Minimal Residual Disease,MRD）清除不彻底是其根源。造血微环境对白血病的生长、支持、庇护是白血病残留的重要因素。基质细胞是造血微环境的主要成分,具有调控白血病细胞生长、浸润,介导白血病的残留及耐药的作用。间隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication,GJIC）是相邻细胞间普遍存在的直接通讯方式。间隙连接蛋白43（connexin43,CX43）介导的GJIC广泛存在于骨髓基质细胞、基质细胞与造血细胞之间,是骨髓基质参与造血调控的必要条件。GJIC减弱或缺失在实体肿瘤的发生发展中起着重要作用。我们前期对急性白血病患者的骨髓基质细胞进行检测发现,其CX43表达明显降低,GJIC功能也明显减弱,对白血病的阻抑作用减弱;临床研究发现,自体造血干细胞移植后患者的GJIC功能长时间处于较低水平,导致骨髓微环境对白血病的阻抑作用减弱,可能是残留白血病易复发的因素。人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCSCs）在体外对白血病细胞株具有抑制增殖及促进凋亡的作用,体内能归巢至骨髓修复造血微环境。能否利用人脐血源基质细胞这一基因载体和对白血病细胞具有阻抑作用的特性,将Cx43基因转染新型人脐血源基质细胞与自体造血干细胞联合移植给预处理后的微小残留病小鼠模型,起到重建移植后GJIC功能以净化小鼠微小残留病的作用,从而降低自体移植后白血病的复发是值得验证的科学设想。本课题为国家自然科学基金项目（No.81070388）“CX43修饰人脐血源基质细胞移植对自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation,AHSCT）后残留白血病净化效应及机制研究”的研究内容。试图从改造白血病造血微环境功能GJIC角度去影响白血病细胞的增殖、分化过程,从而达到去恶化的目的,为探寻白血病治疗的新方法,积累理论和实验依据奠定基础。目的:观察Cx43修饰的新型人脐血源基质细胞移植在造血干细胞移植后的微小残留白血病小鼠骨髓微环境的定植和对异常骨髓微环境的修复作用,通过修复和增强移植后小鼠骨髓基质GJIC功能,改善骨髓微环境造血调控功能,实现对小鼠残留白血病体内净化。方法:1.CX43重组腺病毒载体（Ad-Cx43-GFP）转染人脐血源基质细胞按本科室已经建立的方法对健康产妇脐带血进行细胞分离并贴壁培养,获得人脐血源基质细胞。按我科常规方法构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞。分别用免疫荧光法、PCR、Western-Blot、光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photo bleaching,FRAP）检测转染后Cx43表达。2.构建人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系,体外观察CX43转染前后人脐血源基质细胞对L615白血病细胞的调节作用实验分三组:1)阴性对照组:L615细胞单独培养;2)hUCSCs/L615组:人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组3)Ad-Cx43-hUCSCs/L615组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组CCK8法检测共培养后L615细胞的生长曲线,对比各组间L615细胞增殖率;流式细胞术检测共培养后L615细胞的凋亡率及细胞周期;Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达情况。3.构建L615白血病MRD小鼠模型,进行人脐血源基质细胞联合自体造血干细胞移植,观察转染后人脐血源基质细胞对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应将L615细胞经尾静脉注入L615同系小鼠,3天后经腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,从而获得L615白血病MRD小鼠模型。实验分为两组:1)BM组:骨髓造血干细胞移植组2)Ad-Cx43-hUCSCs+BM组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞联合骨髓造血干细胞移植组以残留白血病L615为受体鼠,以正常L615为供鼠,受鼠在第0天接受6.0 Gy 60Coγ射线TBI;照射后6 h,经尾静脉注射来自供鼠的骨髓造血干细胞细胞以及CM-Dil标记的Cx43修饰的人脐血源基质细胞,其中,BM组输注骨髓细胞为2×106个/只、Ad-Cx43-hUCSCs+BM组输注骨髓细胞及人脐血源基质细胞各1×106个/只。对不同组小鼠移植后尾静脉血行血常规检查以观察造血重建情况;对不同组小鼠移植后的骨髓进行涂片及骨髓病理切片检查;利用荧光标记追踪Ad-Cx43-hUCSCs移植后体内分布情况;对移植后小鼠的骨髓基质细胞进行GJIC功能检测,于移植后不同时间点分别取肝脏、脾脏、肺、肾脏进行病理切片及HE染色;观察各组小鼠移植后的生存率。结果:1.成功构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞:转染后24h可见绿色荧光表达,48h荧光表达达到峰值,转染效率（89.30±3.12）%。