一、细胞周期调节基因蛋白与肿瘤发生的相关性（论文文献综述）
康维亭[1]（2021）在《长链非编码RNA PlncRNA-1通过启动子区的低甲基化调控miRNA-136-5p/Smad3轴促进膀胱癌进展的机制研究》文中提出1.研究背景膀胱癌（bladdercancer,BC）是我国泌尿外科临床上最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最为常见的组织学类型。在我国范围内,膀胱癌的发病率位居全身恶性肿瘤的第13位,其中男性膀胱癌患者的发病率位居第七位,女性膀胱癌患者的发病率居位第17位。而在全身恶性肿瘤中,膀胱癌的死亡率位居第13位,其中男性膀胱癌的死亡率位居1 1位,女性膀胱癌的死亡率位居16位。根据肿瘤细胞浸润膀胱肌层的程度可将膀胱癌分为两类:非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）。NMIBC是膀胱癌中最为常见的类型,约占膀胱癌患者的70%-75%,其余25%-30%的膀胱癌患者为肌层浸润性膀胱癌,甚至部分膀胱癌患者出现远处转移。NMIBC的主要治疗方式是经尿道膀胱肿瘤切除术,当具有复发和进展高危因素时可术后膀胱内灌注免疫制剂或化疗药物来预防肿瘤复发和进展。经尿道切除肿瘤联合膀胱内灌注卡介苗是NMIBC患者最常见的治疗策略,但是超过50%的患者会复发,10%至30%的NMIBC会发展成MIBC,甚至发生转移。而MIBC恶性程度高,其5年生存率仅为25%。然而,目前膀胱癌的发病机制仍未阐明,需要进一步的基础研究寻找新的靶点,为膀胱癌的治疗提供理论依据。上皮-间质转化（EMT）是一个多步骤过程,其中上皮细胞失去其上皮特性并获得间充质特性,从而使细胞具有迁移和侵袭特性。大量的体外和体内研究表明,EMT是包括膀胱癌在内的各种恶性肿瘤侵袭和转移的初始事件。EMT的启动和发展涉及不同的信号通路和信号串扰,在转录、转录后、翻译和翻译后水平受到调控。转化生长因子-β（TGF-β）通过SMAD途径和非SMAD途径来诱导EMT。其中TGF-β通过由Ⅰ型和Ⅱ型受体组成的四聚体复合物激活Smad2和Smad3,然后与Smad4结合。三聚体Smad复合体易位到细胞核中,并与转录调节因子协同作用,抑制或激活EMT转录因子。研究发现TGF-β通过Smad3/Smad4复合物介导Snail、E-cadherin、Zeb1和Twist等基因的表达。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,是涉及多种生物学过程的新兴调节剂之一。研究发现lncRNA通过多种途径参与广泛的生物学过程,包括增殖、粘附、侵袭、转移、干性、细胞凋亡、基因组不稳定性以及EMT。越来越多的证据表明多种lncRNA通过不同的途径参与膀胱癌的EMT。我们前期研究发现前列腺相关长链非编码RNA-1（PlncRNA-1）在前列腺癌组织及前列腺癌细胞中高表达。PlncRNA-1作为内源性竞争RNA通过miRNA-297-3p和miRNA-34c-5p调控雄激素受体的表达促进前列腺癌的发生发展。此外,PlncRNA-1还可通过TGF-β1调控前列腺癌的增殖和EMT。然而,目前缺乏PlncRNA-1在膀胱癌中的表达水平、生物学功能以及其作用机制的相关研究。在本研究中,我们旨在探讨PlncRNA-1在膀胱癌中的表达水平及其生物学功能,进一步阐释PlncRNA-1发挥调控作用的分子机制,为膀胱癌的临床诊断和预后提供潜在的分子标志物,同时为膀胱癌的靶向治疗及药物开发奠定了实验及理论基础。2.实验方法1)探讨PlncRNA-1的表达水平与膀胱癌患者的年龄、性别、病理分级和分期等临床资料的相关性。2)功能实验研究明确PlncRNA-1调控膀胱癌细胞增殖、EMT等生物学功能。3)探讨PlncRNA-1的表达水平受其基因启动子区域甲基化的调控。4)探讨PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展,为膀胱癌的诊疗提供新策略和新靶点。3.实验方法3.1 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值1)收集28对膀胱癌组织和癌旁组织,应用液氮冻存或者福尔马林固定组织。同时,收集患者的各种临床信息。2)应用Trizol提取冰冻组织中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析PlncRNA-1在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。3)应用R语言进行统计分析。T检验分析PlncRNA-1在各亚组中的差异表达。应用卡方检验分析PlncRNA-1高表达组和低表达组在不同亚组的差异分布。3.2 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT1)应用Trizol提取多株膀胱癌细胞（5637、T24、J82和RT4）中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测PlncRNA-1在多株膀胱癌细胞中的表达水平。2)设计和合成PlncRNA-1的小干扰RNA（siPlncRNA-1）,应用RT-qPCR验证siPlncRNA-1的干扰效率。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达水平,应用CCK-8实验检测细胞的增殖能力、克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力、划痕实验检测P细胞的迁移能力、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。4)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达水平,应用Western blot检测在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后EMT标志物蛋白的表差异达。5)在体内检测敲低PlncRNA-1对膀胱癌细胞增殖的调控。应用裸鼠进行皮下植瘤,称量种植瘤的体积和重量,绘制生长曲线,同时利用免疫组织化学技术（IHC）检测种植瘤中细胞增殖相关蛋白Ki-67的表达水平。3.3 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达1)生物信息学分析:应用Wanderer和Mexpress分析PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化修饰水平及其甲基化水平与表达水平之间的相关性。2)应用亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）探索PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化修饰位点。3)应用不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷（AZA）处理膀胱癌细胞,提取细胞DNA,应用亚硫酸氢盐转化试剂盒将胞嘧啶转化为尿嘧啶,然后进行一代测序,检测PlncRNA-1的基因启动子区域131位点的甲基化水平。同时提取细胞总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测AZA对PlncRNA-1表达水平的调控作用。4)随机选取6对膀胱癌组织,提取组织DNA,应用亚硫酸氢盐转化试剂盒将胞嘧啶转化为尿嘧啶,应用重亚硫酸盐测序法（BSP）联合一代测序,检测在膀胱癌组织中PlncRNA-1基因启动子区域131位点的甲基化水平。同时提取上述选取6对膀胱癌组织的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测在膀胱癌组织中PlncRNA-1的表达水平。3.4 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/smad3轴促进膀脱癌的进展1)应用Trizol提取28对冰冻组织中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR分析Smad3 mRNA在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。应用Pearson相关系数检测Smad3 mRNA和PlncRNA-1在膀胱癌组织中表达水平的相关性。同时应用IHC分析Smad3蛋白在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。2)应用FISH对PlncRNA-1在膀胱癌细胞中的亚细胞结构进行定位。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达后,应用RT-qPCR检测Smad3 mRNA的表达水平,同时应用Western blot检测Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。同时应用miRNA-seq检测敲低PlncRNA-1的表达后miRNA的差异改变,并对miRNA的预测靶标进行GO富集分析和KEGG富集分析。4)应用Trizol提取28对冰冻组织中的miRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR分析miRNA-136在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。5)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达后,应用RT-qPCR检测miRNA-136的表达水平。6)在膀胱癌细胞中敲低或过表达miRNA-136,应用RT-qPCR验证敲低或过表达的效率,应用RT-qPCR检测PlncRNA-1和Smad3 mRNA的表达水平,同时应用Western blot检测Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。7)构建PlncRNA-1野生型和突变型的质粒,在293T细胞中双转染质粒和miRNA-136模拟物,双荧光素酶实验验证PlncRNA-1可作为miRNA-136的竞争性内源 RNA。8)挽救实验:在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后,再敲低miRNA-136,应用Western blot检测Smad3蛋白、磷酸化Smad3蛋白和EMT标志物蛋白的表达水平。4.实验结果4.1 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值1)与配对的癌旁组织相比,发现PlncRNA-1在71.43%（20/28）的膀胱癌组织中明显高表达。2)亚组分析显示,PlncRNA-1在≥65岁组（p=0.048）、单发肿瘤组（p=0.049）、MIBC组（p=0.0075）和T3-T4分期组（p=0.019）中高表达。3)在膀胱癌组织中,根据PlncRNA-1表达水平的中位数,将膀胱癌分为PlncRNA-1高表达组和低表达组。在PlncRNA-1低表达组中,T1-T2分期占100%（14/14）,而MIBC分期占42.86%（6/14）。在PlncRNA-1 高表达组中,T1-T2分期占57.14%（8/14）,而MIBC分期占85.71%（12/14）。根据PlncRNA-1的表达水平,可以预测膀胱癌患者的肿瘤浸润程度和T期。4.2 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT1)在不同的膀胱癌细胞系中PlncRNA-1的表达水平存在差异,在5637细胞中表达水平最高,在T24细胞中表达水平最低。2)设计和合成PlncRNA-1的干扰RNA。与对照组相比,siPlncRNA-1可有效降低T24和5637细胞中PlncRNA-1的表达水平。3)PlncRNA-1可抑制膀胱癌细胞的增殖和克隆形成能力:CCK-8实验证明在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显抑制细胞的增殖能力。克隆形成实验进一步表明,敲低PlncRNA-1可明显抑制细胞克隆形成能力。4)PlncRNA-1可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力:应用划痕实验证明敲低PlncRNA-1可明显抑制膀胱癌细胞的迁移能力。Transwell实验证明敲低PlncRNA-1可明显抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。5)PlncRNA-1可调控EMT相关蛋白的表达水平:与对照组相比,敲低PlncRNA-1可明显下调N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达。6)体内研究表明敲低PlncRNA-1可明显抑制肿瘤的生长,降低肿瘤的重量,减小肿瘤的体积。