一、HEMODYNAMIC EFFECTS OF M_3 RECEPTOR ON ANIMAL HEARTS（论文文献综述）
张杰[1]（2021）在《E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究》文中认为研究背景高血压作为心脑血管疾病发生的主要致病因素,同时也是导致肾脏发生损伤的重要原因。高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）是由原发性高血压导致的肾脏结构和功能的损害,是内科常见疾病之一,但其发病机制尚未完全清楚。高血压肾损害主要表现为蛋白尿增多、良性肾小球硬化、肾脏间质纤维化以及炎症细胞浸润。肾小管及间质的纤维化、炎症和免疫激活是导致HRD持续进展的重要因素。细胞外基质蛋白合成及其降解之间的平衡受损造成过量的基质沉积,这是纤维化过程的一个典型特征。炎症因子的分泌以及炎症细胞的浸润是肾脏纤维化的始动因素。目前还没有有效的方法可预防纤维化的进展,因此提高对HRD纤维化和炎症进展的细胞及分子机制的认识至关重要。目前研究中常见的HRD发病机制有遗传因素、盐敏感、氧化应激、内皮细胞功能障碍以及肾素-血管紧张素醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS）的激活。抑制RAAS的过度激活是目前减缓肾脏疾病进展的最有效的方法。血管紧张素Ⅱ（Angiotension Ⅱ,AngⅡ）作为RAAS的主要效应因子,主要通过血流动力学和非血流动力学两方面参与血压和靶器官损害的调节。它可作用于肾脏血管平滑肌细胞,导致血管收缩;它也可作为促炎剂,激活细胞内信号传导系统,促进肾脏的炎症反应;而且它可通过上调转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）的表达、增加成纤维细胞增殖,促进细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解,加速肾脏纤维化的过程。因此,AngⅡ是HRD进展中的关键调节因子。泛素化修饰作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,不仅是蛋白酶体降解目的蛋白的标记,也是蛋白-蛋白相互作用和酶激活的调节因素。目前研究发现多种E3泛素连接酶可调控高血压及其靶器官的损害,但针对高血压肾损伤的泛素化修饰研究还鲜有报道。发现调控HRD的新型E3泛素连接酶及探寻其调控机制,将为阐述HRD发病机制及研发HRD药物提供良好的理论基础,这也成为当前该领域的热点问题。TRIM（The tripartite motif）31属于TRIM家族的一员,也是一个非常重要的E3泛素连接酶,其是否同样在高血压及HRD中发挥重要作用尚未报道。既往研究表明,TRIM31在多种疾病发展中发挥着关键的调控作用,尤其是在肿瘤的增殖、迁移过程中,机制方面主要涉及到TRIM31调控核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）的活化参与炎症反应。因NF-κB的活化在HRD的病理进展中发挥着至关重要的作用,提示TRIM31可能同样参与到HRD疾病的发生和发展中。在本实验中,我们提出以下科学假设:在AngⅡ构建的HRD小鼠模型中,E3泛素化连接酶TRIM31可改善肾脏功能、纤维化和炎症反应。为了验证以上假说,我们精心设计了一系列的体内和体外实验。研究目的1.探讨TRIM31与人和小鼠HRD病理进展的相关性;2.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏功能损害;3.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏纤维化;4.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏炎症反应。研究方法1.实验动物利用 TALEN（Transcription activator-like effectors Nucleases）技术构建TRIM31基因敲除（TRIM3 1-/-）小鼠,小鼠背景为C57BL/6J。与野生型C57BL/6J小鼠杂交扩繁,得到同窝纯合野生型C57BL/6J（TRIM31+/+）小鼠和TRIM31-/-小鼠。野生型C57BL/6J小鼠购买于维通利华（北京）实验动物技术有限公司。所有动物实验均遵循国家卫生部动物管理办法（documentation No 55,2001）,同时遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.实验动物分组（1）选取8周龄雄性野生型（Wildtype,WT）C57BL/6J小鼠,随机分成两组,每组15只:生理盐水组,AngⅡ组。（2）分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRIM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组。3.HRD小鼠模型的建立预先将微量渗透泵灌注适当剂量AngⅡ分别埋入8周龄雄性小鼠的背侧皮下,以泵速1000ng/kg/min持续泵入AngⅡ 42天,构建高血压小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水（每组15只）。分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠24h尿液。实验结束时,将小鼠进行安乐死,测量体重及左右肾重,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本进行下一步组织和细胞分子学研究。4.临床高血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TRIM31蛋白的表达情况,同时利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin andeosin,HE）和 Masson’s trichrome 染色探讨 TRIM31蛋白表达与肾脏损伤和纤维化程度的相关性。5.小鼠基因型鉴定利用鼠尾提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。同时提取小鼠的肾脏组织蛋白,通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）的方法检测TRIM31的蛋白表达水平,评估TRIM31的基因敲除效率。6.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）,培养在 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中,于含 5%CO2 的 37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）时间浓度实验:选用10-5MAngⅡ分别刺激HK2细胞0,4h,8h,12h,24h,36h,收集细胞。（2）浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M的 AngⅡ刺激HK2细胞24h,收集细胞。7.小鼠血压测量利用Data Sciences International（DSI）无线遥感测量方法分别于造模前和造模后每周定时测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组）的收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）。