一、大庆地区某猪场猪传染性胃肠炎的调查与防制（论文文献综述）
颜子涵,原冬伟,李明月,王一,孙东波[1]（2021）在《黑龙江省某猪场猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定》文中研究表明猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）是养猪业常见的猪腹泻病毒,对仔猪具有高死亡率。将黑龙江地区某猪场腹泻样本鉴定为TGEV阳性后,无菌接种于猪肾细胞（PK-15）连续传代培养成功获得一株TGEV分离株,通过CPE观察、RT-PCR鉴定、间接免疫荧光试验以及电镜观察等方法对分离株成功鉴定。测定第15代分离TCID50为10-5.25/0.1 mL,为后续TGEV的致病性研究及疫苗开发提供前期基础。
吴中彬[2]（2021）在《规模化猪场流行性腹泻综合性防控措施的探讨》文中研究说明随着国民经济的迅速发展,我国生猪养殖业从分散、个体经营逐渐向规模化、集约、封闭式的养殖模式发展。然而,疫病的发生并没有随着猪场集约化程度的上升而减少,流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起不同日龄猪只腹泻的重要病原,是规模化猪场最为常见的高发病毒病之一。各种日龄的猪只都会发生,哺乳猪、架子猪和育肥猪的发病率都很高。断奶猪、架子猪和母猪呈现精神萎靡、采食量下降和大约一周的持续性腹泻,然后可逐渐恢复正常;但是哺乳仔猪尤其是一周龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天,常因严重脱水而死亡,死亡率可达50%,最高的死亡率达100%。临床症状主要表现为水样腹泻,或水样腹泻伴有呕吐,发病日龄越小,发病率和死亡率越高。尤其是因其仔猪发病日龄小,机体很难产生抗体,所以猪场对母源抗体的实时监测和合理的免疫程序显得非常重要。1、规模化猪场仔猪流行性腹泻的流行、诊断与母猪初乳中IgA抗体水平的监测2015年3月,江苏某公司下属部分规模化猪场发生腹泻病例,通过观察临床症状、病理解剖、临床胶体金检测、RT-PCR检测以及基因测序,证实此次疫情是由变异的猪流行性腹泻病毒导致的腹泻。为了控制疫情的传播、了解公司下属江苏地区所辖20个规模化猪场流行性腹泻的发病情况、不同胎次母猪初乳中抗体的分布情况以及分析母猪初乳中IgA效价、离散度与发病率和死亡率之间的关系,于2015年3月至2016年10月间采集公司下属江苏地区发病的20个规模化猪场不同胎次初乳共计760份,使用猪流行性腹泻IgA抗体ELISA检测试剂盒对采集的母猪初乳进行检测。根据猪场初乳IgA抗体测定以及抗体离散度分析得出:母猪初乳效价高的申河、安丰、黄海、晚庄、海提、庆丰、下明、海北的八个猪场,也存在发病和死亡的情况,其中检测到安丰、黄海、晚庄、海提、庆丰、下明、海北七个猪场不同胎次抗体离散度较高,是造成仔猪发病和死亡的主要原因。丰海、时丰、海北1、川东一、川东二、川东三、川东四、川东五、川东六、龙河、万星、峥嵘等十二个猪场具有较高的发病率和死亡率,同时检测到相应猪场母乳抗体效价低和抗体离散度高。结果表明,IgA效价低且离散度高的猪场仔猪发病率、死亡率相对较高。2、示范场猪流行性腹泻综合性防制措施的研究20个规模化猪场调查结果显示,虽然各场采取的是公司统一制定的免疫程序和保健程序,但是由于猪群的健康状况以及管理因素导致各猪场发病和死亡情况存在较大差异。本研究以发病率、死亡率较高的的3个猪场为示范场,通过免疫程序优化、完善生物安全措施以及联合用药等展开研究。根据研究结果,结合猪场实际情况,形成了优化后的规模化猪场流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）综合性防制措施,该措施可降低疫病发生带来的危害,在示范猪场的应用结果表明:一是通过免疫程序的优化可以显着提高母猪群初乳中IgA抗体水平;二是对发病仔猪采用高IgA抗体水平的初乳灌服以及优化饲养环境,能够显着改善发病仔猪的成活率;三是通过升级牧场内外的生物安全措施,加强猪群的饲养管理以及优化免疫程序等综合性防制措施对示范场的PED防控起到了良好效果,从而为本地区PED的防制提供了参考模式。
常新见[3]（2020）在《华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究》文中提出猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,Po RV）引起的一种以厌食、腹泻、呕吐、脱水为特征的急性传染病。该病多发于寒冷季节,呈地方性流行,各生长阶段的猪均可感染,感染率最高可达90%～100%,给养猪业带来巨大经济损失。目前,Po RV出现了新的基因型,导致现有疫苗对其保护效果不理想。因此,开展Po RV的分子流行病学调查,明确其流行的病毒基因型,研制安全有效的新型疫苗,对防控该病具有重要的意义。鉴于此,本论文开展了以下三方面的研究内容:1.华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查:采用本实验室已建立的Po RV RT-PCR检测方法对2017～2019年间华东地区35个规模猪场的594份样品进行检测。结果显示,2017～2019年间华东地区Po RV的平均检出率为16.8%（100/594）;在不同类型的样品中,肠道样品的Po RV检出率最高为19.5%（68/349）;在不同生长阶段猪中,仔猪的Po RV检出率最高为18.5%（70/379）。同时,扩增阳性样品的VP7和VP4基因并测序,进行序列比对、同源性比较及遗传进化分析。结果显示,5个Po RV基因型均为A群G9P7型,与参考毒株NMTL相比,VP7蛋白第100、122、180、309位有氨基酸突变;与参考毒株OSU相比,VP4蛋白在30、137、686、774位有氨基酸突变,且两者均无氨基酸位点插入和缺失。遗传进化分析结果显示,不同地区流行毒株基因型相同,表明G9P7型Po RV可能是主要的流行基因型。2.猪轮状病毒VP4蛋白间接ELSA抗体检测方法的建立:针对VP4蛋白的保守区设计并合成引物,通过PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*。将该质粒转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS PAGE和Western blot鉴定了该蛋白的表达,利用Ni柱纯化蛋白。以纯化的重组480-VP4*蛋白为抗原建立间接ELISA方法,确定了该方法的最佳包被浓度为2.56μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳稀释度为1:10 000。建立的方法与病毒中和试验的总符合率达80.0%;用该方法初步检测了华东地区的临床血清,结果显示华东地区Po RV抗体阳性检出率为87.8%。通过该试验建立的间接ELISA检测方法为Po RV的血清学调查和后续疫苗免疫后的抗体评价提供了一种新的技术手段。3.猪轮状病毒不同截短VP4蛋白免疫原性研究:VP4蛋白具有较好免疫原性,是疫苗研究的主要靶蛋白,本研究分别构建3种截断的VP4蛋白的原核表达载体,同时将破伤风毒素的通用T细胞表位（P2）作为分子佐剂与三个截断VP4蛋白融合表达,成功构建了6个重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*、p ET28a-618-VP4*、p ET28a-1428-VP4*、p ET28a-P2-480-VP4*、p ET28a-P2-618-VP4*及p ET28a-P2-1428-VP4*,将它们分别转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS-PAGE和Western blot确定了蛋白表达,利用Ni柱纯化6个重组蛋白。将6个纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂以1:1体积混合后制备成亚单位疫苗,通过肌肉注射免疫6周龄小鼠,间隔2周免疫一次,共免疫3次,第3次免疫后2周,扑杀小鼠,并采集免疫前后小鼠血清,利用ELISA检测免疫前后抗体水平的变化,中和试验检测中和抗体水平。结果显示,6个蛋白免疫原性较好,小鼠血清中能产生特异性的抗体,3个截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为618-VP4*、1428-VP4*、480-VP4*,3个融合P2的截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为P2-1428-VP4*、P2-618-VP4*、P2-480-VP4*,但是6个蛋白诱导的中和抗体水平均偏低。将P2导入VP4蛋白后,1428-VP4*的蛋白免疫原性得到增强。通过该试验对不同截断VP4蛋白的免疫原性的研究,为后期研发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了良好的基础。