免疫组织化学染色分析表明敲低PlncRNA-1可明显降低Ki-67蛋白的表达。4.3 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达1)应用Wanderer和Mexpress在线工具发现,在膀胱癌组织中PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化水平降低,且PlncRNA-1启动子区域的甲基化水平与PlncRNA-1的表达水平呈负相关。2)在膀胱癌T24和5637中,应用BSAS分析PlncRNA-1基因的转录起始位点（TSS,上游2000bp和下游1000bp）的甲基化水平。研究发现PlncRNA-1启动子的131位（位于21号染色体的36157603位）甲基化水平较高,且两株细胞的甲基化水平存在明显差异。3)BSP联合一代测序显示不同浓度的AZA处理膀胱癌细胞后可明显抑制PlncRNA-1启动子区域的甲基化。同时对BSP扩增的产物随机挑取10个单克隆进行一代测序,发现随着AZA浓度的升高,甲基化的单克隆数目越少。因此,AZA可以有效抑制PlncRNA-1启动子的甲基化水平。4)应用不同的AZA浓度处理膀胱癌细胞后,研究发现随着AZA浓度的升高,PlncRNA-1的表达水平也逐渐升高。5)随机选取6对膀胱癌组织和癌旁组织进行BSP和一代测序,发现在膀胱癌组织中PlncRNA-1启动子的131位甲基化水平明显低于癌旁组织。6)应用上述选取6对膀胱癌组织和癌旁组织进行提取总mRNA,进行RT-qPCR。发现在膀胱癌组织中PlncRNA-1的表达水平明显高于癌旁组织。4.4 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展1)在膀胱癌组织中Smad3mRNA和蛋白的表达水平明显高于癌旁组织。相关性分析表明,在膀胱癌组织中PlncRNA-1和Smad3 mRNA的表达水平存在强正相关（R=0.82,p=9.7e-08）。2)应用FISH发现PlncRNA-1主要分布在膀胱癌细胞的细胞核中,部分分布在细胞质中。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显下调Smad3 mRNA、Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。4)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后进行miRNA测序,发现有36个miRNA差异表达,其中has-miRNA-136-5p是差异倍数最大的miRNA。对miRNA的靶基因进行GO富集分析和KEGG富集分析发现,miRNA靶基因调节的生物学过程包括:转录,经典Wnt信号传导和细胞内信号转导。miRNA靶基因主要位于细胞核和细胞质。miRNA靶基因的主要分子功能包括蛋白质和DNA结合以及转录活性。miRNA靶基因主要参与的通路包括多个癌症途径、粘着斑、肌动蛋白细胞骨架的调节、mTOR信号传导途径、Wnt信号传导途径和转录活性。5)miRNA-136在膀胱癌组织中的表达明显低于癌旁组织相比（p=0.0078）。6)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显上调miRNA-136的表达。7)在膀胱癌细胞中敲低或过表达miRNA-136,RT-qPCR验证发现敲低或过表达miRNA-136的效果明显。同时发现敲低或过表达miRNA-136的表达可明显调控PlncRNA-1 mRNA、Smad3mRNA、Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。8)双荧光素酶报告基因检测发现miRNA-136可以与PlncRNA-1直接结合。9)挽救实验:在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后再次敲低miRNA-136。挽救实验发现敲低miRNA-136可部分恢复PlncRNA-1下调诱导的Smad3蛋白、磷酸化Smad3蛋白和EMT标志蛋白表达的变化。5.实验结论1)PlncRNA-1作为癌基因,在膀胱癌组织中过表达,其表达水平与肿瘤浸润、T分期、年龄和肿瘤数目相关。PlncRNA-1的表达水平可以在一定程度上用作膀胱癌患者肿瘤侵袭程度和T分期的预测指标。2)功能研究证实PlncRNA-1可调控膀胱癌细胞的增殖和EMT。3)在膀胱癌组织中PlncRNA-1启动子的131位点（21号染色体上的36157603）存在低甲基化修饰,而PlncRNA-1启动子的低甲基化可促进其自身表达的上调。4)机制研究发现PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展,为膀胱癌的诊疗提供新策略和新靶点。
陶冶[2]（2021）在《LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老》文中认为目的:细胞衰老是一种复杂的应激反应,是导致细胞生长停滞的一种不可逆状态,主要发生在细胞受到不同压力时,可以由多种不同因素（如复制应激、DNA损伤、氧化应激、癌基因诱导、化学疗法、线粒体功能障碍、表观遗传和旁分泌）所触发。恶性肿瘤是一种年龄相关疾病,是老年人主要的死亡原因之一。细胞衰老可以发生在不同的生理和病理过程中,在癌症治疗中,诱导细胞衰老是肿瘤发生发展的有效屏障,是重要的抑癌机制之一。随着抑癌机制研究的不断深入,通过诱导肿瘤细胞衰老来阻止肿瘤发展正逐渐受到重视,诱导肿瘤细胞衰老的具体生物学过程也越来越受到关注。长链非编码RNA（lncRNAs）通过在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达,在广泛的生物学过程中发挥着核心调节因子的作用。对lncRNAs重叠蛋白编码基因启动子区域的研究发现,许多lncRNAs都与细胞周期调控相关,这暗示了lncRNAs在不同生物学过程中以及在细胞命运最终决定过程中的潜在作用。近年来,十余种lncRNAs被发现与细胞衰老相关。有研究表明,lnc MEG3可以通过影响内皮细胞功能进而在调控血管内皮细胞衰老方面发挥重要的作用,所以深入探讨lnc MEG3在肿瘤细胞衰老过程中的作用机制,可能有助于揭示肿瘤细胞衰老与抑癌机制相互联系的分子基础,为诱导肿瘤细胞过程中lnc MEG3成为肿瘤治疗的新方向奠定基础。本课题组前期实验已经证实,在肿瘤细胞衰老过程中YAP出核增加,其表达受到抑制会导致细胞增殖能力下降。VGLL4是包含TDU结构域的VGLL家族转录辅因子（VGLL1-4）的成员,在多种肿瘤细胞中起到强大的抑癌作用,目前已有文献报道了在细胞增殖过程中,VGLL4作为一个共转录因子可以与YAP竞争性结合下游的转录因子。Lnc RNAs可以通过与miRNAs,m RNAs和蛋白质的相互作用在基因表达的表观遗传调控中起关键作用,而miRNAs也可以直接或间接地影响lncRNAs的表达水平。许多文献已经报道了lncRNAs通过发挥分子海绵的作用影响下游miRNAs的表达水平。越来越多的证据表明,lncRNA/micro RNA/m RNA调控轴参与了多种细胞生物学过程。鉴于诱导肿瘤细胞衰老的转录及转录后调控在基因表达中的重要作用,本实验旨在前期工作基础上明确lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴在依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老过程中的生物学作用,并进一步探索诱导肿瘤细胞衰老对于癌症治疗的重要意义。研究方法:1、体外培养肺腺癌A549细胞系及乳腺癌MCF-7细胞系,利用依托泊苷诱导并构建上述两种肿瘤细胞的衰老模型;2、利用SA-β-Gal染色验证上述建立的A549及MCF-7细胞模型的衰老程度;3、利用Western Blot检测细胞衰老过程中,衰老相关基因的表达变化,利用qRT-PCR检测衰老相关基因及衰老相关分泌表型基因的m RNA表达变化;4、利用流式细胞仪检测并验证依托泊苷诱导的A549及MCF-7细胞衰老模型的细胞周期阻滞情况;5、利用生物信息学分析并筛选依托泊苷诱导A549细胞衰老过程中的差异基因;6、利用qRT-PCR检测lnc MEG3的表达水平并检测lnc MEG3高或低表达对肿瘤细胞衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;7、利用免疫荧光法检测衰老过程中VGLL4的核定位情况;分离并提取细胞核、浆蛋白,利用Western Blot检测VGLL4在细胞胞浆及胞核中的表达情况;8、利用生物信息学方法预测lnc MEG3及VGLL4的靶micro RNA,利用双荧光素酶报告检测目的基因与靶micro RNA的结合情况;9、利用qRT-PCR及Western Blot检测miR-16-5p的表达水平并检测miR-16-5p高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因表达水平的影响;10、利用qRT-PCR检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因m RNA表达水平的影响;11、利用Western Blot检测VGLL4的表达水平并检测VGLL4高或低表达对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响;12、利用SA-β-Gal染色及Western Blot检测lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4调控轴的功能:对肿瘤细胞的衰老程度及衰老相关基因蛋白表达水平的影响。结果:1、低剂量依托泊苷可以诱导A549及MCF-7细胞衰老;2、LncMEG3在A549及MCF-7细胞衰老模型中表达升高;3、低表达lnc MEG3显着抑制A549及MCF-7细胞衰老,高表达lnc MEG3在一定程度上促进A549及MCF-7细胞衰老;4、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,共转录因子VGLL4与YAP形成竞争性抑制,VGLL4在细胞核内表达增加,在细胞内总表达水平上调;5、在A549及MCF-7细胞衰老模型中,lnc MEG3通过直接相互作用抑制miR-16-5p的表达;6、Mi R-16-5p参与了A549及MCF-7细胞的衰老过程;7、VGLL4在A549及MCF-7细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因;8、VGLL4参与了A549及MCF-7细胞衰老过程的调控;9、在A549及MCF-7细胞衰老过程中VGLL4的表达受lnc MEG3的调控;10、在A549及MCF-7细胞衰老过程中,lnc MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴发挥了调控作用。结论:1、在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3通过海绵效应与miR-16-5p结合并抑制miR-16-5p表达,进而解除miR-16-5p对VGLL4表达的抑制作用,最终影响肿瘤细胞衰老过程;2、肿瘤细胞衰老过程中VGLL4表达水平上调且受lnc MEG3的调控;3、肿瘤细胞衰老过程中存在VGLL4的细胞内异位。