免疫荧光、RT-PCR以及Western-Blot证实CX43基因修饰后的hUCSCs Cx43表达水平较未转染组显着升高（CX43mRNA升高2倍,CX43蛋白表达升高3倍）（p<0.05）。进一步检测GJIC功能,结果显示:Ad-Cx43-GFP组细胞在漂白后40s时的荧光与淬灭前水平基本相当,而对照组无法恢复。2.CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞的影响:1)以含20%胎牛血清的DMEM+PRMI1640混合培养基作为培养液,成功建立了两种细胞的体外接触共培养体系,共培养72h后,显微镜下可见基质细胞与L615细胞直接接触,电镜下能清晰的看到基质细胞粘附、包裹L615细胞。2)CCK8法检测细胞增殖:共培养48h,转染Cx43组L615细胞增殖受到明显抑制,直接测得OD值,Cx43转染组明显小于其余各组,两两间比较,Cx43转染组与另外两组差异均有统计学意义（p<0.05）。提示自共培养48h起,转染Cx43组L615细胞活力明显降低,存活率明显降低（p<0.05）。3)流式细胞仪检测细胞凋亡:转染CX43组L615细胞凋亡率为9.70±0.83%,明显高于未转染组（7.33±0.74%）和阴性对照组（2.50±0.85%）,差异有显着性（p<0.05）。4)流式细胞仪检测细胞周期:Cx43转染组G0/G1期细胞比例约为80.43%,较阴性对照组（84.43%）降低（P<0.05）;Cx43转染组S期细胞比例为10.42%,较阴性对照组（6.38%）升高（P<0.05）。G2/M期细胞比例Cx43转染组（8.52%）与单独培养组（8.15%）相似（P>0.05）。未转染组各细胞周期的比例与单独培养组无统计学差异。5)Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达:Cx43转染组caspase3表达较对照组升高1.8倍（P<0.05）。Cx43转染组caspase7表达较对照组升高7倍（P<0.05）。caspase6表达各组间无明显差异（P>0.05）。3.Ad-Cx43-hUCSCs对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应:第0天以L615细胞经尾静脉注射L615同系小鼠致白血病,细胞量2×106个/只,于接种+5天即在外周血中查见白血病细胞,接种+8天骨髓、肝脏、脾脏均查见大量白血病细胞浸润,平均存活时间:11±1.71天。第3天经腹腔注射环磷酰胺,200mg/kg,化疗后+5天白细胞明显降低,化疗后+7天白细胞数开始回升,+17天接近正常,此时骨髓、肝脏、脾脏均未查见白血病细胞,于+23天疾病复发,平均存活时间27.33±2.49天。提示治疗后L615模型小鼠能达到完全缓解,存活时间延长,但体内仍有白血病残留,最后复发。1)Ad-Cx43-hUCSCs体内分布情况:移植后24小时即在小鼠骨髓、肝脏、脾脏、肺脏均能检测到Ad-Cx43-hUCSCs,移植+7天,骨髓、肝脏、脾脏中红色荧光细胞数量增加,荧光强度减弱,肺脏中红色荧光标记细胞减少。移植+14天,骨髓及其他脏器均不能查见红色荧光标记的细胞。2)移植小鼠血象变化情况:移植后,Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠白细胞从+8天开始、血小板从+11天开始回升速度明显快于BM组（P<0.05）比较差异具有统计学意义（P<0.05）。3)FRAP检测两组小鼠骨髓基质细胞的GJIC功能:BM+Ad-Cx43-hUCSCs联合移植组,骨髓基质细胞的荧光强度在淬灭后5min内恢复69.33±1.25%,较BM单独移植组（51.67±1.7%）明显增高,有统计学意义（P<0.05）。4)人脐血源基质细胞移植骨髓涂片和病理切片的变化:移植+17天,骨髓涂片显示,Cx43+hUCBDSCs+BM组未查见白血病细胞浸润（p<0.05）,BM组有大量白血病细胞浸润（图11）。骨髓活检显示:Cx43+hUCBDSCs+BM组未见白血病细胞,BM组骨小梁减少,细胞形态偏幼稚,成簇、成团分布（图12）。5)各组小鼠移植后28天内的生存率:Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠平均生存时间为26.9±1.52天,较BM组（23.70±1.99天）延长（p<0.05）Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠死亡率20%,较BM组35%降低（p<0.05）。结论:1.CX43基因腺病毒可成功转染hUCSCs,Ad-Cx43-hUCSCs的CX43表达水平上调,GJCI功能增加;2.成功建立人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系:Ad-Cx43-hUCSCs与L615细胞株共培养可抑制L615细胞增殖,上调L615细胞caspase3、7表达水平,促进其凋亡;3.Ad-Cx43-hUCSCs联合自体造血干细胞移植后,可归巢至骨髓、脾脏、肝脏、肺等器官;联合移植可促进小鼠造血重建;使骨髓基质细胞GJIC功能增强,有助于清除残留白血病,延长移植小鼠生存。