8.小鼠组织样本取材分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠尿液进行相关肾脏功能指标检测。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本,对心脏和左右肾脏进行称重,剥除肾脏包膜,依后期实验需求将各个组织放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定24-48h或者放于2%戊二醛中固定以待后续实验使用。9.小鼠肾脏功能和24h尿蛋白检测留取小鼠血液和尿液,利用全自动生化仪和ELISA的方法检测TRIM31-/-小鼠与 TRIM31+/+小鼠血清中尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Cr）、尿酸（Uric acid,UA）以及24h尿蛋白等主要肾脏功能指标的差异。10.透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏超微结构取4组小鼠的肾脏皮质,利用2.5%的戊二醛固定组织后,利用透射电镜观察4组小鼠的肾小球足突细胞、基底膜等超微结构。11.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取的4组小鼠冻存在-80℃冰箱的血清,基于电化学发光的原理,利用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的含量。12.小鼠肾脏组织学和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。通过Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测4组小鼠肾脏间质的纤维化情况。过碘酸雪夫氏染色（Periodic acid-schiffstain,PAS）观察小鼠肾脏中肾小球硬化的差异。利用IHC的方法检测4组小鼠肾脏组织中TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、α-SMA、CD68、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达差异。13.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因trim31、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、fibronectin、α-sma、tnf-α、il-6和il-1β的 Ct 值,利用β-actin作为内参,将所得的Ct值,采用公式（2-ΔΔCT）计算目的分子表达量的的相对变化。14.Western blot 分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测TRIM31、TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Δ-SMA、TNF-Δ、IL-6 和 IL-1β 的蛋白含量。15.数据统计分析方法所有数据分析均使用的GraphPad Prism 8软件,以均数（mean）±标准误（SEM）进行表示。首先采用Shaβ1ro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。对于属于正态分布的单因素数据,两组间的统计差异采用非配对t检验分析,多组间的统计差异采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,我们使用的Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在AngⅡ诱导的HRD小鼠模型肾组织中TRIM31的表达量明显下调我们通过在小鼠皮下埋入AngⅡ缓释泵成功构建了 HRD小鼠模型。通过IHC、Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠肾脏的TRIM31表达量明显下调。2.AngⅡ剂量和时间依赖性调控肾小管上皮细胞中TRIM31的表达体外培养的HK2细胞,AngⅡ刺激细胞不同的时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）或以不同的浓度（0,10-8 M,10-7M,10-6 M,10-5 M,10-4 M）的 AngⅡ刺激细胞,利用Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现伴随AngⅡ的梯度刺激,TRIM31的表达在蛋白水平和mRNA水平均呈现显着降低。以上体内外实验说明,TRIM31的表达与HRD存在一定相关性,提示我们TRIM31可能参与到HRD疾病进展过程。3.利用TRIM31敲基因小鼠构建AngⅡ诱导的小鼠HRD模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用TALEN技术成功构建TRIM31敲基因小鼠。提取小鼠鼠尾基因组DNA进行鼠尾基因型鉴定,证实了 TRIM31敲基因小鼠成功构建。同时提取TRIM3 1+/+和TRIM3 1-/-小鼠肾脏组织蛋白,利用Western blot的技术进一步验证了 TRIM31敲基因小鼠中TRIM31的蛋白敲除效率。（2）测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM3 1-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM3 1-/-+AngⅡ组）造模前后的体重和取材后左右肾重量,发现TRIM31基因敲除并不影响小鼠的肾重/体重比。4.TRIM31基因缺失不影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变利用DSI遥感法对4组小鼠的SBP及DBP进行测量,结果显示,与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠血压在泵入后第一周起即出现明显升高,并在接下来的几周持续在较高水平。DSI测量结果显示AngⅡ组小鼠造模结束前最后一周血压均大于140mmHg,达到高血压的水平,证实了小鼠高血压模型构建成功。然而在泵入生理盐水或者AngⅡ后,TRIM31+/+与TRIM31-/-两组小鼠间无明显血压改变。以上结果说明,TRIM31基因缺失不影响小鼠血压的基线水平,也不影响影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变。5.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾功能损伤小鼠血清Cr、BUN和24h尿蛋白的测量表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠出现了肾功能的损伤和小鼠肾滤过屏障的损害,而TRIM31基因缺失进一步加重了AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾损伤。肾脏Nephrin、KIM-1的Western blot和IHC染色提示,TRIM31基因敲除加重了 AngⅡ引起HRD小鼠的肾小管的损伤和肾脏足突细胞的损害。