一、Expression and significance of GFRal Gene in the regeneration of spermatogenesis in mice（论文文献综述）
宋连杰[1]（2020）在《蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定》文中提出马业由古老的产业向现代马术和赛马产业发展,已经成为当今重要的经济支柱,我国是养马大国,以蒙古马居多。蒙古马具有抗寒、抗病、耐粗饲的特点,在马的遗传资源中是一个及其珍贵的基因库。但是蒙古马的育种繁殖方面研究相对薄弱,从而影响了马匹改良进程。精原干细胞是雄性动物体内唯一能够进行有丝分裂,并且能把遗传信息传递给下一代的干细胞,然而在众多睾丸细胞中精原干细胞数量较少,为其后续分离纯化带来难度。迄今为止,模型动物精原干细胞的纯化培养体系日渐成熟,然而对于马属动物的精原干细胞的体外分离培养却仍然处于初级阶段。因此,本研究通过建立蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养体系,有利于对精原干细胞的长期培养和生长条件的进一步探索,不仅可以揭示蒙古马睾丸精原干细胞的体外增殖特点,还可以进一步探究蒙古马睾丸发育和精子产生机制,对蒙古马的改良以及育种有着重要意义。本实验以2岁蒙古马为研究对象,取其睾丸通过机械分离法和酶逐步消化法获得睾丸单细胞悬液,经过差速贴壁法进行分离纯化精原干细胞,然后接种于事先复苏好的支持细胞饲养层上,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、免疫荧光染色、qRT-PCR进行特异性标志基因鉴定。研究结果如下:1.支持细胞饲养层的制备,采用机械分离法和胶原酶、胰酶逐步消化法联合使用提取睾丸单细胞悬液,使用明胶包被的培养皿进行差速贴壁以期纯化支持细胞,其生长活性旺盛。2.对纯化的支持细胞进行HE染色,发现其形状不规则或者呈辐射状,细胞核染色为蓝紫色,胞质染色为红色,细胞之间紧密相连,符合支持细胞生长特征。3.连续8天检测支持细胞生长活率,发现其生长曲线呈“S”型,根据生长曲线选择前三代生存活力旺盛的细胞进行丝裂霉素C灭活留作饲养层有较高的使用价值。4.采用qRT-PCR方法检测培养5 d的蒙古马睾丸支持细胞特异性表达基因并选用蒙古马成纤维细胞（EFF）为对照,根据计算结果,P值小于0.01,表明支持细胞特异性基因GATA4和GDNF在支持细胞与成纤维细胞中的差异极显着。证明本次关于蒙古马睾丸支持细胞的体外分离与培养实验成功。5.蒙古马睾丸精原干细胞的制备,将睾丸样品进行分离消化,采用明胶、大鼠尾胶原、层粘连蛋白不同基质包被的培养皿差速贴壁法进行纯化,分离纯度为82%。6.使用经过丝裂霉素C灭活的支持细胞作为饲养层相对使用层粘连蛋白作为饲养层,精原干细胞增殖较快,一周以内出现细胞克隆团,细胞活力稳定。7.将精原干细胞进行（AKP）染色,细胞被染成棕褐色,即AKP 阳性,细胞具有干性,属于蒙古马精原干细胞。qRT-PCR检测精原干细胞特异性标志基因TSPYL2、Gfra1、Pgp9.5、CD9、MHC-I,以蒙古马成纤维细胞作为对照,结果为差异极显着（P<0.01）,即所培养的为蒙古马精原干细胞,经过免疫荧光染色,检测到干细胞标记物Pgp9.5表达,再次确定所培养的细胞为蒙古马睾丸精原干细胞。
罗正誉[2]（2020）在《减数分裂过程中三维基因组研究与多组学研究技术的开发》文中进行了进一步梳理在过去的近二十年中,随着染色质高级结构研究方法的不断发展和突破,对不同物种以及不同生物学过程中染色质高级结构的研究一方面加深了我们对染色质高级结构及其形成机制和功能的了解,另一方面也促进了转录调控、细胞发育、疾病发生等其它领域的研究进展。嗜热四膜虫在一个细胞内具有两个发育来源相同,但最终在功能和基因组结构方面有较大差异的细胞核。通过Hi-C和HiChIP技术,我们对接合生殖过程中不同时期的嗜热四膜虫细胞进行了染色质高级结构的分析。我们发现嗜热四膜虫小核在减数分裂过程中具有特殊的染色质相互作用模式,其端粒和中心粒区域分别聚集在一起。此外,我们的研究发现嗜热四膜虫大核中没有类似哺乳动物细胞中 A/B compartments,topologically associating domains（TADs）,chromatin loops的染色质高级结构,但存在chromosome territories。嗜热四膜虫的小核中也没有类似哺乳动物细胞中A/B compartments和chromatin loops的染色质高级结构,但存在类似TADs的染色质高级结构。通过对小核中的TAD-like结构进行分析,我们发现其边界与染色质断裂位点高度重合。此外,我们的研究发现嗜热四膜虫小核中的一个TAD-like结构对应了大核中的一条染色体。我们的这部分研究工作首次描绘了嗜热四膜虫大、小核的染色质高级结构并提示小核中的TAD-like结构可能参与调控了接合生殖过程大核染色体的发育形成。小鼠的精子发生过程主要涉及到细胞分化、减数分裂、精子形成等一系列生物学过程。在通过Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq等对小鼠精子发生过程中的染色质高级结构,染色质开放状态以及相关蛋白在染色质上的结合情况进行分析后。我们发现,在小鼠精子发生过程中A/B compartments,TADs以及chromatin loops均发生了重组。其中A/B compartments始终存在,但其强度经历了由强到弱再到强的变化过程。TADs和chromatin loops则是经历了从有到无再到有的重组过程,二者在减数分裂的粗线期均基本丢失。进一步的研究结果表明粗线期TADs和chromatin loops的丢失不依赖于染色质开放状态,转录,以及CTCF/cohesin在染色质上结合状态的改变。此外,我们发现在转录失活的成熟精子中重建的chromatin loops与早期胚胎发育过程中表达的基因相关,提示染色质高级结构可能具有表观遗传的功能。在利用现有的技术方法探究不同物种和生物学过程中的染色质高级结构的同时,我们也进行了新技术和方法的开发。我们初步建立了可以在群体细胞水平进行开放染色质位点间染色质相互作用研究的HiATAC技术,该技术可以用于在全基因组水平捕获染色质开放区域间的相互作用,包括enhancer-promoter interactions。我们还初步建立了可以在单细胞水平同时捕获转录组与染色质开放位点的sci-AR技术。
赵鹏伟[3]（2019）在《影响水牛精原细胞富集及体外增殖相关因素的初步研究》文中研究表明水牛是中国南方重要家畜之一,由于其繁殖效率低下及优秀种质资源缺乏,严重制约了水牛产业的发展。精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells,SSCs）是动物种质资源改良和新品种培育最具潜力的种子细胞之一,已成为当前动物繁殖学领域研究的热点。目前小鼠SSCs体外培养系统已较成熟,但是水牛相关研究较少,已知的SSCs体外培养系统尚不能满足水牛SSCs体外长期培养需求。本研究拟通过探索影响水牛精原干细胞富集及体外增殖的相关因素,为优化当前水牛SSCs体外培养系统奠定基础。取得的主要研究成果如下:1.探讨了影响水牛支持细胞（sertoli）饲养层细胞制备的相关因素。水牛睾丸细胞悬液经差异贴壁6 h,对已贴壁细胞用sertoli细胞特异性抗体WT1免疫荧光染色并计数,其纯度可达95%以上。以不同浓度丝裂霉素C处理sertoli细胞,结果显示,3.0 μg/mL丝裂霉素C处理组细胞增殖显着低于对照组和1.5μg/ml裂霉素C处理组,但与其它处理组无显着差异,所以制备sertoli饲养层细胞的丝裂霉素C处理浓度以3.0 μg/ml为宜。收集不同代sertoli细胞（0-10代）,采用qRT-PCR分析sertoli细胞特异表达基因,结果显示,P6、P7和P8代的sertoli细胞中GDNF表达量显着高于其它代细胞,而P7和P8代的SCF与FGF2表达量显着高于其它代细胞。2.观察了不同年龄水牛SSCs相关基因的表达状况。利用DDX4抗体与PGP9.5抗体对水牛睾丸组织SSCs进行定位,发现SSCs主要分布于曲细精管基底膜附近。采用qRT-PCR分析青春期前和成牛水牛睾丸细胞悬液SSCs相关基因的表达,结果显示青春期前睾丸细胞悬液Nanos2表达量显着高于成年水牛。水牛睾丸细胞悬液经明胶和鼠尾胶原蛋白差异贴壁富集SSCs细胞,结果显示富集后的细胞PGP9.5阳性细胞数量显着高于未差异贴壁组,并且经差异贴壁PGP9.5阳性细胞数量是未差异贴壁细胞的2.3倍。3.探讨了褪黑激素（Melatonin）和CHIR-99021（简称 CHIR）对SSCs体外增殖的影响。在IMDM培养系统中分别添加不同浓度褪黑激素或CHIR,SSCs经培养4天后传代,继续培养4天后,收集细胞,对SSCs干性及生殖相关基因（PLZF,DDX4,NANOS2）、分化相关基因（DMRT1,REC8,DAZL）、氧化相关基因（CAT,SOD3）和细胞增殖相关基因（CCND1,CCNE1）进行qRT-PCR分析,结果显示,与对照组相比,10-6MMelatonin处理组SSCs中PLZF、DDX4、SOD3表达量显着高于对照组;而DMRT1和REC8显着下调;CCND1基因表达在各组中无显着差异。10-6M Melatonin处理组与对照组的DDX4和PGP9.5阳性细胞数无显着差异。添加10 μM CHIR处理组SSCs中PLZF表达量极显着高于其它组,与对照组相比,NANOS2、CCND1、CCNE1表达量显着上调;DAZL、DMRT1、CAT和SOD3均显着下调。10μMCHIR处理组DDX4和PGP9.5阳性细胞数显着高于对照组,10 μM CHIR处理组阳性细胞数增加了1.7倍。