郁心[8]（2016）在《IL-24在髓系白血病生物疗法基础研究中的应用》文中研究说明第一部分含IL-24的培养体系对CIK细胞生物学活性的影响目的:观察IL-24对CIK细胞生物学活性的影响,探寻增强CIK细胞毒活性的有效方法。方法:分离人外周血单个核细胞,用含有或不含IL-24的培养体系体外诱导培养CIK细胞,观察细胞增殖情况,FCM和ELISA法分析CIK表型及分泌细胞因子能力的差别,溶血试验和FCM法评价CIK细胞产生颗粒酶等毒性颗粒和IFN-γ的能力,将培养获得的CIK细胞和白血病细胞共培养,MTT法和FCM法检测各组CIK细胞对白血病细胞的细胞毒活性。结果:成功诱导培养获得CIK细胞,CIK细胞呈集落样生长,增殖速度较快,未添加IL-24的对照组CIK细胞的增殖率高于添加IL-24培养组。与对照组相比,培养体系中添加IL-24后CIK细胞中CD3+、CD4+和CD3+CD56+细胞的比例无明显改变,而CD3+CD8+、CD8+CD62L+和CD8+CCR7+细胞的数量呈一定程度增加,同时CD4+CD25+CD127-细胞比例有所下降。IL-24可上调CIK细胞表面CD107a和CD54分子以及胞内颗粒酶B的表达,此外,IL-24还可使CIK细胞分泌TNF-α和IFN-γ的能力显着增强。诱导培养的各组CIK细胞均能不同程度诱导K562、K562/A02及新鲜分离的原代白血病细胞凋亡,IL-24组的CIK细胞比常规方法培养的CIK细胞的肿瘤杀伤活性更强。结论:成功从健康人外周血单个核细胞中诱导培养了CIK细胞,所获得的CIK细胞具有正常的生物学功能。IL-24可通过增加CD3+CD8+细胞和中央型记忆T细胞（CD8+TCM）的数量,上调CIK细胞表面粘附分子、CD107a和胞内颗粒酶等毒性颗粒的表达,以及促进CIK细胞分泌Th1型细胞因子,减少CIK细胞中Treg调节性T细胞的比例等途径来改变CIK细胞的生物学特性,增强CIK细胞的抗肿瘤作用。第二部分il-24基因修饰的树突细胞促进cik细胞对白血病细胞的杀伤作用目的:研究cik细胞与il-24基因修饰的同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其作用机理。方法:从外周血单个核细胞中常规诱导培养dc和cik细胞,同时构建重组腺病毒载体advgfp/il-24（ad-il-24）,将il-24基因通过重组病毒导入已负载肿瘤抗原的dc,所构建的细胞称为dc-il-24,rt-pcr和elisa法检测dc-il-24中il-24基因的表达。重组病毒感染72h后在培养体系中加入il-10,fcm和elisa法分别检测dc表型和细胞因子分泌能力的变化,将各组dc和cik细胞混合培养,fcm法检测与dc共培养的cik细胞对白血病细胞杀伤活性的变化。结果:成功从健康人外周血单个核细胞中诱导培养了dc和cik细胞,重组腺病毒ad-il-24能有效将il-24基因导入dc,il-24可上调dc表面cd80、cd83、hla-dr、cd40、cxcr4分子的表达。基因转染后的dc分泌il-12、tnf-α的能力显着提高。il-10能够抑制dc表型成熟,促使其向单核-巨噬细胞方向分化,并降低dc分泌il-12、tnf-α的能力,但il-10对已转入il-24基因的dc并无明显抑制作用。cik细胞与dc-il-24共培养后对白血病细胞的细胞毒活性明显增强,且这种作用不受il-10的抑制。结论:通过重组病毒将il-24基因导入dc后,il-24基因的表达能有效活化dc,促进dc表型成熟,分泌th1型细胞因子,进而增强共培养的cik细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用,且这种转基因dc能抵抗il-10的免疫抑制作用。第三部分rgd修饰的il-24重组腺病毒载体对髓系白血病目的:构建rgd修饰的il-24重组腺病毒载体,观察它对白血病细胞的抑制效应及其作用机制。方法:构建重组腺病毒ad.rgd-il-24,观察它对髓系白血病细胞thp-1、k562、k562/a02、meg-01的感染效率,瑞氏-姬姆萨染色和fcm检测白血病细胞的分化情况。mtt法检测重组腺病毒对白血病细胞生长的影响,流式细胞仪检测il-24基因表达对白血病细胞周期和凋亡的影响。real-timepcr和westernblot法检测转染il-24基因后细胞凋亡相关基因grp78/bip、gadd153、gadd34、gadd45α、bax、bcl-2和mcl-1在thp-1细胞中的表达,分光光度法检测caspase-3活性的变化。结果:我们成功构建并获得rgd修饰的重组腺病毒载体ad.rgd-il-24,ad.rgd-il-24对meg-01等髓系白血病细胞的感染效率较高。异位过表达il-24能通过细胞周期阻滞来抑制靶细胞生长,并对髓系白血病细胞有一定诱导分化的作用。ad.rgd-il-24重组腺病毒能显着诱导thp-1细胞凋亡,但不能明显诱导k562和k562/a02细胞凋亡。ad.rgd-il-24能明显上调thp-1细胞grp78/bip、gadd153、gadd34、gadd45α和bax基因的表达,并下调bcl-2和mcl-1基因的表达,同时增强caspase-3的活性。结论:rgd修饰的重组腺病毒载体ad.rgd-il-24对某些种类的髓系白血病细胞具有较高的基因转导能力,内源性il-24的过表达可明显抑制白血病细胞生长,并一定程度地诱导分化。ad.rgd-il-24能通过调节凋亡相关蛋白的表达,诱导thp-1细胞凋亡。第四部分il-24基因表达对髓系白血病细胞的免疫调变作用目的:观察il-24基因表达对髓系白血病细胞免疫原性的调变作用。方法:为观察il-24对髓系白血病细胞的免疫调变作用,fcm检测il-24对白血病细胞表面cd80、cd86、hla-abc、hla-dr、mica/b、cd137、cd137l、cd200等免疫分子表达的影响,elisa检测ad.rgd-il-24对白血病细胞分泌vegf、tnf-α、il-6和il-8细胞因子的影响,细胞毒试验检测白血病细胞感染重组病毒后对cik细胞毒敏感性的变化。