孙新锋[3]（2021）在《芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究》文中研究表明背景:原发性肝癌是一个全球性的健康问题,其中90%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是第二位致死性肿瘤,5年生存率仅为18%,HCC早期可选择肝移植、手术切除或射频消融等根治性治疗,中晚期化疗栓塞/放射栓塞和全身系统治疗是仅存的治疗方法。和大多数肿瘤一样,HCC中存在干性癌细胞,即癌干细胞（cancer stem cell,CSC）,是具有无限增殖和分化潜能的一类特殊细胞群,特别是在HCC的复发转移过程中起着关键作用。癌干细胞标志物是一种特异性的信号分子或蛋白质受体,是利用其鉴定癌干细胞最简单的方法。很多研究表明癌干细胞表面标记物是影响HCC固有耐药性和侵袭转移能力以及调节其干性的关键因素。随着对癌干细胞的深入研究,越来越多的癌干细胞标记物被发现,在体内成瘤实验中确证过,常见的有EpCAM、CD133、CD44及SOX4等癌干细胞表面蛋白,这些标记物在上皮癌变过程中具有一定的促进作用,它的活化和显着表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。最近研究表明,HCC癌干细胞的存在是影响临床疗效导致HCC患者死亡的主要原因之一。中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶,具有毒副反应少、多组分、治疗靶点多、减毒增效等特点,能够优化HCC治疗早已形成共识,导师在传承的基础上,创新和发展传统中医宏观气血辨证论治思想,对芪术抗癌方治疗HCC宏观和微观物质基础进行了一系列研究,本方以由黄芪、莪术、炒白术、柴胡、白芍、鸡内金及炙甘草等药物组成。前期临床研观察发现,该方可显着提高HCC患者临床疗效,明显改善生存质量、减少肿瘤的复发和转移并提高患者的生存率。进一步研究发现该方能阻止癌细胞转移、诱导HepG2细胞凋亡、p53蛋白表达及p21细胞周期调控等;并通过调节JNKs信号通路促进HepG2细胞凋亡、阻止裸鼠HCC转移,及逆转TGF-β诱导的肝癌细胞EMT和干性特征减少癌细胞迁移等。故系统深入研究HCC癌干细胞的侵袭转移机制以及寻求新的治疗方法,是提高疗效、改善预后及延长生存率的关键环节。通过对癌干细胞的起源、生物学特征及作用和机制初步的阐述,进一步研究HCC转移和复发机制,探讨中药阻止HCC进展的疗效机制具有重要意义。目的:芪术抗癌方可能会影响癌细胞干性标志物表达从而影响HCC复发和转移;据此,本研究拟在导师前期工作基础上,（1）通过对HCC患者外周血淋巴细胞（PBMC）进行癌干性标志物高通量测序以验证主要干性相关标志物基因及SOX4的表达;（2）建立芪术抗癌方处理HepG2细胞损伤模型,验证芪术抗癌方对肝癌细胞株干性标志物表达的影响。（3）建立肝癌原位小鼠动物模型,验证芪术抗癌方对干性标志EpCAM、CD133、CD44表达和对SOX4基因表达的影响。本研究结果,有望在肿瘤干性标志物方面初步阐释芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效作用机制,为中药抗癌制剂的研发和广泛的临床应用提供理论和实验依据。方法:第一部分:收集正常对照人群、HCC患者血液标本,通过PBMC高通量测序及蛋白芯片表达,研究不同分期分级HCC患者之间干性标志及SOX4表达差异,并与正常对照人群进行对比分析。1.经医院伦理委员会批准依据我国《原发性肝癌诊疗规范》（2017年版）选择确诊为肝细胞癌患者,共80例,其中年龄在30岁至70岁之间,平均年龄51.2岁。根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期,80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;为了进一步区分HCC组癌干性基因表达,我们选取了正常对照组,随机入组50例正常人群作为对照组,同时对入组进行统计学分析。2.对入组者进行外周血单个核细胞（PBMC）提取A.使用量约5ml的EDTA抗凝真空采血管进行血液采集,上下颠倒与抗凝剂混合均匀后放入4℃冰箱保存,并在2小时内完成PBMC提取。B.对入组标本进行RNA提取与检测,包括Trizol法提RNA,Thermo试剂盒法进行细胞裂解、RNA萃取、RNA清洗、Elute RNA、RNA检测,对文库构建与质控,库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina 测序。C.数据对比分析:采用Subread软件中的FeatureCounts工具对基因进行表达水平的定量,FeatureCounts主要使用-Q 10-B-C参数,分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上的reads,比对到基因组多个区域的reads。3.随机抽取36例肝癌患者和对照组血浆标本进行蛋白数据进行分析,包括原始数据归一化,差异蛋白筛选,差异蛋白聚类等基础分析。第二部分:芪术抗癌方体外、体内实验研究1.芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达影响的体外肝癌细胞研究通过体外实验,观察芪术抗癌方是否影响TGF-β1诱导的肝癌细胞干性标志物表达。利用TGF-β1诱导Huh7细胞干性表达,加入芪术抗癌方浸提液共培养,Western blot检测癌细胞干性相关蛋白表达水平,验证芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达的影响。2.芪术抗癌方对癌细胞干性标志及SOX4基因表达影响的体内肝癌动物模型研究2.1肝癌原位模型造模小鼠肝包膜下种植SMMC7721-luc制备肝癌模型,4周后进行活体成像仪查看荧光情况来确认小鼠是否造模成功。2.2分组用耳标法将30只肝癌模型小鼠和5只空白小鼠进行编号,然后将肝癌模型小鼠随机等量分为5组（肝癌模型组、索拉非尼组、芪术抗癌低剂量、中剂量、高剂量组）。空白小鼠则做为对照组。2.3取材给药30天后用安乐处死小鼠,剪开小鼠腹部皮肤2cm,分离肌肉,取出小鼠肝脏、拍照。然后肝脏和肿瘤备用。2.4 HE染色及免疫组织化学染色2.5 PCR定量检测根据实验说明书从肝脏肿瘤组织中提取的总RNA,以RNA为模板,按照说明书配制逆转录反应体系,总体积为20μl,37℃,60min;98℃,10min,合成cDNA第一链,并收集备用;加入特定引物,在PCR反应条件下:94℃ 2min,94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 20s,40循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线分析证实。基因表达相对定量与ΔΔCt方法实现（Ct值）。2.6肝癌组织标本进行Western Blot和免疫组化检测。结果:第一部分:收集健康对照组、肝细胞癌患者血液标本,通过PBMC基因测序及蛋白芯片表达,对比健康对照组与HCC、HCC不同分期组之间干性标志物基因、蛋白及SOX4基因表达。本研究中对纳入的80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;同时纳入50例健康人群作为对照组。通过采用RNA-Seq对HCC患者和正常健康对照组外周血淋巴细胞（PBMC）进行高通量测序,及生物信息学方法分析,发现在HCC患者和健康对照者验证队列中,使用qRT-PCR对9个干性基因表达进行验证对比发现,在两者组人群中都存在 CD13、CD24、CD44、CD47、EPCAM、CD133、SOX2、SOX4、CD90等基因表达,并且以CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4表达更显着。对HCC巴塞罗那分期0-B期和C-D期,进一步进行RNA-Seq测序结果分层分析比较,发现在9个癌干性基因表达中,CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4、EpCAM在两组中亦均明显表达,同时发现C-D级较0-B期HCC患者CD133基因表达更为显着,而EpCAM表达0-B期较C-D期患者基因表达有较为明显的表达,同时我们还发现在两组患者中具有同等水平的SOX4的表达。HCC患者和对照组的干性基因表达聚类图进一步分析发现,SOX4基因在HCC组呈现明显的高表达,同样HCC患者PBMC中CD24、CD47、CD13基因表达和健康对照组比较存在显着差异。通过HCC患者血浆蛋白芯片检测,发现HCC患者存在CD44、EpCAM基因高表达。本研究部分,通过RNA-seq技术及血浆芯片蛋白检测技术,确证人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关。第二部分:通过体外、体内实验观察芪术抗癌方对癌干细胞中CD133、CD44、EpCAM及SOX4表达的影响,初步探讨在癌干细胞方面中医药治疗肝癌的作用。1.芪术抗癌方对Huh7肝癌细胞干性标志表达的影响我们体外研究发现,通过对TGF-β1诱导的癌细胞干性标志基因蛋白表达发现,芪术抗癌方干预Huh7肝癌细胞后,能抑制EpCAM和CD133表达,表明该中药复方可以在体外通过抑制癌细胞中EpCAM和CD133干性表达而阻止HCC进展。2.芪术抗癌方对肝癌动物模型癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响EpCAM、CD133、CD44、SOX4等细胞表面蛋白的活化和高表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。我们已对HCC患者PBMC进行了高通量测序研究,发现EpCAM、CD133、CD44、SOX4等干性相关基因,在HCC患者PBMC中表达,及体外实验亦证实了芪术抗癌方可以抑制部分干性标志及SOX4基因表达。由此,我们进行了进一步体内实验研究,验证芪术抗癌方对HCC癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响,初步探索芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效机制。我们对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色研究分析,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉菲尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方可以通过影响癌细胞干性标志物表达从而阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关。结论:在本研究中,首先通过对临床HCC患者PBMC进行RNA-seq及血浆芯片蛋白检测研究,发现了人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关,而中医药可能通过调节SOX4基因影响干性标志表达。其次,通过体外实验研究发现芪术抗癌方可影响Huh7肝癌细胞中CD133、CD44、EpCAM干性标志表达。最后,我们通过对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色分析研究,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉非尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方在体内外实验中能通过影响癌细胞干性标志物表达阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关,为芪术抗癌方进一步深入的疗效机制研究提供了较好的临床及试验证据,为中医药在HCC治疗的临床广泛应用提供了研究依据。
乐露露[4]（2021）在《子宫内膜癌关键基因的筛选及分子机制研究》文中研究表明背景与目的:子宫内膜癌（Endometrial Carcinoma,EC）是来源于子宫内膜上皮的一组恶性肿瘤。EC的发病率和死亡率正在逐年上升,严重威胁妇女的健康。目前治疗的方案主要是以手术为主,其次是以放疗、化疗、激素治疗等辅助手段进行综合治疗。最近几年,早期诊断,手术,放疗和化疗可以显着改善治疗效果,但对治疗早期病灶并需要保留生育能力,晚期和复发的患者仍然有限。因此,探寻子宫内膜癌发生、发展及耐药的潜在分子机制,寻找新颖的生物标志物和有效的治疗靶点迫在眉睫。当今临床面临的最大挑战之一是开发可临床应用且功能强大的生物标记物,以预测预后并选择更可能受益患者的治疗。为了改善子宫内膜癌的治疗预后,需要发展可独立预测的更强大的生物标志物。子宫内膜癌的演化是一个多基因参与,多步骤发展的过程,主要与原癌基因的激活与抑癌基因的丢失或突变有关。目前多种原癌基因和（或）抑癌基因的发现能部分阐明肿瘤的发生机制。如果这些基因能够合理的解释肿瘤的某些生物学行为,为进一步临床治疗提供依据,那么这些基因有可能成为未来肿瘤治疗的靶点,而深入研究这些基因的作用机制及功能则是重要前提。由于芯片和高通量测序技术的广泛应用,积累了越来越多的有关肿瘤研究领域的基因组学数据,这些数据库为肿瘤学的研究提供了一定的便利。由于子宫内膜癌发病机理复杂,参与EC的发生和发展的关键基因尚不完全清楚。因此,本研究的目是运用生物信息学筛选全基因组差异表达基因和子宫内膜癌信号通路中的关键基因,探讨EC发病机制和预后的潜在生物标志物,为EC的早期筛查和靶向治疗提供理论依据。实验方法:1.数据处理:我们基于癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合（GEO）数据库中子宫内膜癌的数据进行生物信息学综合分析,我们对3个独立的数据集的可用转录组数据进行了综合分析,鉴定出差异表达基因（differentially expressed Genes,DEGs）。信号通路筛选和评估成髓细胞瘤转录因子第2亚型（MYB proto-oncogene like 2,MYBL2）基因表达水平与临床病理特征和生存的关系。2.临床验证:通过免疫组织化学染色方法验证子宫内癌组织中MYBL2基因的表达情况,与临床病理特征的关系。3.细胞增殖实验:建立了两个代表性的EC细胞模型,观察sh-MYBL2抑制MYBL2表达时EC细胞的增殖能力。RNA-seq实验技术分析MYBL2沉默对子宫内膜癌细胞模型转录组的影响。