汪晶晶[4]（2019）在《雄激素受体调控小鼠PLZF+精原细胞命运的生物学机制研究》文中研究表明雄激素在精子发生中起关键作用,但雄激素是如何作用于睾丸生殖细胞并对其命运发挥调控作用的机制目前仍不清楚。转录抑制因子Promyelocytic Leukemia Zinc Finger（PLZF）对于维持未分化的精原细胞群（也称精原细胞祖细胞,spermatogonial progenitor cells,SPCs）是必需的,但具体的调控机制仍有较多不明之处,尤其是雄激素信号通路与PLZF之间的关联性研究目前仍属空白。本研究首先分析雄激素和PLZF+SPCs群体的命运之间的调控关系。通过免疫组织化学检测,我们确认出生后小鼠睾丸生殖细胞从精子发生开始就缺乏内源性雄激素受体（androgen receptor,AR）,表明精子发生过程中雄激素可能通过间接作用的方式调控精原细胞的命运。随后,从5dpp（day postpartum）小鼠睾丸中分离总细胞,并且用雄激素DHT和雄激素拮抗剂比卡鲁胺刺激并观察PLZF表达与雄激素信号的关联性。然后,用体外分离纯化的原代支持细胞进行ChIP-seq试验,筛选AR和Wilms Tumor’1（WT1）的下游靶基因,并用基因沉默和过表达来证明支持细胞或SPCs-支持细胞共培养系统中的这些相互作用。结果显示Gata2被鉴定为AR的靶基因,β1-integrin是支持细胞中WT1的靶基因。雄激素信号通过GATA2和WT1负调节支持细胞上的β1-integrin,而支持细胞上的β1-integrin与SPCs上的E-cadherin相互作用以调节SPCs命运。随后,我们通过转基因小鼠在生殖系中特异性过表达AR,分析持续性增加生殖细胞的内源性AR对精子发生的影响。首先,我们用DDX4-Cre的雄鼠与R26hARQ9floxed/+雌鼠合笼,获得R26hARQ9floxed/+:DDX4-Cre生殖系AR过表达子代小鼠。免疫组化结果发现在小鼠发育的各个阶段,R26hARQ9floxed/+:DDX4-Cre小鼠睾丸中的PLZF+SPCs群数量较对照组明显下降,成年R26hARQ9floxed/+:DDX4-Cre小鼠睾丸大部分曲细精管出现空腔,生殖细胞丢失,只剩支持细胞附着在基膜上,这些结果表明生殖细胞中特异性激活雄激素会诱导SPCs群体的丢失。综上所述,本文揭示了支持细胞中AR对未分化精原细胞（SPCs）的命运调控作用的信号传导通路及生殖系中持续性AR过表达对精子发生的损耗作用,分别在体外和体内证明了 AR可以促进睾丸中PLZF+精原细胞群的分化,为SPCs的体外分化及其与微环境相互作用的分子机制提供了理论支持,也为畜牧生产中雄性动物的繁殖力维持提供了新的思路。
杨阳[5]（2018）在《钙粘蛋白CDH1和CDH22对小鼠生殖干细胞自我更新的调控机制研究》文中研究表明生殖干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞,对动物的繁殖能力起到决定作用。而钙粘蛋白（Cadherins）是一种参与生殖干细胞命运调控的Ca2+依赖的跨膜糖蛋白,其对于生殖干细胞调控的具体机制目前还不是十分明确。在本研究中,我们分别关注了钙粘蛋白CDH1和CDH22对生殖干细胞自我更新的作用机制。第一部分:CDH1对雄性生殖干细胞的命运调控小鼠睾丸内精原干细胞（Spermatogonial Stem Cells,SSCs）的自我更新和分化受到多种因素的影响,而CDH1（又叫E-cadherin）很早就被确定为在雄性未分化的生殖细胞上特异性表达。体外分离得到的精原祖细胞（Spermatogonial Progenitor Cells,SPCs）维持未分化状态的过程十分复杂。转录抑制因子早幼粒细胞白血病锌指（PLZF）己被确定为维持SPCs干性的关键因子,但具体调控机制尚不明确。本研究中,我们从5日龄小鼠睾丸中分离纯化了 Thy-1+细胞并在体外培养建系,随后通过鉴定其表达谱,如Id4,Gfral,Plzf,Cdh1,Daz1,Ngn3和C-kit等的表达,证明了我们得到的Thy-1+细胞是SPCs富集的细胞群体。我们通过免疫荧光实验方法证实SPCs同时表达CDH1、β-catenin和PLZF,随后我们利用免疫共沉淀实验证实了在小鼠睾丸中CDH1和β-catenin之间存在相互作用。根据之前的研究报道,我们推测组蛋白去乙酰化酶4（HHdac4）在小鼠睾丸中是β-catenin的下游靶基因。于是我们用siRNA干扰技术在SPCs中敲低β-catenin,发现HDAC4表达也随之降低,证实了β-catenin调控HDAC4的表达。有研究报道,HDAC4通过与PLZF的结合和互作参与抑制细胞分化。所以我们通过免疫共沉淀证实了 HDAC4与PLZF在小鼠睾丸中相互结合相互作用。以上的实验结果表明CDH1通过调节β-catenin及其下游靶基因Hdac4,从而可能影响HDAC4的结合蛋白PLZF活性,来调控SPCs的干性。第二部分:CDH22对雌性生殖干细胞的命运调控初探雌性生殖干细胞（Female Germline Stem Cells,FGSCs）是近些年才被发现的一种存在于雌性哺乳动物卵巢内的生殖干细胞,但是对其自我更新和分化机制我们知之甚少。而充分了解这一机制对于维持雌性哺乳动物的生殖力有着重要意义。根据之前的研究报道我们知道,CDH22在雌性小鼠卵巢中高表达,但是对于卵巢生殖细胞起到什么样的作用还不是很清楚。为了探究这一机制,我们用免疫组织化学实验验证了 CDH22在不同年龄阶段（5d、10d、20d、42d）的小鼠卵巢中高表达。通过利用siRNA敲低CDH22在雌性生殖干细胞中的表达,发现其与雌性生殖干细胞的增殖有关。而根据有关报道我们知道JAK-STAT信号通路影响精原干细胞的自我更新。为了验证CDH22与JAK-STAT信号通路在雌性生殖干细胞中是否也存在类似的调控作用,我们通过免疫共沉淀实验发现在雌性生殖干细胞中CDH22与JAK2也存在结合作用。初步探究了在雌性生殖干细胞中,CDH22可能是通过JAK-STAT信号通路影响其自我更新。综上所述,我们探索了钙粘蛋白对生殖干细胞自我更新的重要的调控作用,这对于后续研究生殖干细胞提供了参考依据,同时从生物学角度为畜牧业中家畜繁殖力的维持提供了一个新的研究方向。