同时PAS染色表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠的发生了肾小球硬化,TRIM31基因敲除进一步加重HRD小鼠的肾小球硬化。此外,TEM检测发现TRIM31基因敲除后明显加AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的足突和基底膜的损害。以上说明TRIM31基因缺失明显加重了 HRD小鼠的肾功能损伤。6.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化Masson’s trichrome和天狼猩红染色显示,AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾脏呈现明显的纤维化,并且TRIM31-/-小鼠较TRIM31+/+小鼠更严重。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、纤连蛋白（Fibronectin）和促纤维化因子 α-smooth muscle actin（α-SMA）的 IHC、Western blot、RT-PCR 实验显示在泵入 AngⅡ后,与TRIM31+/+对比,TRIM3 1-/小鼠的以上纤维化指标表达明显增加。提示TRIM31基因缺失可明显加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化。7.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的炎症反应利用MSD多因子检测技术检测4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM3 1+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组）血清中炎症相关指标,结果显示泵入AngⅡ后,小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-iβ的表达量明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-小鼠增加的更为显着。利用巨噬细胞表面Marker CD68抗体对4组小鼠肾脏进行IHC染色,结果显示泵入AngⅡ后,巨噬细胞浸润明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-进一步加重了HRD小鼠的肾脏组织中巨噬细胞的浸润。同时IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测4组小鼠肾脏炎症指标表达量,结果同样提示与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31基因敲除后明显增强小鼠肾脏组织中炎症相关分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。8.TRIM31在HRD患者肾活检组织中的表达明显下降利用IHC的检测方法,我们发现与非高血压患者的正常癌旁肾组织Control和非高血压的GML活检肾组织相比,HRD患者的肾组织切片中TRIM31的表达量明显下调。实验结论1.TRIM31在HRD的病理组织中蛋白表达量降低。2.TRIM31基因缺失明显加重了小鼠高血压肾功能损害、纤维化和炎症反应。研究背景炎症和纤维化是高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）的两个主要病理特征,血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ AngⅡ）在诱发肾脏组织发生炎症和纤维化的过程中发挥着关键作用。转化生长因子β1（Transfoiming growth factor-beta 1,TGF-β1）是HRD炎症、纤维化发病机理中的主要调控因子。TGF-β1可诱导细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的生成和沉积、促进成纤维细胞的增殖和分化和上皮细胞的转分化等病理过程。机制方面,TGF-β1主要通过介导Smad依赖的信号通路和非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB信号通路）的活化来调控肾脏纤维化及肾脏炎症,靶向抑制TGF-β1下游信号通路的激活对HRD的治疗具有重大意义。研究显示,Angll可诱导肾脏过度分泌TGF-β1等细胞因子,并进一步通过TGF-β1加重高血压肾损伤。探讨TGF-β1信号通路的调控机制,有利于进一步阐明高血压肾病的发病原因,并为高血压肾病药物研发提供理论依据。TGF-β-activated kinase 1（TAK1）是一种丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K）。TAK1的激酶活性受到TGF-β1等多种细胞因子的调控。研究显示,活化的TAK1进一步磷酸化TGF-β1信号通路下游关键接头蛋白,在非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB）的活化及炎症因子的产生过程中发挥着关键作用。然而,在HRD发生发展过程中,TAK1是否同时参与调控TGF-β1介导的经典Smad信号通路及肾脏纤维化进展仍有待进一步的研究阐明。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是泛素本身通过7个内部的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K64）形成多聚泛素链。E3泛素连接酶决定了泛素分子结合到靶蛋白的特异性,因此也是蛋白质泛素过程中最关键的分子。蛋白质泛素化修饰在多种疾病发生发展过程中发挥着关键作用。研究蛋白质泛素化修饰调控HRD发生的分子机制,并寻找新型治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值。已有文献报道,蛋白泛素化修饰在TGF-β1下游信号转导以及TAK1生物学功能的发挥着重要的作用,然而相关的E3泛素连接酶有待进一步的发现。在我们第一部分研究中已证实The tripartite motif 31（TRM31）参与并调控HRD小鼠肾功能损伤、纤维化和炎症反应。TRIM31是否通过调控TGF-β1信号通路在HRD中发挥作用,以及具体的分子机制有待进一步研究。因此,我们在本研究中提出了以下科学假说:TRIM31可通过泛素化修饰TGF-β1信号通路中的靶蛋白,从而参与到TGF-1P相关信号通路在HRD中的激活,进而在HRD病理进程中发挥保护作用。在本研究中,我们将通过体内和体外实验研究进一步探讨TRIM31在HRD中发挥作用的分子机制,为高血压肾损害的治疗寻找新的靶点。研究目的1.探讨在HRD病理进展中TRIM31对TGF-β1信号通路活化的影响;2.探讨TGF-β1信号通路TRIM31的靶分子;3.探讨TRIM31对靶分子的泛素化修饰情况;4.探讨TAK1在TGF-β1信号通路中的作用。研究方法1.实验动物分组分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRJM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRJM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组。