王先松[4]（2020）在《渝西地区零星死亡哺乳仔猪四种腹泻病调查及RVA VP7基因生物信息学分析》文中研究说明仔猪零星死亡是目前养猪生产中十分常见的现象,多发生于仔猪的哺乳期和断奶后保育阶段,因其累积死亡数量较大,对养猪业造成的损失和潜在威胁较大,已逐渐引起人们的关注和重视。重庆西部地区畜牧业发达,有日全农牧、新希望六和等众多国内着名农牧企业入驻。随着渝西地区养猪规模的日益扩大,其中哺乳仔猪零星死亡现象频频发生,且存在难预防、难控制等问题。猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和新型猪Delta冠状病毒病,均可引起仔猪腹泻、脱水等症状,疾病流行迅速,属于现代生猪养殖业中重点防控的疫病范畴。为探究渝西地区零星死亡哺乳仔猪的死亡原因,本研究于2017年7月至2018年8月对渝西部分地区8个规模猪场仔猪零星死亡情况进行了调查。将随机采集的零星死亡哺乳仔猪样本246份,采用病理剖检、石蜡切片镜检进行病理学观察,分析了零星死亡哺乳仔猪消化道病理变化特征和规律;利用分子生物学诊断技术,对病料中猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒A型和新型猪Delta冠状病毒进行了核酸检测。结果显示:（1）被调查猪场总产仔猪57346头,零星死亡3299头,平均零星死亡率为5.75%;其中春季零星死亡率最高,达8.18%,夏季最低,为4.01%。（2）消化道病理学检查显示,出现肠系膜淋巴结肿大、出血和小肠管充气、肠壁变薄现象的样本最多,达39.8%以上,有24.3%的样本存在消瘦、脱水,15.4%的样本小肠黏膜出血;且上述病变冬春季节多于夏秋两季。病理切片显示,被检仔猪小肠绒毛萎缩,黏膜上皮细胞坏死、脱落,且脱落后呈扁平或方形的未成熟细胞。（3）病毒核酸检测显示,猪轮状病毒感染率最高,为6.50%,其次是猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒,分别为4.88%和3.66%,猪Delta冠状病毒未检出;前三者混合感染检出数量占总样本数的3.66%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒合感染检出率为0.84%。为了解渝西地区猪轮状病毒基因型流行情况,以及该地区流行毒株VP7蛋白结构和功能特征,分析优势抗原表位。本研究对6株病毒VP4和VP7基因进行克隆测序,并通过生物信息学初步分析,结果显示:（1）成功扩增6株猪轮状病毒VP7基因,命名为CQ-2019/VP7-16,通过NCBI数据库对比分析得出渝西流行株均为G9基因型,未扩增到VP4基因。（2）多序列比对显示,CQ-2019/VP7-16基因序列相似度为99.92%,该基因序列与同型TM-a毒株同源性最不低于为93.7%,与不同G型代表毒株同源性最高仅为79.7%;基因进化树分析,CQ-2019/VP7-16毒株和同型毒株TM-a、NMTL在同一进化亚枝。（3）CQ-2019/VP7-16基因的ORF翻译出同一条氨基酸序列（CQ-2019/VP7）,包含326个氨基酸残基;双序列比对结果显示CQ-2019/VP7与同型代表毒株似度为93.7%,与不同型代表毒株相似性最高为85.89%,进化树分析CQ-2019/VP7与同型毒株处在同一进化分支;此外,CQ-2019/VP7与重庆人源轮状病毒VP7蛋白氨基酸序列同源性最低为93.58%,且与之存在9个氨基酸变异。（4）CQ-2019/VP7蛋白一级结构预测显示,该蛋白含有115个疏水性氨基酸和121个亲水性氨基酸,属于稳定蛋白,不能分泌信号肽,为二次跨膜蛋白;二级结构预测,该蛋白主要由α螺旋、β转角和无规则卷曲组成。（5）潜在N、O糖基化位点、潜在磷酸化位点预测,CQ-2019/VP7蛋白存在1个潜在的N-糖基化位点和24个潜在的磷酸化位点;抗原表位预测结果显示CQ-2019/VP7蛋白存在5个优势抗原表位区域。渝西地区调查猪场哺乳仔猪平均零星死亡率达到5.75%,以冬、春季最严重;调查的四种病毒性腹泻病中,猪轮状病毒核酸检出率最高（6.5%）,猪轮状病毒、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎三种病毒混合感染检测率达3.66%。试验基于猪轮状病毒CQ-2019/VP7基因的生物信息学分析,渝西地区猪场仔猪猪轮状病毒流行的基因型为G9,与G9型中的TM-a毒株亲缘关系最近,预测CQ-2019/VP7蛋白有5个优势抗原表位区域。本试验结果为渝西地区哺乳仔猪零星死亡现象的防控提供了一定科学依据。
胡哲[5]（2019）在《丹东市某猪场流行性腹泻诊断及防制研究》文中提出近几年来,PED广泛流行,已成为制约全球养猪业发展的顽疾和难题。本课题通过丹东市某猪场2013-2017年度连续6次爆发流行性猪腹泻疫病发病规律、病原检测和防制措施的探索研究,为规模化猪场PED的快速诊断与鉴别诊断、快速扑灭与有效防制提供重要思路、科学依据和宝贵经验。本试验于2013-2017年度采用临床检查、发病统计、病理剖解、PEDV胶体金试纸条检查、PEDV的RT-PCR对954头病猪进行诊断和鉴别诊断。结果:本病流行特点多发生在寒冷季节,各种猪只都发病,但仔猪缺少抗体最易感,日龄越小病死率越高,治疗效果不尽理想;仔猪典型症状为拉黄白色或灰褐色水样粪便,迅速脱水衰竭而亡;特征病变为小肠壁变薄、肠系膜淋巴结肿大、出血、胃黏膜充血或出血、肾脏有出血点、脾脏边缘梗死;p H试纸检测为弱酸性,PEDV胶体金试纸条检测564头为强阳性;RT-PCR检测PEDV为阳性,S1基因测序确诊为2011年PEDV流行毒株感染,与AJ1102同源率97.5%,KDGG13-2013同源率97.2%,与CH-LNC-2012S、USA2014、South Korea-2008同源率97.0%,与PEDV4-S-3同源率96.6%。本课题于2015年度进行仔猪药物治疗对比试验:将受试10日龄以内腹泻仔猪随机分为5组,每组30头。1组为西药治疗组,2组为中药治疗组,3组为中西医结合治疗组,4组为补液盐+干扰素诱导剂治疗组,5组为致病不治疗对照组。结果4组效果最好,治疗有效率和痊愈率分别为56.7%、30%。于2016年度进行母猪返饲防制对比试验:试验分3个组,1组返饲对象是临产前15d以内的妊娠母猪,2组返饲对象是临产前15～30d的妊娠母猪,对照组母猪不作任何处理。结果试验2组效果最好,腹泻率和死淘率分别为43.77%、34.74%,均与对照组差异显着（P<0.05）。于2016年2月至2017年10月进行综合防制改进方案实施效果对比试验:采用母猪返饲+自家组织苗接种+配套生物安全综合措施,母猪和仔猪抗原阳性率均明显降低,抗体阳性率提高19%～34%,母猪产仔和仔猪成活数显着提升;仔猪腹泻发病率、死淘率分别降至4.7%、0.37%,有效防止了PED的发生。试验结果表明:快速科学诊断是防制PED的前提条件,（口服补液盐+干扰素诱导剂）+隔离消毒+母猪返饲+自家组织苗接种+配套生物安全综合措施是防制PED的有效措施。