张小宇[6]（2018）在《钙粘素CDH22调控雌性生殖干细胞自我更新机制的研究及褪黑素在生殖力维持中的应用》文中研究说明生殖干细胞是一类具有自我更新能力,以及通过分化产生配子的生殖系干细胞,包括雄性动物中的精原干细胞,以及雌性动物中的雌性生殖干细胞（也叫卵原干细胞）。生殖干细胞的健康程度,以及自我更新和分化能力,直接决定着个体的生殖能力,但目前生殖干细胞自我更新和分化的分子机制尚不明确。本文从三个不同的方向分别讨论了生殖干细胞的特性及在生物医学领域,畜牧产业以及农业经济中的关联性与重要性,具体包括:以小鼠雌性生殖干细胞为研究对象,研究了小鼠雌性生殖干细胞命运调控的相关调控分子与信号通路;针对化疗药物白消安的生殖系毒副作用,探索了褪黑素在化疗过程中对小鼠精原干细胞生殖力保护作用的机制;以及针对畜牧业中玉米赤霉烯酮对种公畜的生殖毒性影响,初步探索了褪黑素在缓解玉米赤霉烯酮引发的猪精原干细胞损伤中的效果。具体内容和研究结果如下:在第一部分的研究里,我们发现钙粘素蛋白CDH22是调控小鼠雌性生殖干细胞的重要膜蛋白。有报道证实大鼠CDH22能编码长短两种剪切型式,其中短型剪切体能通过PI3K-AKT,JAK-STAT通路促进精原干细胞的自我更新,但不存在与β-catenin的相互作用。但我们发现在小鼠雌性生殖干细胞中CDH22只编码一种型式的蛋白,且能够通过与JAK2,PI3K以及β-catenin的相互作用,调节其自我更新。同时,我们证实GDNF能够通过GFRα1受体调节雌性生殖干细胞的自我更新,并揭示AKT3是调控雌性生殖干细胞自我更新的信号通路的一个枢纽因子,CDH22和GFRα1都需通过PI3K,SFK调控AKT3表达,从而调控雌性生殖干细胞的自我更新和维持。在第二部分中,我们研究了不同激素在化疗药物白消安诱导的生殖毒性中对精原干细胞的保护作用。通过分析了化疗药物白消安对生殖系统,尤其是对精原千细胞的毒性损伤,我们发现白消安能够诱导精原干细胞内活性氧的大量积累,激活了精原干细胞ATM-P53信号通路,诱导精原干细胞凋亡,自我更新阻滞。通过P53基因敲除老鼠验证了,P53是白消安诱导精原干细胞凋亡的重要分子,P53缺失能够避免白消安引起的凋亡。接着我们比较了促性腺激素FSH和LH,性激素DHT和E2,以及垂体激素褪黑素在白消安存在时对精原干细胞的保护效果,发现褪黑素有最佳的缓解效果。随后我们又优化了褪黑素的给药方式,发现连续注射褪黑素可以高效的缓解白消安对精原干细胞的损伤。最后我们证实了褪黑素能够通过中和精原干细胞内由于白消安产生的活性氧,避免白消安诱导的P53依赖性凋亡,防止生殖力丢失。在最后一部分中,我们初步探索了褪黑素在保护种公畜繁殖力中的作用。玉米赤霉烯酮是一种主要的粮食污染物,不仅具有雌激素毒性,而且能够引起生殖细胞的氧化应激。我们以体外培养的猪精原干细胞作为模型,初步研究了褪黑素在玉米赤霉烯酮毒性存在下,对猪精原干细胞的保护作用,结果发现褪黑素可以有效减缓玉米赤霉烯酮诱导的猪精原干细胞的损伤。综上所述,本研究分别利用模式动物小鼠和大型家畜猪的生殖干细胞作为研究对象,深入的研究了生殖干细胞自我更新的机制,生殖激素对生殖力的保护以及大型家畜的生殖毒理,为揭示生殖干细胞体外维持和微环境相互作用的分子机制提供了理论支持,为临床化疗中对生殖力保护的应用提供了很有价值的参考,并且对临床的治疗和诊断提供了依据,也对畜牧生产中雄性动物的繁殖力维持提供了新的思路。
魏超[7]（2018）在《FOXC2在小鼠精原干细胞中表达和功能的研究》文中认为雄性哺乳动物从青春期到老年持续的精子发生依赖于精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）。精原干细胞是哺乳动物体内唯一能将遗传信息传递给后代的成体干细胞,其能够自我更新并产生大量分化的生殖细胞。为了维持正常的精子发生,精原干细胞的自我更新和分化受到其内源基因表达和外部信号的精确调控,自我更新和分化之间微妙的平衡非常重要。精原干细胞是优秀的成体干细胞模型,研究精原干细胞对男性不育和睾丸生殖细胞肿瘤的治疗具有十分重要的意义。在本研究中,首先利用免疫荧光双染的方法检测了 forkhead box C2（FOXC2）在小鼠睾丸中的表达。结果显示,FOXC2在睾丸中表达并仅限于一部分未分化的精原细胞中。随着睾丸的发育,表达FOXC2的精原细胞在未分化的精原细胞中的比例逐渐下降。曲细精管整体免疫荧光双染的结果显示,FOXC2主要在Asingle（As）和Apaired（Apr）精原细胞中表达,在Aaligned（Aal）精原细胞中表达很少且在Aal-16精原细胞中没有表达。进一步的免疫荧光双染的结果显示,FOXC2与正常精子发生中实际干细胞的标记分子GFRα1表达于同一细胞中。5-溴-2’-脱氧尿苷（BrdU）标记实验的结果表明,大部分表达FOXC2的精原细胞为BrdU阴性。精原干细胞的体外培养为研究其功能提供了一种很好的方法。免疫细胞荧光的结果显示,在体外培养的精原干细胞中,几乎所有细胞都表达未分化的精原细胞的标记分子PLZF,但其中只有一部分表达FOXC2,这个结果与组织切片和曲细精管整体免疫荧光双染的结果都是一致的。抑制Foxc2显着影响了精原干细胞在体外的维持。感染Foxc2 shRNA慢病毒的精原干细胞在培养10天后,与对照组相比,精原干细胞数量和克隆大小均大幅度降低。抑制Foxc2同样大幅度降低了精原干细胞重建精子发生的能力。将感染Foxc2 shRNA慢病毒的精原干细胞和感染对照shRNA慢病毒的精原干细胞分别移植到白消安处理的受体BDF1小鼠的睾丸中,2个月后,感染Foxc2 shRNA慢病毒的精原干细胞在受体睾丸中形成的克隆数量只有对照的10.42%。对移植后的睾丸曲细精管的分析表明,抑制Foxc2后,在移植后的前2周内精原干细胞可以正常的归巢和自我更新,但在第4周时,重建精子发生的能力开始下降,而移植后6周精原干细胞出现了耗竭的现象。抑制Foxc2后,对精原干细胞中自我更新、归巢和分化相关基因的表达进行了检测。RT-qPCR结果显示,目前已知的与精原干细胞自我更新和归巢相关的基因都没有发生明显变化。然而,抑制Foxc2后,抑制精原干细胞分化的基因Nanos2和Id4出现了下调,而促进精原干细胞分化的基因Nanos3,Sox3,Rarg,Stra8和c-Kit出现了上调,表明抑制Foxc2后精原干细胞出现了分化的趋势。外源因子处理和信号通路实验结果表明,FOXC2被胶质细胞源神经营养因子（GDNF）上调,而被视黄酸（RA）下调,GDNF通过PI3K-Akt途径上调Foxc2的表达。综上所述,FOXC2是一个在精原干细胞的存活和命运决定中起关键作用的转录因子。FOXC2主要在As和Apr精原细胞中表达,以保护实际和潜在干细胞之间微妙的平衡。由睾丸支持细胞局部产生的GDNF和RA以相反的方式发挥作用以调节精原细胞中FOXC2的表达和精原干细胞特性。
李阳[8]（2019）在《Shp2蛋白在精母细胞减数分裂中的功能研究》文中研究指明Shp2（人基因名ptpn11）是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,广泛表达于全身各个组织器官,在多种生长因子介导的细胞质信号通路中作为重要的调控蛋白从而参与细胞增殖、分化、细胞免疫应答以及细胞代谢等生理过程。临床研究证明人类生殖细胞的PTPN11基因突变会导致努南综合征（Noonan syndrom）和豹综合征（LEOPARD syndrom）等相关疾病,患有这些疾病的男性患者大多表现为性腺发育迟缓,不育。这些临床研究揭示了 Shp2在男性精子发生中发挥了重要功能。虽然Shp2在支持细胞,出生前原始生殖细胞中的功能有一定的揭示,但是Shp2在生殖细胞发育中特别是减数分裂启动及其过程中的功能尚需进一步研究和探讨。本文中,我们首次系统的描述了 Shp2在生殖细胞中的动态表达模式,发现Shp2广泛表达于各级生殖细胞中。在精原细胞中高表达于细胞质内,而随着减数分裂的准备和启动,Shp2的表达量明显下降并逐渐进入细胞核继而定位于染色体两端,提示着Shp2在减数分裂中功能的复杂性和多样性。随后我们利用Shp2flox/flox stra8-cre的特异性敲除小鼠模型,在出生后生殖细胞中敲除Shp2,发现敲除小鼠第一波减数分裂严重破坏,生殖细胞大量丢失,Shp2缺失严重破坏精子生成。而通过对敲除效率的详细探究证明由于敲除效率随小鼠年龄的逐渐下降最终导致小鼠弱育。我们通过对幼年小鼠睾丸组织荧光染色发现Shp2敲除后小鼠减数分裂启动提前至出生后第9天进而诱导精母细胞凋亡,减数分裂正常波次紊乱并阻滞在偶线期,接着通过组织免疫荧光染色以及原代细胞QRT-PCR定量分析发现Shp2敲除破坏精原细胞增殖/分化平衡调控。Shp2敲除后减数分裂相关基因提早至精原细胞中表达,但是无法达到正常表达峰值。而原代分离精母细胞核扩展染色证明Shp2敲除导致的提前启动的减数分裂虽然可以正常进行DNA-组蛋白的解构,但是同源重组早期核心RAD51/DMC1复合体无法正常形成,导致减数分裂同源重组失败。同时联会复合体的组装也不完全。这些结果证明了 Shp2在调控减数分裂的正确启动以及减数分裂的过程中发挥着重要作用。