2.HRD小鼠模型的建立将预先灌注好AngⅡ的微量渗透泵,分别埋入小鼠的背侧皮下,按照以1000ng/kg/min的泵速持续泵入AngⅡ42天,构建HRD小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠肾脏进行下一步组织和细胞分子学研究。3.临床髙血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β1、Collagen Ⅰ、pSmad3、TAK1、TNF-a、pP65的表达情况。4.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）、小鼠原代肾小管上皮细胞（Mouse Primary renal tubular eβ1thelial cells,MRPTEβ1C）、人胚肾细胞（HEK-293T）,分别培养在含10%FBS的RPMI1640、高糖DMEM培养基和Eβ1CM-A培养基中,于含5%CO2的37°C孵箱中增殖。主要处理见下:（1）HK2细胞处理:1)选择hTGF-β1作为HRD体外刺激因子。体外培养HK2细胞,给予不同浓度的hTGF-β1（0,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL）刺激24h或以10ng/mL的hTGF-β1刺激不同时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）,收集细胞;2)体外培养HK2细胞,给予TGF-β1中和抗体预处理后,以10-5 M浓度的AngⅡ刺激HK2细胞时间梯度（0,4h,8h,12h,24h,36h）,提取细胞蛋白;3)体外培养HK2细胞,利用RNAiMAX转染细胞TRIM31的小干扰RNA敲减TRIM31的表达,使用10ng/mL的hTGF-β1刺激细胞0、12h或24h,提取细胞蛋白;4)将构建的将Flag标签的TRIM31-WT、缺失突变体TRIM31-ΔRing以及点突变TRIM31-C53A/C56A过表达质粒利用Lipo3000转染试剂分别转染体外培养的HK2细胞,并利用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0或24h,提取细胞蛋白,进行Western blot实验;5)体外培养HK2细胞,lOng/mLhTGF-β1刺激0.5h或lh后,提取细胞蛋白,进行Western blot或免疫共沉淀实验（Co-immunopreciβ1tation,Co-IP）实验;6)体外培养HK2细胞系,利用TAK1的特异性抑制剂5z-7-oxozeaenol（5z7）抑制TAK1的激酶活性,或利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mLhTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（2）MRPTEpiC细胞处理:体外培养MRPTEpiC细胞,利用TAK1的特异性抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性,或者利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（3）HEK-293T细胞处理:1)将TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4的过表达质粒,与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。提取细胞蛋白进行Co-IP实验;2)将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,进行细胞免疫荧光染色;3)将TRIM31不同的截断突变体（TRIM31-ΔRing,TRIM31-AB,TRIM31-AC-C,TRIM31-AC）和TAK1的不同截断突变体（l-300aa,l-480aa,30I-579aa）,分别与野生型TAK1或者野生型TRIM31过表达质粒共转染入HEK293T细胞系,提取细胞蛋白进行Co-IP实验;4)将不同浓度的Flag-TRIM31过表达质粒与相同浓度Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系,提取细胞蛋白;5)将Flag-TRIM31与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系后培养24h,提取细胞蛋白前4h分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂氯喹（chloroquine）,提取细胞蛋白;6)将Flag标签的TRIM31-WT、TRIM31-ARing以及TRM31-C53A/C56A与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白;7)将HA标签的不同类型（WT、K48或K63）泛素过表达质粒,与Flag-TRIM31、Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白,进行CO-1P实验;8)将TAK1赖氨酸点突变过表达质粒Myc-TAK1-K72R、Myc-TAK1-K158R,分别与Flag-TRIM31和HA标签的泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,24h后提取蛋白,进行CO-IP实验。5.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠肾脏标本,剥除肾脏包膜后,分别放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定2448h以待后续实验使用。6.小鼠肾脏组织制备和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4pn）。利用IHC染色的方法检测4组小鼠肾脏组织中TGF-β1的表达差异。7.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因八Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、Jibronectin、a-sma、tnf-a、il-6和il-1β办的Ct值,利用P-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-AACT公式计算目的分子的相对表达量的变化。8.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。9.激光共聚焦检测TRIM31与TAK1的共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测TRIM31与TAK1在细胞内的共定位情况。10.表达载体和点突变的构建通过目的基因的引物设计、扩增、酶切和连接等步骤进行重组质粒和点突变质粒的构建和抽提,用于进一步的过表达和体外转录翻译实验。11.免疫共沉淀魏（Co-IP）体外培养HK2,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外培养HEK293T细胞,并构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外翻译系统表达目的分子蛋白,利用标签抗体进行Co-IP检测目的分子的外源性结合。12.