一、MALDI-TOF-MS法对重组人内皮抑素蛋白分子质量测定（论文文献综述）
谢双华[1]（2020）在《中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌（贲门癌）危险因素及预测预警标志物的多中心前瞻性研究》文中研究表明研究目的在中国上消化道癌高发区多中心前瞻性人群筛查队列中,探索并验证贲门癌（gastric cardia adenocarcinoma,GCA）危险因素及血浆预测预警蛋白标志物,构建高发区人群贲门癌风险预测模型,为我国贲门癌的综合防控提供科学依据。材料和方法1.中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌（贲门癌）危险因素及预测预警标志物的横断面探索研究:包括4部分内容:一是采用以人群为基础的多中心横断面研究设计。基于2005-2009年在我国上消化道癌高发区（河南林州、河北磁县和山东肥城）的人群筛查项目,应用非条件logistic回归模型分析各暴露因素与贲门癌及癌前病变的关系。二是制定烫热饮食热暴露情况的精准调查方案,在不同热暴露特征的两组样本人群中（20名欧洲和52名中国高发区有烫热饮食习惯者）进行调查,验证可行性。评价第一口温度、平均温度、摄入量加权平均温度和食管内温度（intra-esophagealtemperature,IET）等指标对两组样本人群热暴露特征的量化能力。三是基于2015-2017年河南林州的人群筛查队列（随机对照试验）,随机抽取筛查组20%的人群进行13C-尿素呼气试验（13C-urea breath test,13C-UBT）,检测H.pylori现症感染情况。结合H.pylori现症感染、贲门粘膜病理诊断及流行病学调查数据,采用非条件logistic回归模型分析H.pylori现症感染与贲门各级粘膜病变的关系。四是依托河南林州上消化道癌筛查与早诊早治项目,选取年龄（±3岁）、性别1:1个体匹配的10对贲门癌、高级别上皮内瘤变（high-grade intraepithelial neoplasia,HIN）、低级别上皮内瘤变（low-grade intraepithelial neoplasia,LIN）和贲门正常者,采集其血浆标本。采用数据非依赖采集（data-independent acquisition,DIA）质谱蛋白组学定量技术对前述4组血浆进行全谱分析,建立贲门癌及癌前病变血浆差异蛋白表达谱,筛选贲门癌及癌前病变潜在血浆蛋白标志物。筛选标准为DIA检测蛋白表达量在贲门正常血浆中均处于较低水平,而在贲门癌或癌前病变血浆中处于较高水平（>5倍）。2.中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌（贲门癌）危险因素的多中心前瞻性队列研究及预测预警模型构建:该研究在本文第一部分基础上,建立多中心贲门癌人群筛查亚队列。利用当地覆盖全人群的肿瘤登记系统进行长期肿瘤监测随访。采用Cox 比例风险模型分析队列基线危险因素及贲门粘膜病变与贲门癌发病风险的关系。基于宏观危险因素和贲门粘膜病理诊断信息,采用Logistic回归模型构建贲门癌风险预测预警模型。采用Harrell’s一致性统计量（concordance statistics,C-statistic）评价模型的区分度,采用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验评价模型的校准度。研究结果1.3个高发区共计完成人群筛查21592人,检出贲门正常粘膜（normal cardia mucosa,Normal）/非萎缩性贲门炎（non-atrophic carditis,NAC）18356 例、萎缩性贲门炎（atrophic carditis,AC）/肠上皮化生（intestinal metaplasia,IM）1094 例、LIN 1117例、HIN150例、贲门癌118例。男性、年龄较高（≥50岁）、吸烟、无饮茶习惯、蔬菜水果摄入较少（<1次/周）、葱蒜、腌晒食品、油炸食品和烫热食品摄入较多（≥1次/周）、有肿瘤家族史和高体质指数（bodymassindex,BMI）（≥25.0kg/m2）与贲门癌及癌前病变发生呈正相关（OR值均>1.0,P值均<0.05）。2.与IARC组调查对象相比,中国高发区组摄入烫热饮食时的热暴露明显较高,其摄入第一 口的时间更早（平均早5.6minutes）、温度更高（平均高9.5℃）、摄入量更多（平均多17g）、IET也更高（平均高18.6℃）。第一口温度对两组样本人群的区分效果较差,第一口 IET对两组样本人群的区分效果较好。3.调查人群H.pylori现症感染率为 41.34%（828/2003）。Normal/NAC、AC/IM、LIN和 HIN/GCA的H.pylori现症感染率分别为:39.29%、62.16%、55.91%和 52.17%。H.pylori感染与 AC/IM、LIN 和HIN/GCA 关联的 OR 值分别为:2.78（95%CI:1.70-4.53）、2.14（95%CI:1.47-3.10）和 2.29（95%CI:0.98-5.33）。4.共鉴定蛋白质1212个。与贲门正常组相比,LIN、HIN和GCA组分别获得差异表达蛋白149、170和89种。生物信息学分析显示各病变组差异表达蛋白质生物过程主要集中于细胞信号传导、上皮细胞增殖、发育、分化、凋亡、迁移和黏附,以及血管生成和免疫调节等。信号通路主要集中于焦点黏连、肌动蛋白骨架调节、细胞黏附分子、血小板激活、PI3K-Akt信号通路、H pylori感染的上皮细胞信号转导和胃酸分泌等。本研究优先筛选出RNH1、TERA、ATAD2、ROBO4、RAC1、ICAM1、GBP4和REG3A等8个贲门癌或癌前病变潜在分子标志物。5.截止2017年12月31日,21474例队列人群总计随访207179人年,平均随访9.7年,共收集贲门癌新发病例202例（男性125例,女性77例）。男性（HR=1.92,95%CI:1.36-2.70）、年龄较高（50-59 岁:HR=2.59,95%CI:1.75-3.85;60-69 岁:HR=4.50,95%CI:2.91-6.96）、无饮茶习惯（HR=1.80,95%CI:1.19-2.74）、肉蛋奶类摄入较少（<1 次/周）（HR=1.31,95%CI:0.98-1.76）、葱蒜（HR=1.67,95%CI:1.08-2.58）和烫热食物（HR=1.37,95%CI:1.03-1.81）摄入较多（≥1次/周）、有肿瘤家族史（家族中≥2 人曾患肿瘤:HR=2.05,95%CI:0.83-5.06）和高 BMI（25.0～29.9kg/m2:HR=1.28,95%CI:0.95-1.72）增加贲门癌发病风险。6.贲门正常粘膜/非萎缩性贲门炎（Normal/NAC）人群的贲门癌发病率为44.30/10万,萎缩性贲门炎/肠上皮化生（AC/IM）、低级别上皮内瘤变（LIN）和高级别上皮内瘤变（HIN）人群的贲门癌发病率分别为:227.07/10万、380.95/10万和4366.35/10万。AC/IM、LIN和HIN的贲门癌变风险较Normal/NAC分别增加:3.45倍（HR=4.45,95%CI:2.74-7.23）、5.67 倍（HR=6.67,95%CI:4.48-9.94）和 60.65 倍（HR=61.65,95%CI:40.19-94.55）。7.基于宏观危险因素建立的贲门癌风险预测模型的C-statistic为0.717（95%CI:0.679-0.754）,模型的拟合优度较好（χ2=6.20,P=0.625）。联合宏观危险因素和贲门粘膜病理诊断建立的贲门癌风险预警模型的C-statistic为0.834（95%CI:0.810-0.871）,模型的拟合优度较好（χ2=6.83,P=0.555）。结论1.男性、年龄较高（≥50岁）、无饮茶习惯、肉蛋奶类摄入较少（<1次/周）、葱蒜、烫热食物摄入较多（≥1次/周）、有肿瘤家族史、高BMI（≥25.0kg/m2）以及H.pylori感染可能是高发区居民贲门癌的危险因素。本研究发现仅使用既往流行病学研究常用的第一口温度指标不能准确评价摄入烫热饮食时的真实热暴露。未来流行病学研究应注意同时测量摄入温度和摄入量暴露信息。本研究制定的精准测量方案具有可行性,可供使用。2.RNH1、TERA、ATAD2、ROBO4、RAC1、ICAM1、GBP4 和 REG3A 等 8个蛋白可能为贲门癌或癌前病变早期诊断分子标志物,但尚需进一步验证。3.萎缩性贲门炎/肠上皮化生、低级别和高级别上皮内瘤变的长期贲门癌癌变风险逐级升高,是贲门癌的癌前病变。4.基于前瞻性验证的宏观危险因素和贲门粘膜病理诊断指标,初步构建的贲门癌风险预测预警模型具有良好的预测能力,在高发区人群筛查初筛和分流中具有潜在应用价值。
周小满[2]（2020）在《唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究》文中指出唾液酸是一种以九个碳原子作为骨架的酸性糖,常以单体或多聚形式存在于糖链末端。细胞以葡萄糖为底物,经过一系列酶催化过程合成唾液酸,最终由唾液酸转移酶将唾液酸添加至糖链中。已证实唾液酸在肿瘤的发生发展过程中具有重要的生物学功能,例如帮助肿瘤细胞躲避免疫系统监控,促进肿瘤相关血管生成,促进肿瘤细胞增殖和迁移,增加肿瘤细胞对化学治疗和放射线治疗的抵抗。唾液酸修饰受唾液酸转移酶和唾液酸酶共同调控。唾液酸转移酶在肿瘤组织中常高表达,且有助于癌细胞累积唾液酸修饰,但唾液酸酶在肿瘤中的作用仍存在争议。膀胱癌是起源于膀胱的恶性肿瘤,也是泌尿系统中最常见的肿瘤,男性发病率较高。膀胱癌因进展迅速且治疗方法有限,严重威胁着患者生存质量。本文以膀胱癌为主要的研究模型,结合基于质谱的糖组学和蛋白组学技术,研究了唾液酸修饰和膀胱癌发生发展的关联及分子机理,并探索了小细胞外囊泡唾液酸修饰在囊泡内吞过程中的作用,此外还针对唾液酸修饰,改进了基于质谱检测唾液酸不同键型的样品制备方法。主要结论如下:（1）改进基于滤膜的唾液酸质谱样品制备方法,使用二甲胺/氨水衍生化方法区分α2,3和α2,6连接唾液酸。该方法基于α2,3唾液酸与临近半乳糖形成内酯的特性,在EDC和HOBt的催化下,使用二甲胺和氨水对α2,3和α2,6唾液酸进行不同衍生化,借助质谱区分二者。以唾液酸化乳糖（α2,3唾液酸修饰乳糖和α2,6唾液酸修饰乳糖）及糖蛋白（胎球蛋白和重组人乳铁蛋白）为模型,验证了该样品制备及衍生化方法可以有效鉴定两种方式连接的唾液酸修饰。继而利用该方法分析了肿瘤细胞在常氧和低氧状态下的N-糖修饰变化。该方法在鉴定N-糖链结构的同时能表征唾液酸α2,3和α2,6连接类型,扩展了质谱所获得的糖组信息。（2）膀胱癌唾液酸修饰的异常增加与唾液酸酶NEU1低表达有关。经高通量N-糖组学分析发现恶性膀胱癌细胞含有较多唾液酸修饰。检测唾液酸酶活性,发现膀胱癌唾液酸修饰增加与总唾液酸酶活性低有关。经高通量蛋白质谱检测,发现膀胱癌细胞表达的唾液酸酶主要为NEU1,且恶性膀胱癌细胞NEU1表达量较低。