王寒凝[9]（2017）在《猪诱导多能干细胞向雄性生殖细胞样细胞诱导分化的研究》文中研究指明生殖细胞的分化与发育是一个复杂而有序的过程。建立体外诱导形成生殖细胞的技术方法,对治疗不孕不育、动物优良品种资源的保存及生殖细胞发育机制的研究有重要意义。小鼠和人多能干细胞定向诱导为雄性生殖细胞的研究较为成熟。然而,由于小鼠寿命短等不足之处,人的生殖细胞相关功能探究无法在小鼠体内长期观察;因受到伦理限制也无法直接进行人的体内实验。因此,需要大动物（如猪）模型为医学提供技术及安全性评价体系。与小鼠相比,猪的寿命较长、生理学和解剖学等与人更接近,无苛刻的伦理限制,这使得猪成为医学研究的理想动物模型。另外,猪也是我国畜牧业中重要的家畜之一。目前,猪多能干细胞的相关研究亟待进一步发展,在猪多能干细胞向生殖细胞诱导方面,尚未有相关的报道。因此,本研究的重点为:建立猪诱导多能干细胞（iPSCs）系,进而建立猪ipSCs向雄性生殖细胞样细胞定向分化的诱导体系和技术方法。首先,本研究建立了猪iPSCs系。其形态类似于小鼠胚胎干细胞的形态,呈致密凸起的克隆;该iPSCs的碱性磷酸酶染色呈阳性,并表达OCT4、SOX2、SSEA-1等多能性标记蛋白;在体外,猪iPSCs可以通过拟胚体随机分化为三胚层类型细胞,并可以定向分化为脂类和神经类细胞;在免疫缺陷小鼠体内,猪iPSCs可以形成畸胎瘤,并分化为三胚层类型组织。这说明本研究中的猪iPSCs具有定向分化为生殖细胞的潜力。其次,根据猪iPSCs的特性,借鉴小鼠和人原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）诱导方法并进行改进和优化,建立猪生殖细胞样细胞诱导分化的体系及方法。第一,在含有Activin A等细胞因子的培养体系中,将猪iPSCs分化为上胚层干细胞样细胞（EpiLCs）,EpiLCs高表达上胚层干细胞标记基因。第二,在含有BMP4等细胞因子的诱导体系中,将EpiLCs定向诱导分化为PGCLCs。PGCLCs高表达原始生殖细胞（PGCs）标记基因Stella等,同时表达PGCs标记蛋白STELLA等;在表观遗传特性方面,PGCLCs中H3K27me3表达上调,H3K9me2表达下调,印记基因DNA甲基化水平呈下降趋势,这与体内PGCs的发育相类似;在转录组水平上,PGCLCs高表达与生殖细胞发育相关的基因。第三,PGCLCs在含有睾酮等试剂的诱导体系中,进一步分化为精原干细胞样细胞（SSCLCs）。SSCLCs表达Stra8、Gsg2等减数分裂标记基因,同时表达DAZL、VASA等精原干细胞标记蛋白;通过流式细胞术检测到SSCLCs中含有单倍体细胞。这些结果表明,本诱导体系可以使猪iPSCs定向诱导分化为雄性生殖细胞样细胞。目前,还没有建立良好的生精细胞损伤不育公猪模型,而生精细胞损伤不育小鼠模型的建立方法及其曲细精管注射技术较成熟,因此选择小鼠作为体内研究的受体。将猪的PGCLCs和SSCLCs移植到小鼠曲细精管中,移植后在不同时间段进行检测,结果显示猪生殖细胞样细胞在曲细精管中形成细胞链和细胞簇。免疫荧光染色结果显示,生殖细胞标记蛋白DAZL、VASA等呈阳性。这说明移植后的细胞具有生殖细胞特性,可能有助于修复生精细胞损伤的睾丸组织。综上所述,本研究得到形态类似于小鼠胚胎干细胞的猪iPSCs系。在此基础上,我们建立了一种将猪iPSCs诱导成雄性生殖细胞样细胞的方法。该研究为进一步探索生殖细胞的发育机制和临床上人多能干细胞向生殖细胞的分化奠定了基础,也为畜牧业育种提供了新的思路。
贾媛媛[10]（2017）在《猕猴睾丸生殖细胞纯化、培养及基因修饰探索》文中认为人类遗传信息的传递与配子发生过程息息相关,而雄性配子发生则承担了其中一半的重担。目前绝大部分科学家都是利用啮齿类动物小鼠作为模式动物来研究男性配子发生过程中的基因调控机制,但是啮齿类动物与人类存在巨大的生殖间隔,其所能提供的研究线索十分有限。与啮齿类动物相比,灵长类动物在生理生化各方面都与人类十分相似,因而具有更重要的研究价值。虽然小鼠各级生精细胞的分离及精原干细胞培养方法的研究,经过这些年的不断优化已经十分成熟,但是由于材料难以获得,缺乏有效分子标志等原因,对于灵长类各级生精细胞的研究及精原干细胞培养的探索难以取得有效进展。我们通过学习小鼠STA-PUT（Sedimentation Velocity）的实验方法,成功地利用不同年龄的猕猴睾丸组织分离出了精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子、长形精子、以及成熟精子,并且对各期生精细胞进行了特异性分子标志的细胞荧光验证,完成了纯度鉴定。同时,我们成功地对猕猴睾丸进行了白消安造模实验,并对猕猴的精原干细胞培养、基因修饰及细胞移植做出探索,以期得到基因修饰后精原干细胞在猕猴体内再生精克隆。我们利用大鼠精原干细胞的培养液及多种生长因子的组合培养精原干细胞至14天后,对于培养出的细胞克隆进行荧光鉴定,并对其进行基因表达分析,发现符合精原干细胞特征,表达多个特异分子标志物,包括Utf1、Zbtb16、Fgfr3、Dazl。我们将STA-PUT的实验方法应用于猕猴睾丸细胞,成功分离出5个不同时期的生精细胞,并且完成精原细胞的体外维持培养。这些初步获得的各期生精细胞探索,为灵长类动物精子发生过程中基因表达变化、生殖细胞基因修饰,以及灵长类动物精原干细胞体外长期增殖提供了线索。
二、Expression and significance of GFRal Gene in the regeneration of spermatogenesis in mice（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression and significance of GFRal Gene in the regeneration of spermatogenesis in mice（论文提纲范文）
（1）蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蒙古马简介及其特点 |
| 1.2 睾丸发育和精子发生过程 |
| 1.2.1 睾丸组织学构造及功能 |
| 1.2.2 精子发生过程 |
| 1.2.3 精子发生的微环境 |
| 1.3 精原干细胞(spermatogonial stem cells SSCs) |
| 1.3.1 精原干细胞简介 |
| 1.3.2 精原干细胞来源 |
| 1.3.3 精原干细胞生物学特点 |
| 1.3.4 精原干细胞的特殊生长环境 |
| 1.3.5 精原干细胞表面分子标记物 |
| 1.3.6 精原干细胞自我更新分化方式 |
| 1.3.7 精原干细胞的培养 |
| 1.3.8 精原干细胞体外培养研究进展 |
| 1.3.9 温度对精原干细胞的影响 |
| 1.4 精原干细胞应用前景 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 实验一 蒙古马睾丸支持细胞(饲养层)的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 支持细胞原代分离培养及纯化 |
| 2.2.2 支持细胞的低渗处理 |
| 2.2.3 支持细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.4 支持细胞饲养层制备 |
| 2.2.5 支持细胞鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 支持细胞生长曲线观察 |
| 2.3.2 HE染色结果 |
| 2.3.3 qRT-PCR结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.2 实验前工作准备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 蒙古马睾丸单细胞悬液制备 |
| 3.3.2 利用差异贴壁法将蒙古马睾丸精原干细胞的纯化 |
| 3.4 将精原干细胞转移到支持细胞饲养层上培养 |
| 3.4.1 支持细胞饲养层复苏 |
| 3.4.2 精原干细胞的培养 |
| 3.4.3 精原干细胞的纯化效率 |
| 3.5 精原干细胞的鉴定 |
| 3.5.1 精原干细胞生长情况检测和形态学观察 |
| 3.5.2 精原干细胞(SSCs)碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定 |
| 3.5.3 精原干细胞SSCs免疫荧光化学染色鉴定 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 支持细胞饲养层形态 |
| 3.6.2 精原干细胞分离纯化效率检测 |
| 3.6.3 在不同饲养层上的形态 |
| 3.6.4 碱性磷酸酶(AKP)染色法鉴定SSCs |
| 3.6.5 精原干细胞免疫荧光染色结果 |
| 3.6.6 qRT-PCR结果 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 4 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（2）减数分裂过程中三维基因组研究与多组学研究技术的开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 染色质高级结构研究方法简介 |
| 1.1.1 基于3C的三维基因组结构研究方法简介 |