结果:1.TCGA联合GEO数据库（3个数据集）共筛选出5个DEGs,即ASPA、MYBL2、TROAP、CCNB2和CDC25C（P均<0.05）;5个DEGs中,MYBL2高低表达EC患者总生存期（Overall Survival,OS）和无病生存期（Disease-free Survival,DFS）差异有统计学意义（P<0.05）,且组织低分化、Ⅱ型EC患者MYBL2基因高表达比例分别高于高分化、Ⅰ型患者（P均<0.05）。2.本研究通过子宫内膜癌信号通路的筛选,发现MYBL2在B-MYB/FOMX1信号通路起重要作用。子宫内膜癌经典信号通路中关键基因EGF、IGF、TGF在子宫内膜癌中低表达,且与子宫内膜癌的生存无关,最终筛选出关键基因MYBL2。3.MYBL2在子宫内膜癌中存在明显的拷贝数变异（copy-number variation,CNV）（p<0.001）,主要的变异形式为基因扩增,且拷贝数的扩增明显上调了MYBL2 m RNA表达水平（p<0.001）,携带MYBL2基因CNV的子宫内膜癌患者OS与DFS均明显低于不携带该基因CNV的患者（P<0.05）。II型子宫内膜癌中MYBL2的CNV变异更显着（P﹤0.05）。4.MYBL2的高表达与子宫内膜癌的病理类型、病理分期和不良预后有关（P<0.05）,与患者患病年龄、月经情况和FIGO分期无显着性关联（P>0.05）。5.临床验证结果发现子宫内膜癌组织中MYBL2蛋白的表达量明显高于对应癌旁正常子宫内膜组织,且在癌组织中表达的阳性率高于癌旁组织（P<0.05）。MYBL2在子宫内膜癌组织中过表达,与不同病理类型、组织分级和有无淋巴结转移有关（P<0.05）。6.MYBL2基因表达的下调可以显着抑制子宫内膜癌细胞系HEC-1-B和AN3CA体外细胞增殖,并使子宫内膜癌细胞阻滞在G1期,诱导子宫内膜癌细胞凋亡。7.RNA-seq技术和通路富集分析,发现MYBL2与细胞周期和细胞凋亡这两个通路密切相关,可以激活与细胞增殖有关的基因表达。结论:1.子宫内膜癌全基因组差异性表达分析,发现MYBL2在子宫内膜癌中高表达,且与不良预后相关,因此MYBL2基因是子宫内膜癌发生发展的关键基因。2.本研究首次发现,MYBL2基因在子宫内膜癌组织中存在明显拷贝数的扩增,拷贝数的扩增影响其表达和生存,说明MYBL2的DNA变异促进了子宫内膜癌的发生和发展。3.子宫内膜癌组织中MYBL2呈高表达,且与不良临床病理特征相关,提示MYBL2可能在肿瘤发生、发展和转移过程中起着重要的作用。4.MYBL2可能通过调控细胞周期,促进细胞增殖,抵抗凋亡,在子宫内膜癌细胞的增殖中起关键作用,说明MYBL2在子宫内膜癌进展中发挥其致癌作用。5.MYBL2可能作为一种新的EC患者预后和治疗指标的生物标志物。
饶敏[5]（2021）在《hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究》文中指出背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,是全球第三大癌症致死原因。我国胃癌的发病率及死亡率均高于世界平均水平。胃癌病程隐匿,目前早期诊断及治疗的手段仍有局限。circRNA成为近年肿瘤研究的热点,其可作为竞争性内源RNA与miRNA结合,参与相应mRNA的表达调控。circRNA-miRNA-mRNA网络这一全新基因表达调控模式与肿瘤包括胃癌的发生发展关系密切。而外泌体中的circRNA,存在于肿瘤微环境及各种体液中,不仅是肿瘤细胞与其微环境之间信息交流的桥梁,也因其方便检测而被认为是潜在的肿瘤生物标志物。许多研究已经探索了它们在胃癌诊断以及新型治疗中的可能应用。近年来,多项高通量分析关注了胃癌组织和体液中差异表达的circRNA（DE circRNA）,但血浆外泌体目前尚无研究报道。因此,本研究希望通过高通量RNA测序检测出胃癌患者血浆外泌体中的DE circRNA,进而通过体内外功能实验筛选出在胃癌进展中发挥重要功能的circRNA,从而帮助阐明胃癌的发病机制,并为胃癌的诊断和治疗提供新的线索。研究方法:（1）使用exoEasy Maxi Kit（Qiagen）从胃癌（GC）患者及健康对照（HC）血浆中分离外泌体,通过Western blot和透射电子显微镜对外泌体性状进行鉴定;而后通过高通量RNA测序和生物信息学分析,筛选外泌体中差异表达的circRNA;并通过GO和KEGG分析预测DE circRNA可能的发挥的功能和参与的信号通路;通过RT-q PCR对高通量测序结果加以验证,并筛选出进行功能研究的circRNA。（2）通过统计学分析评估GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。（3）利用circBase数据库查询（http://www.circbase.org）hsa＿circ＿0014606的序列、亲本基因及染色体定位。使用NCBI的基因组工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）进行基因组序列比对。利用Circ Bank数据库（http://www.circbank.cn/）查询hsa＿circ＿0014606的翻译和修饰信息。（4）构建过表达和敲减hsa＿circ＿0014606的慢病毒载体,包装慢病毒,感染GC细胞建立稳定细胞株。通过CCK8实验检测GC细胞增殖;通过Annexin VAlexa Fluor 488/PI染色检测细胞凋亡;通过划痕愈合实验检测细胞迁移能力;通过基质胶包被的Transwell实验检测细胞侵袭能力。（5）使用PMA刺激THP-1细胞使其分化为M0巨噬细胞,与GC细胞外泌体共培养后通过RT-q PCR检测M1巨噬细胞的标志性分子IL-12和i Nos,以及M2巨噬细胞的标志性分子IL-10和Arg-1,从而确定巨噬细胞的极化方向。（6）通过生物信息学分析预测hsa＿circ＿0014606的靶标miRNA及其下游靶基因;双荧光素酶报告实验验证它们之间的结合和相互作用。（7）使用NCD免疫缺陷小鼠构建了GC移植瘤模型以确定hsa＿circ＿0014606在体内对GC细胞成瘤的影响,及其对靶标miRNA及其下游靶基因的影响。研究结果:（1）我们采集了5名GC患者和5名健康供者的外周血样本,并从血浆中成功分离出外泌体。通过高通量RNA测序,在所有血浆外泌体样品中共检测到67,880个circRNA,筛选出1,060个在GC中差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。（2）GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。（3）RT-q PCR结果显示选定的6个上调的circRNA在GC细胞和/或GC组织中显着上调;其中hsa＿circ＿0014606上调最为稳定及显着。（4）GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。（5）hsa＿circ＿0014606来自YY1AP1（YY1 associated protein 1）基因,为外显子-内含子circRNA（EIciRNA）。其可能具有编码蛋白质的能力。（6）体外实验证实过表达hsa＿circ＿0014606促进GC细胞增殖、迁移和侵袭;敲减hsa＿circ＿0014606促进GC细胞凋亡。（7）AGS细胞外泌体能够促进THP-1细胞向M2巨噬细胞方向极化;过表达hsa＿circ＿0014606后的AGS细胞外泌体进一步促进了M2极化,而敲减hsa＿circ＿0014606则抑制了M2极化。（8）miRNA-194-5p是hsa＿circ＿0014606的靶miRNA,其在GC组织中表达下调,在AGS细胞中过表达hsa＿circ＿0014606可显着抑制其表达。（9）双荧光素酶报告实验证实hsa＿circ＿0014606可与miRNA-194-5P结合。（10）YAP1被预测为miRNA-194-5p的靶基因,双荧光素酶报告实验证实YAP1可与miRNA-194-5p结合,后者能够促进其转录本降解。（11）hsa＿circ＿0014606促进AGS细胞NCD小鼠体内成瘤,且可下调miRNA-194-5p并上调YAP1的表达。结论:通过高通量RNA测序,我们在GC患者血浆外泌体样品中筛选出1,060个差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了与GC发生发展密切相关的生物过程和通路,如细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。RT-q PCR证实了高通量测序的结果,且提示血浆外泌体中表达上调的circRNA很可能来自肿瘤组织和细胞。hsa＿circ＿0014606在GC组织和细胞中上调最为显着,其在患者血浆外泌体中的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。功能研究表明hsa＿circ＿0014606可能作为miRNA-194-5p的海绵,上调YAP1的表达,在GC细胞内发挥促进增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡的功能,并可进入GC细胞外泌体促进共培养的巨噬细胞向M2表型极化,从而促进GC的发生发展。
卢本兆[6]（2021）在《基于生物信息学分析HOXD11在脑胶质瘤中的生物学功能和意义》文中认为背景和目的:胶质瘤来源于神经胶质细胞,包括多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞肿瘤、室管膜细胞肿瘤、髓母细胞瘤及其它来源的胶质瘤。现已是成人中枢神经系统肿瘤中最高发的原发性恶性肿瘤,世界卫生组织（WHO）将胶质瘤分为四级,将WHOI、Ⅱ级的胶质瘤归为低级别胶质瘤,WHOⅢ、Ⅳ级归为高级别胶质瘤,约占颅内肿瘤的60%,预后极差,中位生存期仅15个月左右。在临床治疗上,主要采用传统手术切除+术后化疗及放疗,但治疗作用效果仍不理想。研究发现脑胶质瘤的发生及恶性进展与基因的改变密切相关,其发生发展过程涉及基因突变、转录调节、甲基化修饰等的不同环节。对肿瘤相关基因进展研究,是肿瘤诊断和治疗的重要突破。同源盒基因（HOX gene）是决定发育的主要调节基因,越来越多研究发现HOXD11与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,如口腔鳞状细胞癌、咽部鳞状细胞癌、前列腺癌等,但HOXD11在脑胶质瘤中作用研究较少,本文整合公共肿瘤数据库的胶质瘤病例数据并进行综合分析,探究HOXD11在胶质瘤表达情况及其对预后的影响,对HOXD11在胶质瘤中参与的信号通路及分子机制进行预测,探索HOXD11作为胶质瘤预后预测因子和治疗靶点的可能性。方法:通过GEAIP网站分析HOXD11在人体肿瘤组织中表达水平,下载并分析国际肿瘤基因图谱（TCGA）中脑胶质瘤的mRNA数据,分析目前研究较少的HOXD11的表达情况,筛选出胶质瘤病例与正常样本之间的差异表达基因（DEGs）。同时应用RT-PCR检验HOXD11在正常组织及U251、U118MG人脑胶质瘤细胞系的表达水平。接着分析TCGA及CGGA数据库中HOXD11在不同分级胶质瘤、IDH1基因状态及1p/19q联合删失状态表达水平比较,运用K-M生存分析法探究HOXD11表达水平与胶质瘤患者预后关系,COX回归模型进行单因素及多因素分析进一步验证HOXD11对预后预测价值,受试者工作特征曲线（ROC）检验其预后预测效能。采用GO及KEGG分析HOXD11参与生物学功能及参与肿瘤形成的相关通路分析。结果:TCGA数据库中基因表达谱分析表明在胶质瘤组织中HOXD11 mRNA表达水平较正常组织上调,差异具有统计学意义（p<0.05）,同时应用荧光定量PCR显示人脑胶质瘤细胞株U251及U118MG中HOXD11 mRNA表达量较正常脑组织增高（p<0.05）。对TCGA及CGGA数据进一步分析显示,HOXD11 mRNA表达水平与胶质瘤WHO分级、IDH1基因突变状态、1p/19q联合删失状态相关（p<0.001）。HOXD11高表达往往提示胶质瘤患者总生存期（OS）较短,单因素及多因素回归分析显示HOXD11是影响胶质瘤患者预后的独立预测因子,且能较为准确预测胶质瘤患者预后。GO分析显示HOXD11参与的生物学过程包括新生血管形成、细胞分裂等过程,KEGG富集分析显示HOXD11通过P53信号通路及细胞周期调控等途径促进胶质瘤进展及影响患者预后。结论:HOXD11在脑胶质瘤中呈高表达状态,且在不同WHO分级、IDH基因突变状态、1p/19q染色体删失状态的表达具有显着差异,可作为预测胶质恶性程度指标之一。在临床预后方面,HOXD11高表达提示患者总生存期较短,是影响胶质瘤患者的独立预后因素,其可能通过p53信号通路、细胞周期、微血管血管形成等途径影响肿瘤进展。
陈媛媛[7]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中进行了进一步梳理一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