体内成瘤试验观察转基因白血病细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况,免疫组织化学法检测vegf、cd31、cd34、collageniv、cd147、mt1-mmp、mmp-2和mmp-9等因子的表达。结果:髓系白血病细胞低表达上述分子,而IL-24可影响部分免疫分子的表达,并对白血病细胞分泌某些与免疫相关的细胞因子具有一定的调节作用。IL-24基因修饰可提高白血病细胞对免疫杀伤细胞的敏感性,并抑制裸鼠白血病细胞移植瘤的生长。分子机制检测结果显示:Ad.RGD-IL-24重组腺病毒能明显下调与肿瘤血管生成密切相关的蛋白分子VEGF、CD31、CD34和collagen IV的表达,同时下调肿瘤侵袭相关分子CD147和基质金属蛋白酶MT1-MMP、MMP-2和MMP-9的表达。结论:IL-24对髓系白血病细胞的免疫原性具有调变作用,能增加白血病细胞对CIK细胞体外杀伤作用的敏感性,还能通过抑制肿瘤血管生成和降低其侵袭性,抑制裸鼠白血病细胞移植瘤的生长。
张曦[9]（2006）在《VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能》文中研究表明骨髓造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是造血干/祖细胞生长发育的“土壤”,基质细胞作为造血微环境中的重要成分,不仅与造血干/祖细胞的归巢定位、增殖分化和自我更新密切相关,而且在某些血液系统疾病的发生、发展和转归过程中具有非常重要的作用,探讨基质细胞在造血调控中的作用需继续深入。人脐血中的细胞成分丰富且较骨髓和外周血更原始;脐血细胞具有来源广泛、采集方便、GVHD轻和高增殖的特点,临床应用前景广阔。目前对造血基质细胞的研究主要侧重于骨髓基质细胞,而对于脐血中是否存在基质细胞,脐血源基质细胞的生物学特点如何,能否作为一种新型的造血基质细胞来源等问题尚缺乏系统深入的研究;血管细胞粘附分子（vascular cell adhsion molecule-1,VCAM-1）是骨髓基质细胞参与造血调控不可缺少的粘附分子,它与受体整联蛋白（Integrin）家族中的α4β1特异性结合能起到固定造血干细胞于骨髓基质的作用,对造血干/祖细胞的增殖、分化、迁移中发挥重要调控作用。鉴于此,本课题将人脐血CD34+细胞,采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血源基质细胞培养,探讨人脐血细胞体外扩增基质细胞的可行性和有效性;研究人脐血源基质细胞微环境的造血支持作用;构建荧光蛋白标记的VCAM-1腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞,移植给造血微环境辐射损伤裸鼠,探讨其对重建造血微环境功能及促进造血损伤修复的作用,为平战条件下造血功能损伤的救治提供新的辅助治疗措施。1.研究内容及方法:1.1分离人脐血CD34+细胞,采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血源基质细胞培养、传代扩增,采用光镜,电镜、组织细胞化学、免疫细胞化学和流式细胞仪等技术对脐血源基质细胞进行鉴定;1.2采用DNA重组技术,将目的基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与腺病毒基因组进行同源重组,产生重组腺病毒;在脂质体介导下,将重组的腺病毒表达质粒转染293细胞,使腺病毒在293细胞中包装复制,并对转染后的293细胞进行荧光观测,检测培养上清目的蛋白的表达;用高效转染载
王锋超[10]（2006）在《电离辐射与内毒素致小肠上皮细胞损伤机制的实验研究》文中研究指明正常状态下,小肠隐窝上皮细胞可不断增殖,并向绒毛上皮移行,同时伴随分化、成熟和衰老,最终在绒毛顶端生理性脱落。这种细胞动态更新对维持肠粘膜正常的结构和功能有重要意义。多种因素打破肠上皮这种固有的动态更新平衡,造成胃肠道损伤。这些因素主要可分为基因毒损伤（包括电离辐射、DNA为靶的化疗药物等）,非基因毒（急慢性炎症、严重创伤和休克等）等。在核战争、核事故以及核生化恐怖袭击时,基因毒和非基因毒性损伤因素可同时或相继作用于胃肠上皮等组织,病员伤情往往表现为复合损伤。而这两种损伤因素在靶细胞、信号通路激活等方面存在诸多差异,为我们分析肠上皮损伤的发生、发展机制和提出有效治疗方案带来障碍。基因毒性致伤因素如电离辐射可快速诱导隐窝细胞发生凋亡,而巳分化成熟的绒毛细胞辐射敏感性很低。机体接受一定剂量（如12Gy）的射线照射后,隐窝上皮细胞发生暂时性增殖抑制及部分细胞凋亡、变性和坏死等病理改变,使辐射后期（48-72h）绒毛上皮的更新缺乏来源,从而破坏上皮结构的完整性。严重创伤和休克往往通过非基因毒方式直接作用于绒毛细胞,导致肠粘膜屏障衰竭和肠源性感染,快速启动MODS的发生。动物体内注射LPS引发内毒素休克模型可快速诱导MODS,其诱导在小肠局部产生的低灌注、氧自由基生成及炎症因子等多种非基因毒因素可直接作用于肠上皮细胞,促使绒毛细胞快速死亡、脱落,造成了肠屏障和吸收功能的快速、严重受损。这两种模型在靶细胞损伤和修复动力学等方面形成了鲜明的对比,提示它们对胞内信号途径的激活存在差异。目前通过基因敲除和组织病理学等手段研究认为,电离辐射激活的P53通路和后续的线粒体依赖的促凋亡途径是肠隐窝细胞凋亡的主要因素;内毒素休克导致胃肠微环境中的炎性因子等可通过细胞膜死亡受体来激活肠上皮细胞内的促凋亡、坏死信号,诱导细胞凋亡或坏死的发生;而Akt、MAPK、NF-κB等在两种模型的细胞存活和抗凋亡中都可发挥重要作用。另一方面,隐窝和绒毛这两群细胞对相同的致伤因素又有不同的反应,又增加了对肠上皮细胞损伤机制进行准确分析的难度。以往研究中对致伤模型的肠上皮细胞取材时,多采用直接的肠上皮洗脱或者刮除,所得物中包含了以绒毛细胞为主、部分隐窝细胞和大量间质细胞等多种成分,因此很难针对性地对肠上皮细胞进行损伤后信号转导机制研究;原位的激光切割捕获技术,虽可