| 1.1.2 非3C依赖的三维基因组结构研究方法简介 |
| 1.1.3 单细胞水平的三维基因组结构研究方法 |
| 1.2 染色质高级结构简介 |
| 1.2.1 染色质领域和染色质隔室 |
| 1.2.2 染色质拓扑结构域和染色质环 |
| 1.3 染色质高级结构调控因子简介 |
| 1.3.1 参与染色质高级结构调控的蛋白 |
| 1.3.2 染色质高级结构相关的ncRNA |
| 1.4 染色质高级结构与转录调控简介 |
| 1.4.1 A/B compartments与转录调控简介 |
| 1.4.2 TADs、chromatin loops与转录调控简介 |
| 第二章 嗜热四膜虫三维基因组结构研究 |
| 2.1 绪论 |
| 2.1.1 嗜热四膜虫简介 |
| 2.1.2 嗜热四膜虫减数分裂简介 |
| 2.1.3 嗜热四膜虫大、小核基因组 |
| 2.2 研究成果 |
| 2.2.1 嗜热四膜虫中Hi-C实验体系的建立及小核数据的获取 |
| 2.2.2 嗜热四膜虫新月期小核特异的染色质相互作用 |
| 2.2.3 嗜热四膜虫大核的三维基因组结构 |
| 2.2.4 嗜热四膜虫小核的三维基因组结构 |
| 2.2.5 嗜热四膜虫小核中TAD-like结构与大核染色体形成相关 |
| 2.2.6 嗜热四膜虫三维基因组图谱与基因组组装 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.4 材料与方法 |
| 2.4.1 嗜热四膜虫细胞培养 |
| 2.4.2 嗜热四膜虫细胞饥饿 |
| 2.4.3 嗜热四膜虫细胞诱导接合生殖 |
| 2.4.4 嗜热四膜虫细胞的甲醛交联 |
| 2.4.5 嗜热四膜虫小核分离 |
| 2.4.6 嗜热四膜虫in situ Hi-C实验 |
| 2.4.7 嗜热四膜虫HiChIP实验 |
| 2.4.8 嗜热四膜虫Hi-C和HiChIP数据分析 |
| 第三章 小鼠精子发生过程中三维基因结构的研究 |
| 3.1 背景 |
| 3.1.1 小鼠精子发生过程简介 |
| 3.1.2 哺乳动物精子发生过程染色质高级结构的动态变化 |
| 3.2 研究成果 |
| 3.2.1 小鼠精子发生过程中不同时期细胞的分离 |
| 3.2.2 小鼠精子发生过程中染色质高级结构的动态变化 |
| 3.2.3 小鼠精子发生过程A/B compartments的动态重组 |
| 3.2.4 小鼠精子发生过程A/B compartments转换与基因表达调控 |
| 3.2.5 小鼠精子发生过程中TADs发生重组 |
| 3.2.6 小鼠精子发生过程中pacSC时期TADs的消失不依赖于CTCF/cohesin以及染色质开放性的改变 |
| 3.2.7 成熟精子中重建的chromatin loops与早期胚胎发育相关 |
| 3.2.8 减数分裂与有丝分裂过程染色质高级结构的对比 |
| 3.2.9 小鼠雄性Xi与雌性Xi的染色质高级结构的对比 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 材料与方法 |
| 3.4.1 实验动物 |
| 3.4.2 分离不同时期的精子细胞 |
| 3.4.3 免疫荧光 |
| 3.4.4 In situ Hi-C实验 |
| 3.4.5 ATAC-seq实验 |
| 3.4.6 Native ChIP-seq实验 |
| 3.4.7 数据分析 |
| 第四章 多组学及单细胞研究技术的开发 |
| 4.1 绪论 |
| 4.1.1 启动子-增强子间相互作用捕获技术简介 |
| 4.1.2 单细胞转录组与染色质开放性研究技术简介 |
| 4.2 研究成果 |
| 4.2.1 通过HiATAC捕获全基因范围内染色质开放区域间的相互作用 |
| 4.2.2 通过single-cell AR同时捕获单细胞转录组与染色质开放位点 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.4 材料与方法 |
| 4.4.1 细胞培养及传代 |
| 4.4.2 ATAC-seq实验 |
| 4.4.3 多聚甲醛交联细胞的ATAC-seq实验 |
| 4.4.4 多聚甲醛交联细胞HiATAC实验 |
| 4.4.5 未交联细胞Hi-C实验 |
| 4.4.6 未交联细胞HiATAC实验 |
| 4.4.7 群体细胞AR实验 |
| 4.4.8 单细胞AR实验 |
| 4.4.9 数据分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
（3）影响水牛精原细胞富集及体外增殖相关因素的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一部分 综述 |
| 引言 |
| 1 精原干细胞研究进展 |
| 1.1 精原干细胞的起源 |
| 1.2 精原干细胞自我更新与分化 |
| 1.3 精原干细胞的冷冻保存 |
| 1.4 精原干细胞生态位 |
| 1.5 精原干细胞的移植 |
| 1.6 精原干细胞的分子标记 |
| 1.7 精原干细胞的特性 |
| 1.8 精原干细胞的培养 |
| 1.8.1 小鼠精原干细胞的培养 |
| 1.8.2 大鼠精原干细胞的培养 |
| 1.8.3 家养动物精原干细胞的培养 |
| 2 睾丸支持细胞的功能及应用研究 |
| 2.1 支持细胞的形态学 |
| 2.2 支持细胞分子生物学 |
| 2.3 支持细胞因子控制SSCs维持和自我更新 |
| 2.4 支持细胞作为饲养层细胞 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 1 支持细胞的鉴定和培养 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.1.1 实验材料 |
| 1.1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.1.3 主要实验仪器设备 |
| 1.1.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.2.1 水牛睾丸组织固定及包埋 |
| 1.1.2.2 水牛睾丸组织化学分析 |
| 1.1.2.3 免疫细胞化学分析 |
| 1.1.2.4 水牛睾丸细胞的分离 |
| 1.1.2.5 水牛支持细胞分离培养 |
| 1.1.2.6 丝裂霉素C浓度的优化 |
| 1.1.2.7 Edu染色 |
| 1.1.2.8 实时定量PCR分析 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 HE染色 |
| 1.2.2 水牛sertoli细胞定位分离与纯化 |
| 1.2.3 丝裂霉素C浓度的优化 |
| 1.2.4 不同代sertoli细胞特异基因的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 2 水牛精原干细胞的分离与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.1.3 主要实验设备仪器 |
| 2.1.1.4 主要实验溶液配制 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 Sertoli细胞的培养 |
| 2.1.2.2 Sertoli feeder的制备 |
| 2.1.2.3 精原干细胞SSCs的富集 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 青春期前-成年水牛睾丸组织精原干细胞的定位 |
| 2.2.2 青春期前-成年水牛睾丸组织细胞悬液SSCs相关基因的表达 |
| 2.2.3 水牛SSCs的富集 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 小分子化合物对精原干细胞体外增殖的影响 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.1.3 主要实验设备仪器 |
| 3.1.1.4 主要实验溶液配制 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 精原干细胞传代培养 |
| 3.1.2.2 实时定量PCR分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 褪黑激素(Melatonin)对精原干细胞(SSCs)体外增殖的影响 |