细胞转染体外培养HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞,将TRIM31或TAK1的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减目的基因的表达。将过表达质粒利用Lip3000转染细胞进行目的基因的过表达。13.体外翻译系统进行体外蛋白表达实验构建含有T7启动子的PCDNA3.1过表达质粒,利用Promega公司的TNT Quick Coupied Transcription/translation System试剂盒进行网织红细胞体外转录翻译系统,或者利用Mini Expression Module试剂盒进行大肠杆菌体外翻译对TAK1和TRIM31等表达质粒进行体外转录翻译。14.体外泛素化修饰实验将体外翻译系统获得的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素修饰系统（包含有El,UbcH5a,K48,K63等蛋白）,室温反应30分钟后,利用Western blot的方法检测体外泛素化修饰的情况及泛素化修饰的类型。15.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表示为均数（mean）土标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.TGF-β1参与了AngⅡ诱导的小鼠高血压肾损害TGF-β1是高血压肾损伤和肾小管间质纤维化的关键细胞因子。Western blot、IHC和RT-PCR检测发现,TGF-β1在AngⅡ诱导的小鼠HRD的肾脏组织中的表达量明显增加,说明TGF-β1参与了HRD的疾病进展。同时,TGF-β1的表达量在TRIM31+/+和TRIM31I小鼠之间没有统计学差异,说明TRIM31的基因敲除并不影响TGF-β1在HRD肾脏中的表达量。2.TGF-β1抑制TRIM31的蛋白表达Western blot及RT-PCR结果显示,伴随hTGF-β1刺激HK2细胞不同时间或利用不同浓度的hTGF-β1刺激细胞,肾小管上皮细胞中TRIM31的表达均呈现显着降低。这些结果说明TGF-β1抑制TRIM31基因的转录和翻译,并提示TRIM31可能参与TGF-β1介导的信号通路。而在给予TGF-β1中和抗体预处理的情况下,Angll导致TRIM31蛋白水平下降的情况得以恢复。以上提示TGF-β1负向调控TRIM31的蛋白表达,而Angn对TRIM31的蛋白表达调控可能是通过TGF-β1发挥的。3.TRIM31负调控hTGF-β1介导的肾小管上皮细胞的纤维化及炎症反应Western blot和RT-PCR检测结果显示,TRIM31基因敲减能明显加重hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化进程和炎症相关指标的表达。野生型TRIM31基因过表达可明显改善hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。而过表达缺失E3泛素连接酶活性的TRIM31 Ring结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及E3泛素连接酶活性缺失点突变过表达质粒TRIM31-C53A/C56A不影响hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。以上结果说明,TRIM31通过其E3泛素连接酶活性抑制hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症反应。4.TRIM31介导了TGF-β1信号的通路活化经典Smad信号通路以及非Smad信号通路在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,其中Smad2、Smad3的磷酸化代表经典Smad信号通路活化,ERK、JNK、P38、NF-κB的磷酸化代表非Smad信号通路的活化。提取4组小鼠(TRIM31+/+生理盐水组,TRIM31-/+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组)肾脏蛋白,Western blot检测显示,相比野生型小鼠HRD肾脏组织,TRIM31-/-HRD小鼠肾脏组织中Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-κB磷酸化明显升高。体外培养HK2细胞,发现TRIM31基因敲减同样能明显增强TGF-β1诱导的经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化水平。以上结果说明TRIM31可负向调控TGF-β1信号通路的活化水平。5.明确了TGF-β1信号通路中TRIM31的靶分蛋白前期结果表明TRIM31可调控TGF-β1介导的信号通路,我们将重点寻找该信号通路中TRIM31作用的靶蛋白。将TGF-β1信号通路中关键接头分子TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4等的过表达质粒与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。利用Co-IP实验检测发现TRIM31与TRAF6、TAK1发生了明显的结合。同时体外培养HK2细胞,hTGF-β1刺激不同时间点后,利用TRIM31特异性抗体进行Co-IP实验,同样检测到了内源性TRIM31与TAK1、TRAF6的结合,同时发现伴随着hTGF-β1刺激时间的增加,HK2细胞中TRIM31与TAK1的结合呈现增多的趋势。以上结果提示TAK1、TRAF6可能是TGF-β1信号通路中TRIM31调控的靶分子。6.TRIM31靶向降解TAK1将浓度梯度的TRIM31过表达质粒与TRAF6或TAK1过表达质粒分别共转染HEK293T细胞系,利用Western blot的方法检测到TRIM31可降低TAK1蛋白表达量,并且存在浓度梯度依赖性。然而,TRM31的过表达并不影响TRAF6的蛋白表达量。我们同时发现,转染TRIM31-ARing以及TRIM31-C53A/C56A过表达质粒不影响TAK1的蛋白表达量。以上结果说明,TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性特异性降解TAK1,而对TRAF6的蛋白表达无影响。至此,我们确定TAK1为TGF-β1信号通路中TRIM31的结合及降解靶点。7.TRIM31对TAK1进行了蛋白酶体途径的降解泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是体内蛋白质发生降解的主要途径。我们将Flag标签的TRIM31过表达质粒与Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,培养24h后分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂chloroquine处理4h,提取细胞蛋白,利用Western blot的方法检测到蛋白酶体抑制剂Bortezomib可恢复TRIM31介导的TAK1降解,而溶酶体抑制剂chloroquine对TRIM31介导的TAK1降解无影响。以上说明TRIM31通过蛋白酶体途径介导TAK1的降解。8.TRIM31与TAK1在细胞浆中共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测发现TRIM31与TAK1在细胞中存在明显的共定位。