杨兴玲[8]（2021）在《PYCR1在肺癌中的表达与预后价值分析及其生物学功能研究》文中研究指明背景:肺癌是全球发病率与死亡率最高的癌症,以外科切除为主的治疗方式对于部分IA期非小细胞肺癌患者术后五年生存率可达70%以上,然而对于晚期肺癌患者,5年生存率不到10%,以手术为主的治疗方案治疗效果仍不满意,对肺癌的发生发展过程及潜在机制的更深层次的研究,有助于我们更好的理解肿瘤发生与发展背后潜在的原因,并有望针对潜在的抗肿瘤靶点开发出高效的抗肿瘤治疗手段。近年的研究证实,细胞代谢酶在肿瘤中具有调节基因表达,影响细胞周期,DNA损伤修复,调节细胞增殖,存活,凋亡,以及在肿瘤微环境重建中具有重要作用,有研究表明,在肿瘤中,氨基酸匮乏会特异性引起脯氨酸合成途径过度激活,这可能导致肿瘤代谢重编程,并对肿瘤的生物学行为产生影响。吡咯啉-5-羧酸还原酶-1（Pyrroline-5-carboxylate reductase-1,PYCR1）为脯氨酸合成途径的关键酶,其表达变化引起的脯氨酸代谢途径优劣势可能影响肿瘤的生物学行为并影响肿瘤患者的生存预后,其可能成为潜在的抗肿瘤靶点或成为肿瘤预后评估的指标。近年有研究陆续报道PYCR1在结直肠癌,肝癌,肾癌等肿瘤组织中表达明显上调,并能够调节细胞增殖,转移,侵袭等,但其影响肿瘤生物学行为的直接机制及深入分析研究报道甚少,目前尚无关于PYCR1对肺癌患者预后影响的报道。PYCR1作为一种细胞代谢酶,对其更深入广泛的研究有助于我们更好的理解细胞应激调节下的代谢重编程在肿瘤发生发展中的作用及影响机制。目的:1.分别从mRNA水平,蛋白水平,表观遗传修饰水平研究PYCR1是否在肺癌患者中发生显着变化,并分析其在不同肺癌群体中的表达水平差异情况来研究其表达水平是否受个体因素影响2.通过对肺癌中PYCR1及其共表达基因网络进行功能富集分析及构建蛋白质互作网络来广泛地研究其在肺癌中可能参与或调节的生物学过程并提出其对肿瘤生物学行为影响的可能机制3.通过生存分析评价PYCR1及其同工酶PYCR2,PYCRL表达水平对肺癌患者总生存期,初次复发时间,复发后生存期的影响及其作为肺癌患者预后评价及复发预测指标的价值4.通过RNAi,Western-Blot等方法对PYCR1在肺癌中对细胞自噬现象的影响作初步研究方法:1.使用ULCAN对PYCR1在肺癌中及在肺癌患者不同群体中的表达水平进行差异分析。TCGA中515例原发肺腺癌组织与59例正常组织的RNAseq数据经R3.2.2TCGA-Assembler及PERL程序进行下载和转换,得到每百万量级转录本的基因表达值（transcripts per million,TPM）,同时从Genomic Data commons下载患者的包含肿瘤分期,病理类型,淋巴结转移状态,吸烟状态,TP53突变状态等临床信息。蛋白质表达水平数据来自CPTAC蛋白质组学数据库,包含111例肺癌组织与111例正常组织的PYCR1蛋白表达数据。ULCAN对PYCR1mRNA表达水平,蛋白表达水平,启动子甲基化水平进行亚组分析,结果以箱线图表示,包含了每组的表达水平四分位数,并对各组间进行Student’s t test统计学差异分析。2.通过ULCAN确定PYCR1及其共表达基因,对PYCR1及其534个共上调表达基因与197个负表达相关基因使用Metascape进行基因功能注释,并以KEGG通路等为来源根据系统计算的P值进行基因功能富集分析,以-log10（P）值衡量富集程度,分析前20条通路,同时更具富集条目相似性对富集结果使用Cytoscape可视化,同时对输入的基因列表使用STRING,Bio Grid,Omni Path,In Web＿IM进行蛋白质互作网络构建,以MOCODE识别并划分为不同的网络模块并进行功能富集分析。3.对来自GEO,TCGA数据库的肺癌患者基因表达数据及临床预后信息使用K-M plotter进行生存分析,对基因表达值以Best cutoff值划分为高表达与低表达组,对两组生存率以Log-Rank进行统计学差异分析。4.应用免疫组织化学法对肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中PYCR1表达情况进行检测,应用免疫印迹法对肺癌细胞系A549,95D与人正常气道上皮细胞系BEAS-2B中的PYCR1蛋白表达情况进行检测,通过RT-PCR检测了肺癌细胞系与正常气道上皮细胞系中PYCR1mRNA表达情况。通过转染PYCR1si RNA构建PYCR1表达下调的肺癌细胞系A549,NCI-H1299,采用免疫印迹法检测了细胞自噬及其可能的上游信号通路相关分子LC3A/B,Phospho-Beclin1（Ser93）,Phospho-ULK1（Ser555）,及Phospho AMPKα,p70S6K,通过免疫荧光法检测了A549细胞系正常对照组与PYCR1表达干扰组的LC3A/B蛋白表达情况。通过转染mRFP-GFP-LC3腺病毒观察A549细胞系正常对照组与PYCR1干扰组自噬流强弱。结果:1.A)TCGA数据库中肺腺癌等24种肿瘤类型的癌组织中PYCR1mRNA表达水平均较正常组织上调。B)TCGA数据库515例肺腺癌组织与59例正常组织及不同临床特征患者PYCR1表达水平进行分层差异分析,肺腺癌组织PYCR1表达较正常组织明显升高,P值为:1.62E-12。41-60岁肺腺癌患者较61-80岁,81-100岁肺腺癌患者PYCR1表达水平升高,P值为:5.96E-04,2.70E-02。吸烟组较不吸烟组,戒烟组患者PYCR1表达平均水平升高,p值分别为:7.50E-05,3.83E-05,3.16E-02,戒烟组患者吸烟时间大于15年患者与小于15年患者PYCR1表达水平具有显着性差异,P值为:4.56E-03,不吸烟组与吸烟大于十五年已戒烟患者组PYCR1表达水平具有显着性差异,P值为:5.54E-03。各分期组间患者PYCR1表达水平无统计学差异,白种人,黑种人与亚裔种族患者组间无统计学差异,男性组与女性组间无统计学差异,混合亚型组较粘液型及非粘液型细支气管肺泡腺癌组PYCR1表达水平升高,P值为:2.31E-02,1.45E-02,实性成分为主腺癌较腺泡型腺癌PYCR1表达水平升高,P值为:3.46E-02,肺乳头状腺癌PYCR1表达水平较粘液型腺癌组高,P值为:4.11E-02。PYCR1表达水平在不同淋巴结状态患者之间无明显差异。TP53基因突变组较TP53未突变组PYCR1表达水平升高,P值为:3.58E-06。肺腺癌患者组较正常组PYCR1启动子甲基化水平无统计学差异。4期组较正常组PYCR1启动子甲基化水平减低,P值为:2.06E-02,4期组较1期组PYCR1启动子甲基化水平减低,P值为:1.46E-02。肺腺癌非裔组较正常组,肺腺癌白人组,亚裔组,PYCR1启动子甲基化水平减低,P值分别为:1.18E-04,2.03E-07,3.31E-02。PYCR1启动子甲基化水平与性别不相关。C)PYCR1启动子甲基化水平无年龄组间差异。肺癌吸烟组较正常组PYCR1启动子甲基化水平降低,P值为:5.25E-03,肺腺癌吸烟时间大于15年的戒烟患者组较肺腺癌不吸烟患者中PYCR1启动子甲基化水平高,P值为:3.12E-02。淋巴结转移状态:各组间无统计学差异。D)使用ULCAN数据库对111例肺腺癌组织与111例正常组织PYCR1蛋白表达水平进行差异分析及不同临床特征患者间进行分层差异分析,肺腺癌组较正常组PYCR1蛋白表达水平高,P值为:2.75E-3。肺腺癌各分期组间PYCR1蛋白表达水平无统计学差异,不同性别患者PYCR1蛋白表达无差异,41-60岁组患者较61-80岁组患者表达水平高,P值为1.61E-02。肥胖组较超重组PYCR1蛋白表达水平升高,P值为7.10E-06。组织学3级组较组织学2级组PYCR1表达水平升高,P值<1E-12。2.通过UALCAN网站确定了534个上调共表达基因,197个下调共表达基因,使用Metascape对PYCR1及共表达基因进行富集分析,富集到的生物学过程及细胞成分包括:Mitochondrial matrix线粒体基质,nc RNA metabolic process非编码RNA的代谢过程,lymohocyte activation白细胞的活化,Golgi-associated vesicle membrane高尔基囊泡。并在Immunologic Signatures中富集到了抗原刺激后免疫细胞活化与表达受调控的相关基因序列。对PYCR1及其共表达基因构建蛋白质蛋白质互作网络,并对各模块进行富集分析:与PYCR1具有直接作用关系的蛋白包括PYCR3,COPG1,ARCN1,COPA,CAD,HTRA2,CCT7,STIP1,PSMC5,MDH2,TBRG4,LONP1,MRM1,CHCHD1,MRPL58,PAICS,PYCR2等17个分子,PYCR1与这些分子直接作用可能参与或调节这些分子的生物学功能,对肿瘤的影响需结合这些分子的具体生物学特性及功能进一步分析,PYCR1可能在调节细胞凋亡,调节线粒体基因表达及维持线粒体基因组完整性方面具有一定作用,但仍需进一步研究。蛋白质互作网络中共生成了主要10个MCODE,对10个MCODE进行功能富集分析,他们参与的生物学过程主要包括:细胞分裂过程,核糖体蛋白复合物的生成,核糖体的生物发生,RNA的代谢,线粒体翻译,线粒体氧化呼吸链的组装,蛋白质定位到染色体的端粒区域,泛素连接酶的活性,UTP生物合成过程,PRC1复合体,Pc G蛋白复合物,IκB-α磷酸化,TLR通路信号级联反应,细胞增殖的调控,整合因子复合体。3.PYCR1高表达与肺癌患者较差的总生存期,疾病进展,及进展后生存期有关,PYCR2的表达水平对肺癌患者总生存期,疾病初次进展时间,疾病进展后生存期的影响与PYCR1相反,但PYCR2生存分析假设检验校正FDR值大于5%,PYCR2对肺癌患者生存的影响不具备统计学意义,PYCRL对肺癌患者的总生存期,疾病进展,进展后生存期无显着影响。对SLC25A10等100个共上调表达基因进行生存分析,YDJC,SLC25A39,NME1,MRPL38,CCDC137等5个分子对肺癌患者总生存期影响显着。对N4BP2L1等100个与PYCR1表达负相关的基因进行生存分析,以HR=0.7为界,N4BP2L1,GAB3,NAPSB,GIMAP2,SPN,RILPL2,ABI3BP,RORA,ARHGEF6,FRY,ADH1B,HS2ST1等12个对肺癌患者总生存期影响显着。4.免疫组织化学结果显示PYCR1蛋白在肺腺癌组织中较正常组织表达增高,Western-blot结果显示PYCR1在肺癌细胞系A549与95D中表达较正常气道上皮细胞BEAS-2B明显增高,通过转染PYCR1si RNA构建PYCR1表达下调的A549,NCI-H1299细胞系,Western-Blot检测到细胞自噬相关分子LC3II/LC3I比值上调,Phospho-Beclin1（Ser93）上调,Phospho-ULK1减低,p70S6K表达上调,P-AMPKα表达上调。提示PYCR1抑制可能会促进肺癌细胞自噬。结论:1.PYCR1在多种肿瘤中表达上调,其在多个肿瘤中的表达不具备特异性。在肺腺癌中,PYCR1mRNA表达水平在不同年龄,吸烟状态,组织学类型,TP53突变状态患者中表达存在差异,PYCR1蛋白在不同年龄,肿瘤学分级,体质指数患者中存在差异,PYCR1启动子甲基化水平与患者不同肿瘤分期,种族,吸烟状态有关,异质性是影响肿瘤患者的一个重要因素,基于细胞代谢酶PYCR1在肺癌不同临床特征组间的差异性,其可能是不同临床特征患者预后不同的潜在影响因素,但PYCR1在不同临床特征患者中的差异表达原因及机制还需进一步研究。2.PYCR1可能通过直接或间接作用影响细胞分裂,核糖体蛋白复合物的生成,核糖体的生物发生,RNA的代谢,线粒体生物合成,线粒体翻译,线粒体氧化呼吸链的组装,泛素结合酶的活性,UTP的生物合成,PRC1复合体,Pc G蛋白复合物,IκB-α磷酸化,细胞增殖调控,TLR通路信号级联反应,整合因子复合体等生物学过程或生物学分子功能调控,调控基因表达,细胞代谢等并可能在肿瘤的发生及进展中发挥一定作用。PYCR1与PYCR3,COPG1,ARCN1,COPA,CAD。HTRA2,CCT7,STIP1,PSMC5,MDH2,TBRG4,LONP1,MRM1,CHCHD1,MRPL58,PAICS,PYCR2等17个分子具有直接作用关系,其中大多为细胞代谢相关酶类及线粒体核糖体亚单位,其对肿瘤的影响需结合这些分子的具体生物学特性及功能进一步分析。3.PYCR1高表达与肺癌患者较差的总生存期,疾病进展,及进展后生存期等不良预后相关,PYCR1的共表达基因YDJC,SLC25A39,NME1,MRPL38,CCDC137,N4BP2L1,GAB3,NAPSB,GIMAP2,SPN,RILPL2,ABI3BP,RORA,ARHGEF6,FRY,ADH1B,HS2ST1同样对肺癌患者的总生存期具有较好的预测效能,本研究不纳入临床信息而单纯针对PYCR1及其以上共表达基因尝试构建的肺癌患者预后预测模型ROC曲线下面积为0.76,因此基于多个代谢酶及及肿瘤患者临床特征信息构建COX模型可能有助于评估肿瘤患者术后复发转移风险及预后情况。4.PYCR1在肺癌组织及肺癌细胞系中表达明显上调,PYCR1过表达在肺癌中可能通过间接调控ULK1,Beclin1,LC3等表达抑制肺癌细胞自噬,目前针对自噬与肿瘤相互作用关系的研究表明,细胞自噬能够抑制肿瘤,因此PYCR1表达的上调,可能通过抑制细胞自噬,对肿瘤的发生,进展具有一定的作用和影响。但还需进一步研究。