| 3.2.1.1 褪黑激素(Melatonin)对SSCs干性及生殖相关基因的影响 |
| 3.2.1.2 褪黑激素(Melatonin)对SSCs分化相关基因表达检测 |
| 3.2.1.3 褪黑激素(Melatonin)对SSCs氧化与增殖相关基因表达检测 |
| 3.2.1.4 免疫荧光染色鉴定SSCs增殖情况 |
| 3.2.2 CHIR对精原干细胞(SSCs)体外增殖的影响 |
| 3.2.2.1 CHIR对SSCs特异性标记基因表达检测 |
| 3.2.2.2 CHIR对SSCs分化相关基因表达检测 |
| 3.2.2.3 CHIR对SSCs氧化与增殖相关基因表达检测 |
| 3.2.2.4 免疫荧光染色鉴定SSCs增殖情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（4）雄激素受体调控小鼠PLZF+精原细胞命运的生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1.1 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1.1 精子发生 |
| 1.1.2 SSCs的起源 |
| 1.1.3 生殖细胞的形态学特征 |
| 1.1.4 鉴定SSCs的标准-移植试验 |
| 1.1.5 SSCs龛境 |
| 1.1.6 SSCs自我更新和分化相关基因 |
| 1.1.7 影响体外培养的SSCs集落生成的因素 |
| 1.1.7.1 小鼠的品系 |
| 1.1.7.2 饲养层细胞 |
| 1.1.7.3 培养液成分 |
| 1.1.8 曲精细管上皮周期 |
| 1.2 雄激素和雄激素受体 |
| 1.2.1雄激素对间质细胞和支持细胞的发育和功能的影响 |
| 1.2.2 AR的结构 |
| 1.2.3 AR的信号通路 |
| 1.2.4 AR对精子发生的影响 |
| 1.3 AR对PLZF的调控作用 |
| 1.4 本实验的目的与意义 |
| 第二章 支持细胞中的AR促进PLZF~+精原细胞的分化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 实验动物 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 相关溶液配制 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 睾丸总细胞的分离培养 |
| 2.1.2.2 精原细胞的分离培养 |
| 2.1.2.3 支持细胞的分离培养 |
| 2.1.2.4 RNA提取 |
| 2.1.2.5 半定量RT-PCR及定量RT-PCR |
| 2.1.2.6 ChIP-seq及ChIP-qPCR |
| 2.1.2.7 组织固定包埋 |
| 2.1.2.8 免疫组化 |
| 2.1.2.9 细胞的免疫荧光 |
| 2.1.2.10 siRNA及过表达质粒的转染 |
| 2.1.2.11 Western blot |
| 2.1.2.12 DHT、比卡鲁胺的添加 |
| 2.1.2.13 慢病毒载体质粒及其包装系统质粒的扩增 |
| 2.1.2.14 免疫共沉淀 |
| 2.1.2.15 小鼠体重计数分析的数学方法(标准差,t-检验) |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 不同发育阶段小鼠睾丸中AR、PLZF的表达情况 |
| 2.2.2 出生后小鼠睾丸性原细胞中AR的检测 |
| 2.2.3 SPCs-体细胞体外共培养系统的构建 |
| 2.2.4 雄激素信号对SPCs分化的影响 |
| 2.2.5 支持细胞的分离培养及AR下游靶基因的筛选 |
| 2.2.6 WT1直接调控支持细胞中的β1-integrin |
| 2.2.7 支持细胞中敲低β1-integrin对SPCs-支持细胞共培养系统中精原细胞命运的影响 |
| 2.2.8 支持细胞中的β1-integrin与精原细胞中的E-cadherin相互作用 |
| 2.2.9 E-cadherin对SPCs-支持细胞共培养系统中SPCs的命运影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 生殖系特异性AR过表达对小鼠精子发生的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.1.1 试验动物 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.1.4 相关溶液配制 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 鼠尾中DNA的提取 |
| 3.1.2.2 转基因小鼠基因型的鉴定 |
| 3.1.2.3 组织固定包埋 |
| 3.1.2.4 免疫组化 |
| 3.1.2.5 Western Blot |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 生殖系特异性AR过表达小鼠的构建 |
| 3.2.2 转基因小鼠基因型的PCR鉴定 |
| 3.2.3 生殖系中特异性AR过表达小鼠的验证 |
| 3.2.4 60日龄生殖系特异性AR过表达小鼠生殖力的检测 |
| 3.2.5 生殖系特异性AR过表达对60日龄小鼠睾丸精子发生的影响 |
| 3.2.6 生殖系特异性AR过表达小鼠睾丸中PLZF的表达下降 |
| 3.2.7 生殖系特异性AR过表达对小鼠精子发生影响机制的初步探究 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表(或待发表)的学术论文 |
（5）钙粘蛋白CDH1和CDH22对小鼠生殖干细胞自我更新的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文部分缩略词及中英文对照表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 生殖细胞的研究进展 |
| 1.1 雄性生殖细胞 |
| 1.2 雌性生殖干细胞 |
| 2 钙粘蛋白的分类及概述 |
| 2.1 上皮钙粘蛋白的研究进展 |
| 2.2 PB-钙粘蛋白的研究进展 |
| 3 与自我更新有关分子的概述 |
| 3.1 早幼粒细胞白血病锌指蛋白 |
| 3.2 组蛋白去乙酰化酶 |
| 3.3 β-连环蛋白 |
| 4 本实验的研究目的和意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 CDH1对雄性生殖干细胞命运的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 相关溶液配制 |
| 1.5 引物序列 |
| 1.6 siRNA序列 |
| 1.7 组织固定包埋 |
| 1.8 HE染色 |
| 1.9 免疫组织化学实验(IHC) |
| 1.10 精原干细胞分离纯化 |
| 1.11 siRNA转染 |
| 1.12 蛋白样品的制备 |
| 1.13 Western blot检测 |
| 1.14 小鼠睾丸组织的免疫荧光实验 |
| 1.15 细胞的免疫荧光实验 |
| 1.16 免疫共沉淀实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Thy-1~+细胞是SPCs富集群体 |
| 2.2 CDH1、β-catenin和PLZF在小鼠未分化的精原细胞的表达 |
| 2.3 CDH1、β-catenin和PLZF在SPCs上的共表达 |
| 2.4 小鼠SPCs中CDH1与β-catenin的相互作用 |
| 2.5 在SPCs中β-catenin对于HDAC4的直接调控作用 |
| 2.6 小鼠睾丸中HDAC4对PLZF的调节 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小节 |
| 第二章 CDH22对雌性生殖干细胞自我更新的调控机制初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 相关溶液配制 |
| 1.5 组织固定包埋 |
| 1.6 免疫组织化学实验(IHC) |
| 1.7 Western blot检测 |
| 1.8 免疫共沉淀实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CDH22在小鼠卵巢生殖细胞的表达情况 |