9.TRIM31与TAK1体外结合利用大肠杆菌和网织红细胞体外翻译系统分别获得TRIM31和TAK1的体外表达蛋白,利用glutathione S-transferase（GST）pull-down实验和Co-IP的方法检测到体外表达的TRIM31与TAK1蛋白可发生直接结合。10.TRIM31与TAK1发生结合的结构域通过构建一系列TRIM31与TAK1的关键结构域截断突变体,共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31的130-425氨基酸序列与TAK1的1-300氨基酸序列分别在TRIM31与TAK1的结合中发挥着重要作用。11.TRIM31对TAK1进行了泛素化修饰前期结果证明TRIM31介导了TAK1蛋白酶体途径的降解,TRIM31作为E3泛素连接酶家族的一员,我们进一步探索了TRIM31是否是通过泛素化修饰TAK1进而介导其发生蛋白酶体途径降解。将泛素过表达质粒、TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31明显促进了TAK1的泛素化修饰,过表达泛素连接酶活性关键结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及泛素连接酶活性缺失点突变体TRIM31-C53A/C56A则没有此作用,说明TRIM31可促进TAK1的泛素化修饰,这一作用与TRIM31的E3泛素连接酶功能密切相关。作为对照,TRM31并不能促进接头分子TRAF6的泛素化修饰。12.证明TRIM31促进TAK1进行了K48位泛素化修饰前面验证了TRIM31可对TAK1进行泛素化修饰,为进一步探索TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的类型,我们分别将不同类型（WT、K48或K63）的泛素过表达质粒,与TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,泛素化实验表明TRIM31可明显促进TAK1 K48位的泛素化修饰。同时培养HK2细胞系,利用TRIM31小干扰RNA敲减TRIM31的表达,hTGF-β1刺激后,提取细胞蛋白,利用TAK1特异性抗体进行Co-IP,结果显示TRIM31同样可介导内源性TAK1蛋白的K48位的泛素化修饰。13.发现了TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的具体位点为了进一步探索TRIM31对TAK1上哪个赖氨酸位点进行了泛素化修饰,我们通过查阅文献发现TAK1上第158位赖氨酸位点和第72位赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,但调控这2个位点进行修饰的E3泛素连接酶却一直没有被发现。我们进一步构建了K158位和K72位赖氨酸突变的TAK1过表达质粒,分别与TRIM31过表达质粒和K48泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,通过泛素化实验检测发现TRIM31可对TAK1第72位赖氨酸进行了K48位的泛素化修饰。14.利用体外蛋白拥译系统和体外泛素化系统验证了TRIM31对TAK1的泛素化修饰为了进一步探索TRIM31是否直接对TAK1进行泛素化修饰,我们将TAK1和TRIM31分别构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达质粒上和含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达质粒上,然后利用Promega公司的TNT体外转录翻译系统对TAK1和TRIM31的表达质粒进行体外转录翻译,将翻译后的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素化修饰系统,利用Western blot的方法进一步证明了TRM31对TAK1进行了K48位的泛素化修饰。同时构建只保留K72位赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72）和只突变掉K72赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72R）的TAK1的点突变过表达质粒,并进行体外转录翻译得到Myc-TAKl、Myc-TAK1-K72、Myc-TAK1-K72R、FIag-TRIM31的蛋白,然后加入体外泛素化修饰系统,同样发现TRIM31只对含有K72位赖氨酸残基的TAK1进行泛素化修饰。以上结果共同说明了TRIM31可直接对TAK1的第72位赖氨酸进行K48位的泛素化修饰。15.TAK1介导了TGF-β1信号通路的活化体外培养HK2细胞系以及小鼠原代肾小管上皮细胞MRPTEβ1C,利用TAK1的抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性或者利用Si-RNA敲减TAK1的表达后,hTGF-β1介导的Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-kB磷酸化表达水平均明显下降。以上说明,在肾小管上皮细胞中,TAK1同时参与调控TGF-P1信号通路中经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化。16.临床患者TAK1、炎症、纤维化和TGF-β1信号通路与HRD的相关性从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁组织、无高血压的GML患者肾活检组织、HRD患者肾活检组织切片,并进行IHC检测。结果发现纤维化水平代表性指标Collagen Ⅰ、炎症水平代表性指标TNF-α、TGF-β1信号通路活化代表指标（TGF-β1、pSmad3、pP65）、以及TAK1的表达在HRD活检组织样本中明显增加。这些结果进一步提示我们,TAK1在HRD肾脏纤维化、炎症反应及疾病进展中可能发挥着重要作用。同时,伴随HRD疾病进展,TRIM31表达逐渐降低可能是导致TAK1表达升高及HRD疾病加重的重要原因。实验结论1.TRIM31参与了TGF-β1介导的肾脏纤维化和炎症反应;2.TRIM31通过靶向调控TAK1 K48位的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解进而负调控TGF-β1下游经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化,最终改善高血压肾损害。
