一、A STUDY ON THE TREATMENT OF GASTRIC CANCER BY CD GENE COMBINED WITH 5-FC IN VITRO AND IN VIVO（论文文献综述）
许晨[1]（2019）在《基于生物小分子构建多羟基阳离子基因载体》文中研究说明基因治疗作为一种新型的医学手段可以用于治疗遗传性疾病,心血管疾病以及癌症等严重疾病,其主要是通过导入治疗性的基因取代突变基因或补充缺失基因,或者通过抑制相关病变蛋白的表达来实现根源上的治疗。基因治疗中最为重要的是要寻找到高效安全的基因载体。相比于安全性不高,具有免疫原性的病毒类载体,越来越多的非病毒类载体开始逐渐被人们引入治疗体系的构建。近年来我们组报道了一系列关于乙醇胺（EA）功能化的甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）衍生物（PGEA）拥有较好的基因转染效率。同时其结构中大量的羟基可以保证载体具有较好的血液循环性和较低的毒性。然而这类载体的功能比较单一,转染效率仍然没有达到预期的目标,需要进一步功能化修饰。脂质是一类优异的生物小分子,也是细胞膜的重要组成部分。由于这类生物小分子具有优良的生物特性,其被广泛的应用于各种生物应用中。通过将膜脂质引入基因载体体系可以有效的增加载体的生物相容性,细胞吞噬效率和转染效率。在第二章中,我们通过原子转移自由基活性聚合（ATRP）方法构建了 一系列膜脂质胆固醇基和磷脂酰肌醇基的PGEA,分别为CHO-PGEA和PI-PGEA。这两种载体相比于国际金标PEI（25 kDa）和单纯的PGEA而言这两者都具有更好的转染效率。此外,在体内外两个载体与抑瘤基因p53形成的络合物都有良好的抗肿瘤效果,相比较于对照组肿瘤的质量可以平均降至0.15g以下。基于在肿瘤治疗中的良好的性能,我们又探究了 CHO-PGEA在心血管疾病中的应用。CRISPR/Cas9系统作为一类高效的工具可以通过基因编译对基因突变的疾病进行治疗。但是由于血管内皮结构完整这一生理障碍,目前递送CRISPR/Cas9系统治疗血管遗传病仍然是一个挑战,尤其是在胸主动脉上。在第三章中,我们提出可以利用CHO-PGEA携带pCas9-sgFbn1在体外编译Fbn1基因的10号外显子。更为重要的是,在血管紧张素（Ang Ⅱ）的辅助下,CHO-PGEA/pCas9-sgFbn1纳米系统可以有效的在体内实现血管基因的编译,编辑后的血管扩张约0.01 mm,与预期结果一致。在这章中,我们同时证明了 CHO-PGEA可以被当作心脏肥厚基因治疗的有效载体,以防止其过度发展导致心脏衰竭和猝死。在体内治疗中,CHO-PGEA载体可以有效的递送miR-182-in进入心肌细胞,拮抗心脏中过量的miR-182从而上调FOX03因子。相比于未经治疗组心脏体重比扩大到正常组1.5倍的情况,该治疗可以有效的改善心脏肥厚的状况。CHO-PGEA在这类疾病中有两大优点,首先是由于心肌细胞中有大量的胆固醇的存在,这种载体可以更有效的进行转染。其次,大量的羟基可以使耐受力较差的心肌细胞能在低毒性下被有效的转染。主动脉夹层（TAD）是一种危及生命的急性血管疾病,需要早期诊断和有效的治疗。但是由于病变血管结构的复杂性和狭小性,目前还没有较好的药物治疗体系。在第四章,我们构建了一种多功能的核酸递送系统（TP-Gd/miRNA-ColIV）。这个系统中以钆螯合的生物小分子单宁酸作为基体,包括低毒性的阳离子聚合物PGEA以及IV型胶原的靶向多肽ColIV,通过组装的方式形成的纳米复合物可以对TAD进行靶向治疗,早期诊断和病情监控。TP-Gd/miR-145-ColIV可以有效的携带miR-145对TAD进行治疗,在治疗后下TAD模型小鼠的胸主动脉夹层发生率可以有效的降低到不足20%。除此之外,实验数据证明TP-Gd/miRNA-ColIV拥有很好的核磁造影能力并且能够无伤的监控核酸系统对TAD的治疗效果。综上所述,我们使用不同的生物小分子修饰PGEA阳离子基因载体,构建出一系列效率更高,功能更丰富的基因载体,可以有效的针对不同的严重疾病。这些工作为将来的基因治疗策略的设计提供了借鉴意义
周盼盼[2]（2018）在《YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病的研究》文中认为背景:急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童时期最为常见的恶性肿瘤,其中又以B系（B-ALL）居多。随着诊疗水平的提高及治疗方案的改进,急淋患儿的缓解率和预后明显改善,但仍有20%-30%不能缓解而最终死亡,并且化疗副反应所引起的严重合并症也不容小觑,寻找新的治疗策略迫在眉睫。基因靶向治疗是当前恶性肿瘤治疗的研究热点,而自杀基因靶向疗法是其中最有前途的策略之一。然而由于缺乏将自杀基因传递至肿瘤组织的理想载体,使其发展受到阻碍,因此开发更有效的自杀基因系统及载体,提高靶向性具有重大意义。间充质干细胞（MSCs）具有肿瘤靶向迁移能力,且易被转导入各种基因片段,可作为肿瘤靶向治疗的理想载体。但是当前常规二维（2D）培养存在诸多缺点,可导致MSCs的趋化因子受体表达下降,削弱其迁移和归巢能力。而三维（3D）培养能更好地模拟体内微环境,改善细胞功能,因此研究MSCs的三维培养及其对细胞体内迁移能力的影响具有重大意义。此外,大量白血病细胞的生长必须依赖肿瘤微环境中新生血管的生成,其中VEGF（血管内皮生长因子）在血管新生和白血病细胞的抗凋亡进程中处于关键地位。因此寻找和应用有效抑制肿瘤微环境中VEGF水平和血管形成的策略具有重要意义。miRNAs可引起靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA的翻译,有效抑制靶蛋白的表达,因此筛选出可有效抑制MSCs和白血病细胞VEGF产生和血管形成的miRNA分子十分重要。再联合自杀基因系统和MSCs 3D培养技术,实现近距离杀伤和血管饥饿双重战术治疗B-ALL,达到良好的局部靶向治疗效果,同时降低系统用药的严重不良反应,以期为B-ALL的临床治疗提供新的策略和研究基础。目的:1.构建良好的脐带间充质干细胞（UCMSCs）三维培养体系,研究三维培养对细胞体内迁移和归巢能力的影响。2.构建高效低毒的以UCMSCs为载体的自杀基因系统。3.筛选出可有效抑制MSCs促血管形成能力的miRNA分子。4.构建高效低毒的自杀基因和miRNA双修饰的3D UCMSCs治疗B-ALL技术体系,抑制肿瘤生长增殖和血管形成,达到良好的靶向治疗效果。方法:1.脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究1.1脐带间充质干细胞的分离培养及流式鉴定:取新鲜健康新生儿脐带,采用组织块贴壁培养法分离培养人UCMSCs,显微镜下观察细胞形态,并行流式细胞术检测细胞表型 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和CD271的表达情况。1.2构建壳聚糖/β-甘油磷酸钠（β-GP）/胶原蛋白/MSCs-CM（间充质干细胞条件培养基）温敏水凝胶-UCMSCs三维培养体系:分别制备壳聚糖、β-GP和I型胶原蛋白溶液,收集脐带MSCs-CM,将它们以一定比例混合后制成温敏水凝胶并验证其温敏特性。显微镜观察联合CCK-8实验检测UCMSCs在水凝胶中的生长和增殖情况。1.3 构建猪脱细胞真皮基质支架（porcine acellular dermal matrix scaffold,PADM）-UCMSCs三维培养体系:将UCMSCs以一定密度种于PADM上,DAPI染色观察细胞的植入及存活状况。1.4比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs表面免疫标志的表达情况:流式细胞术检测PADM-UCMSCs三维支架中培养7天和14天的细胞表面标志的表达情况,以常规二维培养的UCMSCs为对照。1.5比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs重要受体的表达:RT-PCR以及Western blot检测比较常规二维培养和PADM-UCMSCs三维支架中培养3天的UCMSCsCXCR4（C-X-C趋化因子受体4）、TLR（Toll样受体）2、TLR3、TLR4和TLR6的表达情况。1.6比较二维及PADM-UCMSCs三维培养的UCMSCs体内迁移和归巢能力:分别将2D,3D和3D+AMD3100（CXCR4受体的抑制剂）培养组的男性UCMSCs移植至雌性BALB/c小鼠,分别于移植后8、24和48h三个时间点处死小鼠,提取各组小鼠心脏、肺、肝、脾、肾、卵巢和骨髓（BM）的基因组DNA,行PCR检测比较每只小鼠体内其它各组织相对于肺组织的SRY 基因（Sex-determining Region on the Y Chromosome,Y染色体性别决定基因）的相对含量。2.YCD:UPRT（酵母菌来源的胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶）和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病Nalm-6细胞体外作用研究2.1构建含有自杀基因YCD:UPRT的慢病毒载体:慢病毒载体采用以第三代载体系统为基础的四质粒体系构建而成。首先构建LV5-YCD:UPRT-GFP穿梭转移质粒,并行基因测序验证。然后将其和包装质粒共转染293T细胞,进行病毒的包装、收集和滴度测定。同法制备仅含有报告基因GFP（绿色荧光蛋白）的慢病毒载体作为阴性对照。2.2 YCD:UPRT-GFP稳转脐带间充质干细胞的建立及验证:慢病毒载体转染UCMSCs,荧光显微镜下观察转染效率。嘌呤霉素筛选稳转细胞（YCD:UPRT-GFP-UCMSCs）并行流式细胞术验证。同法筛选稳转的阴性对照GFP-UCMSCs。普通PCR检测未转染的UCMSCs、GFP-UCMSCs和YCD:UPRT-GFP-UCMSCs 细胞 YCD:UPRT 基因的表达情况。2.3研究YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-氟胞嘧啶（5-FC）自杀基因系统的自杀效应:CCK-8 实验分别检测 5-FC 对 UCMSCs 和 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs的杀伤效率,同时显微镜下持续观察细胞形态变化情况。2.4研究YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统对Nalm-6细胞的旁观者效应:将UCMSCs、GFP-UCMSCs 和 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs 分别与Nalm-6细胞共培养,再根据有无添加 5-FC,分成6组。前药（5-FC350μM）处理7天,行显微镜观察、细胞计数和流式细胞凋亡术检测并评估各组Nalm-6细胞的生长状态和凋亡情况。2.5具有抑制血管形成功能的miRNA的筛选及功能验证:首先RT-PCR检测比较 miRNA26a、miRNA27b、miR195 和 miRNA200b 转染对 UCMSCs VEGFA mRNA水平的抑制情况。挑选出抑制程度最高的miRNA并行Western blot检测验证。然后行HUVEC（人脐静脉内皮细胞）成血管实验检测其对UCMSCs的促血管形成能力的抑制情况,并行Western blot检测其对与UCMSCs共培养的Nalm-6细胞的VEGFA蛋白表达的抑制情况。3.YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的体内实验研究3.1急性B淋巴细胞白血病动物模型的建立和评估:裸鼠腹腔注射环磷酰胺溶液0.2mL（10mg/mL）1天后,给予 Nalm-6 细胞（1×107/mL）尾静脉注射0.2mL/只。每日密切观察小鼠行为状态和生存状况,以后肢出现瘫痪为发病标准,待其濒死时,脱颈处死,取肝、脾、肾组织行H&E染色,光镜观察各组织肿瘤细胞浸润情况。骨髓涂片瑞氏染色检测幼稚细胞比例。3.2 YCD:UPRT和miR195双修饰的3D脐带间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的方法和疗效评估:本实验分为四组,（A）正常对照组;（B）造模组;（C）UCMSCs+5-FC组;（D）YCD:UPRT+miR195双修饰的UCMSCs+5-FC组。造模1周后,分别给予两个疗程的各组相应的3D UCMSCs（1×106细胞/200μL/只）+5-FC（500mg/kg/d）X5天处理。然后从以下方面评估疗效:临床表现、体重变化及生存时间;待有第1只造模裸鼠后肢瘫痪时,各组随机选取5只小鼠,快速脱颈处死。行骨髓涂片瑞氏染色,计数并比较各组裸鼠骨髓幼稚细胞比例;取肝、脾、肾及骨髓行H&E染色、GFP免疫荧光染色、CD31和KI-67免疫组化染色检测和比较各组病理结果。结果:1.脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究1.1脐带间充质干细胞的分离培养及流式鉴定:本实验分离培养的细胞具有UCMSCs的典型形态和细胞表型特点。1.2壳聚糖/β-GP/胶原蛋白/MSCs-CM温敏水凝胶-UCMSCs三维培养体系构建成功:上述制备的水凝胶具有温敏特性。显微镜下观察UCMSCs在水凝胶三维结构中几乎完全伸展,黏附、生长良好,CCK-8实验表明UCMSCs在水凝胶中培养1周内的具有良好的增殖活性。1.3 PADM-UCMSCs三维培养体系构建成功:DAPI染色观察UCMSCs在PADM支架内植入和存活良好。1.4比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中 UCMSCs表面免疫标志的表达情况:PADM支架中3D培养14天,UCMSCs的CD105阳性率持续降低（P<0.05）,而CD34和CD271的阳性率在3D培养7天时较2D培养明显升高（P<0.05）。