使用凝集素和NEU1抗体荧光染色、激光共聚焦等实验检测,发现膀胱癌细胞NEU1表达量与唾液酸修饰呈负相关趋势。分析临床样本发现膀胱癌患者癌组织中NEU1的表达水平显着低于癌旁组织,且NEU1表达量与唾液酸修饰负相关,NEU1的低表达预示着患者有更短的生存期。（3）唾液酸酶NEU1催化降低纤维连接蛋白（FN）的唾液酸修饰,抑制由整合素α5β1介导的Akt磷酸化和细胞增殖。通过慢病毒感染的方式构建了高表达NEU1的膀胱癌细胞株YTS-1/NEU1。经检测YTS-1/NEU1细胞唾液酸修饰显着减少,且细胞增殖减缓、凋亡增加,细胞周期G0/G1期占比增加。经蛋白相互作用实验和免疫共沉淀等实验证实,部分NEU1定位于细胞膜并导致FN的去唾液酸化,而FN唾液酸修饰影响其与整合素α5β1的亲和力。因此FN去唾液酸修饰致使由整合素介导的与细胞黏附相关的信号通路减弱,促进细胞内吞并降解整合素α5β1和FN,导致细胞增殖减缓,凋亡增加。利用裸鼠皮下成瘤实验证明在体内条件下NEU1可以减少唾液酸修饰,降低FN、整合素α5β1表达并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。（4）小细胞外囊泡（sEV）的唾液酸修饰影响其被受体细胞摄入,可为膀胱癌临床诊断提供参考。通过凝集素印迹实验和ELISA等实验发现膀胱癌细胞分泌的sEV含有丰富的唾液酸修饰。膀胱癌细胞sEV能被正常膀胱细胞摄入,且激活其Akt信号通路,促进细胞增殖。对sEV的去唾液酸处理明显降低了其进入受体细胞的速率,且弱化了sEV对细胞的Akt通路的激活。通过检测48例膀胱癌患者和30例健康志愿者血浆和血浆sEV的唾液酸修饰水平,发现膀胱癌患者血浆和血浆sEV唾液酸修饰均显着高于健康志愿者。且以sEV唾液酸修饰水平作为膀胱癌检测指标,有较高准确性,可为临床诊断膀胱癌提供参考。
陆旭丽[3]（2019）在《聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基对其致敏性的影响》文中提出β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）是牛奶中易引起过敏反应的主要成分之一,采用共价修饰降低其致敏性是国际乳制品加工的研究热点。本课题利用酶催化聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）定点修饰技术对β-LG进行修饰以降低其致敏性。在谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase,TGase）的催化下,用5 kDa单甲氧基聚乙二醇胺（mPEG-NH2）对β-LG的谷氨酰胺残基（Gln）进行了修饰,制备得到了PEG单修饰产物,然后对修饰产物的结构、修饰位点和致敏性进行了分析,探究了酶催化PEG定点修饰β-LG的修饰位点、结构变化与致敏性之间的关系,并对其致敏性变化机理进行了初步探讨。首先,对β-乳球蛋白谷氨酰胺残基进行了PEG定点修饰并对修饰条件进行了优化。以β-LG的PEG修饰产物的修饰率为指标,通过SDS-PAGE结合凝胶过滤色谱分析对修饰条件进行了优化。结果表明,β-LG与PEG摩尔比、酶与底物质量比、反应温度、pH、乙醇添加量对修饰反应均有较大影响。其最佳修饰条件为:反应pH 7.0、反应温度25℃、β-LG与PEG摩尔比1:15、TGase与β-LG质量比3:1、缓冲液中乙醇添加量25%。在该修饰条件下其PEG修饰产物的修饰率可达到60.17%,且只有一种PEG修饰产物生成。采用阳离子交换色谱对β-LG的PEG修饰产物进行了分离纯化并对得到的修饰产物进行了鉴定。SDS-PAGE分析结果显示,纯化得到的PEG修饰产物仅有一个单一条带,其表观分子量在28 kDa左右;MALDI-TOF-MS测定结果表明,β-LG及其PEG修饰产物的实际分子量分别约为18.3 kDa和23.4 kDa,说明得到的修饰产物为只有一个PEG分子连接的PEG单修饰产物;RP-HPLC分析结果表明,得到的PEG修饰产物均一,无其它位置异构体存在。通过圆二色谱、内源荧光光谱、表面疏水性和自由巯基含量测定、修饰位点分析以及致敏性测定,研究了酶催化PEG定点修饰β-LG的修饰位点、结构变化与致敏性之间的关系。结构分析表明,经PEG修饰后,β-LG的二级结构未发生明显改变;其PEG修饰产物的内源荧光强度降低,表面疏水性增加,自由巯基含量无明显变化,说明经PEG修饰后β-LG的三、四级结构有轻微改变。PEG修饰位点分析显示,其修饰位点可能位于Gln155或Gln159。致敏性测定结果表明,PEG修饰可以使β-LG的致敏性显着降低69%。结合PEG修饰前后β-LG的结构和致敏性分析结果,推测TGase催化PEG定点修饰使β-LG的致敏性降低的机制主要是由于PEG链的空间屏蔽效应,连接在β-LG谷氨酰胺残基上的分子量较大的PEG长链覆盖在蛋白表面,掩盖了β-LG表面的部分线性抗原表位和构象表位,阻碍了它们与特异性抗体的结合,从而使致敏性降低。
刘姗姗[4]（2019）在《泰山灰树花的驯化栽培及其抗细菌性咽炎活性物质的研究》文中认为咽炎是耳鼻喉科常见的一种疾病,咽炎引起的病理改变严重时会影响机体的其它机能,对人们的身体健康造成威胁。当前对于咽炎的治疗多采用抗生素等药物,很容易产生耐药性,而且一些药物还会产生负面作用。泰山灰树花（Grifola frondosa）是在泰山特殊地理环境和气候条件下形成的一种珍稀食药用真菌,民间多用于治疗咽炎、扁桃体炎等疾病。如果以泰山灰树花作为原料,从中分离鉴定出既可以治疗咽炎又无毒副作用的物质,这将对人类的身体健康产生深远的影响,具有重要的科学研究价值。本研究以泰山灰树花为试验材料,探讨了其母种、液体菌种和栽培出菇的最佳条件;然后以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC6538）为指示菌,以泰山灰树花子实体为试验材料,利用一系列纯化方法,对泰山灰树花中治疗咽炎的活性物质进行分离鉴定;最后,利用大鼠细菌性咽炎模型对活性物质进行了验证,并研究了泰山灰树花治疗咽炎的初步机理。通过以上试验,取得以下结果:1.泰山灰树花母种的最适碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母膏,培养基内添加栗树木屑浸出液有利于菌丝的生长,菌丝生长的最适酸碱度为pH 6.0,最适温度为24℃;液体菌种的最佳培养条件为:转速120 r/min,接种量20 mL,温度24℃;栽培种的最佳培养基配方为:栗树木屑45%,棉籽壳33%,麦麸20%,石膏1%,白糖1%;栽培种最适发菌温度为24-28℃;出菇时需要进行覆土处理;出菇的适宜温度为20-24℃,相对湿度为90%。2.泰山灰树花发酵液和菌丝球对金黄色葡萄球菌没有抑菌活性,子实体对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性,但泰山灰树花子实体内多糖对金黄色葡萄球菌无抑菌活性。利用水抽提、硫酸铵沉淀、pH 3.5类等电点沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对泰山灰树花中的活性物质进行分离纯化,并用SDS-PAGE检测活性物质的纯度及分子量,最终确定泰山灰树花中治疗咽炎的活性物质是分子量为71 KDa等分子量双亚基蛋白质,命名为GFP。3.通过肽段测序,获得GFP中的五个肽段序列,分别为:NHNADTSNSQEFYR（GFP1）、QYAEIVGTPAEVPYWSFGFHQCR（GFP2）、KHHQTYVNALNAAEQA YAK（GFP3）、HHQTYVNALNAAEQAYAK（GFP4）、EFNATTASIQGSGWGWL GLNPTTK（GFP5）,前两个序列与α/β葡萄糖苷酶序列相似,后三个序列与MnSOD中的保守序列相似;通过测定GFP的N端序列,得到其N-末端部分氨基酸序列为:AVRPLAAGVY（丙氨酸-缬氨酸-精氨酸-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸）。通过对GFP理化性质的测定,得到GFP最适温度为40℃;在pH 2-11的伯瑞坦-罗比森缓冲液中相对活性保持在为80%以上,对pH有较宽的稳定性;10 mM Ca2+、Ba2+、K+、Mg2+对GFP抑菌活性具有一定的激活作用,尤以K+最为显着,相对活性高达139%;10 mM Na+、Fe3+、Zn2+、Al3+和Cu2+对GFP的活性具有抑制作用,其中Al3+和Cu2+的抑制作用达100%;进一步试验证明,0.625 mM Al3+和Cu2+对GFP无影响,当浓度高于0.625 mM时,能够抑制GFP的活性。GFP对有机溶剂甲醇、乙醇和异丙醇敏感,对氯仿不敏感;通过硫酸-苯酚法测得该GFP的含糖量为3.15%。4.通过金黄色葡萄球菌感染大鼠口腔粘膜成功建立了大鼠咽炎模型。经验证,GFP对大鼠细菌性咽炎有较好的治疗效果,且呈现剂量依赖关系。通过对大鼠表观观察、咽部组织病理形态学观察、炎症因子的测定等数据进行分析,初步得出泰山灰树花治疗大鼠细菌性咽炎的机理为:泰山灰树花活性蛋白GFP能抑制金黄色葡萄球菌的生长,改善咽炎大鼠的精神状态及毛色光泽度,降低咽部粘液分泌量,使咽部粘膜变薄且有光泽,减轻口腔粘膜的肿胀充血;明显降低大鼠口腔粘膜组织的病理形态学的变异,缓解粘膜角质化趋势,减轻钉突现象,维持粘液腺的完整性;抑制血管内皮细胞的渗透,有效对抗炎细胞的浸润和蔓延,减少体内促炎性细胞因子的生成,从而减轻炎症症状。通过以上试验,我们首先确定了泰山灰树花母种及栽培种的最优培养条件,且在实验室条件下成功进行了人工栽培。通过一系列方法明确泰山灰树花中抗细菌性咽炎的物质为蛋白质,揭示了泰山灰树花治疗咽炎的分子机理,具有重要的科学意义。