武博[2]（2020）在《鸭舍环境微生物气溶胶监测及其对小鼠肺损伤与BEAS-2B细胞毒理机制的研究》文中研究指明大气当中的微生物与周围干燥的固体颗粒、液体小滴结合形成稳定的胶体体系,它能够随空气流动向周围扩散形成微生物气溶胶（Microbiological aerosols）。细菌和真菌是微生物气溶胶的主要组成成分,它们当中的致病或条件性致病微生物,对动物体和人体的健康构成一定程度的威胁,即使吸入高浓度的非病原微生物也会对动物体或人体产生免疫抑制。细颗粒物PM2.5（fine particles）是空气动力学直径小于等于2.5μm的微粒。PM2.5的粒径较小、表面积大,使其沉降速度变慢,传播距离增长,且能够进入到呼吸道的深部细支气管、肺泡等处,甚至通过气血交换进入到全身各处,对机体健康产生危害。PM2.5发挥其毒理学效应的基础是诱发机体氧化应激反应和炎症应答。流行病学大量研究显示,高浓度的PM2.5暴露能够诱导机体的氧化应激、炎症反应、细胞凋亡,引起呼吸系统、免疫系统、心血管系统等全身多个组织器官的损伤,使发病率和死亡率增加,甚至降低人类寿命。当前,国内外学者对于PM2.5的研究集中于对其理化性质的分析和研究以及其相应的致病机理方面,尚少见对于其中微生物成分及其作用的研究,而对于动物舍PM2.5的研究就更少了。自噬是细胞内发生物质循环的重要生理过程,对于维持细胞内环境稳态有非常重要的作用。自噬与许多疾病的发生相关,很多研究已经证明氧化应激是诱导细胞发生氧化损伤的常见途径,活性氧ROS（reactive oxygen species）是调节细胞存活和死亡过程中重要的信号分子,并且ROS可以通过不同的信号分子途径激活自噬。在此背景下,我们对鸭舍环境PM2.5进行采集,对其中的微生物成分（细菌和真菌）进行检测;为了揭示鸭舍PM2.5对动物和人体的危害,我们进行鸭舍PM2.5短期和长期暴露小鼠实验,明确其对哺乳动物肺部的病理损伤、氧化应激、细胞凋亡以及相关免疫因子表达的影响,将其对肺部的损伤进行一个全面的评估,并明确其中生物成分所起到的作用。此外,我们还进行体外实验,将PM2.5暴露于人支气管上皮细胞,对PM2.5诱导呼吸道炎性和氧化应激的分子机制进行进一步深入研究,揭示了ROS-SRC-STAT3轴在PM2.5诱导的BEAS-2B细胞自噬中起到重要作用。本研究包括以下五部分内容:1.鸭舍环境PM2.5中细菌和真菌的多样性分析本研究中鸭舍PM2.5浓度为112μg/m3-208μg/m3,大大超过我国的PM2.5标准值75μg/m3,这也意味着本研究中鸭舍的颗粒物对动物及动物舍从业人员的潜在健康威胁更大。通过16S高通量测序技术对细菌样品进行分析,五个鸭舍PM2.5共同含有的OTUs为160种,五个鸭舍A、B、C、D、E独有的OTUs分别为26、6、4、13、17,交叉性很高,表明采样鸭舍之间细菌样品组成相似性比较高。鸭舍样品在门分类水平上排名前五的物种有:Actinobacteria（放线菌）、Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Patescibacteria。Actinobacteria是绝对的优势物种。在属水平上排名前10的菌种依次是:Corynebacterium-1、Corynebacterium（棒状杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Romboutsia、Turicibacter（杆菌属）、Vagococcus（漫游球菌属）、Macrococcus（巨型球菌）、Jeotgalicoccus、Rothia（罗斯氏菌）、Aerococcus（气球菌）。Corynebacterium-1相对丰度最高,是绝对的优势物种。丰度较高的Corynebacterium（棒状杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Aerococcus（气球菌）属于致病或条件致病菌,对人体健康有潜在危害。通过ITS高通量测序技术对鸭舍真菌样品进行分析,五个鸭舍PM2.5共同含有的OTUs为96种,五个鸭舍A、B、C、D、E独有的OTUs分别为8、4、1、79、14,五个样品OTUs交叉性也很高,表明采样鸭舍之间真菌样品组成相似性比较高。在真菌门水平检测到Ascomycota（子囊菌门）和Basidiomycota（担子菌门）。在属水平上排名前10的菌种依次是:Aspergillus（曲霉菌）、Cladosporium（枝孢菌）、Trametes（栓菌属）、Alternaria（链格孢属）、unclassified.p.Ascomycota、Diutina、Schizophyllum（裂褶菌）、Bjerkandera（烟管菌）、Coprinellus（鬼伞属）、Mycosphaerella（球腔菌）。其中丰度最高的是Aspergillus（曲霉菌）,属于绝对优势物种。其中丰度排名前两位的Aspergillus（曲霉菌）、Cladosporium（枝孢菌）属于致病或条件致病菌,对人体健康有潜在危害。2.PM2.5(PM2.5-,PM2.5+)单一和重复暴露BALB/c小鼠后免疫相关因子的表达及肺部损伤的研究为了评估短时间和长时间暴露于鸭舍PM2.5对于肺部病理损伤和免疫应答的影响,我们进行小鼠PM2.5暴露实验。肺组织病理学结果显示PM2.5暴露会对肺部产生不同程度的病理损伤,Masson染色显示肺部出现纤维化病变,且重复暴露组的病理变化更为明显。针对与上皮细胞-间充质转化（EMT）密切相关的E.钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）双重免疫荧光显示,随着PM暴露时间的增长,上皮细胞标志蛋白E.钙黏蛋白（E-cadherin）表达量下调,间充质标志物波形蛋白的表达量上调,进一步证明肺部纤维化水平增加。针对Toll样受体的检测结果表明,TLR2、TLR4、TLR9的表达量与对照组相比显着上调,重复PM2.5+暴露组均极显着上调（P<0.01）,TLR3和TLR7的表达量没有显着的变化。这表明TLR2、TLR4、TLR9受体在识别PM成分过程中起到重要的作用,生物成分在其中的作用不容忽视。对于细胞因子的检测表明,重复暴露组TNF-α、IL-6、VEGFA的表达量与对照组相比显着上调（P<0.05）,表明它们是PM2.5暴露过程中发挥效应的主要细胞因子。总而言之,本部分试验初步确认了大气颗粒物及其微生物成分在哺乳动物的病理损伤及相关免疫应答反应的作用,为进一步研究其致病机制提供理论依据。3.PM2.5(PM2.5-,PM2.5+)单一和重复暴露BALB/c小鼠引起的肺部氧化应激和细胞凋亡的研究本部分研究评估了PM暴露以后小鼠肺组织氧化应激和细胞凋亡的影响。首先,对肺部的总抗氧化能力T-AOC、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX、丙二醛MDA这4个主要的氧化应激指标进行测定。与对照组相比,随着PM2.5暴露时间的增长,T-AOC、SOD、GSH-PX的表达量呈下降趋势,丙二醛MDA的表达量呈上升趋势,且相同暴露时间内PM2.5+暴露组对氧化应激各指标的影响均高于PM-2.5暴露组。这表明PM暴露能够降低肺部的抗氧化能力,增加脂质过氧化作用,引起机体的氧化应激损伤。对于PM2.5暴露以后肺部细胞凋亡的研究显示,PM2.5的暴露能引起小鼠细胞凋亡率明显的升高,且重复PM2.5+暴露组细胞凋亡率最高。总之,本部分研究表明PM2.5暴露能诱导机体发生一定程度的氧化应激反应和细胞凋亡,对机体健康产生危害。4.PM2.5暴露对BEAS-2B细胞细胞存活率的研究本部分研究初步探究了PM2.5暴露对Beas-2B细胞的细胞毒理学效应。将BEAS-2B细胞进行PM2.5的时间和浓度暴露实验,结果表明PM2.5暴露使细胞的存活率以时间和剂量依赖性方式显着降低,PM2.5暴露对BEAS-2B细胞产生一定的毒理学效应。上一部分的研究显示PM2.5暴露能诱导机体产生一定的氧化应激效应,因此我们对PM2.5暴露过程中Beas-2B细胞产生的活性氧ROS进行检测,随着暴露时间的增长,ROS的产生量增多。接下来我们使用ROS的清除剂NAC（N-acetyl-L-cysteine）预处理细胞然后进行PM2.5暴露,发现NAC预处理能够一定程度缓解PM2.5对细胞存活率的影响。本部分研究结果与动物实验类似,PM2.5暴露也能够使细胞发生氧化应激反应,并对BEAS-2B细胞活力产生影响。