| 2.2 CDH22对FGSCs自我更新的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（6）钙粘素CDH22调控雌性生殖干细胞自我更新机制的研究及褪黑素在生殖力维持中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 研究背景 |
| 1.1 生殖干细胞 |
| 1.2 原始生殖细胞 |
| 1.3 雌性生殖干细胞 |
| 1.4 精原干细胞 |
| 1.5 生殖干细胞命运相关的关键分子 |
| 1.6 生殖干细胞的自我更新研究进展 |
| 1.7 化疗药物白消安及其生殖系毒副作用 |
| 1.8 褪黑素 |
| 1.9 凋亡促进因子P53 |
| 1.10 玉米赤霉烯酮 |
| 第一章 CDH22对FGSCs命运的调控机制研究 |
| 引言 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验仪器 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 小鼠卵巢的固定与包埋 |
| 1.2.2 免疫组织化学 |
| 1.2.3 H.E.染色 |
| 1.2.4 细胞免疫荧光 |
| 1.2.5 BrdU荧光标记 |
| 1.2.6 免疫蛋白印迹 |
| 1.2.7 RNA提取 |
| 1.2.8 反转录及RT-PCR |
| 1.2.9 胶回收 |
| 1.2.10 感受态的制备 |
| 1.2.11 连接 |
| 1.2.12 转化 |
| 1.2.13 筛选阳性克隆 |
| 1.2.14 慢病毒的包装 |
| 1.2.15 STO细胞培养 |
| 1.2.16 STO细胞的传代 |
| 1.2.17 STO细胞的换液 |
| 1.2.18 STO细胞的冻存 |
| 1.2.19 STO饲养层的制备 |
| 1.2.20 雌性生殖干细胞的分离和纯化 |
| 1.2.21 雌性生殖干细胞的换液 |
| 1.2.22 雌性生殖干细胞的传代 |
| 1.2.23 雌性生殖干细胞的冻存 |
| 1.2.24 雌性生殖干细胞的解冻 |
| 1.2.25 差异表达分析 |
| 1.2.26 统计分析 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 CDH22在不同时期小鼠卵巢的表达特征分析 |
| 1.3.2 小鼠雌性生殖干细胞的分离培养与鉴定 |
| 1.3.3 小鼠CDH22只编码一种剪切型式的蛋白 |
| 1.3.4 Cdh22 shRNA敲低效果的验证 |
| 1.3.5 CDH22对雌性生殖干细胞自我更新的影响 |
| 1.3.6 CDH22对雌性生殖干细胞凋亡的影响 |
| 1.3.7 在FGSCs中CDH22与JAK-STAT通路的相互作用 |
| 1.3.8 在FGSCs中CDH22与β-catenin通路的相互作用 |
| 1.3.9 CDH22在雌性生殖干细胞微环境中的调控 |
| 1.3.10 雌性生殖干细胞生物信息学分析 |
| 1.3.11 CDH22,AKT3,GFRα1,PI3K在雌性生殖千细胞中的表达及AKT3 |
| 1.3.12 CDH22与PI3K-AKT通路的相互作用 |
| 1.3.13 GDNF与PI3K-AKT通路对小鼠雌性生殖干细胞的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 褪黑素挽救白消安诱导的精原干细胞凋亡及其生物学机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 DNA提取及转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 2.2.2 流式分选 |
| 2.2.3 MEF细胞的分离 |
| 2.2.4 MEF细胞的传代 |
| 2.2.5 MEF细胞的换液 |
| 2.2.6 MEF细胞的冻存 |
| 2.2.7 MEF饲养层的制备 |
| 2.2.8 精原干细胞的分离和纯化 |
| 2.2.9 TUNEL凋亡检测 |
| 2.2.10 细胞内活性氧检测 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 通过体外试验验证不同激素缓解白消安的毒性效果 |
| 2.3.2 检测褪黑素受体在精原干细胞中的表达情况 |
| 2.3.3 新注射方法的设计 |
| 2.3.4 褪黑素对白消安注射的小鼠精原干细胞的体内挽救作用 |
| 2.3.5 褪黑素对白消安处理的小鼠精原干细胞的体外挽救作用 |
| 2.3.6 褪黑素对白消安处理的K562细胞系的影响 |
| 2.3.7 白消安对P53敲除小鼠的精原干细胞的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 褪黑素挽救玉米赤霉烯酮对猪精原干细胞的毒性作用研究 |
| 引言 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 猪精原干细胞分离步骤 |
| 3.2.2 猪睾丸组织的固定与包埋 |
| 3.2.3 免疫组织化学 |
| 3.2.4 H.E.染色 |
| 3.2.5 细胞免疫荧光 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪精原干细胞体外分离培养 |
| 3.3.2 猪精原干细胞鉴定 |
| 3.3.3 玉米赤霉烯酮对猪精原干细胞的影响 |
| 3.3.4 褪黑素对猪精原干细胞在玉米赤霉烯酮处理后的挽救作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表(或待发表)的学术论文 |
（7）FOXC2在小鼠精原干细胞中表达和功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.2 FOXC2的分子生物学特性及生物学作用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要试剂和溶液 |
| 2.4 实验方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 FOXC2在小鼠睾丸中的表达 |
| 3.3 FOXC2在小鼠精原干细胞中的功能 |
| 3.4 FOXC2调控小鼠精原干细胞的相关机理 |
| 3.5 结果分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）Shp2蛋白在精母细胞减数分裂中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 曲细精管结构和主要细胞类型 |
| 1.1 精子发生简介 |
| 1.2 生精波与生精上皮周期 |
| 1.3 精原细胞简介及其增殖与分化调控机理 |
| 1.3.1 精原细胞自我更新与增殖调控的外源性因子与内源性基因 |
| 1.3.2 精原细胞分化与发育调控的外源性因子与内源性基因 |
| 1.3.3 精原细胞增殖与分化平衡调控 |
| 2 有丝分裂向减数分裂的转化,减数分裂启动调控 |
| 2.1 视黄酸RA对有丝分裂向减数分裂的转化,减数分裂启动的调控 |
| 2.2 内源性基因对有丝分裂向减数分裂的转化与减数分裂启动的调控 |
| 3 减数分裂以及相关事件简介 |
| 3.1 联会简介以及联会的分子机制 |
| 3.2 同源重组以及同源重组的分子机制 |
| 4 男性不育发病机制以及治疗方法研究进展 |
| 4.1 由遗传缺陷导致男性不育发病机制研究进展 |
| 4.1.1 Klinefelter综合症 |
| 4.1.2 Y染色体微缺失 |
| 4.1.3 X染色体上基因突变 |
| 4.1.4 常染色体基因的缺失与突变 |
| 4.2 男性不育的治疗 |
| 4.2.1 药物治疗 |
| 4.2.2 手术治疗 |
| 4.2.3 辅助生殖技术 |
| 5 Shp2蛋白 |
| 5.1 Shp2蛋白的结构,活性调控以及表达模式 |
| 5.1.1 Shp2蛋白的结构 |
| 5.1.2 Shp2蛋白的活性调控机制 |
| 5.1.3 Shp2的表达模式 |
| 5.2 Shp2的分子角色以及调控的细胞信号通路 |
| 5.2.1 Shp2对Ras/MAPK信号通路的调控 |
| 5.2.2 Shp2对PI3K-AKT信号通路的调控 |
| 5.2.3 Shp2对其他细胞质信号通路的调控 |
| 5.2.4 Shp2在细胞核与线粒体中的调控 |