赵丹[5]（2017）在《SOD1的化学修饰及细胞递送研究》文中研究表明铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）催化O2·-歧化为H2O2与O2,对保持胞内活性氧（ROS）的内稳态起到非常关键的作用,是体内重要的抗氧化物酶之一,主要分布于胞浆、线粒体膜缝隙处和细胞核内。SOD1也是调控细胞内氧化还原信号转导的关键蛋白质之一,参与调节多种细胞过程。作为一种蛋白质药物,SOD1具有抗氧化、抗炎、抗癌、防衰老等作用,但是作为一种大分子蛋白质药物,SOD1本身并不具备穿透细胞膜的能力,静脉注入的SOD1多附着在细胞膜外侧,无法进入细胞实现它的功能。使用化学方法对蛋白质直接进行共轭修饰是一种常见的改善蛋白质递送的方法,从广义上说,凡通过活性基团的引入或除去,而使蛋白质一级结构发生改变的过程,统称为蛋白质的化学修饰,化学修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。化学修饰SOD1能显着提高其稳定性、改善其药学性质、增强酶的功能、帮助蛋白质进行细胞递送等。本论文从SOD1的化学修饰出发,主要进行了以下几个方面的工作:1,使用三种荧光分子修饰SOD1,获得非特异性修饰产物SOD1-FITC、SOD1-RhB和N末端特异性修饰产物SOD1-pRhB,其后从光谱性质、结构分析、活力变化以及抗酶水解能力等方面综合比较了几种荧光SOD1的性能。N末端特异性修饰方法反应条件温和,产物单一,不影响SOD1的结构,SOD1-pRhB在荧光性能、酶活等方面具有明显优势。2,通过荧光成像与流式细胞术等实验手段证明SOD1-pRhB能够在无任何外加载体的条件下快速进入多种哺乳动物细胞,实现蛋白质的无载体细胞递送,这一蛋白质修饰策略可以广泛应用于其他种类蛋白质药物修饰中。3,根据SOD1-pRhB中SOD1与修饰基团罗丹明B衍生物（pRhB）的结构特点,对SOD1-pRhB的细胞跨膜机理进行了讨论。确定其跨膜方式属于能量依赖型与非膜破坏性的主动运输方式;分析了修饰基团和SOD1-pRhB跨膜能力之间的关系,确定阳离子修饰基团pRhB是SOD1-pRhB跨膜的决定性因素,结合各类跨膜途径抑制剂对SOD1-pRhB细胞内化的影响、SOD1-pRhB在细胞内的分布与内吞外排动态过程,进一步确定了SOD1-pRhB的细胞递送与阳离子荧光小分子罗丹明B衍生物之间的关联性,表明SOD1-pRhB的这种跨膜行为可能是一种通过阳离子小分子介导的由细胞膜上有机阳离子转运体完成的跨膜途径。4,开展了乙二胺修饰SOD1的研究,对SOD1进行了表面氨基化的修饰（使用乙二胺二盐酸盐对蛋白质表面天冬氨酸与谷氨酸进行修饰）,获得了SOD1-（NH2）n非特异性修饰产物。SOD1-（NH2）n具有超正电荷蛋白质的特性,表面具有更高正电荷,可以与带负电荷的生物大分子如DNA有强结合作用,这对SOD1作为一种基因转染体系的研究有一定启发作用。5,综合使用非特异性氨基化修饰与N末端定点特异性荧光修饰两种分子修饰手段,获得偶联位点较为明确的双功能SOD1修饰产物（NH2）n-SOD1-pRhB,表现出与SOD1-pRhB相同的细胞跨膜能力,同时具有对DNA较高的结合能力,对探讨SOD1作为一种基因转染体系至关重要。
马良[6]（2017）在《重组胶原蛋白的制备和区域稳定性研究》文中进行了进一步梳理胶原蛋白是人体内最重要的结构蛋白之一。它具有特征性的（Gly-X-Y）n重复序列,且其中X和Y位置的氨基酸通常是脯氨酸和羟脯氨酸。与从动物中提取的胶原蛋白相比,非动物来源的重组胶原蛋白具有低免疫原性等优点,因此是生物医学的理想材料之一。本文围绕重组胶原蛋白的制备和区域稳定性开展了三个方面的工作:（1）发酵过程中的条件优化。优化发酵条件包括:培养基的选择、培养环境的pH以及诱导温度,从而实现V-CL的产率高达14.3g/L。（2）重组胶原蛋白的高效纯化。使用酸沉降的方法实现一步纯化胶原蛋白V-CL。与传统的小型层析法相比,酸沉降的方法更加简单、高效,并且无重金属离子的引入,更加环保。（3）胶原蛋白酶切位点的稳定性。研究V-CL蛋白酶切位点的先后顺序,并与预测的稳定性特征进行比较。实验确定的蛋白酶切先后顺序符合预测的稳定性特征,说明了蛋白的酶切是遵循特定顺序进行的。由于胶原蛋白的酶切通常与消化疾病相关,本研究揭示了胶原蛋白和相关疾病模型的生物降解途径。
杨坤玓[7]（2016）在《大绿臭蛙皮肤分泌物中天然肽类化合物的分离、鉴定、合成及活性研究》文中研究表明两栖动物由于其独特的身体结构和腺体组织可以生活在水里和陆地上,因此得到了生物学者广泛的研究兴趣。近年来,由于两栖动物的皮肤分泌物中存在着独特的化学成分,使他们获得了医药学和毒理学研究人员的青睐。本文针对两栖蛙科动物中Rana家族中的中国大绿臭蛙[Rana（Odorrana）Livida]的皮肤分泌物进行了提取和研究。通过霰弹枪分子克隆方法,发现和提取潜在的药效学活性蛋白质。在本文中,我们通过霰弹枪克隆法得到了一条全新的cDNA序列,该序列经双脱氧链终止（Sanger）测序法测序,将得到的序列送基因库中搜索同源蛋白,根据其结构和序列相关性设置活性实验进行验证。本实验通过上述方法获取了一条全新的多肽Odorrana-BI-vl,通 过 测 序 及 翻 译 得 到 其 氨 基 酸 序 列 为Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Lys-Ser-Val-Lys-Gly-Ser-Ile-OH。本实验使用固相合成法对该多肽进行固相合成,合成产物经RP-HPLC分离纯化后用于药理活性研究。合成产物由MALDI-TOF质谱和LC-MS质谱分析对其结构进行确证。根据NCBI-BLAST数据库匹配结果发现该多肽与Rana家族多肽odorranain-v1属于同源蛋白,拥有高度相似的高保守信号肽区域和成熟肽区域（10/12片段重叠）。针对该多肽的生物活性,本文对其进行了最小抑菌浓度（MIC）、溶血性、抗癌活性、平滑肌舒张/收缩以及缓激肽抑制活性的研究。结果表明,Odorrana-BI-vl在512mg/L时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌的抑制活性不明显,且在该浓度下亦无明显的溶血性;该多肽对人肿瘤细胞株MB-435有轻微的选择性抑制作用,浓度为1×10-4M时的抑制率仅约为20%左右;但针对Wistar大鼠膀胱平滑肌的BK作用上,该多肽能明显抑制BK对组织的收缩作用。
隋顺超[8]（2014）在《对转基因克隆牛乳脂肪球膜蛋白质及四种牛奶蛋白质组学研究》文中研究表明作为牛奶中蛋白质的重要组成部分乳脂肪球膜蛋白质具有多种重要的生理功能,由于其来源于乳腺上皮细胞膜及内质网,对其研究不仅是对转基因克隆牛奶蛋白质安全性评估的重要组成,而且可以从侧面反映产奶牛本身乳腺的健康状况。围绕不同奶牛品种或品系（包括美国荷斯坦牛、中国荷斯坦牛、娟珊牛及水牛）乳品性状的差异,建立牛乳清蛋白差异表达谱、乳脂肪球膜差异蛋白质表达谱,挖掘与乳品质改良相关的功能性蛋白,揭示不同奶牛品种乳蛋白质合成、分泌信号传导通路的差异,为牛奶品质的改良提供素材,同时通过牛奶蛋白质组技术平台和牛奶蛋白质数据库的建立,进行转基因牛奶蛋白质表达差异的食品安全研究。在本论文中,我们分别对在乳腺中特异表达人溶菌酶（TC-LZ）、人α-乳清蛋白（TC-LA）和人乳铁蛋白（TC-LF）的三个转基因克隆牛品系共17头健康的转基因克隆牛、3头健康的克隆牛和9头健康的普通对照牛的初乳和常乳的乳脂肪球膜蛋白质进行了全面系统的分析。利用液质联用对各组中初乳和常乳乳脂肪球膜蛋白质表达谱进行了鉴定和分析。我们在五组样品中共鉴定到蛋白质1225种,在TC-LA组中有166种特异表达的蛋白质,在TC-LF组中有265种特异表达的蛋白质,在TC-LZ组中有184种特异表达的蛋白质,结果表明在转基因克隆组中共有43种特异表达的蛋白。我们根据GO的功能注释对其进行功能分类。利用双向电泳（2-D）结合MALDI TOF/TOI质谱的定量蛋白质组的方法进一步对各组的乳脂肪球膜蛋白质进行鉴定分析。在TC-LZ、TC-LA、TC-LI转基因克隆的三组中共有33个差异表达的蛋白点。其后我们利用iTRAQ技术对五组不同样品间蛋白质表达量进行分析。在初乳乳脂肪球膜蛋白质中共有459种蛋白质具有定量信息,在常乳中共有426种蛋白质具有定量信息。我们以普通牛乳脂肪球膜蛋白质表达量为参照,对比三组转基因克隆牛及一组克隆牛蛋白质表达量,筛选表达量差异显着蛋白质。在TC-LA组中,初乳乳脂肪球膜蛋白质共有126种,常乳中共有77种表达量产生了明显差异；在TC-LF组中,初乳157种,常乳有222种表达量产生了明显差异;在TC-LZ组中,初乳有49种,常乳有98种表达量产生了明显差异；在克隆组中,初乳有98种,常乳中有132种表达量产生了明显差异。在其后分别利用聚类分析和主成分分析中对差异蛋白点进行分析,两种分析方法的分析结果均表明由转基因克隆因素所引起乳脂肪球膜蛋白成分的变异度在普通对照组与克隆对照组变异范围之内。对在乳腺中特异表达人溶菌酶、人α-乳清蛋白和人乳铁蛋白的三个转基因克隆牛品系初乳和常乳的蛋白质及营养组成的研究表明,所引起乳蛋白成分改变在普通对照组组内的自然变异范围之内。在四种牛奶初乳和常乳的乳清及乳脂肪球膜蛋白质中,利用高效液相色谱和质谱联用的方法,鉴定出1148种蛋白质；将娟珊牛与水牛中表达的全部蛋白质分别与荷斯坦牛进行比较,在水牛中特异表达的蛋白质有132种,在娟珊牛中特异表达的蛋白质有131种。对这些特异表达的蛋白质结合四种牛泌乳特性和牛奶的特性进行分析,发现了大量与乳脂肪合成分泌相关的蛋白质。通过对差异表达蛋白的鉴定与功能分析我们找到了多个与脂代谢与炎症反应及其它疾病相关的蛋白,这些蛋白可以作为候选基因转入牛奶中,提高牛奶品质或增强奶牛抗病性,从而能够形成高品质牛奶生产种群。
金科华[9]（2015）在《Mycoepoxydiene抑制宫颈癌HeLa细胞生长的分子机制研究》文中研究指明天然产物来源广泛,结构复杂多样,具有丰富的生物学活性,是抗肿瘤药物的重要来源。我们从海洋真菌中分离的真菌环氧二烯（mycoepoxydiene,MED）具有新颖的化学结构,能有效抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长（IC50为20 μM）,但其作用机制还很不清楚。本文采用双向电泳（two dimensional gel electrophoresis,2-DE）等技术对MED抑制HeLa生长的分子机制进行了研究,为将其进一步发展为抗肿瘤药物,尤其是宫颈癌的治疗奠定基础。蛋白组学结果表明,MED处理HeLa细胞后的差异蛋白主要涉及糖酵解、磷酸戊糖途径、脂肪酸合成、核苷酸代谢、细胞周期、细胞骨架、转录加工、蛋白质翻译和降解等途径,且以下调为主。进一步研究表明,MED抑制HeLa细胞生长与糖、脂代谢途径中的关键酶的含量（或活性）改变密切相关。我们运用Western blot（WB）确认了 2-DE鉴定的下调蛋白-磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase,TPI）。并发现MED处理后,多个糖酵解酶,如己糖激酶 2（hexokinase 2,HK2）、磷酸果糖激酶 1（phosphofructokinase 1,PFKM）、醛缩酶 A（aldolaseA,ALDOA）、烯醇化酶 1（enolase 1,ENO1）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A,LDHA）均下调。HeLa细胞内,糖酵解终产物乳酸含量以MED浓度依赖的方式降低,同时MED通过间接途径抑制LDHA酶活性。进一步研究表明过表达上述下调的糖酵解酶均可显着降低MED对HeLa细胞生长的抑制,表明MED抑制糖酵解与其抑制HeLa生长密切相关。WB结果表明,MED下调HeLa细胞6-磷酸葡萄糖酸内酯酶（6-phosphogluconolactonase,PGLS）（2-DE鉴定的下调蛋白）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）。还原型烟酰胺腺嘌呤核苷二磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）以 MED浓度依赖的方式降低。并且,MED通过间接途径抑制G6PD酶活性。过表达G6PD和PGLS均可显着降低MED诱导的ROS,减轻MED对HeLa细胞生长的抑制。MED上调脂肪水解的限速酶—脂肪组织甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）、脂肪酸β氧化的限速酶—肉碱棕榈酰转移酶1 A（CPT1-A）、延胡索酸水化酶（fumarate hydratase,FH）、琥珀酸脱氢酶复合体a 亚基（succinate dehydrogenase complex subunit a,SDHA）,升高细胞 ATP 水平,同时诱导ROS产生。shRNA敲低CPT1-A可显着降低MED诱导的ATP上升和ROS产生,并拮抗MED对HeLa细胞生长的抑制。与促进脂肪酸β-氧化相反,MED下调脂肪酸合酶（fatty acid synthas,FASN）,抑制脂肪酸合成。总之,MED抑制HeLa细胞生长主要通过抑制糖酵解、PPP、脂肪酸从头合成以及加速脂肪水解、脂肪酸p氧化和氧化磷酸化。为其进一步发展为抗宫颈癌药物奠定了良好基础。