周玲[6]（2018）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒的回顾性检测、分离鉴定及荧光定量探针法的建立》文中指出猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV）作为一种新发现的冠状病毒,属于冠状病毒科Alpha冠状病毒属,是有囊膜包被的单股正链RNA病毒,自2017年首次在中国猪场发现和报道以来,已经在广东清远地区猪场引发了严重的仔猪腹泻疫情。本研究对收集自广东地区45个猪场的236份腹泻病料进行回顾性检测,以确定SADS-CoV的最早出现时间及分布情况。结果表明,SADS-CoV至少在2016年7月前就已经在猪场出现,目前广东地区11个猪场检出为SADS阳性。腹泻病原的混合感染调查结果显示SADS-CoV的阳性检出率为43.5%,仅次于PEDV的阳性检出率（78.2%）,而SADS-CoV-PEDV混合感染的类型也最为普遍。对SADS-CoV阳性猪场腹泻病料进行测序分析,共获得两条SADS-CoV全基因组序列、五条N基因序列和五条S基因序列,序列比对显示所得五个阳性猪场的序列相似性高达99%-100%,系统遗传进化分析表明研究中所获得的所有SADS-CoV序列与先前报道的SADS-CoV毒株序列处在同一AlphaCoVs分枝并且与蝙蝠冠状病毒HKU2毒株有着最接近的亲源关系。与此同时,本研究建立了一种针对SADS-CoV的快速可靠的鉴定和定量的诊断方法。依据SADS-CoV N基因保守区域设计并合成了特异性的引物和荧光探针,建立了一种TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,此方法中的引物和探针与其他十几种猪病原不发生交叉反应,特异性良好;检测灵敏度是普通RT-PCR的10倍,174份临床样品中,探针法SADS-CoV阳性检出率为70.69%,普通RT-PCR检出率为51.15%。这些数据证明了SADS-CoV TaqMan探针法具有高度的灵敏性（检出下限为1×101 copies/μL）、特异性和可重复性（变异系数<2%）,是一种适用于临床SADS-CoV快速检测和准确定量的方法。本研究以四个SADS-CoV阳性猪场的仔猪肠道研磨物悬液为材料进行病毒分离鉴定。在添加8μg/mL胰酶的条件下,SADS-CoV能在Vero细胞中稳定增殖并出现明显病变,从而成功分离出4株SADS-CoV病毒株（SADS-CoV-CN/GDDCD/2017、SADS-CoV-CN/GDWT/2017、SADS-CoV-CN/GDDE/2017以及SADS-CoV-CN/GDST/2017）。对4株SADS-CoV病毒株进行全基因组序列测定,序列比对结果表明,从细胞分离出的SADS-CoV毒株彼此间以及与已有的SADS-CoV毒株相比相似性在99%以上。在电镜下可以观察到明显的冠状病毒粒子,用间接免疫荧光方法检测,可以看到胞浆部位有特异性荧光,以上结果证明成功分离到4株SADS-CoV病毒株。为了确定SADS-CoV分离株对仔猪具有致病性,用第9代WT分离株(TCID50为106.625/mL)对3天龄无腹泻病原感染的仔猪进行动物回归试验,攻毒组和对照组各6头,分别口服6 mL病毒液和DMEM,攻毒后每天记录临床症状并检测腹泻病原。结果显示,攻毒后48 h,攻毒组全部水样腹泻,体重下降,腹泻病原检测只有攻毒组呈SADS-CoV阳性。到攻毒后第4 d,攻毒组仔猪3/6死亡,而对照组仔猪表现正常。在攻毒后第2d、3 d、4 d剖检仔猪,可观察到攻毒组仔猪肠道变得薄而透明,肠腔充满黄色水样,对照组无明显症状。各组织器官带毒量检测结果显示,SADS-CoV具有小肠嗜性,在小肠部位（空肠、回肠、十二指肠,肠系膜）带毒量相对较高。动物回归试验证明SADS-CoV分离病毒株能引起仔猪腹泻等临床症状,具有致病性。
陈芳洲[7]（2017）在《猪流行性腹泻病毒的感染和分子特征及下一代测序技术在挖掘新病原的应用研究》文中进行了进一步梳理猪肠道冠状病毒病主要病原是猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪重组肠道冠状病毒（Se CoV）以及新近报道的猪肠道阿尔法冠状病毒（PEACoV）。这些病原感染导致猪不同程度的肠道问题,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前,世界范围内猪肠道冠状病毒病呈现出新发和再发特点。传统意义上,TGEV和猪A群轮状病毒（RV）可引起不同日龄仔猪发生腹泻。但自2010年底以来,免疫猪群中出现了变异PEDV导致包含中国和美国在内的全球主要养猪国家发生PED,造成严重经济损失。本文围绕猪流行性腹泻病毒的感染和分子特征及下一代测序技术在新病原挖掘方面的应用进行了如下研究:1.我国PED流行情况及PEDV的分子特征2010年底以来,以免疫猪群发病、传播速度快、季节性不明显、发病率和死亡率高为临床特征的腹泻病在我国主要养猪区蔓延。为了研究我国三种常见病原的感染特点,本研究使用三重RT-PCR方法（PEDV、TGEV和Po RV）检测了我国2012年至2015年的采集的2643份临床样品。结果表明,这一期间PEDV、TGEV和Po RV的检出率分别是61.1%（1615/2643）、0.6%（12/2076）和5.2%（95/1828）。在此基础上,为了增加对中美两国新型PEDV毒株基因特征的了解,本文测定了不同PEDV毒株的全S基因和全基因组序列,并进行了比对分析,阐明了新毒株与传统疫苗毒株之间的基因差异。为了进一步研究我国不同PEDV毒株的多样性,本研究对其中的91份典型样品的S1（1-1323bp）以及其中的46个样品的ORF3基因进行了测序,结果显示变异PEDV毒株基因型在我国占主导地位。发现了区分不同PEDV毒株的分子标记,为建立鉴别诊断方法奠定基础。同时与国内同期报道的314个PEDV毒株基因序列进行比较分析,旨在揭示我国猪流行性腹泻的病原学特点。2.美国PED流行情况及PEDV的分子特征通过分析了UMVDL提供的2016年12月-2017年5月来源于美国24个州的13,269份样品的三重（PEDV、PDCoV和TGEV）定量RT-PCR的检测数据。检测结果表明PEDV、PDCoV和TGEV的检出率分别是5.8%（763/13,269）、1.0%（137/13,269）和低于0.01%（2/13,269）,结果表明,PEDV是最常见的猪腹泻性病原。序列测定发现,在美国流行的PEDV毒株主要分为新发的强毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株。为了给临床检测提供快速简便方法,依据这两种PEDV S基因序列差异,设计引物,通过条件优化,建立了具有良好特异性和敏感性的二重RT-PCR鉴别诊断方法。应用该方法检测287份PEDV阳性样品,结果表明强毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株单独感染的比率分别为80.8%（232/287）和14.6%（42/287）,这两种毒株的混合感染率是1.0%（3/287）。结果表明该方法与之前报道的定量RT-PCR方法的的符合率为:INDELs PEDV毒株91.3%（42/46）、强毒力PEDV毒株96.6%（229/237）和INDELs PEDV毒株和毒力PEDV毒株75%（3/4）。统计学分析表明两种检测方法差异不显着。3.新型PEDV毒株分离鉴定和传代致弱研究从临床上发生典型腹泻猪场（该猪场存在严重的腹泻问题,一周龄仔株的死亡率可以高达80%）的仔猪病料中,分离到一株具有代表性的新型PEDV毒株,S基因和全基因组测序,与PEDV流行毒株的同源性较高,确定是变异毒株,命名为PEDV YN1株。为了解新型PEDV毒株的特点以及为减毒疫苗研制奠定基础。