王延蛟[9]（2021）在《mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响》文中研究说明目的:全球肝癌发病率和死亡率居高不下,每年约有841,000新发病例和782,000死亡病例,其中约50%来自中国,严重威胁到人类的健康。寻找肝癌潜在发病机制及诱发因素,能早发现、早治疗的任务迫在眉睫。DEN（Diethylnitrosamine,二乙基亚硝胺）诱发癌变过程与人肝癌的过程非常相似,是最广泛应用的肝癌模型。而肝癌的发生和发展是一个复杂的多因素过程,涉及细胞和分子水平的异常变化,关于肝癌发病机制的研究主要集中在细胞信号转导、肿瘤相关基因表达调控等方面。基因芯片能对基因表达的组织特异性、病变特异性进行综合的分析和判断,并迅速将基因与疾病联系起来。mi RNA虽然与肝癌的发生密切相关,但其无明显的细胞特异性,而存在于生殖细胞piwi蛋白具有组织特异性,近年被发现也存在于癌细胞,与piwi蛋白结合的piRNA（Piwi-interacting RNA）在维持DNA完整、抑制转录、翻译等均有重要作用,但关于piRNA/piwi与肿瘤发生的相关研究还在初始阶段。肝癌化疗失败的主要原因是多重耐药性（multi-drug resistance,MDR）,研究表明紫草素具有抗癌作用,不易产生耐药性且副作用小,但具体机制并不清楚。综上所述,本研究以DEN诱导建立的大鼠肝癌模型作为研究对象,测定血清肝癌标志物、免疫、内分泌及相关指标,寻找肝组织差异表达的mRNA和piRNA及相关蛋白,揭示以上因素与肝癌发生发展的关系;以肝癌细胞CBRH-7919为研究对象,检测紫草素对其增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,为探索肝癌发生的分子机制及临床用药提供理论支持。方法:1)选取40只6周龄雄性健康Wistar大鼠,重量在150克左右,分为肝癌模型组（NC）和正常对照组（Md）,其中,肝癌模型组自由饮用浓度为0.1 mg/m L DEN的无菌水,每24小时更换一次,20周后停药（9-12周断药用水代替）,观察肝脏组织病理形态学的改变以及细胞超微结构的变化;ELISA法检测外周血AFP、ASMA、HSP、IL-1、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT等指标的改变;利用芯片技术检测组间肝组织mRNA的差异表达并筛选候选基因,采用RT-q PCR、免疫组织化学、Western-blot检测肝癌组织中候选基因的mRNA和蛋白质的表达水平;2)利用二代测序法检测肝组织差异表达的piRNA;利用motif短序列模式比配算法辨认piRNA临近调控区域加工区域特征进行富集度解析和聚类,结合piRNA定位进行功能基因的分布总结,利用RT-q PCR对piRNA、mi RNA进行定量,通过免疫组化和Western-blot检测肝组织中piwil2、piwil4等基因蛋白质的表达水平,利用CRISPR/cas9基因编辑系统敲除CBRH-7919细胞中的piwil4基因,利用CCK-8、流式细胞术、划痕实验检测细胞的增殖、凋亡及迁移的变化;3)用MTT、流式细胞术、划痕实验以及transwell小室法观察紫草素作用于CBRH-7919细胞后的细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等变化,通过Western Blot法检测紫草素作用CBRH-7919细胞后STAT3、Cyclin D1、piwil4、Bcl-xl蛋白。结果:1)利用改变饮水方式建立了DEN诱导大鼠肝癌模型,成癌率为75%,并避免了实验动物中途死亡,肝癌组肝脏表面粗糙度增加,假小叶、增生灶和大量癌结节形成。与正常对照组比较,肝癌模型组血清AFP明显升高,差异显着（P<0.01）;组间血清ASMA无统计学差异,肝癌模型组与正常对照组血清HSP差异显着（P<0.01）。血清免疫学指标IL-1、IL-6水平降低而TNF-α水平升高（P<0.05）,内分泌指标ACTH和CORT的水平降低。mRNA芯片结果显示,31042个mRNA中表达上调的有1639个,表达下调的有360个,应用RT-q PCR法检测结果发现,STAT3和Cyclin D1基因的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）;Igfals、G6PC基因的mRNA表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;免疫组织化学结果显示,正常对照组中STAT3和Cyclin D1蛋白表达量少,肝癌模型组STAT3和Cyclin D1蛋白的高表达主要定位在细胞核。western-blot实验结果显示Igfals、G6PC以及Emp1蛋白表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;2)总计发现符合piRNA序列特征的为27439个,mRNA芯片结果显示,与正常对照组相比发现,肝癌模型组中上调表达的piRNA有4个（P<0.05）,分别是piR-64745（piR-rno-51044）,piR-64265（piR-rno-50623）,piR-79437（piR-rno-48177）,piR-64744（piR-rno-51043）,表达下调的有2个（P<0.01）,分别是piR-64143（piR-rno-50518）和piR-64142（piR-rno-50517）。组间表达异常的piRNA靶基因涉及嘌呤嘧啶代谢、氨基酸降解、黏多糖合成、复制、DNA剪切与修复、RNA和蛋白质降解、MAPK信号通路、Ras信号通路众多途径,RT-q PCR显示,与正常对照组比较,肝癌模型肝组织的piR-79437表达增加（P<0.01）、piR-64143表达降低（P<0.01）,肝癌模型组血清中mi R-133b升高（P<0.05）;在肝癌模型肝脏中Piwil2、Piwil4的蛋白高表达（P<0.01）,Piwil4基因敲除后,与肝癌正常对照组和空载组相比,KO组细胞的增殖活性降低（P<0.05）,KO组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）,Piwil4-/-细胞中STAT3、Cyclin D1、Bcl-x L蛋白表达水平均下调,差异显着（P<0.05）;3)紫草素的IC50是11.97μM,作用细胞的浓度确定为5、10、15μM,细胞的存活率随药物浓度的增加而发生梯度变化,具有统计学差异（P<0.05）,FCM结果显示,紫草素浓度为0μM、5μM、10μM、15μM时候,凋亡细胞数量分别为5.50±0.28%、7.88±0.51%、16.05±1.23%、26.88±0.22%,细胞凋亡率逐步上升,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）,划痕实验结果显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应的迁移率分别为52.10±6.12%、47.01±9.01%、34.11±7.18%、13.98±4.52%,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）;transwell实验显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应穿过小室膜的细胞数分别为482.33±55.54%、423.00±35.51%、386.33±68.37%、288.67±50.74%,呈现出浓度依赖性,侵袭能力下降,具有统计学差异（P<0.05）;用15μM紫草素处理CBRH-7919细胞48小时后,STAT3、Cyclin D1蛋白表达下调（P<0.05）,piwil4和Bcl-x L与正常对照组无明显变化。结论:1)使用0.1mg/ml的DEN饮用水诱导大鼠肝癌模型20周（9-12周停药）,成癌率为75%（15/20）,效果良好,观察肝脏组织HE病理结果发现肝癌发生,且血清AFP、HSP均升高,是一种较理想的研究肝癌发生发展的大鼠模型。作者认为免疫相关IL-1、IL-6、TNF-α水平的升高,内分泌相关ACTH和CORT水平的降低,提示肝癌模型中免疫和内分泌功能至少在一定程度上发生紊乱;2)模型肝脏中,STAT3,Cyclin D1等癌基因的过表达和促凋亡基因EMP1低表达共同导致细胞的持续增殖,肝癌模型的G6PC表达的降低便于糖异生的中间产物用于肝癌细胞增殖所需能量的供应和物质的生物合成;3)本研究发现piR-79437、piR-64143的异常表达可能与HCC存在关联,在肝癌的发生和发展中起作用,血清mi R-133b可能是肝癌的潜在标志物,PIWIL2和PIWIL4在肝癌模型组的高表达,提示具有促癌作用,PIWIL4基因敲除细胞中STAT3,cyclin D1和Bcl-xl的表达水平低于对照组,表明PIWIL4基因可能通过作用于STAT3/cyclin D1促进肝癌细胞的增殖,通过STAT3/Bcl-x L抑制其凋亡;4)紫草素使STAT3和Cyclin D1蛋白表达下调,提示其对肝癌细胞生长有抑制作用,同时,紫草素可以促进肝癌细胞的凋亡,抑制其迁移及侵袭,呈现浓度依赖性的关系,但其作用细胞后的piwil4和Bcl-x L的表达水平没有变化,提示紫草素不通过Bcl-x L影响细胞凋亡,具体通过什么途径促进肝癌细胞的凋亡,还需进一步研究。
李腾达[10]（2021）在《肺泡巨噬细胞Lkb1对其自稳的调控及肿瘤表观遗传学相关研究》文中研究表明课题一:肺泡巨噬细胞Lkb1对其自稳的调控缺失。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activatedreceptor-γ,PPAR-y）的基因或蛋白表达水平在Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM中均降低,其激动剂可部分挽救AM脂质堆积状态。结论:Lkb1在AM胞内糖脂代谢调节过程中起到了重要作用。ROS抑制剂或PPAR-γ激动剂可一定程度挽救Lkb1缺陷AM的比例或脂质堆积状态。第一部分Cd11cCreLkb1f/f条件敲除小鼠的建立及其免疫表型的鉴定目的:明确Lkb1在肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophage,AM）发挥免疫功能过程中的主要作用。方法:我们对小鼠DNA扩增后进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定其基因型。对Lkb1f/f和Cd11cCreLkb1ff小鼠进行肺泡灌洗并取肺组织制备单细胞悬液以进行流式分析。用Click-iTTM Plus EdU试剂盒对细胞增殖情况进行检测。利用金黄色葡萄球菌经滴鼻建立肺炎模型。肺部巨噬细胞的去除根据Nano Sciences公司的巨噬细胞去除试剂盒说明书进行。两组独立连续变量之间的比较采用t检验。结果:经杂交我们构建了Cd11cCreLkb1ff条件敲除小鼠,检测结果显示相对于Lkb1ff小鼠,Cd11cCreLkb 1ff小鼠AM绝对数和比例显着降低,细胞凋亡增加（P<0.05）,但其前体巨噬细胞、单核细胞与胚胎巨噬细胞并未发生改变。肺炎模型结果表明相对于Lkb1ff小鼠或去除实验对照组,Cd11cCreLkb1ff小鼠或AM去除组肺部炎症更为严重,感染的病菌更多,中性粒细胞百分比增加,嗜酸性粒细胞百分比降低,差别具有统计学意义（P<0.05）。结论:Lkb1缺陷可致AM数目或比例严重缺失,这种缺失来源于AM自身凋亡或坏死细胞的增多,可使小鼠肺部易受病原体感染及中性/嗜酸性粒细胞比例失衡。第二部分代谢相关检测及Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM挽救实验目的:探究Lkb1对AM代谢的影响,挽救Lkb1缺陷AM的缺失或其功能。方法:我们用流式或磁珠分选技术纯化AM。用油红O对细胞脂质进行染色。代谢组学分析基于气相色谱-质谱联用仪或多反应监测技术进行。用Seahorse XF技术对细胞代谢状况进行分析。细胞基因水平检测采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术。蛋白水平检测采用蛋白印迹法。活性氧水平经检测试剂盒获得。免疫表型相关检测经流式分析得到。配对实验设计采用配对检验,两组独立样本之间的比较采用t检验。结果:相对于Lkb1ff小鼠,Cd11cCreLkb1ff小鼠AM呈脂质堆积。代谢组学分析结果显示Cd11cCreLkb1ff小鼠AM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）等的检测水平相对于Lkb1ff小鼠AM下调,而亚油酸、油酸和β-D-果糖-6-磷酸盐等上调,差别具有统计学意义（P<0.05）。Seahorse XF实验结果显示Cd11cCreLkb1ff小鼠AM糖酵解过程活跃,呼吸能力增强,ATP产生增加。