张加慧[10]（2014）在《尿酸氧化酶长效制剂的研制及体内外研究》文中指出目的：制备一种新型支链（Y型）聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）修饰的尿酸氧化酶,并通过大鼠体内药效学、药代动力学和免疫原性评估该修饰酶的体内外酶活性和稳定性,为其临床研究提供实验基础与理论依据。方法：（1）通过不同pH、时间、投料比,考察对PEG耦合尿酸氧化酶的影响,采用离子交换色谱、超滤等手段对修饰产物进行分离纯化,制备PEG修饰尿酸氧化酶耦合物；（2）运用凝胶电泳、高效液相色谱技术、TNBS法、酶法研究支链PEG修饰产物的理化特征、修饰度等；（3）采用酶反应—紫外分光光度法对修饰的尿酸酶生物活性及其体外稳定性进行检测；（4）并以大鼠为模型,研究不同聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶在体内的药代动力学和药效动力学；（5）通过ELISA方法分析比较修饰产物的免疫原性。结果：（1）在pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中,在室温（25℃）条件下,以1：5的摩尔比加入尿酸氧化酶和Y型SPA-mPEG20000MW （SPA-mPEG2）反应30min,可以得到修饰度和保留活性较高的PEG化蛋白药物；采用Q Sepharose Fast Flow层析柱和截留分子量为50kD的超滤膜堆进行分离纯化,可以得到纯度≥95%的PEG化尿酸氧化酶样品。（2）Y型PEG尿酸氧化酶修饰物rUOX-mPEG2的表观分子量比线性PEG修饰的产物rUOX-mPEG更大,PEG分子的修饰度更低而活性更高；（3）在相同温度、pH条件下的活性稳定性明显高于直链型PEG尿酸氧化酶修饰物；（4）Y型PEG尿酸氧化酶修饰物在体内半衰期显着延长,在体内具有更长的药效维持时间；（5）免疫原性实验结果表明,Y型PEG修饰能有效降低免疫原性。结论：新型聚乙二醇修饰尿酸氧化酶的酶学性质明显优于重组酶和商业直链型修饰的尿酸氧化酶,药效维持时间显着高于后者,免疫原性和国外品种采用的直链修饰尿酸氧化酶相当,且明显低于重组酶,在大鼠体内呈线性动力学特征。
二、MALDI-TOF-MS法对重组人内皮抑素蛋白分子质量测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MALDI-TOF-MS法对重组人内皮抑素蛋白分子质量测定（论文提纲范文）
（1）中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌（贲门癌）危险因素及预测预警标志物的多中心前瞻性研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究目标 |
| 技术路线图 |
| 第1章 中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌(贲门癌)危险因素及预测预警标志物的横断面探索研究 |
| 第1节 宏观危险因素与贲门癌及癌前病变关系的探索研究 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 研究设计 |
| 2.2. 研究对象 |
| 2.3. 流行病学问卷调查和内镜检查 |
| 2.4. 质量控制 |
| 2.5. 危险因素的定义和分类 |
| 2.6. 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 内镜筛查依从性 |
| 3.2. 研究对象调查特征分布 |
| 3.3. 宏观危险因素与贲门癌及各级癌前病变的关系 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第2节 烫热饮食热暴露情况精准调查方案的探索研究 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 研究设计 |
| 2.2. 研究对象 |
| 2.3. 流行病学问卷调查 |
| 2.4. 烫热饮食摄入温度和摄入量测量 |
| 2.5. 质量控制 |
| 2.6. 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 调查对象基本信息和自我报告的烫热饮食热暴露特征 |
| 3.2. 调查对象烫热饮食摄入过程特征 |
| 3.3. 调查对象烫热饮食客观测量的热暴露特征 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第3节 幽门螺杆菌现症感染与贲门癌及癌前病变关系的探索研究 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 研究设计 |
| 2.2. 研究对象 |
| 2.3. 流行病学问卷调查 |
| 2.4. ~(13)C-尿素呼气试验(~(13)C-UBT) |
| 2.5. 内镜筛查与病理诊断 |
| 2.6. 数据管理和质量控制 |
| 2.7. 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 贲门各级粘膜病变研究对象基本特征 |
| 3.2. H.pylori感染与未感染对象基本特征 |
| 3.3. H.pylori感染与贲门各级粘膜病变的关系 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第4节 基于DIA(Data-independent acquisition)质谱蛋白质组学定量技术的贲门癌及癌前病变血浆蛋白标志物的探索研究 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1. 研究设计 |
| 2.2. 研究对象 |
| 2.3. 血液样本的采集、处理和保存 |
| 2.4. 实验方法 |
| 2.5. 统计学分析 |
| 2.6. 质量控制 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 研究对象基本资料 |
| 3.2. 贲门各级病变研究对象血浆差异表达蛋白分析 |
| 3.3. 潜在贲门癌及癌前病变蛋白标志物筛选 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第2章 中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌(贲门癌)危险因素的多中心前瞻性队列研究及预测预警模型构建 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 研究设计 |
| 2.2. 研究对象 |
| 2.3. 基线流行病学调查、内镜筛查与病理诊断 |
| 2.4. 队列随访及结局 |
| 2.5. 质量控制 |
| 2.6. 危险因素的定义和分类 |
| 2.7. 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 宏观危险因素与贲门癌发病风险关系 |
| 3.2. 贲门各级粘膜病变与贲门癌发病风险关系 |
| 3.3. 贲门癌风险预测预警模型构建 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文文章 |
| 文献综述 Ghrelin基因主要产物与上消化道癌发病关系的流行病学研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 蛋白质的糖基化修饰 |
| 1.2.1 N-糖基化修饰 |
| 1.2.2 O-糖基化修饰 |
| 1.2.3 GPI锚定修饰 |
| 1.2.4 糖基化修饰的功能 |
| 1.3 唾液酸 |
| 1.3.1 唾液酸简介 |
| 1.3.2 哺乳动物体内唾液酸的代谢 |
| 1.3.3 唾液酸与肿瘤的关系 |
| 1.3.4 唾液酸的研究方法 |
| 1.4 膀胱癌 |
| 1.4.1 膀胱癌简介 |
| 1.4.2 膀胱癌分类 |
| 1.4.3 膀胱癌的治疗 |
| 1.4.4 膀胱癌与Akt信号通路 |
| 1.5 细胞外囊泡 |
| 1.5.1 细胞外囊泡的简介 |
| 1.5.2 sEV的糖修饰研究进展 |
| 1.6 本课题的立项依据、研究意义及主要研究内容 |
| 1.6.1 立项依据与研究意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 唾液酸α2,3和α2,6连键类型质谱检测样品制备方法改进 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 细胞及培养方法 |
| 2.2.5 低氧培养模型 |
| 2.2.6 细胞总蛋白的提取 |
| 2.2.7 蛋白质定量 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 Lectin blot |
| 2.2.10 唾液酸的衍生化 |
| 2.2.11 N-糖链的释放 |
| 2.2.12 N-糖链的除盐 |
| 2.2.13 N-糖链的MALDI-TOF检测 |
| 2.2.14 质谱数据分析方法 |
| 2.2.15 数据统计方法及结果表示 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 MALDI-TOF区分唾液酸α2,3与α2,6 的原理分析 |