1.5比较二维及PADM-UCMSCs三维培养体系中UCMSCs重要受体的表达:RT-RCR和Western blot结果示在PADM三维支架中培养3天,UCMSCs细胞TLR2、TLR3、TLR4、TLR6及CXCR4的mRNA和蛋白表达水平均较二维培养组细胞明显增高（P<0.05）。1.6比较二维及PADM-UCMSCs三维培养的UCMSCs体内迁移和归巢能力:结果显示在输注8h后,以肺组织为对照,3D组UCMSCs向小鼠心脏、肝脏、脾脏和BM中迁移数量显着大于2D组（P<0.05）,但是AMD3100处理的3D细胞向肺以外其它各组织的迁移明显受到抑制,甚至低于2D组（P<0.05）。然而在移植后24h和48h,PCR检测结果示各组小鼠肺组织以外的其它各组织均未能检测到SRY基因。2.YCD:UPRT和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病Nalm-6细胞体外作用研究2.1携带自杀基因YCD:UPRT及报告基因GFP的重组慢病毒构建成功:LV5-YCD:UPRT-GFP穿梭转移质粒行基因测序验证YCD:UPRT基因序列正确。携带自杀基因YCD:UPRT及阴性对照GFP的慢病毒载体其病毒滴度均为 1×109TU/mL。2.2成功构建稳定表达YCD:UPRT-GFP的脐带间充质干细胞及验证:荧光显微镜观察示慢病毒转染UCMSCs成功。嘌呤霉素筛选后,流式细胞术验证GFP阳性的YCD:UPRT-GFP-UCMSCs的比例高达95%,表明高纯度的稳转细胞构建成功。同法获得作为阴性对照的GFP-UCMSCs。普通PCR结果示只有YCD:UPRT-GFP-UCMSCs可成功表达YCD:UPRT基因。2.3 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统具有高效的自杀效应:在本实验选用的浓度范围内,5-FC对UCMSCs本身无明显的细胞毒性,但是对YCD:UPRT-GFP-UCMSCs具有强大的直接杀伤作用,且这种杀伤作用具有时间和剂量依赖性。2.4 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统具有强大的旁观者效应:共培养结果示只有 YCD:UPRT-GFP-UCMSCs+Nalm-6+5-FC组的 UCMSCs 及Nalm-6细胞形态出现异常,大小不一,最终大量死亡,Nalm-6细胞数目明显少于其他五组（P<0.05）,且Nalm-6细胞的早期和晚期凋亡率均明显高于其它五组（P<0.05）。2.5具有抑制血管形成功能的miRNA的筛选及功能验证:RT-PCR示miR195对UCMSCs VEGFA基因的表达具有最强抑制作用,Western blot检测验证了 miR195转染可有效抑制UCMSCs的VEGFA蛋白表达,HUVEC成血管实验检测其可有效抑制UCMSCs的促血管形成能力,并且Western blot检测其可有效抑制与UCMSCs共培养的Nalm-6细胞的VEGFA蛋白表达。3.YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的体内实验研究3.1急性B淋巴细胞白血病裸鼠动物模型构建成功:造模（30±3）天后,裸鼠后肢行动迟缓,迅速发展为双后肢瘫痪,病情迅速进展直至死亡,平均存活时间（50±7）d;骨髓涂片可见白血病细胞,幼稚细胞比例大于20%;肝、脾、肾组织都可见肿瘤细胞浸润。3.2 YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病模型小鼠的疗效评估:YCD:UPRT+miR195双修饰的3D UCMSCs+5-FC治疗B-ALL模型裸鼠具有良好的肿瘤靶向治疗效果,可一定程度降低骨髓幼稚细胞比例,有效抑制肿瘤生长增殖和血管形成,改善小鼠的一般情况,减缓体重的下降趋势,延长生存期。结论:1.本研究成功构建PADM-UCMSCs三维培养体系,发现三维培养可明显增强UCMSCs体内迁移和归巢能力,其中CXCR4发挥重要作用。2.本研究构建的YCD:UPRT-GFP-UCMSCs/5-FC自杀基因系统在体外可发挥强大的自杀效应和旁观者效应。3.miR195可有效抑制UCMSCs促血管形成能力。4.YCD:UPRT+miR195 双修饰的 3DUCMSCs+5-FC 治疗 B-ALL 模型裸鼠,可有效抑制肿瘤生长增殖和血管形成,具有良好的靶向治疗效果。
谭成光[3]（2017）在《双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究》文中研究说明肝癌系原发于人类肝脏组织及脏器的癌症,也是发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的恶性病变,是临床肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,也是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一。肝癌细胞具有极强的浸润性,其恶性程度极高,预后极差,且临床确诊患者超过80%以上已是晚期不适宜再进行手术切除,尤其是肝癌患者常出现对多种药物抗药性与耐药性,故对目前放疗和化疗均不敏感。因此,目前临床一线及二线治疗的疗效大多并不满意和理想,致使其发病早期便可发生癌症的肝转移,生存率极低。目的:为了更加深入和系统地探寻和创建更加安全、更有疗效、更有特色、更具实用价值的临床中西医结合抗肝癌疗法,本课题希望通过建立双自杀基因逆转录病毒转移体系在转染人肝癌细胞HepG2的实验研究,观察它们对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用;同时,本课题还希望探索研究天然药物芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用以及它可否共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK,以提高和增加它们之间联合增效的抗癌作用效果;而且,本课题也希望通过此实验研究,探寻天然药物芪三酚共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK的最佳作用时间和剂量效应,为中西医结合应用在临床对人肝癌的有效治疗和早期干预提供新的研究思路和科学依据。方法:1、双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及共稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究的方法是:采用基因工程技术构建pWZLneoCDglyTK质粒,并将其转导至DH5α感受态菌中,再将扩增获得的大量质粒提取并通过脂质体载体进行介导,将含双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglyTK导入至病毒包装细胞PA317中,经过G418筛选带病毒PA317/CD+TK阳性克隆细胞株,进行扩增培养后收集培养液中病毒上清液进行浓缩,随后再在Polybrene介导下转染人肝癌细胞株HepG2;然后经过G418的再次筛选阳性克隆、并进行扩增培养,以获得稳定表达双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞株及建立稳定转染双自杀基因的HepG2细胞系,再采用RT-PCR检测双自杀基因的表达情况。2、双功能融合自杀基因CDglyTK对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及芪三酚协同增强杀伤效应的实验研究的方法:分别采用不同浓度的一种或两种联合的自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）、芪三酚、以及自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）与芪三酚组合物分次处理人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞,分别采用光镜和电镜观察其细胞形态学改变,采用凋亡小体细胞形态学、DNA Ladder、原位末端标记法（TUNEL）、凋亡相关基因检测、流式细胞检测观察其细胞凋亡情况;采用MTT检测和细胞克隆形成实验观察细胞增殖状况;采用流式细胞检测观察细胞周期变化,以综合观察、分析和评价它们分别或联合对人肝癌HepG2细胞和HepG2/CD+TK细胞的杀伤效果及其共济协同与联合增效的生物学作用。结果:第一部分:双自杀基因逆转录病毒转移体系建立及其稳定感染人肝癌细胞HepG2结果:1.双自杀基因逆转录病毒转移体系构建与稳定表达的结果:（1）pWZLneoCDglyTK质粒DNA含Amp抗性基因,其转化阳性菌株可在含Amp琼脂上生长,未转化菌无Amp抗性则不能生长,证实是含单一细菌克隆的转化菌落。（2）质粒pWZLneoCDglyTK经提取其DNA并纯化后检测清晰可见有质粒DNA存在。（3）含pWZLneoCDglyTK的质粒经BamH I单酶切后可形成1.19kb和6.9kb的两条电泳条带;经EcoR I单酶切后可形成8.09kb的一条电泳条带;经BamH I和EcoR Ⅰ双酶切后可形成1.19kb、1.31kb和5.59kb的三条电泳条带,证实此质粒为pWZLneoCDglyTK。另以提取的质粒DNA为模板,以CD和TK引物进行PCR扩增,可见扩增的CD和TK的阳性条带,证实此质粒是含CD和TK基因为pWZLneoCDglyTK质粒。构建的双自杀基因经DNA测序并与genebank标准序列比对后证明其序列正确。对质粒pWZLneoCDglyTK阳性转化菌大量扩增培养提取质粒后进行电泳分析,结果有明亮的阳性条带,证明该质粒大量提取成功,对大量提取pWZLneoCDglyTK质粒纯度及浓度测定计算,DNA浓度（μ g/μ 1）=5.25,DNA纯度=1.81,其与理论预估值1.80基本一致。（4）逆转录病毒载体转入病毒包装细胞PA317后第2天即有80%细胞贴壁,生长状态良好,增殖旺盛,细胞形态呈成纤维样,可见分裂相,细胞透明,细胞内无颗粒。用脂质体将pWZLneoCDglyTK质粒及pLXSN.GFP质粒转入PA317细胞48h后可见对照组细胞有绿色荧光产生,证明质粒转染成功,其转染效率在20-30%。（5）对未转染细胞PA317及转染细胞PA317CD+TK的基因组DNA电泳,清晰可见DNA电泳条带;CD、TK基因PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到PA317细胞的基因组上。（6）对提取转染PA317细胞的总RNA进行电泳,有RNA电泳条带存在,证明RNA提取成功;RNA逆转录后PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物在730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物在650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD,TK基因均为阴性,证明CD,TK基因已在PA317细胞中有表达。（7）将pWZLneoCDglyTK质粒以脂质体包裹后导入病毒包装细胞PA317,电镜可见培养上清液中有病毒颗粒散在或聚集成堆呈圆球形,边缘呈波状,直径约100nm大小,说明其逆转录病毒包装成功。2.双自杀基因逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2的结果:（1）人肝癌HepG2细胞复苏第2天可见大部分细胞贴壁,细胞生长良好,形态呈上皮样,多见分裂相,细胞较透明,高倍镜可见细胞内有少许颗粒及细胞器。（2）荧光显微镜下观察,转有对照组病毒上清液中人肝癌HepG2细胞可见大量绿色荧光产生,感染效率达60-70%。（3）对PA317/CD+TK细胞培养上清液中逆转录病毒感染HepG2细胞镜检,该细胞形态未变,用G418筛选,第2天有少数细胞皱缩、死亡、脱落、形成细胞碎片,继续用G418加压培养,存活细胞持续增殖,形成多个细胞克隆,且细胞克隆密切相连。（4）提取未转染人肝癌细胞HepG2及转染细胞HepG2/CD+TK的DNA,电泳后清晰可见DNA电泳条带,证明其基因组DNA提取成功。进行CD、TK基因PCR扩增电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,未经转染HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到HepG2细胞的基因组上。（5）对提取转染细胞的总RNA电泳,有RNA电泳条带存在,证明其RNA提取成功;将RNA逆转录后PCR扩增后电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物650bp处有一特异性条带,而HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已在HepG2/CD+TK细胞中得到了表达。3.人肝癌HepG2/CD+TK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较结果:将转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞及空白对照HepG2细胞进行传代、冻存、复苏后镜检,处于对数生长期的这两种细胞一般形态学基本相同,均呈上皮样生长,且它们的生长曲线也基本一致,无显着性差异（p>0.05）。流式细胞仪对这两种细胞的细胞周期检测,发现它们的细胞周期分布也无明显差异（p>0.05）。第二部分:双自杀基因前体药物联合芪三酚对人肝癌细胞HepG2细胞及转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的杀伤作用的实验研究结果1.