二、~(60)Co辐射后IL-2基因修饰肿瘤细胞生物学行为的改变（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、~(60)Co辐射后IL-2基因修饰肿瘤细胞生物学行为的改变（论文提纲范文）
（1）IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑色素瘤 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 治疗现状 |
| 1.1.3 免疫治疗 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.2.1 肿瘤干细胞一般特征 |
| 1.2.2 黑色素瘤中的肿瘤干细胞研究 |
| 1.2.3 肿瘤干细胞——肿瘤免疫治疗的新靶点 |
| 1.2.4 肿瘤干细胞疫苗——靶向肿瘤干细胞免疫治疗 |
| 1.2.5 靶向肿瘤干细胞多种免疫治疗潜在机制 |
| 1.2.6 肿瘤干细胞疫苗潜在的抗肿瘤免疫机制 |
| 1.2.6.1 树突状细胞的作用 |
| 1.2.6.2 抗肿瘤特异性T细胞的作用 |
| 1.3 IL-33 |
| 1.3.1 IL-33 的免疫调节作用 |
| 1.3.2 IL-33 在肿瘤免疫中的作用 |
| 1.3.2.1 IL-33 对DCs的作用 |
| 1.3.2.2 IL-33 对CD8~+T细胞的作用 |
| 1.3.2.3 IL-33 在肿瘤疫苗中的潜在作用 |
| 1.3.3 IL-33 在黑色素瘤中的研究 |
| 第2章 研究方案 |
| 2.1 黑色素瘤干细胞疫苗的制备 |
| 2.2 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价 |
| 2.3 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要试剂的配制 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.1.5 实验相关细胞株 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞复苏、培养及冻存 |
| 3.2.2 利用免疫磁珠技术分选细胞 |
| 3.2.3 测定细胞克隆形成能力 |
| 3.2.4 总RNA的提取与逆转录 |
| 3.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-q PCR)检测细胞的干性 |
| 3.2.6 流式细胞术测定细胞表面MHC I的表达 |
| 3.2.7 IL-33 过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44~+CD133~+ |
| 3.2.8 肿瘤细胞灭活及细胞灭活后鉴定 |
| 3.2.9 酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)测定IL-33 的表达 |
| 3.2.10 建立预防性动物模型 |
| 3.2.11 肿瘤病理组织学检测 |
| 3.2.12 DCs的诱导及鉴定 |
| 3.2.13 检测疫苗促DCs成熟能力 |
| 3.2.14 小鼠脾脏淋巴细胞的分离及脾脏中CD8~+T细胞比例及活性测定 |
| 3.2.15 小鼠脾脏淋巴细胞CFSE染色 |
| 3.2.16 检测疫苗对DCs激活CD8~+T细胞能力的影响 |
| 3.2.17 测定疫苗对CD8~+T细胞免疫检查点及CD8~+记忆性T细胞的影响 |
| 3.2.18 检测疫苗对CD8~+T细胞抗肿瘤效应分子的影响 |
| 3.2.19 测定小鼠脾淋巴细胞的杀伤能力 |
| 3.2.20 测定黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133的表达 |
| 3.2.21 检测小鼠血清细胞因子水平 |
| 3.2.22 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 黑色素瘤干细胞疫苗的制备 |
| 4.1.1 B16F10-CD44~+CD133~+黑色素瘤干细胞的鉴定 |
| 4.1.2 IL-33 过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44~+CD133~+细胞 |
| 4.1.3 黑色素瘤干细胞的灭活 |
| 4.1.4 B16F10-IL-33 CD44~+CD133~+细胞灭活后鉴定及抗肿瘤疫苗制备 |
| 4.2 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价 |
| 4.2.1 疫苗对荷瘤小鼠肿瘤大小的影响 |
| 4.2.2 疫苗对小鼠肺转移的影响 |
| 4.2.3 荷瘤小鼠肿瘤组织病理学及免疫组织化学分析 |
| 4.2.4 小鼠生存期分析 |
| 4.3 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究 |
| 4.3.1 疫苗促进小鼠骨髓来源的DCs成熟 |
| 4.3.2 疫苗增强DCs刺激CD8~+T细胞增殖的能力 |