| 2.3.2 衍生化方法的有效性验证 |
| 2.3.3 胎球蛋白的N-糖链唾液酸分析 |
| 2.3.4 重组乳铁蛋白复杂N-糖链及唾液酸分析 |
| 2.3.5 肿瘤细胞低氧状态N-糖修饰及唾液酸修饰组学 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 膀胱癌唾液酸修饰与唾液酸酶NEU1的关联 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 细胞株及培养方法 |
| 3.2.5 总蛋白提取 |
| 3.2.6 Western blot实验 |
| 3.2.7 Lectin Blot实验 |
| 3.2.8 细胞总唾液酸酶活性测定 |
| 3.2.9 细胞N-糖链质谱 |
| 3.2.10 SILAC标记定量蛋白质谱 |
| 3.2.11 免疫组化和免疫荧光染色 |
| 3.2.12 激光共聚焦荧光显微镜检测 |
| 3.2.13 数据统计方法及结果表示 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 恶性膀胱癌唾液酸修饰增加 |
| 3.3.2 膀胱癌细胞总唾液酸酶活性分析 |
| 3.3.3 NEU1在膀胱癌细胞中的表达 |
| 3.3.4 NEU1在膀胱癌临床样本中的含量 |
| 3.3.5 临床样本中NEU1与唾液酸关系 |
| 3.3.6 NEU1与膀胱癌患者预后的关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 过表达NEU1对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响及机理分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.2.4 细胞及培养方法 |
| 4.2.5 过表达NEU1细胞构建 |
| 4.2.6 NEU1瞬时干扰 |
| 4.2.7 细胞总蛋白提取 |
| 4.2.8 细胞组分分离和提取 |
| 4.2.9 免疫共沉淀 |
| 4.2.10 Western blot |
| 4.2.11 Lectin blot |
| 4.2.12 细胞总唾液酸酶活测定 |
| 4.2.13 细胞表面唾液酸检测 |
| 4.2.14 MTS检测细胞增殖 |
| 4.2.15 细胞凋亡检测 |
| 4.2.16 细胞周期检测 |
| 4.2.17 激光共聚焦检测蛋白表达及定位 |
| 4.2.18 FN-Integrin亲和力检测 |
| 4.2.19 小鼠皮下成瘤实验 |
| 4.2.20 组织免疫化学染色 |
| 4.2.21 组织凋亡TUNEL染色 |
| 4.2.22 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 构建过表达NEU1的膀胱癌细胞株 |
| 4.3.2 过表达NEU1对细胞唾液酸修饰的影响 |
| 4.3.3 过表达NEU1对细胞表型的影响 |
| 4.3.4 过表达NEU1对膀胱癌细胞生长和抵抗凋亡相关分子表达的影响 |
| 4.3.5 过表达NEU1抑制膀胱癌的分子机理探究 |
| 4.3.6 过表达NEU1膀胱癌细胞小鼠皮下成瘤实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 膀胱癌细胞sEV唾液酸修饰对受体细胞摄入的影响及在临床诊断中的作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂及材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 试剂配制 |
| 5.2.4 细胞及培养方法 |
| 5.2.5 细胞总蛋白提取 |
| 5.2.6 蛋白质含量测定 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 Lectin blot |
| 5.2.9 sEV提取 |
| 5.2.10 密度梯度离心纯化sEV |
| 5.2.11 透射电镜检测 |
| 5.2.12 sEV粒径分析 |
| 5.2.13 sEV内吞激光共聚焦制样及检测 |
| 5.2.14 sEV生物素标记及内吞检测 |
| 5.2.15 EdU细胞增殖检测 |
| 5.2.16 s EV唾液酸含量检测(ELISA) |
| 5.2.17 数据量化及统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 细胞分泌的sEV的分离与鉴定 |
| 5.3.2 sEV唾液酸修饰 |
| 5.3.3 sEV唾液酸修饰对受体细胞影响 |
| 5.3.4 血浆sEV与膀胱癌诊断 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 课题展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:附表 |
| 附录 Ⅱ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基对其致敏性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 β-乳球蛋白概述 |
| 1.2 β-乳球蛋白致敏性及其降敏性研究进展 |
| 1.2.1 热处理 |
| 1.2.2 高压处理 |
| 1.2.3 酶水解 |
| 1.2.4 共价修饰 |
| 1.2.5 乳酸发酵 |
| 1.3 聚乙二醇修饰技术及其国内外研究现状 |
| 1.3.1 聚乙二醇的特性 |
| 1.3.2 聚乙二醇修饰反应的类型 |
| 1.3.3 聚乙二醇修饰反应的影响因素 |
| 1.3.4 聚乙二醇修饰技术的应用 |
| 1.4 课题研究意义、研究内容及创新点 |
| 1.4.1 课题研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 创新点 |
| 第2章 β-乳球蛋白谷氨酰胺残基的PEG定点修饰及修饰条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 TGase催化PEG定点修饰原理 |
| 2.3.2 乙醇对TGase酶活的影响 |
| 2.3.3 修饰条件优化 |
| 2.3.4 SDS-PAGE分析 |
| 2.3.5 凝胶过滤色谱分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 乙醇对TGase酶活的影响 |
| 2.4.2 TGase与β-LG质量比及反应pH值对修饰产物修饰率的影响 |
| 2.4.3 β-LG与 PEG摩尔比及乙醇添加量对修饰产物修饰率的影响 |
| 2.4.4 反应温度对修饰产物修饰率的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 β-乳球蛋白的PEG定点修饰产物的纯化及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 β-LG的 PEG定点修饰产物的制备 |
| 3.3.2 阳离子交换色谱分离纯化β-LG的 PEG定点修饰产物 |
| 3.3.3 β-LG的 PEG定点修饰产物的鉴定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 阳离子交换色谱分离纯化β-LG的 PEG定点修饰产物 |
| 3.4.2 β-LG的 PEG定点修饰产物的鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 β-乳球蛋白PEG修饰产物的结构表征、修饰位点及致敏性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 β-LG的 PEG修饰产物的结构表征 |
| 4.3.2 β-LG的 PEG修饰产物的致敏性分析 |
| 4.3.3 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 β-LG的 PEG修饰产物的结构表征 |
| 4.4.2 β-LG的 PEG修饰产物的修饰位点分析 |
| 4.4.3 β-LG的 PEG修饰产物的致敏性分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 PEG定点修饰β-LG谷氨酰胺残基修饰条件优化 |
| 5.1.2 β-LG的 PEG定点修饰产物的纯化及鉴定 |
| 5.1.3 β-LG的 PEG修饰产物的结构表征、修饰位点及致敏性分析 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（4）泰山灰树花的驯化栽培及其抗细菌性咽炎活性物质的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 1.1 灰树花概述 |
| 1.1.1 灰树花的生物学特性 |
| 1.1.2 灰树花的活性成分及药理作用 |
| 1.1.3 泰山灰树花研究现状 |
| 1.2 蛋白质的分离纯化及鉴定概述 |
| 1.2.1 根据溶解度差异分离蛋白质的方法 |
| 1.2.2 根据分子大小差异分离蛋白质的方法 |
| 1.2.3 根据电荷不同分离蛋白质的方法 |
| 1.2.4 根据蛋白质吸附特性分离蛋白质的方法 |
| 1.2.5 根据生物分子特异亲和力分离蛋白质的方法 |
| 1.2.6 蛋白质鉴定方法 |
| 1.3 咽炎概述 |
| 1.3.1 咽炎的发病机制 |
| 1.3.2 咽炎动物模型的建立 |
| 1.3.3 咽炎动物模型的评价指标 |
| 1.3.4 NF-κB调控炎症因子的机制 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基及溶剂配置 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 泰山灰树花的驯化栽培 |
| 2.2.2 泰山灰树花活性物质的分离与鉴定 |
| 2.2.3 利用大鼠细菌性咽炎模型验证泰山灰树花活性物质并初步研究治疗机理 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 泰山灰树花的驯化栽培 |
| 3.1.1 泰山灰树花母种培养条件的优化 |
| 3.1.2 泰山灰树花栽培种培养条件的优化 |
| 3.2 泰山灰树花中活性物质的分离与鉴定 |
| 3.2.1 泰山灰树花发酵液、发酵菌丝和子实体对金黄色葡萄球菌抑菌活性的检测 |
| 3.2.2 泰山灰树花多糖对金黄色葡萄球菌抑菌活性的检测 |
| 3.2.3 小分子物质对金黄色葡萄球菌抑菌活性的检测 |