双自杀基因前体药物分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h镜检结果:双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC无论单用或联用均对未转染自杀基因的人肝癌HepG2细胞无作用,但对转染自杀基因的HepG2/CD+TK细胞均有一定作用,联用效果较单一效果更好,且作用效果随前体药物浓度增加而增加,但不同自杀基因前体药物浓度作用HepG2/CD+TK细胞后尚未见死亡细胞增多。2.芪三酚作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:不同浓度芪三酚对人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞均有作用,且其作用效果随着芪三酚作用浓度而增加,杀伤作用呈剂量相关性和浓度依赖性,但相同浓度芪三酚分别作用两类靶细胞,其细胞形态及细胞死亡情况未见明显不同和差异。3.芪三酚联合自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:应用双自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对人肝癌HepG2细胞作用,其作用效果随药物浓度增加而增加,并与单用芪三酚作用无明显差别。应用双自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对转染双自杀基因HepG2/CD+TK细胞作用效果更明显,且影响程度也呈剂量效应和浓度依赖性。4.自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后镜检结果:（1）未转染自杀基因的HepG2细胞,在分别或联合应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）作用72h与作用24h时的情况基本相同;而对转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞在分别或联合应用自杀基因前体药物GCV和/或5-FC作用72h比作用24h时损伤目的细胞加重,且GCV和5-FC联合应用较两者单独作用的效果更好。5.芪三酚分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后的镜检结果:与24h作用相比,芪三酚作用72h对两类靶细胞损伤和杀伤均加重,且随药物浓度增加而增加。但芪三酚在同一浓度分别作用两类靶细胞,其细胞形态及死亡情况未见明显差异。6.芪三酚联合自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞后72h后的镜检结果:与24h相比,应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对HepG2细胞作用72h的效果更明显,且随着药物浓度增加而增加,但与单用芪三酚作用HepG2时无明显差别。但应用自杀基因前体药物（GCV和/或5-FC）和芪三酚联合对HepG2/CD+TK细胞作用72h与作用24h相比,随着药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞形态和生长状态更差,细胞数量更减少,死亡细胞增多更明显等,且它们之间关系呈剂量效应和浓度依赖性。7.自杀基因前体药物和芪三酚对人肝癌细胞HepG2及HepG2/CD+TK的生长抑制作用:（1）分别单用或合用GCV或/和5-FC对人肝癌HepG2细胞作用时,对其生存与增殖影响不明显,而对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用则随药物浓度增加而增加。合用GCV和5-FC对该细胞生长抑制作用更明显。（2）应用芪三酚对HepG2和HepG2/CD+TK细胞的抑制作用均随药物浓度增加而增加,但抑制程度在这两类细胞间无显着性差异。（3）应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,但芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC应用,对该细胞增殖影响无明显差异,均与单独用芪三酚对该细胞增殖抑制情况相似。应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC,对该细胞增殖抑制无明显差异,但细胞抑制情况均明显高于单独应用芪三酚组。8.凋亡细胞的瑞氏染色光镜观察结果:分别或联合加入GCV和/或5-FC对HepG2细胞作用,该细胞生长与增殖均未受影响,也未见该细胞出现凋亡,且GCV、5-FC、GCV+5-FC之间以及各药物浓度间均未见HepG2细胞凋亡现象。加入低浓度芪三酚后也未见HepG2细胞凋亡;但随芪三酚浓度增加,HepG2细胞凋亡现象逐渐明显。芪三酚和自杀基因前体药物联用与单独使用芪三酚的结果基本类似。而分别或联合加入低浓度GCV和/或5-FC对HepG2/CD+TK细胞作用与干预后,未见HepG2/CD+TK细胞出现凋亡;但随自杀基因前体药物作用浓度增加,HepG2/CD+TK细胞出现明显凋亡;尤其是GCV+5-FC合用,该细胞凋亡较单用GCV或5-FC更明显。加入低浓度芪三酚作用未见HepG2/CD+TK细胞凋亡,但随芪三酚浓度增加,HepG2/CD+TK细胞凋亡逐渐明显。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CD+TK细胞凋亡非常明显,即使在低浓度下亦可出现凋亡现象,且随药物浓度增加,凋亡细胞数增加。9.凋亡细胞DNA Ladder检测结果:加入不同浓度GCV（8μg/ml和4μg/ml）和/或5-FC（160μg/ml和80μg/ml）作用HepG2细胞72h,只在加样孔附近发现DNA条带,但未见有DNA Ladder条带产生。而加入低浓度（0.04mmol/L）和高浓度（0.08mmol/L）芪三酚作用,可见微弱的HepG2细胞DNA Ladder产生,且随芪三酚浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚作用效果类似。而在HepG2/CD+TK细胞中加入不同浓度的 GCV（8μg/ml、4μg/ml）和/或 5-FC（160μg/ml、80μg/ml）72h 后,均可见DNA Ladder产生,随自杀基因前体药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder更明显,且GCV+5-FC较单用GCV或5-FC效果更明显。加入低浓度（0.04mmol/L）和高浓度（0.08mmol/L）芪三酚,可见有微弱的HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder产生,且随药物浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和自杀基因前体药物作用HepG2/CD+TK细胞,其DNA Ladder较单用芪三酚或自杀基因前体药物更明显。10.TUNNEL法检测细胞凋亡结果:在人肝癌HepG2中分别加入不同浓度GCV（8μg/ml 和 4 μ g/ml）和/或 5-FC（160 μ g/ml 和 80 μ g/ml）作用 72h,TUNEL 结果为阴性。加入芪三酚作用,TUNEL结果为弱阳性;同时加入芪三酚和前体药物共同作用,HepG2细胞大部分为弱阳性,最高浓度时有部分HepG2细胞为阳性。而HepG2/CD+TK中加入不同浓度 GCV（8μg/ml、4ug/ml）和/或 5-FC（160μg/ml、80ug/ml）作用,TUNEL 结果显示每种低浓度前体药物可使大部分HepG2/CD+TK细胞为弱阳性,但每种高浓度前体药物作用均可使少部分细胞为阳性;采用两种前体药物联用,细胞大部分为阳性。加入芪三酚有部分HepG2/CD+TK细胞的为弱阳性,高浓度芪三酚作用,其细胞核黄色加深。同时加入芪三酚和前体药物,HepG2/CD+TK细胞均为阳性,且在高浓度时为强阳性。11.流式细胞检测细胞凋亡结果:在HepG2细胞中分别加入前体药物GCV（8μg/ml）或5-FC（160μg/ml）作用72h后,其细胞凋亡率分别为5.43%和5.49%,结果基本相同;而当二者联用时,其细胞凋亡率可达到11.09%,这可能与自杀基因前体药物联合应用后的非特异性毒性有关。而当加入浓度为0.08mmol/L的芪三酚后,与前体药物组相比,HepG2细胞凋亡率可升至12.02%,说明芪三酚可引起HepG2细胞的凋亡。但当同时加入芪三酚和前体药物后,HepG2细胞凋亡率比单用芪三酚有增高,HepG2细胞的凋亡率为16.32%。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入前体药物GCV（8μg/ml）或5-FC（160μg/ml）作用72h,与HepG2细胞相比,细胞凋亡率明显增加,分别为11.11%和14.37%;当二者联用时,细胞凋亡率为17.89%。加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞凋亡率为15.81%,稍高于HepG2。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CDTK细胞凋亡率明显增高,可达到22.64%。12.细胞克隆形成的实验结果:在HepG2细胞中分别加入不同浓度前体药物GCV（8 u g/ml 和 4 u g/ml）和/或 5-FC（160 μ g/ml 和 80 μ g/ml）72h,各孔 HepG2 细胞克隆形成率均在90%以上,各孔间无显着差异,细胞克隆较大,每一克隆有数百细胞,且细胞克隆间距离近,有些紧密相连。加入芪三酚后与前体药物相比,HepG2细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加克隆形成率降低。芪三酚浓度0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,每一细胞克隆均明显缩小,每一细胞克隆内仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚的差别不大,在高浓度时的HepG2细胞克隆形成率近50%,细胞克隆内细胞数仅数十个。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入不同浓度前体药物 GCV（8μg/ml,4μg/ml）和/或 5-FC（160μg/ml,80μg/ml）作用 72h,与 HepG2 细胞相比,HepG2/CD+TK克隆形成率明显减少,随前体药物随浓度增加,克隆形成率降低;当增至高浓度时,细胞克隆形成率近50%;两种药物联用,克隆形成率降低更明显,仅为400%,且克隆内细胞数量也逐渐减少,当GCV8μg/ml+5-FC160μg/ml时,细胞数仅数十个。与HepG2细胞实验相似,加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加,克隆形成率降低,在芪三酚浓度为0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,细胞克隆也明显缩小,每一克隆仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物作用的HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显降低,当三者联用高浓度时,未见有细胞克隆产生。13.对相关基因表达水平影响的检测结果:HepG2细胞中分别加入GCV（8μg/ml）、5-FC（160μg/ml）及二者联用,对HepG2细胞凋亡抑制基因c-fos的表达水平影响不大,而bax基因几无表达,二者联用时仅有微弱bax基因表达;而加入芪三酚后的c-fos基因表达明显降低,而bax基因表达明显增高;但前体药物与芪三酚联用与芪三酚单用相比,c-fos基因表达水平变化不大,而bax基因均有较明显表达,但与单用芪三酚结果相比,无显着性差别（P>0.05）。在HepG2/CD+TK细胞中加入GCV（8μg/ml）,5-FC（160μg/ml）后,c-fos基因表达水平均降低,bax基因表达水平均增高。两种前体药物联用的c-fos基因表达降低更明显,而bax基因表达均高于其中任何单一前药使用;加入芪三酚后的c-fos基因表达水平与其对HepG2作用相差不大;但前体药物与芪三酚联用与单用芪三酚相比,c-fos基因表达降低更明显;当三者联用时,c-fos基因几乎无表达。加入芪三酚后,bax基因表达也明显增高;前体药物与芪三酚联用,bax基因表达水平有更明显升高,而三者联用时的bax基因表达水平最高。14.细胞迁移实验的观察结果:在HepG2细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,对该细胞迁移影响较小;加入芪三酚后可抑制HepG2细胞迁移。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距与单用芪三酚差别不大,对HepG2细胞起不到协同抑制细胞迁移的效果。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,该细胞划痕间距明显增大;当两种前药联用时,细胞划痕间距明显大于单种前药。同样,加入芪三酚后对HepG2/CD+TK细胞划痕间距加大,细胞形态变差。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距明显增大,细胞形态更差;当三者联用时的细胞划痕周围几乎无状态良好的细胞。15.流式细胞检测细胞周期结果:在HepG2细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞 G1、S、G2 期细胞比例分别为 22.95%、68.14%、8.91%或 30.31%、67.19%、2.50%,统计学处理差别不显着（P>0.05）,且S期细胞所占比例最多;二者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为32.68%、64.51%、2.82%,差别均无显着性意义（P>0.05）。