将YN1株在Vero细胞上连续传代200代次,采集不同代次病毒进行全基因组测序,明确了不同代次病毒的基因变化特点,分析基因变化与细胞适应性、毒力之间的关系。通过比较新型PEDV毒株YN1与其不同代次衍生毒株的全基因组序列发现,伴随着传代过程,PEDV全基因组序列变化加剧,NSP2、NSP4-7、NSP10、NSP12和NSP13和新型PEDV毒株的细胞适应性没有直接的关系。不同PEDV毒株的毒力减弱的分子特点是ORF1a/b和S蛋白存在9-26aa的改变,S蛋白存在1-3个aa的缺失,ORF3的提前终止和8aa的改变,E、M和N蛋白存在1-3aa的改变。一些核苷酸水平的同义突变,可能也会对新型PEDV毒株的减毒有关。S蛋白144aa位点的1aa的缺失是新型PEDV毒株减弱的标志。结合动物感染试验结果,表明ORF3基因的提前终止对PEDV毒株的细胞适应性比对其减毒性更为重要。将传代致弱的PEDV YN144株接种仔猪,没有观察到腹泻症状,表明YN144为减毒毒株。有限的临床试验证明,该毒株对仔猪和妊娠母猪安全,并能刺激母猪在乳汁中产生针对PEDV的Ig A,具有作为口服疫苗的潜力,为后续的新型PEDV毒株弱毒疫苗的研究奠定基础。4.下一代测序技术在新病原挖掘方面的应用本研究通过下一代测序方法（NGS）在美国发现了新型TGEV毒株。对明尼苏达大学兽医诊断实验室（UMVDL）提供采集自美国41个州的2008年1月至2016年11月份的29,397个临床病料的TGEV定量检测数据进行了分析,研究了这期间美国TGE的流行情况,结果表明TGE在美国呈现周期性的发生,在寒冷的季节多发。2013年之后TGEV在美国的检出小于0.4%。其次通过从头测序组装和比对,我们获得了18株美国TGEV的全基因组序列及一株美国PRCV毒株的全基因组序列,这18株TGEV毒株中,有16株拥有独特的8个基因缺失位点以及199个氨基酸序列的改变。遗传进化树分析表明,这16个毒株形成了新的进化分支。这种新型TGEV毒株在美国占主导地位,但其临床意义还需要进一步研究。对新近发现和鉴定的PRCV的全基因组序列分析发现,该毒株和美国TGEV毒株之间存在重组现象。综上所述,通过对中美猪肠道冠状病毒病的流行情况调查发现,其首要病原是PEDV。对中美PEDV毒株的的分子特征和分子流行病学的研究阐释了中美PED复杂的感染情况。对我国变异PEDV毒株分离和传代致弱的研究揭示了我国变异PEDV毒株的生物学特征并为后续弱毒苗的研制奠定基础。通过研究NGS在新病原挖掘方面的应用,可以帮助我们更好的应对新发和再发兽医临床疾病（比如新发的新型PED）。
郑逢梅[8]（2013）在《猪流行性腹泻流行毒株部分基因分子特征及防治措施研究》文中进行了进一步梳理自2010年10月起，猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）在中国严重暴发流行。为了解该病暴发的原因，对2010～2012年12株猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）华中地区流行毒株S基因进行克隆、测序及遗传进化分析。利用原核表达的PEDV河南流行毒株N基因蛋白建立了用于检测PEDV抗体的间接ELISA方法，为猪群PED疫情防控提供工具。另外，为控制此次PED疫情，研究制备PE D卵黄抗体并应用于临床，取得较好防控效果。1.2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析自2010年底开始，PED在中国境内出现严重暴发。为探讨该病突然再次暴发的原因，对2010年10月至2012年6月收集于华中地区11个地市的12株PEDV流行毒株S基因进行RT-PCR扩增、克隆及测序，并对其序列变化、遗传进化关系、抗原位点、糖基化位点和多肽极性进行分析。结果显示，12株PEDV流行毒株S基因部分核苷酸及氨基酸的改变使其关键序列明显不同于以往毒株，其中有11株流行毒株的S基因比现用疫苗毒株CV777多9个核苷酸，而且在其S1区N′端存在大量的氨基酸突变。遗传进化分析显示，12株PEDV华中地区毒株与2007～2009年韩国毒株、2007～2008年泰国毒株、2009～2010年越南毒株、2011年日本毒株及2010～2012年中国其它地区流行毒株亲缘关系均较密切，而与欧洲株（CV777、Br1/87）、中国现用疫苗株（CV777）及2003～2007年中国分离株（LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC）亲缘关系均较远。与现用疫苗株（CV777）相比，流行毒株S蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明显改变，提示PEDV在近年呈现快速变异和进化的趋势。2.PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立用RT-PCR从腹泻仔猪样本中扩增获得了1段PEDV河南流行毒株N基因全长序列，根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果，将N基因上两个大的抗原表位区（112～321位氨基酸）克隆至原核表达载体pET-32a，构建pET-32a-N重组质粒并转化至宿主菌BL2（1DE3）中。将重组菌在37℃的条件下加入IPTG进行诱导使该蛋白获得了高效表达，表达产物为融合蛋白，分子量约41.3kD。Western-blotting分析表明，所表达的蛋白可与PED小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法，抗原最佳包被量0.226μg/孔，血清最佳稀释度为1:100，二抗最佳稀释度为1:2000，待检血清OD450值≥0.28判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检测，母猪血清PED抗体阳性率为84.26%（166/197），仔猪血清阳性率为27.93%（31/111）。结果表明所建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好，可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查。3.猪流行性腹泻高免卵黄的制备及临床应用针对病毒变异、现有疫苗预防效果不佳等状况，为有效控制疫情的发生和流行，利用流行毒株制备了PED高免卵黄抗体，并对其防治效果进行了研究。以流行毒株制备PED灭活苗免疫产蛋母鸡，当卵黄抗体的琼扩效价达到1:128时收集鸡蛋制备PED高免卵黄液，通过人工感染治疗试验和临床治疗试验观察其效果。人工感染治疗试验结果表明，治疗组仔猪的死亡率为10%（1/10），而对照组死亡率高达100%；临床治疗试验结果表明，对不同地市5家规模化猪场1343头猪的治疗有效率为90%，预防有效率为91%。结果表明所制备的高免卵黄抗体对PED具有显着的防治效果。