| 3.2.4 温度对泰山灰树花活性物质的影响 |
| 3.2.5 硫酸铵沉淀饱和度的确定 |
| 3.2.6 pH3.5类等电点沉淀 |
| 3.2.7 Q-Sepharose强阴离子交换层析 |
| 3.2.8 DEAE-Sephadex弱阴离子交换层析 |
| 3.2.9 Q-Sepharose强阴离子交换层析(线性洗脱) |
| 3.2.10 Superdex~(TM)75 pg分子凝胶过滤层析 |
| 3.2.11 SDS-PAGE检测 |
| 3.2.12 泰山灰树花活性蛋白(GFP)的纯化回收率 |
| 3.2.13 泰山灰树花GFP肽段测序 |
| 3.2.14 泰山灰树花GFP的N-末端部分氨基酸测序 |
| 3.2.15 泰山灰树花GFP理化性质的测定 |
| 3.3 利用大鼠细菌性咽炎模型验证活性物质并初步分析治疗机理 |
| 3.3.1 大鼠细菌性咽炎模型的建立 |
| 3.3.2 泰山灰树花GFP治疗细菌性咽炎的试验验证及机理研究 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表情况 |
（5）SOD1的化学修饰及细胞递送研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质药物 |
| 1.2 蛋白质的化学修饰 |
| 1.3 蛋白质药物的运输 |
| 1.3.1 机械运输方式 |
| 1.3.2 化学破坏方式 |
| 1.3.3 载体运输方式 |
| 1.3.4 蛋白质修饰方式 |
| 1.4 超氧化物歧化酶及其修饰与细胞递送 |
| 1.5 本论文的研究内容 |
| 1.5.1 立题思想 |
| 1.5.2 研究内容与意义 |
| 第二章 荧光修饰SOD1及其表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验分析仪器、试剂及溶液配制 |
| 2.3 SOD1的荧光修饰 |
| 2.4 荧光SOD1的光谱分析 |
| 2.4.1 实验方法 |
| 2.4.2 结果与讨论 |
| 2.5 荧光SOD1的凝胶电泳分析 |
| 2.5.1 实验方法 |
| 2.5.2 结果与讨论 |
| 2.6 荧光SOD1的圆二色光谱分析 |
| 2.6.1 实验方法 |
| 2.6.2 结果与讨论 |
| 2.7 荧光SOD1的活性测定 |
| 2.7.1 实验方法 |
| 2.7.2 结果与讨论 |
| 2.8 SOD1-pRhB的质谱测定 |
| 2.8.1 实验方法 |
| 2.8.2 结果与讨论 |
| 2.9 荧光SOD1的抗酶解能力 |
| 2.9.1 实验方法 |
| 2.9.2 结果与讨论 |
| 2.10 本章小结 |
| 第三章 SOD1-pRhB的细胞递送研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验分析仪器、试剂及溶液配制 |
| 3.3 SOD1-pRhB细胞摄取及分布研究 |
| 3.3.1 实验方法 |
| 3.3.2 结果与讨论 |
| 3.4 浓度、时间等对SOD1-pRhB细胞摄取的影响 |
| 3.4.1 实验方法 |
| 3.4.2 结果与讨论 |
| 3.5 胞内SOD1-pRhB的进一步观测 |
| 3.5.1 实验方法 |
| 3.5.2 结果与讨论 |
| 3.6 不同细胞系对SOD1-pRhB的摄取研究 |
| 3.6.1 实验方法 |
| 3.6.2 结果与讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 SOD1-pRhB的跨膜机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验分析仪器、试剂及溶液配制 |
| 4.3 修饰基团对SOD-pRhB细胞摄取的影响 |
| 4.3.1 实验方法 |
| 4.3.2 结果与讨论 |
| 4.4 温度对SOD1-pRhB细胞摄取的影响 |
| 4.4.1 实验方法 |
| 4.4.2 结果与讨论 |
| 4.5 SOD1-pRhB的膜破坏性研究 |
| 4.5.1 实验方法 |
| 4.5.2 结果与讨论 |
| 4.6 SOD1-pRhB的细胞摄取途径 |
| 4.6.1 实验方法 |
| 4.6.2 结果与讨论 |
| 4.7 SOD1-pRhB的胞内细胞器定位 |
| 4.7.1 实验方法 |
| 4.7.2 结果与讨论 |
| 4.8 SOD1-pRhB的动态细胞摄取与细胞外排过程研究 |
| 4.8.1 实验方法 |
| 4.8.2 结果与讨论 |
| 4.9 本章小结 |
| 第五章 SOD1的氨基和羧基修饰及性质研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验分析仪器、试剂及溶液配制 |
| 5.3 SOD1的氨基与羧基修饰 |
| 5.4 SOD1-(NH_2)_n的性质分析 |
| 5.4.1 实验方法 |
| 5.4.2 结果与讨论 |
| 5.5 SOD1-(NH_2)_n的DNA结合性质分析 |
| 5.5.1 实验方法 |
| 5.5.2 结果与讨论 |
| 5.6 (NH_2)_n-SOD1-pRhB的DNA结合性质与细胞摄取研究 |
| 5.6.1 实验方法 |
| 5.6.2 结果与讨论 |
| 5.7 SOD1-(COOH)_n的稳定性与活力初步分析 |
| 5.7.1 实验方法 |
| 5.7.2 结果与讨论 |
| 5.8 本章小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ: 部分化合物的NMR谱图 |
| 附录Ⅱ: 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）重组胶原蛋白的制备和区域稳定性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胶原蛋白简介 |
| 1.1.1 胶原蛋白的组成与结构 |
| 1.1.2 胶原蛋白的分布 |
| 1.1.3 胶原蛋白的分类 |
| 1.2 胶原蛋白的制备 |
| 1.2.1 胶原蛋白的酸提取法 |
| 1.2.2 胶原蛋白的碱提取法 |
| 1.2.3 盐法提取胶原蛋白 |
| 1.2.4 胶原蛋白的生物酶法 |
| 1.3 胶原蛋白的纯化 |
| 1.3.1 离子交换色谱分离纯化胶原蛋白 |
| 1.3.2 凝胶过滤色谱分离纯化胶原蛋白 |
| 1.3.3 亲和色谱分离纯化胶原蛋白 |
| 1.3.4 反相色谱分离胶原蛋白 |
| 1.4 胶原蛋白的应用 |
| 1.4.1 胶原蛋白在食品中的应用 |
| 1.4.2 胶原蛋白在医学中的应用 |
| 1.5 重组胶原蛋白的特点与发展 |
| 1.5.1 重组胶原蛋白的特点 |
| 1.5.2 重组胶原蛋白的发展 |
| 1.6 课题设计的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 发酵过程中的条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 种子培养 |
| 2.3.2 探究不同因素对发酵的影响 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 pH在发酵过程中对细胞生长的影响 |
| 2.4.2 培养基的优化 |
| 2.4.3 发酵过程中补液的影响 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组胶原蛋白高效纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组胶原蛋白的表达 |
| 3.3.2 细胞破碎 |
| 3.3.3 His-tag柱的纯化方法 |
| 3.3.4 不同pH对蛋白溶解度的影响 |
| 3.3.5 蛋白的酶切 |
| 3.3.6 透析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pH对蛋白溶解度的影响 |
| 3.4.2 His-tag柱与酸沉降纯化效果对比 |
| 3.4.3 蛋白的酶切 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 胶原蛋白酶切位点的稳定性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验步骤与样品处理 |
| 4.2.1 蛋白的表达与制备 |
| 4.2.2 圆二色谱的测定 |
| 4.2.3 动态激光散射仪(DLS)测定粒镜大小 |
| 4.2.4 V的酶切顺序 |
| 4.2.5 CL的酶切顺序 |
| 4.2.6 MALDI-TOF MS实验结果 |
| 4.3 实验结论 |
| 4.3.1 圆二色谱(CD) |
| 4.3.2 V-CL酶切条件的确定与产物的DLS测定 |
| 4.3.3 球状域V的酶切过程 |
| 4.3.4 重组胶原蛋白域的酶切过程 |
| 4.3.5 酶切产物的质谱测定 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）大绿臭蛙皮肤分泌物中天然肽类化合物的分离、鉴定、合成及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 天然产物在药物研发中的作用 |
| 1.3 源于两栖动物皮肤分泌物的活性多肽研究 |
| 1.4 抗菌肽研究概况 |
| 1.5 激肽释放酶-激肽系统和缓激肽研究概况 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 cDNA文库建立以及分子克隆 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 中国大绿臭蛙皮肤分泌物的提取 |
| 2.3.2 所用试剂组成(试剂盒提供) |
| 2.3.3 mRNA的提取分离 |
| 2.3.4 cDNA文库建立 |
| 2.3.5 BD SMART~(TM)基因快速扩增(RACE-PCR) |
| 2.3.6 PCR产物的凝胶电泳分析 |
| 2.3.7 RACE-PCR产物纯化 |
| 2.3.8 重组质粒的构建 |
| 2.3.10 基因测序 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 RACE-PCR扩增 |
| 2.4.2 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.4.3 基因测序结果分析 |
| 第三章 天然肽链的人工合成以及合成产物结构确证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 固相合成多肽及结构鉴定 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 固相载体及消旋体系选择 |