| 5.3 Shp2突变以及导致的疾病 |
| 5.3.1 体细胞Shp2突变以及相关疾病 |
| 5.3.2 生殖细胞中Shp2突变以及相关疾病 |
| 5.4 Shp2的在不同组织器官发育中的多样性生理功能 |
| 5.4.1 Shp2在心脏发育中的功能 |
| 5.4.2 Shp2在T细胞发育中的功能 |
| 5.4.3 Shp2在脑及神经系统发育中的功能 |
| 5.4.4 Shp2在胰腺、肝和乳腺发育中的功能 |
| 5.5 Shp2在雄性生殖系统中功能研究最新进展 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 小鼠DNA提取 |
| 2.3 基因型鉴定 |
| 2.4 组织固定,石蜡包埋以及HE染色 |
| 2.5 石蜡切片的免疫组化 |
| 2.6 石蜡切片的免疫荧光 |
| 2.7 原代生殖细胞的粗分离一二步酶法 |
| 2.8 原代生殖细胞的精分离—牛血清白蛋白梯度沉淀法(简称STA-PUT法) |
| 2.9 精母细胞核扩展法免疫荧光染色 |
| 2.10 睾丸组织石蜡切片免疫荧光 |
| 2.11 RNA相关实验 |
| 2.12 RNA测序 |
| 2.13 数据统计以及后续分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 Shp2在早期生殖细胞中呈现动态表达模式 |
| 1.1 有效分离小鼠精原细胞与减Ⅰ期各类型精母细胞 |
| 1.2 Shp2在早期生殖细胞中呈现动态表达模式 |
| 2 Shp2在出生后的生殖细胞中敲除导致小鼠精子发生受损以及弱育 |
| 2.1 Shp2特异性敲除小鼠生殖能力减弱,睾丸减小 |
| 2.2 有效的Shp2敲除导致精子发生受损 |
| 2.3 Shp2特异敲除小鼠曲细精管中生殖细胞损失 |
| 2.4 Shp2在第一次减数分裂后的高“非有效性敲除”现象是导致弱育的主要原因 |
| 3 Shp2敲除导致减数分裂提前启动并引发凋亡 |
| 3.1 Shp2敲除导致生殖细胞凋亡 |
| 3.2 Shp2敲除特异性诱导减数分裂精母细胞凋亡 |
| 3.3 ShP2敲除导致减数分裂提前启动，正常生精波紊乱 |
| 4 Shp2敲除导致减数分裂阻滞在偶线期 |
| 5 Shp2敲除导致精原细胞增殖能力下调而分化能力紊乱 |
| 5.1 Shp2敲除导致精原细胞增殖相关蛋白PLZF下调而分化相关蛋白C-KIT上调 |
| 5.2 Shp2敲除导致精原细胞自我维持相关基因下调而分化相关基因紊乱表达 |
| 6 Shp2敲除导致精母细胞减数分裂相关基因提前至精原细胞表达,却不能到达正常峰值 |
| 7 Shp2敲除导致减数分裂同源重组中DMC1/RAD51复合物无法组装,联会异常 |
| 第四章 讨论 |
| 1 Shp2在生殖细胞发育中定位,表达以及功能的多样性 |
| 2 Shp2在器官早期发育与多能干细胞增殖与分化调控中的作用探讨 |
| 3 Shp2是一个重要的阀门基因调控减数分裂的正确启动 |
| 4 Shp2在减数分裂中的功能探讨 |
| 5 减数分裂缺陷诱发生殖细胞凋亡机理 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
（9）猪诱导多能干细胞向雄性生殖细胞样细胞诱导分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 多能干细胞的研究进展 |
| 1.1.1 胚胎干细胞 |
| 1.1.2 诱导多能干细胞 |
| 1.1.3 小鼠和人iPSCs的研究进展 |
| 1.1.4 其他物种iPSCs的研究进展 |
| 1.1.5 iPSCs的应用前景 |
| 1.2 哺乳动物生殖细胞的发生及其发育概况 |
| 1.2.1 PGCs的形成及其迁移 |
| 1.2.2 卵原细胞与精原细胞的形成 |
| 1.2.3 减数分裂及配子生成 |
| 1.3 多能干细胞定向分化为生殖细胞的研究进展 |
| 1.3.1 小鼠多能干细胞向生殖细胞的诱导分化 |
| 1.3.2 人多能干细胞向生殖细胞的诱导分化 |
| 1.3.3 猪多能干细胞向生殖细胞的诱导分化 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验分析工具 |
| 2.5 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 猪iPSCs的产生及其多能性的验证 |
| 3.1.1 猪iPSCs的建立 |
| 3.1.2 猪iPSCs表达ESCs标记蛋白 |
| 3.1.3 猪iPSCs具有体外三胚层分化能力 |
| 3.1.4 猪iPSCs定向分化为脂类及神经类细胞 |
| 3.1.5 猪iPSCs具有体内分化能力 |
| 3.2 猪iPSCs向PGCLCs的体外诱导分化 |
| 3.2.1 EpiLCs的形成及其检测 |
| 3.2.2 PGCLCs的形成 |
| 3.2.3 PGCLCs的分子生物学水平检测 |
| 3.2.4 PGCLCs的表观遗传学检测 |
| 3.2.5 PGCLCs的转录组水平分析 |
| 3.3 猪iPSCs向SSCLCs的体外诱导分化 |
| 3.3.1 SSCLCs的形成 |
| 3.3.2 SSCLCs的分子生物学水平检测 |
| 3.3.3 SSCLCs的表观遗传学检测 |
| 3.3.4 SSCLCs中单倍体细胞检测 |
| 3.4 猪生殖细胞样细胞的体内分化实验及其检测 |
| 3.4.1 PGCLCs的体内分化实验及其检测 |
| 3.4.2 SSCLCs的体内分化实验及其检测 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）猕猴睾丸生殖细胞纯化、培养及基因修饰探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验步骤和方法 |
| 三.主要的仪器设备 |
| 结果与分析 |
| 一.猕猴睾丸组织学分析与抗体检测 |
| 二.STA-PUT分离后各级生精细胞纯度鉴定 |
| 三.细胞移植受体与移植技术平台构建 |
| 四.建立灵长类猕猴精原细胞初步培养体系 |
| 五.猕猴睾丸生殖细胞基因修饰探索 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 一.不同物种(小鼠、猴、人)精原细胞亚型分类及动力学研究 |
| 二.不同物种(小鼠、猴、人)精原细胞分子标志 |
| 三.不同物种(小鼠、猴、人)各级生精细胞的分离方法 |
| 四.不同物种(小鼠、猴、人)精原干细胞培养进展 |
| 五.总结与展望 |
| 六.参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、Expression and significance of GFRal Gene in the regeneration of spermatogenesis in mice（论文参考文献）
- [1]蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定[D]. 宋连杰. 内蒙古农业大学, 2020(05)
- [2]减数分裂过程中三维基因组研究与多组学研究技术的开发[D]. 罗正誉. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [3]影响水牛精原细胞富集及体外增殖相关因素的初步研究[D]. 赵鹏伟. 广西大学, 2019(01)
- [4]雄激素受体调控小鼠PLZF+精原细胞命运的生物学机制研究[D]. 汪晶晶. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]钙粘蛋白CDH1和CDH22对小鼠生殖干细胞自我更新的调控机制研究[D]. 杨阳. 南京农业大学, 2018(08)
- [6]钙粘素CDH22调控雌性生殖干细胞自我更新机制的研究及褪黑素在生殖力维持中的应用[D]. 张小宇. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]FOXC2在小鼠精原干细胞中表达和功能的研究[D]. 魏超. 中国农业大学, 2018(12)
- [8]Shp2蛋白在精母细胞减数分裂中的功能研究[D]. 李阳. 厦门大学, 2019(08)
- [9]猪诱导多能干细胞向雄性生殖细胞样细胞诱导分化的研究[D]. 王寒凝. 中国农业大学, 2017(07)
- [10]猕猴睾丸生殖细胞纯化、培养及基因修饰探索[D]. 贾媛媛. 南京医科大学, 2017(05)