杜季梅[9]（2013）在《仔猪病毒性腹泻流行病学调查及卵黄抗体在PEDV防治中的应用》文中进行了进一步梳理2010年11月至今，仔猪腹泻在全国范围内暴发。本次腹泻疫情以发病急、传播速度快、发病率高、死亡率高、波及面积广、造成的经济损失严重等特点，主要感染1周龄以内的产房仔猪，发病率90%以上，死亡率100%。为查明河南省新生仔猪急性腹泻疫情的主要病因，本研究分别应用RT-PCR和PCR方法对98个猪场送检的181份发病仔猪病料进行了猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的分子检测。结果显示，PEDV阳性检出率高达71.27%，与TGEV、PoRV、CSFV和PRV的混合感染阳性检出率分别为2.76%、2.21%、56.91%和17.13%，与CSFV、PRV的三重混合感染阳性检出率为17.10%，而与TGEV、PoRV的三重混合感染阳性检出率仅为0.55%；TGEV、PoRV、CSFV和PRV的阳性检出率分别为5.52%、2.21%、69.06%和44.20%，CSFV和PRV的混合感染阳性检出率为32.04%；腹泻病原检测阳性猪场在河南省分布较为均匀，但以豫北、豫南养猪密集区发病猪场比例较大。秋、冬季节比例较多，但春、夏季季节呈逐步上升趋势，规模化猪场阳性场所占比例远高于中小型猪场。研究结果证实新生仔猪急性腹泻疫情在河南全省猪场感染和流行极为普遍且季节性已日趋不明显，PEDV是引起此次疫情的最主要病因，但CSFV和PRV扮演着推波助澜的重要角色，TGEV、PoRV感染比例比较小。虽然大部分猪场使用目前市场上流通的胃流轮三联弱毒疫苗进行4次/年的预防，但均未起到保护效果，发病仔猪使用抗生素、抗病毒药、均无法控制该病。本研究利用发病仔猪肠道，制备组织灭活苗，定期免疫产蛋母鸡，制备抗PEDV特异性高免卵黄抗体。经实验室和临床试验证明卵黄抗体对新生仔猪的预防保护率达90%，保护率高，对2～3日龄发病仔猪的治疗效果不明显，但随着日龄的增大，卵黄抗体的治愈率逐渐增高。临床试验结果表明预防保护率达到90%以上的猪场34家，占65.38%，保护率在50%～90%的猪场有5家，占9.62%，预防效果理想。其中卵黄抗体预防保护率在50%以下有13家，占25.00%，通过病原检测结果分析，这些猪场均存在猪瘟病毒或伪狂犬病毒混合感染，所以单纯使用抗PEDV卵黄抗体效果较差，应根据猪场的病原检测结果分析原因，采取综合控制措施。
洪尼宁,张登祥,李涛,冉隆仲,虞天德[10]（2010）在《贵州省猪传染性胃肠炎及呼吸冠状病毒病血清学调查》文中研究指明用酶联免疫吸附试验对采自贵州省内88个县（市）的2906份血清进行了猪传染性胃肠炎病毒及呼吸冠状病毒抗体检测,结果检出猪传染性胃肠炎病毒抗体阳性血清12份,总体阳性率为0.41%;猪呼吸冠状病毒抗体阳性血清44份,总体阳性率为1.51%;2818份血清两种抗体均呈阴性（阴性率为96.97%）,32份血清检测无效或无结论（无效率为1.10%）。
二、大庆地区某猪场猪传染性胃肠炎的调查与防制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大庆地区某猪场猪传染性胃肠炎的调查与防制（论文提纲范文）
（1）黑龙江省某猪场猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集与处理 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 主要试剂及设备 |
| 1.4 病毒RNA提取与c DNA合成 |
| 1.5 样品巢式RT-PCR检测 |
| 1.6 病毒的分离培养 |
| 1.7 RT-PCR病原特异性鉴定 |
| 1.8 间接免疫荧光试验 |
| 1.9 电镜观察 |
| 1.1 0 病毒TCID50计算 |
| 2 结果 |
| 2.1 样品巢式RT-PCR鉴定结果 |
| 2.2 病毒分离CPE观察 |
| 2.3 RT-PCR病原特异性鉴定结果 |
| 2.4 IFA鉴定结果 |
| 2.5电镜观察结果 |
| 2.6 病毒TCID50计算结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）规模化猪场流行性腹泻综合性防控措施的探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述: 猪流行性腹泻研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 诊断 |
| 1.7 预防和控制 |
| 1.8 猪流行性腹泻疫苗的研究进展 |
| 1.8.1 灭活疫苗的研究进展 |
| 1.8.2 活疫苗的研究进展 |
| 1.8.3 基因工程疫苗的研究进展 |
| 第2章 某公司下属规模化猪场仔猪流行性腹泻流行、诊断与母猪初乳中IgA抗体水平的监测 |
| 1.1 材料来源场相关情况介绍 |
| 1.1.1 各牧场不同胎次母猪存栏情况 |
| 1.1.2 各牧场日常护理方案 |
| 1.1.3 各牧场猪流行性腹泻的免疫程序 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 病料来源 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 临床症状观察 |
| 1.3.2 病理解剖 |
| 1.3.3 实验室分析检测 |
| 1.3.4 初乳的采集 |
| 1.3.5 乳样抗体的ELISA检测 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 下属各规模化猪场仔猪流行性腹泻的流行情况 |
| 1.4.2 临床症状 |
| 1.4.3 病死猪剖检病变 |
| 1.4.4 胶体金检测 |
| 1.4.5 RT-PCR鉴定 |
| 1.4.6 S1基因测序与比对结果 |
| 1.4.7 初乳中IgA抗体阳性率分析 |
| 1.4.8 初乳中IgA抗体平均值分析 |
| 1.4.9 初乳中IgA抗体离散度分析 |
| 1.4.10 小结 |
| 1.5 讨论 |
| 第3章 示范场猪流行性腹泻综合性防制措施的研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品来源 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 优化生物安全措施 |
| 1.2.2 优化免疫程序 |
| 1.2.3 加强日常保健与消毒 |
| 1.2.4 突发疫情处置 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 生物安全措施实行状况 |
| 1.3.2 优化免疫后母猪初乳中IgA抗体OD值 |
| 1.3.3 优化免疫后母猪初乳中IgA抗体离散度 |
| 1.3.4 防控效果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒形态及分子生物学特征研究 |
| 1.1 轮状病毒形态 |
| 1.2 轮状病毒分子生物学特征 |
| 2 猪轮状病毒的诊断方法研究进展 |
| 2.1 猪轮状病毒的临床诊断方法 |
| 2.2 猪轮状病毒实验室诊断方法 |
| 3 猪轮状病毒病流行现状 |
| 4 猪轮状病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 猪轮状病毒灭活苗 |
| 4.2 猪轮状病毒弱毒活疫苗 |
| 4.3 猪轮状病毒新型疫苗 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 RT-PCR检测 |
| 1.4 数据处理与分析 |
| 1.5 VP7 和VP4 基因克隆与序列鉴定 |
| 1.6 VP7 基因和VP4 基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 华东地区猪轮状病毒病流行病学调查 |
| 2.2 VP7 和VP4 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 PoRV480-VP4*基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.4 重组480-VP4*蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 1.5 重组480-VP4*蛋白浓度测定 |
| 1.6 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.7 间接ELISA的临界值 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 与中和抗体检测的比对试验 |
| 1.12 间接ELISA检测临床猪血清样品 |
| 2 结果 |