| 3.4.2 合成过程中检测 |
| 3.4.3 氨基酸取代基保护策略 |
| 3.4.4 固相合成产物的结构确证 |
| 3.4.5 产物收率 |
| 第四章 合成肽的药理活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 抗菌肽(AMPs)活性试验 |
| 4.2.1 实验指示菌种 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 实验主要试剂 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.3 红细胞溶血实验 |
| 4.3.1 实验血红细胞 |
| 4.3.2 实验仪器 |
| 4.3.4 实验主要试剂 |
| 4.3.5 实验方法 |
| 4.4 MTT筛选实验 |
| 4.4.1 癌细胞株 |
| 4.4.2 实验主要试剂 |
| 4.4.3 实验器材 |
| 4.4.4 实验方法 |
| 4.5 大鼠平滑肌实验 |
| 4.5.1 实验动物组织 |
| 4.5.2 实验主要试剂 |
| 4.5.3 实验仪器 |
| 4.5.4 实验方法 |
| 4.6 实验结果与讨论 |
| 4.6.1 抗菌活性试验 |
| 4.6.2 红细胞溶血性实验 |
| 4.6.3 MTT细胞筛选试验 |
| 4.6.4 平滑肌收缩实验及缓激肽抑制实验 |
| 结论 |
| 研究结果讨论 |
| 需进一步研究方向 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）对转基因克隆牛乳脂肪球膜蛋白质及四种牛奶蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛋白质组学研究进展 |
| 1.1.1 蛋白质组学概述 |
| 1.1.2 蛋白质组学研究意义 |
| 1.1.3 蛋白质组学研究策略及内容 |
| 1.1.4 蛋白质组学研究技术 |
| 1.2 动物转基因技术的进展 |
| 1.2.1 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.2.2 利用转基因技术降低牛乳中主要过敏原 |
| 1.3 转基因食品安全评价研究进展 |
| 1.3.1 转基因食品安全评价概论 |
| 1.3.2 “实质等同性”原则 |
| 1.3.3 转基因动植物食品安全性评估进展 |
| 1.3.4 克隆牛安全性研究进展 |
| 1.3.5 转基因牛奶乳清蛋白质及营养成分研究进展 |
| 1.4 乳中蛋白质组学研究进展 |
| 1.4.1 各种牛奶的组成及特点 |
| 1.4.2 蛋白质组学在普通乳中的应用 |
| 1.4.3 乳中糖蛋白的研究 |
| 1.4.4 利用蛋白质组学的方法寻找与乳腺疾病相关的Biomarkers |
| 1.4.5 蛋白质组学在乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.5 乳脂肪球膜蛋白研究进展 |
| 1.5.1 乳脂肪球膜蛋白概述 |
| 1.5.2 乳脂肪球形成的机理 |
| 1.5.3 乳脂肪球膜蛋白质的组成 |
| 1.5.4 乳脂肪球膜蛋白质的功能 |
| 1.5.5 乳脂肪球膜蛋白质组学的研究 |
| 1.6 研究目的、意义及技术路线 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究意义 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 转基因牛乳脂肪球膜蛋白质表达谱鉴定与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品前处理 |
| 2.2.2 高效液相色谱与质谱联用对转基因克隆牛及其对照组MFGM蛋白质鉴定 |
| 2.2.3 利用双向电泳对转基因克隆牛MFGM蛋白质鉴定与分析 |
| 2.2.4 基于iTRAQ试剂对转基因克隆牛乳MFGM蛋白质表达量的研究 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 转基因牛乳脂肪球膜蛋白质表达谱的鉴定及差异比较 |
| 2.3.2 利用2D-PAGE对转基因克隆MFGM蛋白质的鉴定 |
| 2.3.3 利用iTRAQ标记对转基因克隆MFGM蛋白质表达量的研究 |
| 第三章 中国荷斯坦牛、美国荷斯坦牛、中国水牛和娟珊牛牛奶蛋白质组学研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 4.1 转基因克隆牛乳脂肪球膜蛋白质研究 |
| 4.1.1 转基因克隆MFGM蛋白质表达谱的建立 |
| 4.1.2 转基因克隆MFGM蛋白质表达量的研究 |
| 4.2 中国荷斯坦牛、美国荷斯坦牛、中国水牛和娟珊牛牛奶蛋白质组学研究 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Mycoepoxydiene抑制宫颈癌HeLa细胞生长的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 天然产物 |
| 1.1 天然产物是重要的药物来源 |
| 1.2 天然产物药物开发的瓶颈 |
| 2 蛋白质组学 |
| 2.1 蛋白质组与蛋白质组学定义 |
| 2.2 蛋白质组学的分类 |
| 2.3 蛋白组学核心技术 |
| 2.3.1 双向电泳 |
| 2.3.2 质谱技术 |
| 2.3.2.1 MALDI-TOF |
| 2.3.2.2 纳升电喷雾串联质谱技术 |
| 2.3.3 生物信息学 |
| 2.3.3.1 生物信息学简介 |
| 2.3.3.2 蛋白质组学数据库 |
| 2.3.3.3 2-DE数据库及蛋白质组学研究工具 |
| 2.4 蛋白质组学新技术 |
| 2.4.1 荧光二维差异凝胶电泳 |
| 2.4.2 稳定性同位素亲和标签技术 |
| 2.4.2.1 SILAC |
| 2.4.2.2 ICAT |
| 2.4.2.3 iTRAQ标记技术 |
| 2.4.3 多维色谱串联质谱技术 |
| 2.5 其它蛋白质组学技术 |
| 3 蛋白质组学在天然产物药理研究中的应用 |
| 3.1 鉴定药物作用靶点 |
| 3.1.1 化学蛋白质组学策略 |
| 3.1.2 2-DE策略 |
| 3.2 阐明药物作用机制 |
| 3.3 研究药物的细胞毒性 |
| 3.4 研究细胞的耐药性 |
| 4 肿瘤的代谢特点及靶向肿瘤代谢的治疗方法 |
| 4.1 Warburg Effect |
| 4.1.1 Warburg Effect的发生机制 |
| 4.1.1.1 缺氧的微环境及HIF-1的作用 |
| 4.1.1.2 线粒体功能损伤 |
| 4.1.1.3 癌基因激活 |
| 4.1.1.4 抑癌基因失活 |
| 4.1.2 Warburg Effect的生理意义 |
| 4.2 肿瘤的生物合成 |
| 4.2.1 肿瘤的生物合成前体 |
| 4.2.1.1 有氧糖酵解提供生物合成前体 |
| 4.2.1.2 TAC提供生物合成前体 |
| 4.2.2 信号途径对生物合成的调控 |
| 4.2.2.1 PI3K-AKT-mTOR |
| 4.2.2.2 c-Myc |
| 4.2.2.3 HIF-1 |
| 4.3 靶向Warburg Effect的治疗方法 |
| 4.3.1 抑制葡萄糖摄取 |
| 4.3.2 抑制糖酵解酶活性 |
| 4.3.3 抑制H~+外排 |
| 4.3.4 抑制 MCT1 |
| 4.3.5 抑制HIF-1 |
| 4.3.6 抑制c-Myc |
| 4.4 抑制肿瘤细胞的生物合成 |
| 4.4.1 抑制mTOR |
| 4.4.2 抑制脂质合成 |
| 4.4.3 抑制核苷酸从头合成 |
| 4.4.4 抑制蛋白质合成 |
| 5 立题背景与意义 |
| 第二章 MED对HeLa细胞蛋白质组的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 MED及细胞株 |
| 2.2 试剂与耗材 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 试剂配制 |
| 2.4.1 细胞培养相关溶液 |
| 2.4.2 2-DE相关试剂 |
| 2.4.3 胶内酶解试剂 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养及保存 |
| 2.5.2 MED处理HeLa细胞和正常细胞 |
| 2.5.3 细胞裂解及蛋白浓度测定 |
| 2.5.4 IPG胶条水化 |
| 2.5.5 等电聚焦 |
| 2.5.6 IPG胶条平衡 |
| 2.5.7 SDS-PAGE |
| 2.5.8 凝胶的染色及扫描 |
| 2.5.9 差异蛋白点分析 |
| 2.5.10 胶内酶解 |
| 2.5.11 质谱鉴定 |
| 3 结果及分析 |
| 3.1 MED具有较好的选择性毒性 |
| 3.2 20μM MED处理HeLa细胞24 h 2-DE图谱 |
| 3.3 20μM MED处理HeLa细胞24 h差异蛋白分析 |
| 3.4 20μM MED处理HeLa细胞24 h差异蛋白质谱鉴定结果 |
| 3.5 后续研究重点的选择 |
| 第三章 MED抑制HeLa细胞糖酵解途径 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒、cDNA及细胞株 |
| 2.2 试剂与耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 试剂配制 |
| 2.4.1 Western blot相关试剂 |
| 2.4.2 分子克隆相关试剂 |
| 2.4.3 MTS相关试剂 |
| 2.4.4 LDHA活性测定试剂 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 Western bloting |
| 2.5.1.1 细胞总蛋白裂解液的制备 |
| 2.5.1.2 SDS-PAGE |
| 2.5.1.3 电转印 |
| 2.5.1.4 封闭 |
| 2.5.1.5 免疫印迹反应 |
| 2.5.1.6 曝光 |
| 2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.5.3 LDHA的表达与纯化 |
| 2.5.3.1 PCR扩增LDHA cDNA |
| 2.5.3.2 PCR产物酶切、连接与转化 |
| 2.5.3.3 鉴定重组质粒pET-28a-LDHA |
| 2.5.3.4 LDHA的诱导表达与纯化 |