| 4.3.3 疫苗增强DCs启动CD8~+T细胞的能力 |
| 4.3.4 疫苗对小鼠脾脏中CD8~+T细胞比例及活性的影响 |
| 4.3.5 疫苗降低CD8~+T细胞免疫检查点的表达 |
| 4.3.6 疫苗诱导脾脏CD8~+中心记忆性T细胞的形成 |
| 4.3.7 疫苗增加脾脏CD8~+T细胞抗肿瘤效应分子的表达 |
| 4.3.8 疫苗增强小鼠脾淋巴细胞的杀伤能力 |
| 4.3.9 疫苗降低荷瘤小鼠肿瘤组织细胞CD44和CD133的表达 |
| 4.3.10 疫苗对荷瘤小鼠肿瘤组织细胞MHC I表达的影响 |
| 4.3.11 疫苗促进小鼠血清抗肿瘤细胞因子的分泌 |
| 4.3.12 疫苗增加小鼠肿瘤组织CD8~+T细胞的浸润 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）牙髓干细胞对椎间盘退变与类风湿关节炎的免疫调控作用及治疗机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾1 干细胞在IVDD中的研究进展 |
| 1 正常椎间盘结构 |
| 2 椎间盘退变发生机制 |
| 3 干细胞原位移植在椎间盘退变中的治疗作用 |
| 4 原位移植的干细胞选择 |
| 文献回顾2 间充质干细胞治疗类风湿关节炎的研究进展 |
| 1 RA发病机制 |
| 2 MSCs对固有免疫细胞的作用 |
| 3 MSCs对适应性免疫细胞的作用 |
| 4 MSCs治疗RA的临床研究 |
| 第一章 DPSCs促进椎间盘退变动物模型局部结构恢复及II型胶原产生 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 实验动物来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DPSCs细胞鉴定 |
| 2.2 IVDD大鼠模型构建 |
| 2.3 IVDD大鼠模型细胞治疗 |
| 2.4 IVDD大鼠模型Micro-CT拍摄 |
| 2.5 大鼠椎间盘H&E染色 |
| 2.6 大鼠椎间盘退变组织学分级 |
| 2.7 大鼠椎间盘形态结构参数定量分析 |
| 2.8 大鼠椎间盘Masson染色 |
| 2.9 大鼠椎间盘番红固绿染色 |
| 2.10 大鼠椎间盘IHC染色 |
| 2.11 数据统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DPSCs细胞形态学观察 |
| 3.2 DPSCs细胞表面标志物鉴定 |
| 3.3 DPSCs成骨分化能力检测 |
| 3.4 DPSCs成脂分化能力检测 |
| 3.5 DPSCs治疗后大鼠椎间盘退变影像学改变 |
| 3.6 DPSCs治疗后大鼠椎间盘退变病理学改变 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 IVDD动物模型的选择 |
| 4.2 DPSCs体内治疗效果评价 |
| 第二章 DPSCs抑制髓核细胞炎症保护其存活及功能 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 椎间盘突出患者标本来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代髓核细胞的分离与培养 |
| 2.2 髓核细胞RNA提取与质量控制 |
| 2.3 文库构建及测序 |
| 2.4 转录组测序数据分析: |
| 2.5 Western Blotting实验 |
| 2.6 细胞骨架染色 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DPSCs处理前后DEGs分析 |
| 3.2 基于DEGs的 GO分析 |
| 3.3 基于DEGs的信号通路分析 |
| 3.4 信号通路相关分子蛋白表达分析 |
| 3.5 DPSCs上清促进髓核细胞功能恢复 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 转录组测序揭示髓核细胞改变 |
| 4.2 炎症因子变化影响髓核细胞功能 |
| 4.3 TNF-α对髓核细胞影响 |
| 4.4 IL-1β对髓核细胞影响 |
| 第三章 DPSCs与 DPSCs-HGF治疗类风湿关节炎动物模型的疗效对比 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 实验动物来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CIA小鼠模型构建及评分 |
| 2.2 CIA小鼠模型细胞治疗 |
| 2.3 小鼠关节H&E染色 |
| 2.4 小鼠关节滑膜炎组织学分级 |
| 2.5 小鼠关节Micro-CT拍摄及分析 |
| 2.6 数据统计 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DPSCs-Null治疗降低CIA小鼠关节炎临床评分 |
| 3.2 DPSCs-HGF治疗无较好长期收益 |
| 3.3 DPSCs-Null及 DPSCs-HGF对 CIA骨质破坏的治疗作用 |
| 4.讨论与小结 |
| 4.1 DPSCs生物学特性 |
| 4.2 DPSCs多向分化及免疫调节作用 |
| 第四章 HGF基因修饰DPSCs发挥抑制免疫与促滑膜炎的双重作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 滑膜组织标本来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代滑膜细胞的分离与培养 |