| 2.1 Po RV480-VP4*基因原核表达载体的构建 |
| 2.2 重组Po RV480-VP4*蛋白SDS PAGE和 Western Blot试验 |
| 2.3 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 2.4 间接ELISA的临界值 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 与中和抗体检测的比对试验结果 |
| 2.9 间接ELISA检测临床猪血清样品结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪轮状病毒不同截短VP4 蛋白免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计及目的基因扩增 |
| 1.4 不同的重组基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.5 重组蛋白诱导表达、纯化及鉴定 |
| 1.6 纯化的重组蛋白浓度测定 |
| 1.7 疫苗制备 |
| 1.8 试验动物及免疫接种 |
| 1.9 血清ELISA抗体检测 |
| 1.10 血清中和抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒RT-PCR产物及双酶切产物电泳结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.3 重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.4 纯化的重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.5 纯化的重组蛋白浓度测定结果 |
| 2.6 血清ELISA抗体检测结果 |
| 2.7 血清中和抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）渝西地区零星死亡哺乳仔猪四种腹泻病调查及RVA VP7基因生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 猪流行性腹泻 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎 |
| 1.4 猪Delta冠状病毒病 |
| 1.5 猪轮状病毒病 |
| 1.6 猪轮状病毒VP4、VP7蛋白 |
| 1.7 小结 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究技术路线 |
| 第3章 渝西地区零星死亡哺乳仔猪4种病毒性腹泻调查 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 分析讨论 |
| 第4章 猪轮状病毒分离株基因型及VP7基因序列生物信息学分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 分析讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）丹东市某猪场流行性腹泻诊断及防制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 猪流行性腹泻病原学 |
| 2 猪流行性腹泻流行特点 |
| 3 猪流行性腹泻传播途径 |
| 4 猪流行性腹泻发病机理 |
| 5 猪流行性腹泻诊断方法与鉴别诊断 |
| 5.1 感观诊断与鉴别诊断 |
| 5.2 实验室诊断与鉴别诊断 |
| 6 猪流行性腹泻常规防制措施 |
| 7 本研究的目的意义 |
| 第二章 发病猪场流行性腹泻的诊断 |
| 1 材料 |
| 1.1 目标猪场 |
| 1.2 用品、药品及设施 |
| 1.3 PEDV试剂与器材 |
| 1.4 PEDV、RT-PCR样品 |
| 1.5 PCR检测设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床检查 |
| 2.2 发病统计 |
| 2.3 病理解剖 |
| 2.4 PEDV胶体金试纸条检查 |
| 2.5 PEDV的RT-PCR检查 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 发病情况(发病率、死淘率) |
| 3.3 剖检病理变化 |
| 3.4 PEDV胶体金试纸条检测结果 |
| 3.5 RT-PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生猪抗体水平低是爆发PED的直接原因 |
| 4.2 猪舍设施陈旧老化是爆发PED的客观原因 |
| 4.3 生物安全体系缺失是爆发PED的主观原因 |
| 4.4 人员和饲养管理不到位是爆发PED的重要原因 |
| 5 小结 |
| 第三章 仔猪流行性腹泻防制方法研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 仔猪药物治疗效果对比试验材料 |
| 1.2 母猪人工返饲效果对比试验材料 |
| 1.3 综合防制改进方案实施效果对比试验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 仔猪药物治疗效果对比试验方法 |
| 2.2 母猪人工返饲预防效果对比试验方法 |
| 2.3 综合防制改进方案实施效果对比试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 仔猪药物治疗效果对比试验结果分析 |
| 3.2 母猪人工返饲效果对比试验结果分析 |
| 3.3 综合防制改进方案实施效果对比试验结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 口服补液盐和干扰素诱导剂的治疗作用 |
| 4.2 返饲母猪的选择对PEDV免疫抗体的影响 |
| 4.3 病料选择、处理和使用对返饲效果的影响 |
| 4.4 疫苗选择与接种对PEDV免疫效果的影响 |
| 4.5 免疫抑制性疫病对PED免疫效果的影响 |
| 4.6 建立生物安全屏障对防控PED至关重要 |
| 4.7 霉变饲料饲喂母猪对PED发生的影响 |
| 5 小结 |
| 5.1 10日龄以内发病仔猪无特效药物 |
| 5.2 临产前15~30d的妊娠母猪返饲好 |
| 5.3 母猪返饲+自家组织苗接种效果好 |
| 5.4 隔离消毒是防制PED的重要手段 |
| 5.5 综合防制改进方案可有效防止PED发生 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（6）猪急性腹泻综合征冠状病毒的回顾性检测、分离鉴定及荧光定量探针法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 猪病毒性腹泻 |
| 1.2 冠状病毒概述 |
| 1.2.1 冠状病毒病原学特性 |
| 1.2.2 冠状病毒流行病学 |
| 1.2.3 猪腹泻冠状病毒 |
| 1.3 SADS-CoV研究进展 |
| 1.3.1 临床症状表现 |
| 1.3.2 宏基因组学分析 |
| 1.3.3 SADS-CoV感染宿主细胞受体探究 |
| 1.3.4 SADS-CoV动物回归试验 |
| 1.3.5 SADS-CoV感染诊断方法研究 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞与菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 广东地区规模化猪场SADS-CoV回顾性检测及分析 |
| 2.2.1.1 病料收集 |
| 2.2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.2.1.3 临床腹泻样品的处理及核酸提取 |