| 2.5.4 MED对LDH活性的影响 |
| 2.5.4.1 MED对重组LDHA活性的影响 |
| 2.5.4.2 MED对HeLa细胞内源LDHA活性的影响 |
| 2.5.5 糖酵解酶基因在HeLa细胞中过表达 |
| 2.5.5.1 PCR扩增糖酵解酶cDNA |
| 2.5.5.2 PCR产物与N-Flag质粒的酶切 |
| 2.5.5.3 连接与转化 |
| 2.5.5.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.5.5.5 慢病毒的包装与感染 |
| 2.5.5.6 WB检测过表达效果 |
| 2.5.5.7 测定IC_(50) |
| 3 结果及分析 |
| 3.1 MED降低HeLa细胞糖酵解酶含量 |
| 3.2 MED降低HeLa细胞胞内乳酸含量 |
| 3.3 MED间接抑制LDHA活性 |
| 3.3.1 MED对重组LDHA活性的影响 |
| 3.3.1.1 在大肠杆菌中表达LDHA |
| 3.3.1.2 MED不影响重组LDHA活性 |
| 3.3.2 MED抑制HeLa细胞LDHA活性 |
| 3.4 过表达糖酵解酶对MED抑制HeLa细胞生长的影响 |
| 3.4.1 糖酵解酶cDNA PCR扩增 |
| 3.4.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.4.3 糖酵解酶过表达的检测 |
| 3.4.4 过表达糖酵解酶基因抑制MED诱导的HeLa细胞死亡 |
| 第四章 MED抑制HeLa细胞的磷酸戊糖途径 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒、cDNA和细胞株 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 测定NADPH含量 |
| 2.4.2 MED对G6PD活性的影响 |
| 2.4.2.1 MED对重组G6PD活性的影响 |
| 2.4.2.2 MED对HeLa细胞G6PD活性的影响 |
| 2.4.3 G6PD或PGLS在HeLa细胞中过表达 |
| 2.4.3.1 PCR扩增G6PD或PGLS cDNA |
| 2.4.3.2 酶切PCR产物及N-Flag质粒 |
| 2.4.3.3 连接与转化 |
| 2.4.3.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.4.3.5 慢病毒的包装与转染 |
| 2.4.3.6 WB检测G6PD和PGLS过表达水平 |
| 2.4.4 过表达G6PD或PGLS对MED降低NADPH的影响 |
| 2.4.5 过表达G6PD或PGLS对MED诱导的ROS的影响 |
| 2.4.6 过表达G6PD或PGLS对MED抑制HeLa细胞生长的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MED降低HeLa细胞G6PD和PGLS含量 |
| 3.2 MED降低HeLa细胞NADPH水平 |
| 3.3 MED间接抑制G6PD活性 |
| 3.3.1 G6PD在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 3.3.1.1 PCR扩增G6PD cDNA |
| 3.3.1.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.1.3 G6PD获得可溶性表达 |
| 3.3.2 MED不抑制重组G6PD活性 |
| 3.3.3 MED抑制HeLa细胞G6PD活性 |
| 3.4 G6PD和PGLS的过表达 |
| 3.4.1 G6PD和PGLS cDNA的PCR扩增 |
| 3.4.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.4.3 G6PD和PGLS获得高水平过表达 |
| 3.5 过表达G6PD或PGLS抑制MED诱导的NADPH下降 |
| 3.6 过表达G6PD或PGLS抑制MED诱导的ROS升高 |
| 3.7 过表达G6PD或PGLS拮抗MED对HeLa生长的抑制 |
| 第五章 MED对HeLa细胞脂代谢的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒和细胞株 |
| 2.2 试剂与耗材 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 测定ATP含量 |
| 2.4.2 WB检测脂代谢及TAC相关酶含量 |
| 2.4.3 HeLa细胞油红染色 |
| 2.4.4 敲低HeLa细胞的CPT1-A |
| 2.4.4.1 CPT1-A shRNA干扰引物的设计与退火 |
| 2.4.4.2 pLL3.7-puro载体的酶切及去磷酸化 |
| 2.4.4.3 pLL3.7-puro与退火引物的连接与转化 |
| 2.4.4.4 重组干扰质粒的鉴定 |
| 2.4.4.5 重组干扰质粒转染293T细胞 |
| 2.4.4.6 病毒上清感染HeLa细胞 |
| 2.4.4.7 CPT1-A干扰效果的检测 |
| 2.4.5 干扰CTP1-A对MED升高ATP的影响 |
| 2.4.6 干扰CTP1-A对MED诱导ROS升高的影响 |
| 2.4.7 干扰CTP1-A对MED抑制HeLa细胞生长的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MED升高HeLa细胞ATP水平 |
| 3.2 MED诱导的ATP升高非丙酮酸流向线粒体增加所致 |
| 3.3 MED诱导的ATP升高非谷氨酰胺分解增强所致 |
| 3.4 MED抑制脂肪酸合成并促进脂肪分解 |
| 3.4.1 MED抑制脂肪酸合成 |
| 3.4.2 MED加速脂肪酸β氧化 |
| 3.4.3 MED加速脂肪水解 |
| 3.5 MED加速TAC和OXPHOS |
| 3.6 CPT1-A干扰质粒的构建及干扰效果检测 |
| 3.6.1 重组质粒pLL3.7-puro-CPT1-A shRNA的鉴定 |
| 3.6.2 shRNA显着敲低CPT1-A |
| 3.7 敲低CPT1-A抑制MED诱导的ATP升高 |
| 3.8 敲低CPT1-A抑制MED诱导的ROS升高 |
| 3.9 敲低CPT1-A抑制MED诱导的HeLa细胞死亡 |
| 3.9.1 敲低CPT1-A升高MED对HeLa细胞的IC_(50) |
| 3.9.2 敲低CPT1-A抑制MED诱导的HeLa形态改变 |
| 第六章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1:缩略语及中英文全称 |
| 附录2:图索引 |
| 附录3:表索引 |
| 在学期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）尿酸氧化酶长效制剂的研制及体内外研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 PEG化尿酸氧化酶的制备 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和仪器 |
| 1.2.1 试验材料 |
| 1.2.2 仪器设备 |
| 1.3 PEG偶合条件研究 |
| 1.3.1 pH对修饰反应的影响 |
| 1.3.2 温度对修饰反应的影响 |
| 1.3.3 投料比对修饰反应的影响 |
| 1.4 分离纯化条件研究 |
| 1.4.1 离子交换色谱 |
| 1.4.2 超滤 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 PEG化尿酸氧化酶体外性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 分子量测定方法 |
| 2.2.1 电泳 |
| 2.2.3 SEC-HPLC |
| 2.3 修饰度检测方法 |
| 2.4 酶学性质研究 |
| 2.4.1 最适反应pH |
| 2.4.2 最适反应温度 |
| 2.4.3 活性检测方法及定义 |
| 2.4.4 米氏常数(Km)测定 |
| 2.5 体外37℃活性稳定性研究 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 PEG化尿酸氧化酶动物体内评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 药代动力学研究 |
| 3.2.1 试验材料及仪器 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 试验结果 |
| 3.2.4 结果分析 |
| 3.3 药效学研究 |
| 3.3.1 试验材料及方法 |
| 3.3.2 试验结果 |
| 3.3.3 结果分析 |
| 3.4 免疫原性评价 |
| 3.4.1 试验材料及方法 |
| 3.4.2 试验结果 |
| 3.4.3 结果分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在硕士期间所取得的科研成果 |
四、MALDI-TOF-MS法对重组人内皮抑素蛋白分子质量测定（论文参考文献）
- [1]中国上消化道癌高发区食管胃交界部癌（贲门癌）危险因素及预测预警标志物的多中心前瞻性研究[D]. 谢双华. 北京协和医学院, 2020
- [2]唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究[D]. 周小满. 江南大学, 2020(01)
- [3]聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基对其致敏性的影响[D]. 陆旭丽. 南昌大学, 2019(02)
- [4]泰山灰树花的驯化栽培及其抗细菌性咽炎活性物质的研究[D]. 刘姗姗. 山东农业大学, 2019(07)
- [5]SOD1的化学修饰及细胞递送研究[D]. 赵丹. 华中师范大学, 2017(06)
- [6]重组胶原蛋白的制备和区域稳定性研究[D]. 马良. 兰州大学, 2017(02)
- [7]大绿臭蛙皮肤分泌物中天然肽类化合物的分离、鉴定、合成及活性研究[D]. 杨坤玓. 南京中医药大学, 2016(06)
- [8]对转基因克隆牛乳脂肪球膜蛋白质及四种牛奶蛋白质组学研究[D]. 隋顺超. 中国农业大学, 2014(03)
- [9]Mycoepoxydiene抑制宫颈癌HeLa细胞生长的分子机制研究[D]. 金科华. 厦门大学, 2015(05)
- [10]尿酸氧化酶长效制剂的研制及体内外研究[D]. 张加慧. 浙江大学, 2014(02)