活性氧（reactiveoxygen species,ROS）检测显示Lkb1缺陷的AM其ROS产生增加,用ROS抑制剂可一定程度挽救Cd11cCreLkb1ff小鼠AM 比例的第三部分Lkb1缺陷的肺泡巨噬细胞中重要的信号通路及基因目的:探究Lkb1缺陷对AM重要基因转录水平的影响及相关通路的变化。方法:我们利用流式分选技术分选出AM细胞后进行RNA-seq分析,测序平台为BGISEQ-500。用Cytohubba插件进行关键基因的筛选。热图由R软件获得。结果:差异基因（Cd11cCreLkb1f/f vs Lkb1f/f）主要富集在炎症反应、甘油脂代谢、脂质储存等通路,这些通路中募集到的几乎所有基因在Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM中均表达上调。关键基因评分结果表明C-X-C基序趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2,CXCR2）,Toll 样受体 2（Toll like receptor 2,TLR2）,丝裂原激活的蛋白激酶 3（mitogen-activatedproteinkinase3,MAPK3）,CD40,趋化因子（C-C 基序）受体 7（chemokine（C-C motif）receptor7,CCR7）等基因相对重要且在Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM中表达增高。基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）得到了与Cytoscape相同的炎症反应和代谢相关通路的结果。结论:Lkbl缺陷的AM其炎症反应及甘油脂代谢等通路相关基因上调,一些关键基因如TLR2,CD40,CCR7等可能在此过程中起到了重要作用。课题二:胃癌与黑色素瘤表观遗传学相关研究第一部分 胃癌患者DNA甲基化亚分型及预后评估模型的构建目的:根据胃癌DNA甲基化亚分型,建立预后评估模型以预测高风险胃癌患者,为临床诊治提供依据。方法:我们利用Cox风险回归的方法确定独立预后相关甲基化位点并进行患者亚分型,用coxph函数构建风险评估模型。基因通路富集在Cytoscape软件进行。相关性分析采用Spearman或Pearson分析。两组或两组以上独立样本之间的比较选择参数或非参数统计学检验。结果:我们鉴定出了610个胃癌独立预后相关甲基化位点（P<0.05）,将胃癌患者分为7个甲基化亚组,并利用甲基化水平和患者生存率高于其他亚组的第6亚组中显着变化的甲基化位点（P<0.05）构建了预后风险评估模型。该模型能够有效地将高风险和低风险的胃癌患者进行区分,受试者工作特征曲线下面积大于0.90,其有效性在另一组胃癌患者甲基化样本中得到了证实。独立预后相关甲基化位点对应的基因主要富集在癌症通路或胃癌信号通路。其中,转化生长因子β2（transforming growth factor β2,TGFβ2）在不同的胃癌患者生存状态、T分期、分级和肿瘤阶段的表达水平存在差异,并且相对于正常人,在肿瘤患者中的表达水平升高,参与了该病信号通路。结论:我们实现了基于甲基化大样本的胃癌亚分型并构建了能够有效识别高风险患者的预后风险评估模型。一些重要的独立预后甲基化位点对应的基因例如TGFβ2被发现,这些基因将会为胃癌患者临床诊治和个性化风险评估提供新的依据和思路。第二部分黑色素瘤患者DNA甲基化亚分型及预后评估模型的构建目的:通过建立黑色素瘤DNA甲基化亚分型构建预后风险评估模型并挖掘重要的独立预后相关甲基化位点对应的基因。方法:我们基于475个黑色素瘤患者甲基化文件,利用Cox风险回归方法鉴定独立预后相关甲基化位点进而进行亚分型。利用R软件进行风险评估模型构建,用ClueGo对位点基因进行通路富集。根据数据是否满足正态分布及方差齐性选择参数或非参数统计学检验。结果:我们鉴定出了 256个黑色素瘤独立预后相关甲基化位点（P<0.0001）,并将患者分为7个甲基化亚组,这些亚组中第2亚组的甲基化水平和生存时间显着低于其他组（P<0.05）。于是我们将第2亚组中显着变化的甲基化位点用于黑色素瘤患者预后风险评估模型的构建,该模型能够有效地将患者分为高风险组和低风险组,具有较高的检测效率,受试者工作曲线下面积为0.833。经分析我们发现,随着风险值的升高,死亡患者数目逐渐增加,患者甲基化水平逐渐降低,有高风险分数的患者生存率远低于有低风险分数的患者。相关性分析结果显示,黑色素瘤患者的风险值与生存时间呈负相关（rs=-0.325,P<0.0001）。独立预后相关甲基化位点对应的基因主要富集在癌症和免疫相关通路。在这些位点基因中,我们鉴定出35个关键基因,其中DOK2、GPBAR1、GBP4、PSMB9等基因在不同甲基化亚组、患者生存状态、肿瘤阶段和临床T分期中的表达水平存在显着性差异且呈正相关（P<0.05）。结论:我们实现了基于大样本的黑色素瘤甲基化亚分型并构建了具有较高检测效率的预后风险评估模型,同时发现了几个重要的与患者预后情况存在显着相关性的位点基因,这些基因之间呈明显的正相关,说明其可能通过协同作用共同促进了黑色素瘤疾病的形成过程,这对于进一步理解黑色素瘤疾病分子生物学机理具有重要意义,为临床诊治提供了新的靶点。第三部分 m6a调控基因在黑色素瘤患者中的表达情况及意义目的:探索RNA表观修饰N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6a）调节基因在黑色素瘤疾病形成过程中的重要作用。方法:我们利用Oncomine数据库对m6a的调控基因的表达水平进行了分析,并在基因表达综合数据集（gene expression omnibus dataset,GEO）中进行了验证。关键基因通过Cytohubba获得。利用cBioPortal线上工具对基因突变情况进行分析。结果:我们发现YTHDF1和HNRNPA2B1在黑色素瘤患者中表达上调,对这两个基因进行联合回归分析发现检测效率相比较于单个基因提高了约10%。黑色素瘤转录本中关键基因的功能富集结果表明,p53信号通路中包括了 CDK2,CDK1,RRM2,CCNB1和CHEK1等基因。这五个基因与YTHDF1或HNRNPA2B1呈正相关,这意味着这两个m6a调节基因可能通过影响上述5个关键基因的m6a修饰而调节其表达进而促进其抑制p53信号通路。我们还发现YTHDF1和HNRNPA2B1主要的变异是扩增,且携带m6a调节基因突变的患者与不携带突变的患者在不同的肿瘤阶段和治疗反应组中有显着差别。结论:我们第一次利用m6a调节基因联合回归的方法对黑色素瘤患者进行诊断鉴别。同时,我们发现YTHDF1和HNRNPA2B1表达水平在黑色素瘤患者中显着改变且可能通过p53等信号通路影响了患者的疾病进展。
二、细胞周期调节基因蛋白与肿瘤发生的相关性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞周期调节基因蛋白与肿瘤发生的相关性（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA PlncRNA-1通过启动子区的低甲基化调控miRNA-136-5p/Smad3轴促进膀胱癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/smad3轴促进膀胱癌的进展 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（2）LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LncMEG3 促进依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老 |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞衰老 |
| 1.2 Lnc RNA-MEG3 |
| 1.3 立题依据 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.2.3 依托泊苷诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测目的基因mRNA的表达水平 |
| 2.2.6 SA-β-gal衰老染色 |
| 2.2.7 si RNA转染 |
| 2.2.8 质粒转染 |
| 2.3 GEO数据下载 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 低剂量依托泊苷可以诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 3.2 使用不同方法验证依托泊苷诱导的A549 及MCF-7 细胞衰老模型 |
| 3.3 LncMEG3 在肿瘤细胞衰老模型中表达升高 |
| 3.4 LncMEG3 可以调控肿瘤细胞衰老 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LncMEG3 通过miR-16-5p/VGLL4 轴调控肿瘤细胞衰老过程 |
| 1 前言 |
| 1.1 Micro RNA-16-5p |
| 1.2 VGLL4 |
| 1.3 VGLL4 作为共转录因子与YAP竞争性结合下游转录因子 |
| 1.4 立题背景 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.2.3 依托泊苷诱导A549 及MCF-7 细胞衰老 |
| 2.2.4 Western blot检测目的蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测目的基因m RNA的表达水平 |
| 2.2.6 SA-β-gal衰老染色 |
| 2.2.7 siRNA转染 |
| 2.2.8 质粒转染 |
| 2.2.9 免疫荧光 |
| 2.2.10 双荧光素酶报告基因系统 |
| 2.2.11 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提 |
| 2.3 Starbase数据库的使用 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 共转录因子VGLL4 在肿瘤细胞衰老过程中在细胞核内及总表达水平均上调 |
| 3.2 在肿瘤细胞衰老过程中,lnc MEG3 通过发挥海绵效应,调控miR-16-5p的表达 |
| 3.3 MiR-16-5p参与了肿瘤细胞衰老过程 |
| 3.4 VGLL4 在肿瘤细胞衰老过程中是miR-16-5p的直接靶基因 |
| 3.5 VGLL4 参与了肿瘤细胞衰老过程的调控 |
| 3.6 在肿瘤细胞衰老过程中VGLL4 的表达水平受lnc MEG3 的调控 |
| 3.7 在依托泊苷诱导的A549及MCF-7 细胞衰老模型中,lnc MEG3 通过miR5p/VGLL4 轴发挥调控作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 LncRNAs与细胞衰老的相关性及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌研究概况 |
| 一、肝癌流行病学现况 |
| 二、肝癌病因研究 |
| 三、肝癌发病机制 |
| 四、肝癌的治疗现状 |
| 五、肝癌发生发展与肝癌干细胞的关系 |
| 六、肝癌干细胞与上皮间质转化(EMT) |
| 第二节 肝癌中医药基础理论的形成和发展及芪术抗癌方研究概况 |
| 一、肝癌的渊源及病因病机 |
| 二、肝癌辨证治疗 |
| 三、芪术抗癌方中医气血辨证治疗肝癌的理论依据 |
| 四、芪术抗癌方临床疗效、机制及微观物质基础研究 |
| 第二章 芪术抗癌方对肝癌干细胞的影响 |
| 第一节 临床研究 |
| 一、资料与方法 |
| 二. 数据分析结果 |
| 三、结论 |
| 第二节 体外、体内实验研究 |
| 一、芪术抗癌方对癌细胞的干性表达体外研究 |
| 二、芪术抗癌方对癌细胞干性表达体内研究 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（4）子宫内膜癌关键基因的筛选及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 子宫内膜癌概述 |
| 1.2 MYBL2 的功能 |
| 1.3 MYBL2 促进肿瘤发生的作用机制 |
| 参考文献 |
| 第一部分 子宫内膜癌全基因组差异性表达及生存分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据库及软件 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TCGA数据的子宫内膜癌全基因表达分析及GEO数据验证 |
| 2.2 MYBL2 表达和肿瘤预后的相关性 |
| 2.3 MYBL2 过表达与子宫内膜癌关系 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MYBL2 蛋白在子宫内膜癌组织中的表达与临床特征的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MYBL2 蛋白在子宫内膜癌和癌旁组织中的表达情况 |