| 2.2.1.4 临床样品SADS-CoV检测 |
| 2.2.1.5 SADS-CoV阳性猪场腹泻病原的检测 |
| 2.2.1.6 SADS-CoV阳性场全基因组及N和S基因测序分析 |
| 2.2.2 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.2.1 病毒、临床样品收集 |
| 2.2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.2.3 标准阳性模板的制备 |
| 2.2.2.4 TaqMan-basedreal-time RT-PCR条件最优化 |
| 2.2.2.5 TaqMan-basedreal-time RT-PCR引物特异性验证 |
| 2.2.2.6 TaqMan-basedreal-time RT-PCR标准曲线的制作 |
| 2.2.2.7 TaqMan-basedreal-time RT-PCR方法与普通RT-PCR灵敏性对比试验 |
| 2.2.2.8 TaqMan-basedreal-time RT-PCR的重复性试验 |
| 2.2.2.9 临床样品的验证 |
| 2.2.3 SADS-CoV的分离鉴定和细胞分离株的动物回归试验 |
| 2.2.3.1 样品 |
| 2.2.3.2 SADS-CoV的分离鉴定 |
| 2.2.3.3 SADS-CoV分离株全基因组序列测定与分析 |
| 2.2.3.4 SADS-CoV分离病毒株的纯化和电镜观察 |
| 2.2.3.5 SADS-CoV间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.3.6 SADS-CoV细胞分离株的动物回归试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 规模化猪场SADS-CoV回顾性检测及序列分析结果 |
| 3.1.1 临床腹泻样品筛查结果 |
| 3.1.2 SADS-CoV阳性猪场腹泻病原的检测结果 |
| 3.1.3 SADS-CoV阳性场腹泻病原混合感染情况调查 |
| 3.1.4 SADS-CoV全基因组及N和S基因序列测定与分析结果 |
| 3.1.4.1 全基因组分片段PCR扩增结果 |
| 3.1.4.2 SADS-CoV全基因组序列及N、S基因遗传进化分析 |
| 3.2 SADS-CoV TaqMan-based real-timeRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 标准品质粒的制备 |
| 3.2.2 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR方法条件优化 |
| 3.2.3 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR引物特异性验证 |
| 3.2.4 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR标准曲线的建立 |
| 3.2.5 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR与普通RT-PCR灵敏性对比 |
| 3.2.6 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR重复性试验 |
| 3.2.7 临床样品的验证结果 |
| 3.3 SADS-CoV的分离鉴定和细胞分离株的动物回归试验 |
| 3.3.1 病料检测结果 |
| 3.3.2 SADS-CoV的分离鉴定结果 |
| 3.3.2.1 病毒的培养 |
| 3.3.2.2 SADS-CoV的分离鉴定 |
| 3.3.3 四株SADS-CoV全基因组序列测定与分析结果 |
| 3.3.4 SADS-CoV的纯化及电镜观察结果 |
| 3.3.5 SADS-CoV间接免疫荧光结果 |
| 3.3.6 SADS-CoV细胞分离株动物回归试验结果 |
| 3.3.6.1 肛拭子腹泻病原检测结果 |
| 3.3.6.2 攻毒后仔猪临床症状和病变组织观察 |
| 3.3.6.3 组织器官病毒含量测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 广东地区规模化猪场SADS-CoV回顾性检测分析 |
| 4.2 SADS-CoV TaqMan-based real-time RT-PCR检测方法 |
| 4.3 SADS-CoV的分离鉴定和动物回归试验 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 硕士期间所获奖励与发表文章 |
（7）猪流行性腹泻病毒的感染和分子特征及下一代测序技术在挖掘新病原的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 猪肠道冠状病毒的研究进展 |
| 1.2.1 猪冠状病毒的概述 |
| 1.2.2 猪冠状病毒的基因结构和功能 |
| 1.3 鉴定病毒的主要方法 |
| 1.3.1 病毒的分离 |
| 1.3.2 光学和电子显微镜的观察 |
| 1.3.3 抗原检测 |
| 1.3.4 病原检测 |
| 1.3.5 血清学检测方法 |
| 1.4 NGS的介绍和在兽医领域的应用 |
| 1.4.1 NGS的介绍 |
| 1.4.2 NGS的主要过程及问题 |
| 1.4.3 测序技术的发展情况简介和主要的第二代测序平台 |
| 1.4.4 NGS的主要应用有哪些 |
| 1.4.5 NGS在兽医领域的应用 |
| 1.5 PED的流行病学 |
| 1.5.1 PED的概述 |
| 1.5.2 PED的流行 |
| 1.6 猪传染性胃肠炎(TGE)和猪呼吸道冠状病毒病(PRC)的流行特点 |
| 1.6.1 TGE和PRC的概述 |
| 1.6.2 TGE和PRC的流行 |
| 1.7 猪冠状病毒病疫苗研究进展 |
| 1.7.1 TGE疫苗 |
| 1.7.2 北美使用的PED商业化疫苗 |
| 1.7.3 我国和其它东亚国家使用的PED商业化疫苗 |
| 1.8 PEDV的鉴别诊断研究 |
| 1.9 立题依据 |
| 第二章 我国PED流行情况及PEDV的分子特征 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.2.4 缓冲液及培养基 |
| 2.2.5 引物的设计和合成 |
| 2.2.6 样品的处理 |
| 2.2.7 样品RNA的提取 |
| 2.2.8 cDNA的合成 |
| 2.2.9 重组质粒的构建 |
| 2.2.10 序列信息的分析和比较 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 临床检测结果 |
| 2.3.2 PEDV毒株的S基因和全基因进化树分析 |
| 2.3.3 PEDVS基因和全基因相似性分析 |
| 2.3.4 PEDVS基因和全基因序列同源性分析 |
| 2.3.5 PEDVS基因的特征分析 |
| 2.3.6 PEDVS蛋白的特征分析 |
| 2.3.7 不同类型PEDV毒株基因特征分析 |
| 2.3.8 我国PEDV毒株部分S基因系统进化树分析 |
| 2.3.9 我国PEDV毒株的系统进化地理分布 |
| 2.3.10 我国PEDV毒株的序列同源性、抗原指数和亲水性图分析 |
| 2.3.11 区分不同类型PEDV毒株分子标记 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 美国PED的流行特点和分子特点研究 |
| 3.1 研究的目的及意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 数据与样品 |
| 3.2.2 主要设备和试剂 |