加入芪三酚后该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为66.61%、33.39%、0%,S期细胞比例明显减少,而G1期细胞比例增多。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为91.83%、8.17%、0%,比单用芪三酚的G1期细胞比例有所增高;三者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为92.23%、5.72%、2.04%。HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为33.62%、47.32%、19.06%和39.22%、58.85%、1.96%,与HepG2细胞相比,S期细胞明显降低,G1期细胞明显增多;两种前药联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为47.57%、49.24%、3.19%,虽S期变化不大,但G1期细胞明显增多,说明两种前体药物联用可使更多HepG2/CD+TK细胞阻止在G1期,不能进一步合成DNA。加入芪三酚后,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为76.78%、23.22%、0%,该细胞DNA合成抑制。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为97.77%、2.23%、0%,三者联用时,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为99.93%、0.07%、0%,该细胞被阻止在G1期,几乎无DNA合成。16.细胞亚结构观察结果:在HepG2细胞中应用GCV和/或5-FC后,多数HepG2细胞表面光滑,无明显结构改变,且两种前体药物联合对HepG2细胞形态学影响不明显。应用芪三酚后的HepG2细胞表面微绒毛增粗,变成长而粗的细丝,说明HepG2细胞有凋亡。同时应用GCV和/或5-FC后的HepG2/CD+TK细胞膜上出现许多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。应用芪三酚后的HepG2/CD+TK细胞表面出现很多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡产生。联合应用前体药物和芪三酚的HepG2细胞膜表面出现一些穿孔现象,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。联合应用自杀基因前体药物和芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞出现更加明显的凋亡小体。结论:1.自杀基因前体药物作用于未转染有双自杀基因的人肝癌HepG2细胞,在本实验设计的浓度剂量和作用时间等条件下,均未能表现出明显的杀癌或抑癌的生物学作用。2.以逆转录病毒为载体将双自杀基因转染至人肝癌HepG2细胞后,再使用双自杀基因前体药物作用,可分别对人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞发生不同程度的损伤和杀伤,从而有效控制人肝癌细胞的增殖性进展。3.自杀基因前体药物均能有效地抑制或杀伤人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的增殖性生长,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,其作用浓度越高,则效果越显着。4.自杀基因前体药物能诱导人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的凋亡,且自杀基因前体药物联合应用对肝癌细胞的抑制与杀伤效果更好,表现出明显的协同增效作用,即与单独使用GC V或5-FC比较,联合使用GCV和5-FC能是人肝癌细胞存活率明显降低,表明双自杀基因较单自杀基因有更强的抑癌效果。5.芪三酚能影响人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的形态学,使其发生破坏性改变;同时,它还能有效抑制这两类细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;且芪三酚能诱导这两类细胞的凋亡。6.自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚Res联合应用对人肝癌HepG2细胞具有单独使用芪三酚的生物学作用及类似细胞形态学改变;而它们联合应用对人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞能发生更明显的杀伤及破坏性改变,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,浓度越高效果越显着,且表现出双自杀基因前体药物与芪三酚联合应用后更好杀伤效果,呈现出明显的协同增效作用。7.双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚合理应用,特别是联合应用不仅能减低自杀基因前体药物的用量及副作用,还能发挥相互之间的协同效应,并且能发挥更好的效果,这很可能为今后中西医结合及天然抗癌药物与自杀基因及其前体药物的综合应用提供一种更加适应于临床肝癌治疗的新思路、新技术和新方法。
黄暨生[4]（2016）在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中研究指明恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段（如手术治疗、放疗、化疗等）后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能（GJIC）的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯（GJIC）功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP（tk+）细胞混合A375（tk-）细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高（P<0.05）,说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能（即缝隙连接机制）发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
牛颖[5]（2014）在《核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究》文中研究指明世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（The International Agency forResearch on Cancer）发表的《2014年全球癌症报告》称：2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，中国新增癌症病例高居世界第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。胃癌（gastric cancer）是发生在消化系统胃黏膜上皮组织的恶性肿瘤。它是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率为25.2/10万，占全部恶性肿瘤死亡的23.2%，居各类肿瘤的首位。早期胃癌多无症状或缺乏典型的临床表现，普查的依从性差，费用较高，大部分病人发现时多已处于进展期。传统的治疗效果不理想，预后较差，术后5年生存率并不能让人满意，死亡率仍保持在较高水平。因此寻找一种有效的、新的胃癌治疗方法以提高患者的生存率尤为重要。近年来，分子生物学的发展十分迅速，DNA重组技术日益成熟，基因治疗（gene therapy）在基础研究方面已经取得了很大的进展，成为了一种新的治疗手段。目前肿瘤基因治疗包括许多策略，如基因沉默治疗、自杀基因疗法、反义基因疗法、基因替换疗法、免疫基因治疗、抑癌基因治疗、针对一些细胞因子的基因治疗、针对耐药基因的治疗、肿瘤DNA疫苗、抗端粒酶疗法等几个方面。随着基因治疗策略的不断发展和载体的开发应用，胃癌自杀基因治疗（suicidegene therapy）有望成为一种肿瘤治疗新方法为人们所接受，更多的癌症患者将从中获益。本课题组前期研究结果表明，在survivin基因启动子的驱动下，GFP基因可在胃癌细胞SGC-7901中表达，但在正常胃上皮细胞中不表达。转染的SGC-7901细胞中有胸苷激酶（thymidine kinase, TK）/胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase, CD）（CD/TK）融合基因的表达，但在转染的正常胃上皮细胞中未见CD/TK融合基因的表达产物；转染的胃癌SGC-7901细胞对前体药物高度敏感，CD/TK双自杀基因系统比任一单自杀基因有更好的杀伤靶细胞的效果；体内接种转染SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤实验结果表明，与任一单自杀基因相比，双自杀基因系统治疗抑制肿瘤的生长的效果更强更显着尽管自杀基因治疗目前已成功进行体内外实验研究，但是要达到理想的用于临床治疗胃癌的效果还有很大的差距，还有一些问题有待解决，比如外源基因的导入尚缺乏特异性和靶向性，载体特异性受体在肿瘤细胞中表达较低则会导致肿瘤细胞中病毒载体的表达较低等等。核基质附着区（matrix attachmentregion, MAR）是指真核生物染色质中能够与核基质（nuclear matrix）或核骨架产生特异性结合的DNA序列，又称为核骨架附着区（scaffold attachment region,SAR）。MAR序列的功能主要是参与DNA复制调控、转录调控等多种核生化过程，同时MAR可使染色质形成独立的环状结构，从而避免位置效应引起的基因沉默。鉴于MAR序列和基因表达间的这种关系，特别是它能显着地增强外源基因表达、克服位置效应、避免转基因沉默，目前作为一种顺式调控元件已应用于转基因生物工程中。目前，通过应用MAR序列增强survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统靶向治疗胃癌的研究，迄今为止国内外尚未见报道。因此，本研究中我们构建并验证了含有MAR序列的由survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统是否可以增强对胃癌细胞及裸鼠的胃癌皮下移植瘤靶向杀伤作用，结果表明MAR序列元件可以显着增强CD/TK双自杀融合基因的表达，表达产物可以选择性的抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡，对裸鼠的胃癌皮下移植瘤具有显着的靶向杀伤作用。研究结果为胃癌的基因治疗提供重要的理论依据，为临床应用奠定实验基础。本实验研究内容共分为四部分：第一部分含有MAR的重组pMS-CD/TK双自杀基因表达载体的构建目的分别克隆Survivin启动子、CD、TK和MAR基因，构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因真核重组表达载体pMS-CD/TK。方法1. CD基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增CD基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-CD，进行酶切鉴定和测序验证。2. TK基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增TK基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-TK，进行酶切鉴定和测序验证。3. Survivin启动子基因序列克隆和分析：设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-Sur，进行酶切鉴定和测序验证。4. MAR序列克隆和分析：以人β珠蛋白MAR序列为参考设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增MAR基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-MAR，进行酶切鉴定和测序验证。5.重组pMS-CD/TK真核表达载体的构建：以质粒载体pEGFP-C1为基础，依次将Survivin启动子基因亚克隆连接构建中间载体pEGFP-Sur，再与CD和TK基因连接构建中间载体pS-CD/TK，最后将MAR基因序列连接构建含有MAR的重组真核表达载体pMS-CD/TK，并进行酶切鉴定和测序验证。结果1. PCR产物经酶切及测序鉴定成功克隆Survivin启动子基因（948bp），MAR基因（787bp），CD基因（约1302bp）和TK基因（约1175bp）。2.经不同体系双酶切和测序鉴定成功构建含有MAR的重组表达载体pMS-CD/TK和不含MAR的重组表达载体pS-CD/TK。第二部分重组pMS-CD/TK表达载体转染胃癌细胞及表达分析目的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转染胃癌SGC-7901并分析双自杀基因CD/TK在转染细胞的表达情况。方法1.采用脂质体法将构建好的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转化人胃癌SGC-7901细胞（靶细胞）及人胃黏膜上皮细胞GES-1（对照细胞）并筛选稳定转化株。