| 2.2 Western Blotting实验 |
| 2.3 免疫细胞亚型分析 |
| 2.4 小鼠细胞因子检测 |
| 2.5 培养上清IL-6浓度检测(ELISA法) |
| 2.6 小鼠关节IHC染色 |
| 2.7 H score评分 |
| 2.8 克隆形成实验 |
| 2.9 细胞周期分析 |
| 2.10 数据统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DPSCs-Null与 DPSCs-HGF治疗后免疫细胞亚型变化 |
| 3.2 DPSCs-Null与 DPSCs-HGF治疗后炎症因子变化 |
| 3.3 HGF对滑膜细胞生物学表型及信号通路影响 |
| 3.4 HGF活化c-Met/Akt信号通路促进滑膜细胞增殖及凋亡抵抗 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 HGF及 c-Met受体结构及生物学功能 |
| 4.2 HGF 及 c-Met 受体免疫调控作用 |
| 4.3 HGF 在自身免疫性疾病中的治疗作用 |
| 4.4 HGF在RA中的作用研究 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（4）LncRNA SNHG1调控食管鳞状细胞癌发展进程的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SNHG1 在ESCC中的表达及对细胞生物学行为的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SNHG1 对ESCC细胞生物学特性影响的机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SNHG1 对食管鳞状细胞癌裸鼠体内移植瘤影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 LncRNA和miRNA在食管癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士阶段发表的论文 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）食管癌阴性淋巴结数目与患者预后相关性以及食管癌免疫治疗相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 胸段食管鳞癌根治术后阴性淋巴结数目与患者预后的相关性分析 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EpCAM在食管癌中的表达以及与免疫治疗相关性研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
| 致谢 |
| 发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）K562工程细胞系的构建及对NK-92细胞体外扩增的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 用于扩增 NK-92 细胞的 K562 工程细胞系的构建 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 第二部分 NK-92 细胞的体外扩增及其功能的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 中英文术语和缩略词对照表 |
| 附录 B 主要试剂配制方法 |
| 附录 C 个人简历 |
| 附录 D 发表文章 |
| 附录 E 综述 |
| 参考文献 |
（7）CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CX43基因转染人脐血源基质细胞及GJIC功能的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞调节作用的体外研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对小鼠自体造血干细胞移植后残留白血病净化作用的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞因子在急性白血病诊断、治疗、预后中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）IL-24在髓系白血病生物疗法基础研究中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 含IL-24的培养体系对CIK细胞生物学活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IL-24基因修饰的树突细胞促进CIK细胞对白血病细胞的杀伤作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 RGD修饰的IL-24重组腺病毒载体对髓系白血病细胞的生长抑制效应及其作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 IL-24基因表达对髓系白血病细胞的免疫调变作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文 |