| 2.2 MYBL2 蛋白表达与子宫内膜癌各项临床病理特征的关系 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MYBL2 基因沉默对子宫内膜癌细胞增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MYBL2 敲低抑制子宫内膜癌细胞系增殖 |
| 2.2 差异表达基因的确定及KEGG通路富集分析 |
| 2.3 MYBL2 基因敲低抑制子宫内膜癌细胞系周期进程,促进细胞凋亡 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 讨论 |
| 第3章 结论与展望 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 论文综述 MYBL2 在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CircRNAS的分类和特征 |
| 1.2.1 circRNAs的分类和生物发生 |
| 1.2.2 circRNAs的特征 |
| 1.3 CIRCRNAS在胃癌中的作用机制和生物学功能 |
| 1.3.1 胃癌中circRNAs的表达概况 |
| 1.3.2 circRNAs在胃癌中的作用机制 |
| 1.3.3 circRNAs对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 1.3.4 circRNAs在 GC中发挥作用的信号通路 |
| 1.3.5 外泌体circRNAs在 GC中的功能 |
| 1.3.6 circRNAs研究的公共数据库 |
| 1.4 CircRNAS在胃癌中的应用 |
| 1.4.1 circRNAs作为胃癌的生物标志物 |
| 1.4.2 circRNAs作为GC治疗靶点 |
| 1.4.3 外泌体circRNAs在 GC诊断和治疗中的应用价值 |
| 1.5 问题和展望 |
| 第2章 胃癌中差异表达的CIRCRNAS |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 患者和样本收集 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分离外泌体 |
| 2.3.2 透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态 |
| 2.3.3 Western blot检测外泌体标志物 |
| 2.3.4 提取外泌体RNA |
| 2.3.5 RNA文库构建和测序 |
| 2.3.6 鉴定差异表达的circRNA |
| 2.3.7 GO(Gene ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)分析 |
| 2.3.8 逆转录实时定量 PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血浆外泌体的分离和鉴定 |
| 2.4.2 GC患者血浆外泌体中差异表达的circRNA |
| 2.4.3 DE circRNA的 GO和 KEGG富集 |
| 2.4.4 RT-qPCR验证DE circRNA的表达 |
| 2.4.5 GC患者血浆外泌体中hsa_circ_0014606 的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中发挥促癌作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 hsa_circ_0014606 序列分析 |
| 3.3.2 慢病毒包装和感染 |
| 3.3.3 GC细胞增殖实验 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3.5 划痕愈合实验 |
| 3.3.6 Transwell实验 |
| 3.3.7 THP-1 细胞分化和极化实验 |
| 3.3.8 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 hsa_circ_0014606 的亲本基因和剪接结构 |
| 3.4.2 hsa_circ_0014606在GC细胞中的过表达和敲减 |
| 3.4.3 过表达hsa_circ_0014606 促进GC细胞增殖和存活 |
| 3.4.4 hsa_circ_0014606 促进GC细胞迁移和侵袭 |
| 3.4.5 外泌体hsa_circ_0014606 促进THP-1 细胞向M2 巨噬细胞方向极化 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中的作用靶标 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞和实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 靶标miRNA和 mRNA预测 |
| 4.3.2 RT-qPCR |
| 4.3.3 荧光素酶报告实验 |
| 4.3.4 NCG小鼠体内成瘤实验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 预测的靶标miRNA |
| 4.4.2 hsa_circ_0014606 对候选靶标miRNA表达水平的影响 |
| 4.4.3 hsa_circ_0014606 可与miRNA-194-5p直接结合 |
| 4.4.4 YAP1是miRNA-194-5p的靶基因 |
| 4.4.5 hsa_circ_0014606 促进GC细胞NCD小鼠体内成瘤 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）基于生物信息学分析HOXD11在脑胶质瘤中的生物学功能和意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料和分析方法 |
| 1. 胶质瘤公共数据库数据获取及分析 |
| 2. 荧光定量PCR的实验及其材料 |
| 3. 统计方法 |
| 第三章 结果 |
| 1. HOXD11在胶质瘤中差异性表达 |
| 2. HOXD11在人脑胶质瘤中的表达情况 |
| 3. HOXD11表达与胶质瘤患者预后关系 |
| 4. 单因素及多因素分析 |
| 5. GO和KEGG分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 研究的局限和展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HOX基因在胶质瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 简介 |
（7）长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）PYCR1在肺癌中的表达与预后价值分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 PYCR1 在不同临床特征肺癌者中的表达差异情况 |
| 一.前言 |
| 二.研究工具与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 第二部分 PYCR1 及其共表达基因功能富集分析及蛋白互作分析 |
| 一.背景 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 第三部分 PYCR1 表达差异与肺癌患者预后的相关性 |
| 一.背景 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 第四部分 PYCR1 通过AMPK-mTOR-p70S6K通路影响肺癌细胞自噬的初步研究 |
| 一.前言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 参考文献 |
| 系统综述 PYCR1 在肿瘤发生发展中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 DEN诱导大鼠肝癌模型的建立及mRNA芯片分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 piRNA/piwi与肝癌的关系研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 紫草素对肝癌细胞CBRH-7919 的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 piRNA/piwi 在癌症中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）肺泡巨噬细胞Lkb1对其自稳的调控及肿瘤表观遗传学相关研究（论文提纲范文）
| 课题一: 肺泡巨噬细胞Lkb1对其自稳的调控 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Cd11c~(Cre)Lkb1~(f/f)条件敲除小鼠的建立及其免疫表型的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与总结 |
| 第二部分 代谢相关检测及Cd11c~(Cre)Lkb1~(f/f)小鼠AM挽救实验 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与总结 |
| 第三部分 Lkb1缺陷的肺泡巨噬细胞中重要的信号通路及基因 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 课题二: 胃癌与黑色素瘤表观遗传学相关研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 胃癌患者DNA甲基化亚分型及预后评估模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与总结 |
| 第二部分 黑色素瘤患者DNA甲基化亚分型及预后评估模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与总结 |
| 第三部分 m6a调控基因在黑色素瘤患者中的表达情况及意义 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺泡巨噬细胞 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、流式抗体信息（均来自Biolegend公司) |
| 二、缓冲液配制 |
| 三、缩略词表 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、细胞周期调节基因蛋白与肿瘤发生的相关性（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA PlncRNA-1通过启动子区的低甲基化调控miRNA-136-5p/Smad3轴促进膀胱癌进展的机制研究[D]. 康维亭. 山东大学, 2021(11)
- [2]LncRNA MEG3/miR-16-5p/VGLL4轴调控依托泊苷诱导的肿瘤细胞衰老[D]. 陶冶. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究[D]. 孙新锋. 广州中医药大学, 2021(02)
- [4]子宫内膜癌关键基因的筛选及分子机制研究[D]. 乐露露. 南昌大学, 2021(01)
- [5]hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究[D]. 饶敏. 吉林大学, 2021(01)
- [6]基于生物信息学分析HOXD11在脑胶质瘤中的生物学功能和意义[D]. 卢本兆. 汕头大学, 2021(02)
- [7]长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制[D]. 陈媛媛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [8]PYCR1在肺癌中的表达与预后价值分析及其生物学功能研究[D]. 杨兴玲. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [9]mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响[D]. 王延蛟. 新疆医科大学, 2021(08)
- [10]肺泡巨噬细胞Lkb1对其自稳的调控及肿瘤表观遗传学相关研究[D]. 李腾达. 北京协和医学院, 2021(02)