2.应用实时荧光定量PCR法（Quantitative real-time PCR, qPCR）检测转染细胞株中CD/TK基因表达量；Western blot法检测转染细胞中CD/TK蛋白的表达情况。结果1.通过脂质体介导方法可有效转染SGC-7901和GES-1细胞。RT-PCR结果表明，与未转染SGC-7901细胞组相比，质粒pS-CD/TK或pMS-CD/TK转染组分别扩增出一条与预期CD/TK片段大小相符的特异性条带，而在GES-1细胞各实验组中均检测到CD/TK基因的表达。2. qPCR结果显示，CD/TK基因在转染pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中的相对表达量是转染pS-CD/TK质粒的7.7倍。3. Western blot结果也表明，与未转染的SGC-7901细胞组相比，在转染pMS-CD/TK或pS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中可检测到一条单一特异的蛋白条带。第三部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对胃癌细胞的体外作用实验目的观察MAR序列增强pMS-CD/TK双自杀基因表达系统对胃癌SGC-7901细胞的体外杀伤作用。方法1. SGC-7901和GES-1转染细胞中分别加入前体药物5-FC+GCV，MTT法检测前体药物对转染细胞毒性，计算细胞的存活率。2.转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞和未转染的细胞按所设梯度比例混合，加入5-FC和GCV联合用药治疗，MTT检测细胞的存活率以观察有无旁观者效应。3.流式细胞技术进行转染细胞凋亡率的检测。结果1. MTT检测结果显示，与未转染细胞相比，5-FC和GCV联合应用可以显着降低转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞的存活率，差异有统计学意义（P<0.01）。与转染pS-CD/TK质粒组相比，联合应用前体5-FC+GCV后转染pMS-CD/TK质粒组SGC-7901细胞的存活率降低显着，差异具有统计学意义（P<0.01）；与未转染细胞组相比，5-FC和GCV对转染的GES-1细胞存活率均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。2.随着不断增加转染细胞的比例，细胞的存活率呈现逐渐下降趋势，而且存在明显的旁观者效应。3.在给予5-FC+GCV前药处理后，pS-CD/TK和pMS-CD/TK质粒转染组细胞凋亡率分别为17.65±1.58%、26.25±2.63%，明显高于未转染组对照细胞凋亡率（5.01±0.22%（）P<0.05），且pMS-CD/TK转染组细胞凋亡率显着高于pS-CD/TK组。第四部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对体内裸鼠移植瘤的作用研究目的观察含有MAR的双自杀基因CD/TK表达系统对裸鼠胃癌SGC-7901细胞移植瘤的抑制作用。方法1.胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型的建立：Balb/c裸鼠右前肢腋窝皮下接种5×106SGC-7901细胞，第四天原位补种一次，建立胃癌移植瘤动物模型。2.双自杀基因系统对裸鼠胃癌移植瘤模型的疗效观察：等到裸鼠移植瘤生长至直径约为0.5cm时，将小鼠随机分成3组，6只/每组：A组，空白对照组，仅用PBS处理；B组，注射重组pS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组；C组，注射重组pMS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组。在给药治疗后每三天测量各组小鼠的肿瘤大小，计算瘤体体积，治疗结束时用颈椎脱臼法处死动物，取瘤测瘤重，计算抑瘤率，取肿瘤组织切片行HE染色，镜检观察肿瘤组织的病理变化。3. qPCR法检测裸鼠肿瘤组织中CD/TK双自杀基因的表达结果1.成功建立胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型，当裸鼠成瘤直径达0.5cm后开始进行治疗。各实验组最终瘤重和抑瘤率结果为： A组：557.1±8.9mg；B组：251.7±14.2mg，63.1%；C组：118.8±10.2mg，82.6%。与对照组相比，治疗组肿瘤体积、最终瘤重和抑瘤率明显减小，差异有统计学意义（均P<0.05）。2.肿瘤组织病理学观察结果显示，与对照组相比，治疗组可见肿瘤细胞变性坏死及多发灶性出血散在分布，细胞分裂相少，伴有纤维组织增生，并可见较多的凋亡小体。3. qPCR实验结果表明，在注射转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的移植瘤中检测到CD/TK基因的表达，且后者的表达量是前者的约2.3倍；而PBS处理对照组未检测到CD/TK基因的表达。结论1.成功构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因表达载体系统pMS-CD/TK。2.重组CD/TK融合基因在胃癌细胞SGC-7901中成功表达，MAR基因在转录和蛋白水平均可明显增加CD/TK的表达量。3.双自杀CD/TK融合基因系统对胃癌SGC-7901细胞具有显着的杀伤作用且有明显的旁观者效应。4. MAR序列可通过增强CD/TK基因的表达对胃癌SGC-7901转染细胞产生明显杀伤作用。5. MAR能增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK抑制Balb/c小鼠移植瘤生长的作用
付成伟,王洛夫,江军,孙中义,兰卫华,张克勤[6]（2013）在《rPB-DR（6）调控的溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用》文中指出目的构建含rPB-DR（6）启动子和CD自杀基因的重组溶瘤腺病毒,观测其对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞的杀伤作用,探索雄激素非依赖性前列腺癌治疗的新方法。方法应用分子生物学技术,构建并包装出重组溶瘤腺病毒Ad5-rPC,纯化并扩增,测定滴度。采用PCR方法对重组溶瘤腺病毒颗粒进行鉴定并测序,Western blot检测E1A、CD蛋白表达,TCID50法检测重组腺病毒感染癌细胞后的复制能力,应用CCK-8法检测重组病毒特异性杀伤能力。结果经PCR及测序鉴定证实成功构建了包含rPB-DR（6）启动子和CD基因的重组溶瘤腺病毒Ad5-rPC,测滴度为1.1×1011pfu/mL。Western blot检测到E1A和CD蛋白阳性表达。Ad5-rPC病毒感染前列腺癌细胞系细胞产生的子代病毒滴度均大于3.0×106pfu/mL,CCK-8法证实重组腺病毒对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞均具有特异性杀伤能力,杀伤能力均大于65%。结论前列腺特异性启动子调控的溶瘤腺病毒能在前列腺癌细胞内靶向复制,并对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞均有特异性杀伤作用。
吕政[7]（2013）在《重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究》文中研究说明恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，尽管针对肿瘤治疗的手段已有较大的改善和提高，但仍不能明显提高对肿瘤的抑制效率和增加患者的生存几率。传统的治疗手段有放射疗法和化学疗法，但二者的治疗存在很大风险，治疗过程还会给患者带来痛苦且存在副作用。手术切除肿瘤法，虽然可以去除病灶，但依然有肿瘤扩散和复发的可能性。新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属于副粘病毒科禽副粘病毒属。上世纪六十年代，研究发现NDV可用于治疗人类肿瘤，其可在肿瘤细胞中进行特异性复制，同时对正常细胞并无明显的影响。反向遗传操作技术已经成熟建立，目前应用十分广泛。研究者可以利用该技术对病毒基因组加以改造，使野生型毒株的抗肿瘤效果得以提升。本研究将自杀基因CD插入到重组新城疫病毒的基因组中，并通过反向遗传操作技术拯救病毒，协同5氟胞嘧啶（5-flucytosine，5-FC），增加治疗的靶向性，达到抑制肿瘤的目的。CD（Cytosine deaminase）为自杀基因家族的成员之一，它存在于大肠杆菌或酵母菌等基因组当中，在哺乳动物体内并不存在。CD可将相应的无毒前导药物（prodrug）5-FC转化为具有毒性的抗肿瘤药物5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），后者可引起肿瘤细胞死亡。通过克隆技术获得大肠杆菌E.coli JM109菌株全基因组中的CD基因，构建成真核表达质粒pEE12.4-CD-IRES-EGFP（pEE12.4IE-CD）并转染HepG2细胞，为验证CD表达产物的体外生物学活性，以不同浓度的5-FC孵育单层细胞，采用MTT法检测细胞的死亡率，结果表明CD转化5-FC效果良好，HepG2细胞生长受到显着抑制。携带自杀基因进入细胞的常用载体有慢病毒和腺病毒，这两种载本身并不具备杀伤肿瘤的作用。而利用自身具有抗肿瘤能力的新城疫病毒作为载体，携带CD基因进入肿瘤细胞，可以增强二者的抗肿瘤能力。本研究首次利用反向遗传操作技术在重组新城疫病毒弱毒株LaSota rClone30基因组的F基因和HN基因之间插入了CD基因的开放阅读框，构建带有CD基因的NDV全长cDNA转录质粒pBrClone30-CD。将该转录质粒与表达核衣壳蛋白、磷酸化蛋白以及大聚合酶蛋白的辅助质粒，共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，拯救后获得的重组新城疫病毒于SPF鸡胚中进行增殖，并收集尿囊液进行血凝和血凝抑制实验，重组病毒命名为重组新城疫病毒rClone30-CD株。通过在鸡胚中连续传代8代，确定插入CD基因的新城疫病毒可以稳定增殖。说明CD基因片段的插入并未对病毒复制能力造成影响。在体外实验中，采用MTT法检测不同MOI的重组新城疫病毒对HepG2细胞的抑制作用。结果表明，重组病毒可以有效地抑制HepG2细胞的生长，并呈现剂量依赖性。在较高的MOI条件下，rClone30-CD/5-FC抑制效果明显大于rClone30-CD，说明重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显着。在体内实验中，我们首先对5-FC的半数致死量（LD50）和最大安全剂量进行测定，保证实验小鼠的安全和药物注射剂量的最优化。建立昆明小鼠H22腹股沟皮下荷瘤模型，通过瘤内注射重组新城疫病毒，并采用瘤内或尾静脉两种不同的方式注射5-FC，达到协同治疗肿瘤的目的。实验结果表明，与rClone30-CD治疗组相比，rClone30-CD/5-FC抑制肿瘤生长的效果明显，重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显着，而且可以提高小鼠的存活率。两种不同给药方法所得到结果一致，说明瘤内注射或尾静脉注射5-FC，均能达到良好的抑制肿瘤目的。对小鼠血样中5-FU的含量进行测定，在rClone30-CD/5-FC组的样本中检测到5-FU的存在，5-FC组未检出5-FU。结果表明，插入到NDV中的外源CD基因具有生物学活性，可将5-FC转化为5-FU，并且由于5-FU的存在，使得rClone30-CD/5-FC的抗肿瘤作用显着提升。综上所述，本研究应用反向遗传操作技术，成功拯救重组NDV rClone30-CD，体外实验证实重组NDV rClone30-CD/5-FC能有效的杀伤HepG2细胞。在体内试验中，采用两种不同方法进行5-FC给药，rClone30-CD/5-FC均能达到良好的抑制肿瘤细胞效果，并且可以延长实验小鼠的存活时间。本研究为提高NDV弱毒株治疗肿瘤效果以及为重组新城疫病毒作为自杀基因的载体，应用于恶性肿瘤的靶向治疗奠定良好的基础。
宋飞,邢琪,宋克东,刘健,姬广春,马郁芳,刘天庆,马学虎,田晓峰[8]（2012）在《携带CD基因骨髓间充质干细胞对C6大鼠胶质瘤体内抑制作用研究》文中指出为了研究自杀基因——胞嘧啶脱氨酶基因（cytosine deaminase gene,CD基因）对大鼠脑胶质瘤的体内治疗效果,采用基因转导系统将慢病毒包装的CD基因转染骨髓间充质干细胞（MSC）并使其长时间、高效表达,然后移植到使用颅内立体定向接种法制作的40只SD大鼠胶质瘤模型中.按接种细胞类型将实验SD大鼠分为5组,每组8只:①C6胶质瘤;②C6+MSCs细胞（1∶1）;③C6+MSCs细胞（1∶2）;④C6+MSC-codA/eGFP细胞（1∶1）;⑤C6+MSC-codA/eGFP细胞（1∶2）.瘤龄7天后腹腔注射500 mg/（kg.d）5-氟胞嘧啶（5-flucytosine,5-FC）,共14天.用磁共振成像（MRI）动态监测肿瘤的体积并进行了大鼠存活期观察、常规病理分析、RT-PCR检测、HE染色.结果显示,第①组瘤龄14天时病灶呈圆形,中心见坏死区,肿瘤平均246 mm3,均存活期15.3天,第②组平均生存期16.0天,第③组平均生存期16.6天,第④⑤组自然存活期均大于30天,14天时病灶平均体积分别为55 mm3、40 mm3,28天时肿瘤抑制率分别为77.24%、83.28%.MRI扫描可清楚显示肿瘤的大小、形态和内部结构,与病理结果高度相关;MRI动态观察可证实携带CD基因的骨髓间充质干细胞及5-FC治疗系统治疗C6颅内胶质瘤有效;RT-PCR检测结果证实肿瘤组织内有胞嘧啶脱氨酶表达.