| 本论文受下列课题资助 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 VCAM-1 基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能 |
| 前言 |
| 第一部分 人脐血源基质细胞的发现和鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 第二部分 VCAM-1 和EGFP 双基因共表达重组腺病毒的构建、鉴定及转染人脐血源基质细胞的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 第三部分 VCAM-1 修饰人脐血源基质细胞贴壁层对造血支持作用的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 第四部分 VCAM-1 基因修饰的人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 人脐血造血微环境细胞的研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间已发表论文、撰写专着及获科研基金资助情况 |
（10）电离辐射与内毒素致小肠上皮细胞损伤机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 电离辐射与内毒素致小肠上皮细胞损伤机制的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠小肠上皮细胞隐窝，绒毛细胞的分离鉴定和部分生物学性状研究 |
| 第一节：小肠上皮隐窝，绒毛细胞低温螯合剂沉淀法的改进 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 隐窝、绒毛区细胞部分生物性状对比分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第二部分 电离辐射和内毒素休克对肠上皮损伤模型的建立和MAPK 信号通路激活的比较性研究 |
| 第一节 电离辐射和内毒素休克对肠上皮隐窝、绒毛上皮损伤作用模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 电离辐射和内毒素休克对小肠隐窝、绒毛细胞MAPK 通路的激活 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第三部分 PI3K/Akt 在肠上皮隐窝、绒毛细胞中的激活以及和NF-κB 、P53 通路的关系研究 |
| 第一节 电离辐射和内毒素休克诱导肠上皮隐窝、绒毛细胞Akt 通路的激活和抑制剂的应用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 肠上皮细胞P53、NF-κB 通路的激活以及与P13K/Akt 通路的关系 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第四部分 内毒素休克和电离辐射激活肠上皮细胞NFκB、P53 通路的连续芯片研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第五部分 内毒素休克复合电离辐射诱导肠上皮隐窝细胞损伤反应的分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 小肠上皮细胞生物学研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肠上皮细胞与电离辐射 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
四、~(60)Co辐射后IL-2基因修饰肿瘤细胞生物学行为的改变（论文参考文献）
- [1]IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究[D]. 尹起亮. 吉林大学, 2021
- [2]牙髓干细胞对椎间盘退变与类风湿关节炎的免疫调控作用及治疗机制研究[D]. 董曦文. 军事科学院, 2021(02)
- [3]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [4]LncRNA SNHG1调控食管鳞状细胞癌发展进程的机制研究[D]. 李浩淼. 郑州大学, 2020(02)
- [5]食管癌阴性淋巴结数目与患者预后相关性以及食管癌免疫治疗相关研究[D]. 于兰. 山东大学, 2020(12)
- [6]K562工程细胞系的构建及对NK-92细胞体外扩增的研究[D]. 黄艳平. 蚌埠医学院, 2019
- [7]CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制[D]. 文钦. 第三军医大学, 2017(12)
- [8]IL-24在髓系白血病生物疗法基础研究中的应用[D]. 郁心. 苏州大学, 2016(08)
- [9]VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能[D]. 张曦. 第三军医大学, 2006(11)
- [10]电离辐射与内毒素致小肠上皮细胞损伤机制的实验研究[D]. 王锋超. 第三军医大学, 2006(11)
标签：肿瘤论文; 肿瘤免疫论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞免疫论文; 细胞生物学论文;