| 3.2.3 RNA的提取 |
| 3.2.4 二重RT-PCR用于区分INDELs和非INDELs毒株 |
| 3.2.5 扩增产物的测序 |
| 3.2.6 二重RT-PCR方法的特异性 |
| 3.2.7 二重RT-PCR方法的敏感性 |
| 3.2.8 二重RT-PCR方法的临床应用及其与定量检测方法的一致性 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 临床检测结果 |
| 3.3.2 猪肠道冠状病毒的地理分布 |
| 3.3.3 不同样品中猪冠状病毒的检测情况 |
| 3.3.4 美国流行PEDV毒株的类型 |
| 3.3.5 二重常规PEDV鉴别诊断RT-PCR的建立(特异性和灵敏性) |
| 3.3.6 二重常规PEDV鉴别诊断RT-PCR产物的测序验证 |
| 3.3.7 二重常规RT-PCR方法与定量检测方法的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 新型PEDV毒株的分离鉴定和传代致弱研究 |
| 4.1 研究的目的与意义 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 病料采集 |
| 4.2.2 细胞、菌株、载体和重要的仪器和设备 |
| 4.2.3 工具酶及主要试剂 |
| 4.2.4 培养基及相关试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 病料的处理 |
| 4.3.2 病毒的分离方法 |
| 4.3.3 PEDV的增殖 |
| 4.3.4 毒价的测定 |
| 4.3.5 细胞样品RNA的提取 |
| 4.3.6 间接免疫荧光(IFA) |
| 4.3.7 病毒空斑纯化 |
| 4.3.8 病毒生长曲线的绘制 |
| 4.3.9 病毒形态学 |
| 4.3.10 新型PEDV毒株的连续传代 |
| 4.3.11 YN1不同代次PEDV毒株的特性 |
| 4.3.12 传代后PEDV毒株的致病性研究 |
| 4.3.13 YN144临床安全性初步研究 |
| 4.3.14 统计分析 |
| 4.4 结果和分析 |
| 4.4.1 病毒的分离 |
| 4.4.2 间接荧光免疫(IFA) |
| 4.4.3 透射电镜观察YN1的病毒形态 |
| 4.4.4 不同代次PEDV毒株的生长特性 |
| 4.4.5 PEDVYN1毒株不同代次毒株致病性实验 |
| 4.4.6 不同代次全基因组序列的测定和核苷酸序列比较 |
| 4.4.7 YN144临床安全性初步研究 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 下一代测序技术在挖掘新病原的初步应用 |
| 5.1 研究的目的及意义 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 数据和样品 |
| 5.2.2 主要试剂、仪器和设备 |
| 5.2.3 安全注意事项 |
| 5.2.4 样品的处理 |
| 5.2.5 样品RNA的提取 |
| 5.2.6 IllumimaTruSeqRNA文库的制备和验证 |
| 5.2.7 NGS测序 |
| 5.2.8 序列信息的分析和比较 |
| 5.3 结果和分析 |
| 5.3.1 新型TGEV毒株的鉴定 |
| 5.3.2 不同TGEV和PRCV毒株全基因组的获得 |
| 5.3.3 2008-2016年间美国TGEV检测数据 |
| 5.3.4 TGEV和PRCV毒株基因组特点 |
| 5.3.5 TGEV毒株的变异性分析 |
| 5.3.6 TGEV毒株的entropy分析 |
| 5.3.7 TGEV毒株的重组分析 |
| 5.3.8 TGEV和PRCV进化树和地理分布分析 |
| 5.3.9 蛋白同源模建 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基本信息 |
| 致谢 |
（8）猪流行性腹泻流行毒株部分基因分子特征及防治措施研究（论文提纲范文）
| 致谢 摘要 文献综述 |
| 1. 猪流行性腹泻病毒研究进展 |
| 1.1 PEDV 的一般生物学特征 |
| 1.2 PEDV 的基因组成及其特点 |
| 1.3 PEDV 的变异 |
| 2. 猪流行性腹泻防治研究进展 |
| 2.1 猪流行性腹泻的危害 |
| 2.2 猪流行性腹泻的诊断 |
| 2.3 猪流行性腹泻的免疫预防 |
| 2.4 猪流行性腹泻的卵黄抗体防治 |
| 3. 本研究的目的和意义 试验一 2010～2012 年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 试验二 PEDV 流行株 N 基因主要抗原表位原核表达及 ELISA 方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 试验三猪流行性腹泻高免卵黄抗体的制备及临床应用 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 全文总结 参考文献 英文摘要 附：作者读研期间已发表文章 |
（9）仔猪病毒性腹泻流行病学调查及卵黄抗体在PEDV防治中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 文献综述（一）引起仔猪腹泻的病毒性疾病概述 |
| 文献综述（二）卵黄抗体研究进展 |
| 试验一 猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒RT-PCR、PCR 方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验二 河南省规模化猪场猪 PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRV 的流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验三 抗猪流行性腹泻病毒高免卵黄的制备及临床应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
四、大庆地区某猪场猪传染性胃肠炎的调查与防制（论文参考文献）
- [1]黑龙江省某猪场猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定[J]. 颜子涵,原冬伟,李明月,王一,孙东波. 黑龙江八一农垦大学学报, 2021(02)
- [2]规模化猪场流行性腹泻综合性防控措施的探讨[D]. 吴中彬. 扬州大学, 2021(02)
- [3]华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究[D]. 常新见. 西藏大学, 2020(12)
- [4]渝西地区零星死亡哺乳仔猪四种腹泻病调查及RVA VP7基因生物信息学分析[D]. 王先松. 西南大学, 2020(01)
- [5]丹东市某猪场流行性腹泻诊断及防制研究[D]. 胡哲. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [6]猪急性腹泻综合征冠状病毒的回顾性检测、分离鉴定及荧光定量探针法的建立[D]. 周玲. 华南农业大学, 2018(08)
- [7]猪流行性腹泻病毒的感染和分子特征及下一代测序技术在挖掘新病原的应用研究[D]. 陈芳洲. 华中农业大学, 2017(01)
- [8]猪流行性腹泻流行毒株部分基因分子特征及防治措施研究[D]. 郑逢梅. 河南农业大学, 2013(04)
- [9]仔猪病毒性腹泻流行病学调查及卵黄抗体在PEDV防治中的应用[D]. 杜季梅. 河南农业大学, 2013(05)
- [10]贵州省猪传染性胃肠炎及呼吸冠状病毒病血清学调查[J]. 洪尼宁,张登祥,李涛,冉隆仲,虞天德. 中国畜牧兽医, 2010(12)