罗先润[9]（2012）在《Survivin启动子马区动CD/TK双自杀基因对胃癌的靶向治疗作用》文中认为胃癌是临床最常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年大约有100多万新发胃癌患者,在我国其发病率和病死率均为全身恶性肿瘤的首位,在国内某些地区已居全部恶性肿瘤死亡原因之首。近年来,随着胃癌相关研究的不断深入,人们在胃癌的发病机制和临床诊治方面取得了大量的成果,但目前,胃癌的诊治仍面临许多困难,整体治疗效果仍不理想,其临床特点依然表现为三低一高,即早期诊断率低（约10%）,手术切除率低（<70%）,5年生存率低（约40%）,根治术后复发转移率高（约50%）。因此,积极寻找新的胃癌治疗手段,提高胃癌的治疗水平,具有积极而重要的现实意义。肿瘤基因治疗通常是指把正常的目的基因利用载体及基因转化方法导入患者体内,利用基因的功能抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞。自杀基因疗法又称为基因介导的酶前药治疗——GDE（Gene-directed enzyne prodrug treatment）,已经成为手术治疗、放射治疗、化疗等传统肿瘤疗法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。自杀基因（suicide gene）是指来自病毒和细菌等的一类可以将生物前药转换成有毒产物的基因。此类基因编码的特异性酶类,可以将对细胞本来没有毒或毒性极低的药物前体,在肿瘤细胞内代谢成毒性产物,杀死肿瘤细胞,导致这些细胞自杀。来源于大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶基因（E.coli cytosine deaminase, CD）及来源于病毒的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK）是目前研究应用较多的两类自杀基因。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因编码的酶为胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase）,可激活5-氟胞嘧啶,变成5-氟尿嘧啶,从而抑制DNA和RNA的合成,发挥细胞毒作用。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因编码胸苷激酶,可将核苷类似物代谢为二磷酸化物,进一步代谢为对细胞有毒性的三磷酸化合物,进而抑制DNA聚合酶发挥抗肿瘤作用。胃癌自杀基因治疗是指将自杀基因克隆至适当表达载体,然后导入胃癌细胞,自杀基因编码的特异性酶可以将无毒的药物前体代谢成毒性产物,达到杀死胃癌细胞的目的。在肿瘤基因治疗的研究中,基因的靶向性表达是亟需解决的关键问题之一。靶向性表达是指目的基因仅在肿瘤细胞表达,在正常细胞中不表达,从而减少对正常细胞的影响。有些基因的启动子能在肿瘤细胞中特异表达,而在正常细胞中不表达,利用这些启动子序列构建能在肿瘤细胞中特异表达的载体,让目的基因在肿瘤细胞中的特异表达,特异杀死肿瘤细胞,是目前肿瘤基因治疗靶向性的一个有效途径。目前在肿瘤研究中应用的启动子主要有：端粒酶基因启动子、癌胚抗原（CEA）启动子等,但这些启动子存在明显的缺点,如调控作用弱、应用范围窄、特异性不高等。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的一员,它在多数肿瘤中高表达,但是在成人正常终末分化组织中不表达或者是低表达,具有明显的肿瘤特异性。因此利用survivn特异启动子可以驱动下游目的基因在肿瘤细胞中的特异表达,从而避免对正常细胞的损伤。鉴于上述,在本实验中我们克隆了Survivin启动子,构建了Survivin启动子介导的CD/TK表达载体,转染至胃癌细胞,建立3ALB/C裸鼠胃癌模型,给予一定浓度的5-FC、GCV,证实了Survivin-CD/TK系统对裸鼠的胃癌皮下移植瘤有明显的靶向杀伤作用。本论文分为四部分：第一部分Survivin启动子的克隆及在胃癌细胞中的特异表达目的利用分子克隆技术,构建survivin介导的EGFP基因重组真核表达质粒,转染胃癌细胞,鉴定survivin启动子在胃癌细胞的特异表达。方法1.从人外周血白细胞中提取基因组DNA,设计合适引物,通过PCR扩增出survivin启动子并与pMD18-T载体连接,经筛选得到重组质粒pMD-survivin,进行酶切鉴定及测序。2.提取质粒pMD-survivin,酶切获得survivin启动子片段。采用同样酶切真核表达载体pEGFP-Cl,连接,转化细菌,构建重组真核表达载体pEGFP-Su,酶切鉴定。3.脂质体转化胃癌SGC7901细胞及正常胃上皮细胞株GES-1,72小时后荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。结果1.经酶切和测序证实成功获得survivin启动子（约910bp）。2.经酶切鉴定成功构建重组质粒pEGFP-Su。3.荧光显微镜下观察,survivin启动子介导的EGFP能特异在胃癌SGC7901细胞表达,而在正常的胃上皮GES-1细胞没有活性。第二部分重组pEGS-CD/TK双自杀基因载体的构建与鉴定目的利用分子克隆技术,构建pEGS-CD/TK双自杀基因载体。方法1.提取JE.coli BL21基因组DNA,设计合适引物,通过PCR扩增出CD基因并与pMD18-T载体连接,经筛选得到重组质粒pMD-CD,进行酶切鉴定及测序。2.提取pORF-HSVtk质粒,设计合适引物,通过PCR扩增出TK基因并与PMD18-T载体连接,经筛选得到重组质粒pMD-TK,进行酶切鉴定及测序。3.将质粒pMD-CD进行双酶切,获得CD基因片段,连接与相同酶切的真核表达载体pEGFP-Su上,构建重组真核表达载体pEGS-CD,酶切鉴定。4.再将质粒pMD-TK进行双酶切,获得TK基因片段,连接与相同酶切的真核表达载体pEGS-CD上,构建重组真核表达载体pEGS-CD/TK,酶切鉴定。结果1.经酶切和测序证实成功获得CD基因（约1281bp）,TK基因（约1161bp）。2.经酶切鉴定成功构建重组质粒pEGS-CD。3.经酶切鉴定成功构建重组质粒pEGS-CD/TK。第三部分pEGS-CD/TK双自杀基因载体对胃癌SGC7901细胞的体外杀伤作用目的利用细胞转染技术,研究survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因系统对胃癌细胞SGC7901的体外杀伤作用。方法1.利用脂质体转染技术,将pEGS-CD/TK双自杀基因质粒转染胃癌SGC7901细胞、GES-1细胞。2. SGC790、GES-1细胞加入不同浓度的5-FC、GCV前体药物。MTT方法测定吸收值,计算细胞存活率。3.转染和未转染pEGS-CD/TK的SGC7901细胞混合,加入5-FC+GCV二者混合液,观察有无旁观者效应。4.应用RT-PCR检测转染细胞中CD、TK基因mRNA的表达；Western blot法检测转染细胞CD、TK蛋白的表达。5.流式细胞术检测细胞凋亡率。结果1.在给予5-FC、GCV后并达到一定浓度时,5-FC和GCV对SGC7901细胞存活率随着药物浓度的升高而呈现下降趋势,其体外杀伤作用具有浓度依赖性,且联合用药对SGC7901细胞体外的杀伤作用要强于二者单独应用；而不同浓度梯度的5-FC和GCV对GES-1细胞的细胞存活率改变不大。2.转染的SGC7901细胞即可引起大部分未转染的细胞发生凋亡,旁观者效应较为明显。3.通过RT-PCR和（?） Western blot检测证实CD,TK基因在SGC7901细胞中成功表达。4.转基因SGC7901细胞在给予前药处理24h后,治疗组SGC7901细胞凋亡率明显高于对照组凋亡率（P<0.01）。第四部分pEGS-CD/TK双自杀基因系统对胃癌SGC7901细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应目的观察survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因系统对胃癌SGC7901细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应。方法1.动物模型的建立：小鼠左腋下皮下接种2×106SGC7901细胞,第三天复种一次,建立胃癌动物模型。2. SGC7901皮下移植术后第10天,实验分为4组,每组10支。分组方法：A组：注射重组pEGS-CD/TK与前药5-FC与GCV；B组：仅注射重组pEGS-CD/TK;C组：仅注射前药5-FC与GCV；D组：空白对照,不施加任何处理。每3天测量一次皮下移植瘤的大小,计算瘤体体积。处死裸小鼠,HE染色,观察肿瘤的病理变化。3. RT-PCR检测（?）CD/TK基因的表达。结果1.接种肿瘤细胞后10天左右,出现皮下肿瘤结节。裸鼠成瘤达0.5cm后开始治疗。注射重组pEGS-CD/TK与前药5-FC与GCV组与仅注射pEGS-CD/TK,前药GCV和5-FC,空白对照组相比较,移植瘤体积明显缩小,有统计学意义（P<0.05）。2.治疗组切片中可见肿瘤细胞数目稀少,胞浆少,细胞核较小且染色较深,细胞分裂相少,核和胞浆凝缩及坏死区散在分布,纤维血管较少,可见炎性细胞浸润3.治疗组瘤体内RT-PCR可检测至（?）CD/TK基因表达结论1. Survivin启动子能在胃癌肿瘤细胞中特异表达。2.经酶切和测序鉴定,利用分子克隆技术成功获得CD和TK基因。3.成功构建重组Survivin启动子介导的CD/TK双自杀载体系统。4.含CD和TK融合基因的双自杀基因载体对SGC7901细胞具有强烈的杀伤作用,并且存在明显的旁观者效应。治疗组SGC7901细胞凋亡率明显高于对照组凋亡率（P<0.01）。5. RT-PCR及Western blot检测结果CD/TK基因在SGC7901细胞中成功表达。6.应用SGC7901细胞可成功建立致瘤BALB/C裸小鼠。7. Survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因能在胃癌小鼠的瘤体内特异表达。8. Survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因在前体药物GCV和5-FC作用下,能抑制胃癌瘤体的生长,具备体内抑瘤效应。
孙茂才[10]（2010）在《胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用》文中提出目的:构建大肠埃希菌胞嘧啶脱氨酶（E. Coli cytosine deaminase, EC-CD）基因突变体D314A（即EC-CD基因开放阅读框第314个氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸）并研究其抗肿瘤作用。方法:构建含EC-CD基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CDwt,应用点突变技术将pcDNA3.1-CD中EC-CD基因开放阅读框第314个氨基酸的碱基由A突变为C,即构成pcDNA3.1-CDD314A。用Lipofectamine? 2000将EC-CD基因或D314A基因转入人结肠癌细胞系LoVo细胞,以G418筛选出稳定表达的阳性克隆LoVo-CDwt及LoVo-CDD314A。应用MTT法检测EC-CD基因及D314A基因对LoVo细胞的直接杀伤作用及旁观者效应。结果:EC-CD基因突变体D314A经测序确认。LoVo细胞转染EC-CD基因及D314A基因后均能表达相应的mRNA,Lovo-CDD314A细胞对5-FC的IC50为85.13±0.60mmol/L,显着低于Lovo-CDwt细胞（689.76±0.45umol/L,P=0.000）;在旁观者试验中当Lovo-CDwt细胞和Lovo-CDD314A细胞比例均为30%时,细胞存活率分别为48.5±0.49%与17.3±0.40%（P =0.000）。结论:EC-CD基因突变体D314A的抗肿瘤作用显着强于野生型EC-CD基因,有望成为新的肿瘤基因治疗候选基因。
二、A STUDY ON THE TREATMENT OF GASTRIC CANCER BY CD GENE COMBINED WITH 5-FC IN VITRO AND IN VIVO（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、A STUDY ON THE TREATMENT OF GASTRIC CANCER BY CD GENE COMBINED WITH 5-FC IN VITRO AND IN VIVO（论文提纲范文）
（1）基于生物小分子构建多羟基阳离子基因载体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 两大重要疾病与基因治疗的简介 |
| 1.2 基因递送体系 |
| 1.2.1 基因的种类 |
| 1.2.1.1 DNA |
| 1.2.1.2 RNA |
| 1.2.1.3 mRNA |
| 1.2.1.4 siRNA和shRNA |
| 1.2.1.5 miRNA和lncRNA |
| 1.2.1.6 CRISPER/Cas9 |
| 1.2.2 基因载体 |
| 1.2.2.1 病毒载体 |
| 1.2.2.2 非病毒载体 |
| 1.2.3 递送基因过程中非病毒类载体需要克服的障碍 |
| 1.3 生物小分子 |
| 1.3.1 脂质 |
| 1.3.2 多酚类 |
| 1.3.3 小分子糖类 |
| 1.3.4 小分子活性肽 |
| 1.4 原子转移自由基活性聚合(ATRP)在生物材料构建中的应用 |
| 1.5 分子影像学在疾病中的应用 |
| 1.6 本课题的设计和意义 |
| 第二章 基于细胞膜脂质构建多羟基阳离子基因载体 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 引发剂(CHO-Br和PI-Br)的合成 |
| 2.2.4 CHO-PGMA,PI-PGMA和PGMA及其各自衍生物的制备 |
| 2.2.5 合成的聚阳离子以及聚阳离子/pDNA复合物的表征 |
| 2.2.6 细胞毒性分析 |
| 2.2.7 体外转染分析 |
| 2.2.8 细胞吞噬分析 |
| 2.2.9 体外抗肿瘤细胞分析 |
| 2.2.10 体内抗肿瘤实验 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 脂质基PGEA载体的制备和表征 |
| 2.3.2 CHO-PGEAs/pDNA和PI-PGEAs/pDNA复合物的表征 |
| 2.3.3 细胞毒性分析 |
| 2.3.4 细胞转染分析 |
| 2.3.5 细胞内吞分析 |
| 2.3.6 体外抗肿瘤实验 |
| 2.3.7 体内抗肿瘤实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CHO-PGEA阳离子载体在心血管疾病中的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 聚阳离子/核酸的复合物的筛选和表征 |
| 3.2.4 体内CRISPR/Cas9质粒的吞噬效率 |
| 3.2.5 体内Ang Ⅱ刺激下CRISPR/Cas9质粒的表达效率 |
| 3.2.6 体内编译实验 |
| 3.2.7 体内安全性实验 |
| 3.2.8 体内心脏肥厚治疗实验 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 体内CRISPR/Cas9质粒的吞噬效率 |
| 3.3.2 体内Ang Ⅱ刺激下CRISPR/Cas9质粒的表达效率 |
| 3.3.3 体内编译实验 |
| 3.3.4 体内安全性实验 |
| 3.3.5 体内心脏肥厚治疗实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 多功能阳离子纳米核酸系统用于胸主动脉夹层治疗 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 引发剂TA-Br的合成 |
| 4.2.4 引发剂TA-Br-Gd的再修饰 |
| 4.2.5 TA-PGMA及其衍生物TA-PGEA的合成 |
| 4.2.6 钆螯合的TA-PGEA的合成 |
| 4.2.7 TA-E,TP-ColⅣ和TA-ColⅣ-RhB的合成 |
| 4.2.8 聚阳离子/miRNA复合物的构建 |
| 4.2.9 材料及其复合物理化性质的表征 |
| 4.2.10 抗蛋白吸附实验 |
| 4.2.11 溶血实验 |
| 4.2.12 体外毒性分析 |
| 4.2.13 细胞吞噬分析 |
| 4.2.14 体外miR-145的基因递送效率 |
| 4.2.15 体外miR-145调控下游蛋白KLF4表达 |
| 4.2.16 体内miRNA的递送效率 |
| 4.2.17 体内治疗实验 |
| 4.2.18 体外材料核磁造影能力的检测 |
| 4.2.19 体内核磁诊断与监控 |
| 4.2.20 体内毒性分析 |
| 4.2.21 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 复合物TP-Gd/miRNA-ColIV的制备和表征 |
| 4.3.2 蛋白吸附,溶血和体外毒性实验 |
| 4.3.3 体外吞噬实验和目的蛋白调控实验 |
| 4.3.4 体内摄取实验 |
| 4.3.5 体内TAD治疗 |
| 4.3.6 体外核磁能力检测 |
| 4.3.7 体内诊断与监控 |
| 4.3.8 体内毒性检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（2）YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 脐带间充质干细胞的三维培养及迁移能力研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 YCD:UPRT和miR195修饰的脐带间充质干细胞对急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6体外作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病细胞模型小鼠的体内实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 英文文章Ⅰ |
| 英文文章Ⅱ |
| 附件 |
（3）双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 相关文献研究 |
| 第一章 肝癌 |
| 1.1 原发性肝癌的病因学与病理学: |
| 1.2 原发性肝癌的治疗手段与技术方法 |
| 1.2.1 肝癌的外科手术治疗(术疗) |
| 1.2.2 肝癌的化学药物治疗(化疗) |
| 1.2.3 肝癌的放射治疗(放疗) |
| 1.2.4 肝癌的生物学疗法 |
| 1.2.5 肝癌的分子靶向治疗 |
| 1.2.6 肝癌的射频消融治疗 |
| 1.2.7 肝癌的中医中药学疗法 |
| 1.2.8 肝癌的中西医结合疗法 |
| 第二章 芪三酚 |
| 2.1 芪三酚的结构及性质 |
| 2.2 芪三酚的抗癌作用 |
| 2.2.1 诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.2.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 第三章 自杀基因 |
| 3.1 自杀基因的种类 |
| 3.2 自杀基因的作用及机制 |
| 3.3 自杀基因增效疗法 |
| 第四章 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及其稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 具体操作方法 |
| 1.2.3 统计学方法: |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 质粒的转化、扩增及鉴定 |
| 1.3.2 逆转录病毒的包装、浓缩、鉴定 |
| 1.3.3 逆转录病毒感染HepG2肝癌细胞 |
| 1.3.4 感染细胞的鉴定 |
| 1.3.5 HepG2/CDTK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 双自杀基因联合芪三酚对肝癌细胞HepG2细胞杀伤作用的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验研究细胞 |
| 2.1.2 实验研究试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 细胞克隆形成率检测 |
| 2.2.4 凋亡相关基因检测 |
| 2.2.5 细胞迁移能力实验—细胞划痕法 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.7 细胞亚结构 |
| 2.2.8 统计学方法: |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 一般形态学 |
| 2.3.2 MTT法测定双自杀基因和芪三酚对肝癌细胞的生长抑制情况 |
| 2.3.3 细胞凋亡指标检测结果 |
| 2.3.4 细胞克隆形成实验结果 |
| 2.3.5 凋亡基因检测结果 |
| 2.3.6 细胞迁移实验结果 |
| 2.3.7 流式细胞检测细胞周期结果 |
| 2.3.8 细胞亚结构 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 芪三酚对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.2 肝癌自杀基因对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.3 肝癌双自杀基因与芪三酚联合应用对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
| 2.4.4 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一章 肿瘤基因治疗概述 |
| 一、 基因沉默疗法 |
| 二、 抑癌基因疗法 |
| 三、 免疫基因疗法 |
| 四、 自杀基因治疗 |
| 五、 抗肿瘤血管生成基因疗法 |
| 六、 肿瘤多药耐药基因疗法 |
| 第二章 肿瘤自杀基因治疗研究进展 |
| 一、 自杀基因及自杀基因治疗系统 |
| 二、 自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
| 三、 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
| 第三章 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
| 第四章 木犀草素、芹菜素及槲皮素药理作用及抗肿瘤作用 |
| 一、 木犀草素与肿瘤的相关研究 |
| 二、 芹菜素与肿瘤的相关研究 |
| 三、 槲皮素与肿瘤的相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 人黑色素瘤细胞HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 RT-PCR扩增人tk读码框 |
| 二、 慢病毒载体质粒pLV-tk/GFP的构建和鉴定 |
| 三、 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 四、 重组慢病毒的包装与感染 |
| 五、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 六、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 七、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 三、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 第四节 讨论 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第二章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞间缝隙连接通讯的作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 A375生长曲线绘制 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法和流式细胞技术观察GJIC功能 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 五、 统计方法 |
| 第三节 结果 |
| 一、 A375细胞的增殖测定 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法及流式细胞术检测药物对A375细胞GJIC功能的影响 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 四、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 第四节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件Ⅰ：本论文中使用的缩略语 |
| 附件Ⅱ：pLXSN-tk质粒中tk基因测序图 |
| 附件Ⅲ：已在国内外学术期刊上发表的相关论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（5）核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词及中英文对照索引 |
| 引言 |
| 第一部分 含有 MAR 的重组 pMS-CD/TK 双自杀基因表达载体的构建 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组 pMS-CD/TK 表达载体转染胃癌细胞及表达分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MAR 增强双自杀基因 CD/TK 表达对胃癌细胞的体外作用实验 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 MAR 增强双自杀基因 CD/TK 表达对体内裸鼠胃癌移植瘤的作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 癌症的自杀基因治疗发展现状综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（6）rPB-DR（6）调控的溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 质粒、菌株、细胞株 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Ad5-r PB-DR(6)-m CMV-CD病毒构建及鉴定 |
| 1.2.2 重组溶瘤腺病毒对2种亚型的前列腺癌细胞靶向复制能力的检测 |
| 1.2.3 Western blot检测E1A、CD蛋白表达 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组溶瘤腺病毒Ad5-r PC的构建 |
| 2.1.1 重组质粒p55-r PB-DR(6)酶切鉴定 |
| 2.1.2 质粒p DC315-CD鉴定 |
| 2.1.3 p55-m CMV-CD的酶切鉴定 |
| 2.1.4 质粒p55-r PC构建和鉴定 |
| 2.1.5 重组溶瘤腺病毒的鉴定及滴度测定 |
| 2.2 重组溶瘤腺病毒选择性复制能力测定 |
| 2.3 Western blot检测重组溶瘤腺病毒感染的癌细胞E1A和CD蛋白表达 |
| 2.4 重组溶瘤腺病毒细胞毒性测定 |
| 3 讨论 |
（7）重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 恶性肿瘤 |
| 1.1.2 治疗手段 |
| 1.2 新城疫病毒 |
| 1.2.1 NDV 的危害和防治 |
| 1.2.2 NDV 的粒子框架和基因组 |
| 1.2.3 NDV 的编码蛋白 |
| 1.2.4 NDV 的抵抗力和培养 |
| 1.2.5 NDV 的分类 |
| 1.3 NDV 的抗肿瘤作用 |
| 1.3.1 NDV 的感染和复制机理 |
| 1.3.2 NDV 的抗肿瘤机理 |
| 1.3.3 NDV 应用于肿瘤治疗的安全性 |
| 1.4 运用反向遗传操作技术改造 NDV 用于肿瘤治疗的进展 |
| 1.5 自杀基因疗法（SGT）及胞嘧啶脱氨酶（CD） |
| 1.5.1 自杀基因疗法 |
| 1.5.2 胞嘧啶脱氨酶和 CD/5-FC 系统 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞株和质粒 |
| 2.2 培养基及生化试剂 |
| 2.3 鸡胚和实验动物 |
| 2.4 引物 |
| 2.5 主要仪器和设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 CD 基因的克隆和序列比对分析 |
| 3.1.1 大肠杆菌 JM109 菌株全基因组的提取 |
| 3.1.2 CD 基因的 PCR 扩增 |
| 3.1.3 PCR 产物的纯化 |
| 3.1.4 CD 基因序列测定与结果分析 |
| 3.2 pBrClone30-CD 全长 cDNA 克隆转录质粒的构建 |
| 3.2.1 CD 基因片段及 pBrClone30 载体片段的制备 |
| 3.2.2 CD 基因片段和 pBrClone30 转录载体片段的连接 |
| 3.2.3 阳性重组质粒的鉴定 |
| 3.3 CD 基因真核表达载体的构建 |
| 3.3.1 CD、IRES-EGFP 基因片段和 pEE12.4 真核表达载体片段的制备 |
| 3.3.2 CD、IRES-EGFP 基因片段和 pEE12.4 真核表达载体片段的连接 |
| 3.3.3 阳性重组质粒的鉴定 |
| 3.4 CD 的生物学活性检测 |
| 3.4.1 HepG2 细胞的转染 |
| 3.4.2 MTT 法检测 pEE12.4IE-CD/5-FC 对 HepG2 的杀伤作用 |
| 3.5 重组 NDV rClone30-CD 的拯救及鉴定 |
| 3.5.1 重组 NDV 的拯救 |
| 3.5.2 重组 NDV 的 RT-PCR 鉴定 |
| 3.5.3 拯救后重组 NDV 的 TCID50测定 |
| 3.5.4 重组 NDV 的鸡胚内增殖稳定性检测 |
| 3.5.5 重组 NDV 鸡胚内生长特性的测定 |
| 3.6 MTT 法测定重组 NDV 对 HepG2 细胞的抑制作用 |
| 3.7 5-FC 对昆明小鼠的安全性检测 |
| 3.7.1 5-FC 的小鼠急性毒性（LD50）实验 |
| 3.7.2 5-FC 静脉注射最大安全剂量测定 |
| 3.7.3 最大安全剂量组小鼠的跟踪观察 |
| 3.8 昆明小鼠 H22 肝癌荷瘤模型建立 |
| 3.9 重组 NDV rClone30-CD/5-FC 对小鼠 H22 荷瘤模型的抑制和存活率的提高作用 |
| 3.9.1 尾静脉注射 5-FC 法 |
| 3.9.2 瘤内注射 5-FC 法 |
| 3.9.3 重组 NDV rClone30-CD/5-FC 对实验小鼠存活率的提高作用 |
| 3.10 实验小鼠血液中 5-FU 含量的测定 |
| 3.11 肿瘤组织病理切片的制作与观察 |
| 3.12 重组 NDV 的安全性检测 |
| 3.12.1 重组 NDV 的毒性试验 |
| 3.12.2 荷瘤小鼠组织器官的病毒检测 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 CD 基因的克隆与序列分析 |
| 4.1.1 大肠杆菌 JM109 菌株全基因组的提取 |
| 4.1.2 CD 基因的 PCR 扩增 |
| 4.1.3 CD 基因序列测定与结果比对分析 |
| 4.2 NDV pBrClone30-CD 基因组载体的构建和阳性重组质粒鉴定 |
| 4.2.1 CD 基因片段和 pBrClone30/MCS 载体片段的制备 |
| 4.2.2 pBrClone30-CD 阳性重组质粒的鉴定 |
| 4.3 CD 真核表达载体 pEE12.4IE-CD 的构建和阳性重组质粒鉴定 |
| 4.3.1 CD 基因片段、IRES-EGFP 基因片段和 pEE12.4 载体片段的制备 |
| 4.3.2 阳性重组质粒的鉴定 |
| 4.4 CD 的生物学活性检测 |
| 4.4.1 HepG2 细胞的转染 |
| 4.4.2 MTT 法检测 pEE12.4IE-CD/5-FC 对 HepG2 的杀伤作用 |
| 4.5 重组 NDV rClone30-CD 的拯救及鉴定 |
| 4.5.1 重组 NDV 的拯救 |
| 4.5.2 重组 NDV RT-PCR 鉴定 |
| 4.5.3 重组 NDV 的鸡胚内增殖稳定性检测 |
| 4.5.4 重组 NDV 鸡胚内生长特性的测定 |
| 4.6 MTT 法测定重组 NDV 对 HepG2 细胞的抑制作用 |
| 4.7 5-FC 对昆明小鼠的安全性检测 |
| 4.7.1 5-FC 的小鼠急性毒性（LD50）实验 |
| 4.7.2 5-FC 静脉注射最大安全剂量测定 |
| 4.7.3 最大安全剂量组小鼠的跟踪观察 |
| 4.8 昆明小鼠 H22 肝癌荷瘤模型建立 |
| 4.9 重组 NDV rClone30-CD/5-FC 对小鼠 H22 荷瘤模型的抑制和存活率提高作用 |
| 4.9.1 尾静脉注射 5-FC 法 |
| 4.9.2 瘤内注射 5-FC 法 |
| 4.9.3 重组 NDV rClone30-CD/5-FC 对实验小鼠存活率的提高作用 |
| 4.10 实验小鼠血液中 5-FU 含量的测定 |
| 4.11 肿瘤组织病理切片的观察 |
| 4.12 重组 NDV 的安全性检测 |
| 4.12.1 重组 NDV 的毒性试验 |
| 4.12.2 荷瘤小鼠组织器官的病毒检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 NDV 毒株的选择 |
| 5.2 选择插入 CD 外源基因 |
| 5.3 携带 CD 基因载体的选择 |
| 5.4 外源基因插入位置的选择 |
| 5.5 重组 NDV 的拯救 |
| 5.6 重组 NDV 的鉴定及病毒活性分析 |
| 5.7 重组 NDV 对肿瘤细胞的抑制作用 |
| 5.8 昆明小鼠 H22 肝癌荷瘤模型的建立 |
| 5.9 重组 NDV rClone30-CD/5-FC 对小鼠 H22 荷瘤模型的抑制和存活率提高作用 |
| 5.10 实验小鼠血液中 5-FU 含量的测定 |
| 5.11 重组 NDV 的安全性检测 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）Survivin启动子马区动CD/TK双自杀基因对胃癌的靶向治疗作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词及中英文对照索引 |
| 引言 |
| 第一部分 Survivin启动子的克隆及在胃癌细胞中的特异表达 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Survivin启动子的分子克隆和序列分析 |
| 2.2 pEGFP-Su载体的构建 |
| 2.3 Survivin启动子驱动EGFP在胃癌SGC7901细胞特异表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Survivin启动子的分子克隆 |
| 3.2 基因克隆pMD18-T和表达载体pEGFP-C1 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组pEGS-CD/TK双自杀基因载体的构建与鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CD基因的分子克隆和序列分析 |
| 2.2 TK基因的分子克隆和序列分析 |
| 2.3 重组pEGS-CD/TK双自杀基因真核表达质粒的构建 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因的分子克隆#41 |
| 3.2 单纯疱病毒Ⅰ型(HSV-1)胸苷激酶TK的分子克隆 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 pEGS-CD/TK双自杀基因系统对SGC7901细胞的体外杀伤作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 前体药物对SGC7901细胞、GES-1细胞毒性的检测 |
| 2.2 前体药物对转化的SGC7901细胞、GES-1细胞毒性的检测 |
| 2.3 旁观者效应检测结果 |
| 2.4 RT-PCR结果 |
| 2.5 Western blot结果 |
| 2.6 pEGS-CD/TK双自杀基因系统对SGC7901细胞凋亡的结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 pEGS-CD/TK双自杀基因系统对胃癌SGC7901细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 BALB/C裸小鼠胃癌皮下移植瘤模型的建立及肿瘤生长情况 |
| 2.2 肿瘤病理变化 |
| 2.3 皮下移植瘤双自杀基因CD/TK的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 3.2 pEGS-CD/TK双自杀基因系统对胃癌裸鼠模型的体内抑瘤效应 |
| 4 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 1 胃癌发生的分子遗传学基础 |
| 1.1 遗传易感性 |
| 1.2 基因改变(gene alterations) |
| 2 基因治疗(gene therapy) |
| 3 胃癌基因治疗的方法 |
| 3.1 自杀基因治疗 |
| 3.2 抑制肿瘤生长及诱导凋亡基因治疗 |
| 3.3 免疫基因治疗 |
| 3.4 抗血管生成基因治疗 |
| 3.5 联合其他手段的基因治疗 |
| 4 胃癌的靶向性基因治疗 |
| 5 胃癌基因治疗问题和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（10）胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 己发表论文 |
| 致谢 |
四、A STUDY ON THE TREATMENT OF GASTRIC CANCER BY CD GENE COMBINED WITH 5-FC IN VITRO AND IN VIVO（论文参考文献）
- [1]基于生物小分子构建多羟基阳离子基因载体[D]. 许晨. 北京化工大学, 2019(06)
- [2]YCD:UPRT和miR195双修饰的3D间充质干细胞治疗急性B淋巴细胞白血病的研究[D]. 周盼盼. 山东大学, 2018(12)
- [3]双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究[D]. 谭成光. 广州中医药大学, 2017(05)
- [4]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
- [5]核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究[D]. 牛颖. 郑州大学, 2014(02)
- [6]rPB-DR（6）调控的溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用[J]. 付成伟,王洛夫,江军,孙中义,兰卫华,张克勤. 第三军医大学学报, 2013(24)
- [7]重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究[D]. 吕政. 东北农业大学, 2013(10)
- [8]携带CD基因骨髓间充质干细胞对C6大鼠胶质瘤体内抑制作用研究[J]. 宋飞,邢琪,宋克东,刘健,姬广春,马郁芳,刘天庆,马学虎,田晓峰. 生物化学与生物物理进展, 2012(05)
- [9]Survivin启动子马区动CD/TK双自杀基因对胃癌的靶向治疗作用[D]. 罗先润. 郑州大学, 2012(09)
- [10]胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用[D]. 孙茂才. 南京医科大学, 2010(02)