5.PM2.5暴露对BEAS-2B细胞细胞自噬及相关信号通路的研究本部分研究针对PM2.5暴露诱导的自噬及其介导的信号通路的研究。PM2.5暴露于BEAS-2B细胞后,首先通过电镜和StubRFP-SensGFP-LC3慢病毒感染实验,明确PM2.5能够诱导BEAS-2B细胞自噬且自噬流顺畅。为了检测SRC/STAT3信号通路是否参与到鸭舍PM2.5诱导BEAS-2B细胞发生自噬的过程中。首先,通过Western Blot实验表明,PM2.5的暴露能够使SRC和STAT3的磷酸化水平呈浓度依赖性增加。对SRC干扰后进行PM2.5暴露,发现STAT3的磷酸化被抑制。当使用自噬抑制剂3-MA预处理细胞后进行PM2.5暴露,SRC、STAT3的磷酸化都能被显着抑制。以上结果表明PM2.5暴露可以通过介导SRC/STAT3通路诱导BEAS-2B细胞自噬。为了验证ROS在PM2.5暴露中的作用,使用ROS的清除剂NAC预处理细胞后进行PM2.5的暴露,表明NAC能够一定程度上影响到PM2.5对SRC/STAT3的表达。以上实验共同证明PM2.5暴露可以通过介导ROS-SRC-STAT3途径在支气管上皮细胞中诱导自噬。总之,本研究为深入探究鸭舍环境PM2.5暴露诱导肺部病理损伤的机制奠定了基础,对PM2.5致呼吸系统疾病的防治提供了新思路。
沈荣[3]（2019）在《三种氟喹诺酮药物的生物毒性研究》文中研究说明氟喹诺酮（Fluoroquinolones,FQs）药物是治疗细菌性感染疾病的高效广谱抗菌药,使用量大,应用广泛。人畜服用后,大部分FQs不能被充分吸收利用,多以原药或活性代谢物形式排泄出机体,随后进入环境,成为一种假持久性新型污染物,对环境和人类健康构成严重威胁,由此带来的环境风险和生态风险已引起国际社会的广泛关注。论文选取使用量最大的环丙沙星（Ciprofloxacin,CPFX）、最新一代的加替沙星（Gatifloxacin,GTFX）和人兽共用的培氟沙星（Pefilxacin,PFLX）这三种FQs药物为代表。采用荧光光谱、同步荧光和计算模拟等方法,研究它们与人血清蛋白（HSA）和脱氧核糖核酸（DNA）的相互作用,从分子水平分析FQs与生物大分子的作用方式和结合性能。利用动物模型暴露的方法,研究三种FQs暴露对斑马鱼胚胎和仔鱼的发育毒性,并从基因表达层面阐明FQs对斑马鱼心血管系统作用的分子机制。研究内容主要包括以下四个方面:（1）通过胚胎暴露实验,研究CPFX、GTFX和PFLX的跨膜作用,具体结果如下:胚胎暴露于FQs中,动力学研究发现CPFX、GTFX和PFLX迁移分为快速扩散和慢速转运两个阶段,其中CPFX和PFLX扩散速度快,GTFX扩散较慢。在跨膜过程,三种FQs均可与胚胎膜发生非共价键相互作用。CPFX和PFLX与胚胎膜作用符合Langmuir等温吸附模型,最大结合比分别为1.22μmol/embryo和3.79μmol/embryo,热力学结合常数分别为55.3 L/μmol和4.00×102 L/μmol。GTFX由于具有一定的疏水性,与胚胎作用时分为两个阶段。低浓度（23.12μM-69.4μM）时,符合经典的Pesavento分配规律,GTFX在胚胎上的分配系数为29.60μL/embryo;高浓度（116μM-694μM）时,符合Langmuir吸附模型,最大结合比为0.17μmol/embryo,热力学结合常数为4.93×102 L/μmol。CPFX和PFLX更容易在胚胎膜外吸附、聚集,少量会通过膜蛋白转运作用被携带进入胞质。而GTFX更容易通过疏水作用穿过膜脂进入胞质,但高浓度时由于自聚作用和氢键加强,大部分则堆积在胚胎膜外。研究阐明了跨膜过程中FQs与胚胎膜的作用形式。（2）研究CPFX、GTFX和PFLX与HSA和DNA生物大分子相互作用,分析其可能的致毒类型,具体结果如下:CPFX、GTFX和PFLX与HSA和DNA之间的相互作用主要都是疏水作用。其中GTFX与HSA及DNA之间是典型的疏水作用;以离子态形式存在的CPFX和PFLX与HSA及DNA之间主要是静电和疏水作用,分子模拟与热力学计算结果一致。FQs-HSA和FQs-DNA的作用力强弱顺序一致,由强到弱依次为:GTFX>CPFX>PFLX。由于疏水堆积和氢键共同作用,GTFX相对更容易进入HSA内部疏水区和DNA碱基对,引起代谢毒性和基因功能障碍,而CPFX和PFLX难以引起代谢毒性。研究为毒性效应分析提供理论依据。（3）采用动物模型暴露的方法,对斑马鱼胚胎和仔鱼进行暴露实验,从胚胎自主运动、孵化率、胚胎和仔鱼存活率及致畸效应等方面评价CPFX、GTFX和PFLX的发育急性毒性,具体结果如下:自主运动毒性（抑制）顺序为:GTFX>CPFX>PFLX,这与GTFX、CPFX和PFLX跨膜难易顺序相一致。因此初步判定容易跨膜的FQs对斑马鱼自主运动毒性更大。CPFX（0.68 mM-3.40 mM）暴露使胚胎孵化延迟,GTFX（2.66 mM-5.33 mM）刺激孵化,但对最终孵化率影响不大（p>0.05）,而PFXC（2.13 mM-15.97 mM）暴露显着抑制胚胎孵化（p<0.05）。这可能与胚胎膜通透性有一定关系,因为PFXC与膜结合分子数是CPFX的三倍,即PFXC更容易在胚胎膜表面形成积累,阻塞膜通道,从而影响正常孵化。这三种FQs暴露胚胎和仔鱼存活率都随暴露时间和浓度的增大而减小。同时,失去绒毛膜保护的仔鱼对FQs暴露表现出更高敏感性。其中,CPFX暴露3 d胚胎和仔鱼的LC50值分别为2.271 mM和1.629mM;GTFX暴露5 d胚胎和仔鱼的LC50值分别为5.224 mM和3.169 mM;PFLX暴露4 d胚胎和仔鱼的LC50值分别为8.446 mM和5.728 mM。GTFX显着抑制胚胎心率（p<0.05）,致畸效应明显,胚胎出现心包水肿、卵黄囊肿大、脊椎弯曲等畸形症状。这是由于胚胎膜表面吸附的GTFX易通过疏水作用突破胚胎膜,与血液中血清蛋白（SA）结合能力强,而且易与DNA结合影响基因表达,进而造成代谢毒性和基因功能障碍。而CPFX和PFLX对胚胎心率没有影响（p>0.05）,对胚胎也没有致畸毒性。这是因为大部分的CPFX和PFLX被吸附在胚胎膜表面,只有极少量通过膜蛋白转运作用进入膜内部,而且与SA及DNA的结合能力较弱,不足以诱发形态异常。（4）进一步研究了CPFX和GTFX对斑马鱼心血管系统影响的相关基因表达,为揭示其致毒分子机理提供了重要信息。具体结果如下:CPFX（0.41 mM-5.05 mM）暴露未诱发斑马鱼心包水肿、血栓及出血,但会导致心脏功能受损,使心率减慢,同时抑制了心输出血量和血流速度。GTFX（1.12 mM-11.18 mM）暴露诱发斑马鱼心血管形态异常（心包水肿）,导致心血管功能受损（心动过缓和循环异常）,但未发现斑马鱼心房心室组织结构变化。通过对负责钙离子转运、编码肌浆网上的钙离子受体的ATP-酶相关基因（atp2a1l）、控制电压依赖性钙离子通道相关基因（cacna1ab）和心肌肌钙蛋白C调控基因（tnnc1a）表达谱分析,发现CPFX能够显着性抑制tnnc1a和atp2a1l的表达,对cacna1ab基因表达有促进趋势。而GTFX显着抑制atp2a1l基因的表达,表现出抑制tnnc1a基因表达的趋势,但不影响cacna1ab基因表达。CPFX和GTFX诱导心血管毒性的分子机制可能主要是通过atp2a1l下调,使钙离子转运和编码肌浆网上钙离子受体的功能受到抑制;通过tnnc1a下调,抑制心肌收缩;从而引起心脏功能紊乱。论文首次综合分析三种FQs与胚胎膜、生物大分子和个体毒性特征间的相关性。从微观（基因）到个体（分子、胚胎、群体）系统性开展了研究。从膜吸附、分子作用、基因表达和毒性表现四个层次揭示FQs环境污染物的致毒机理。研究成果可为FQs的生态毒理学提供更多的信息,有望为水环境中FQs的环境质量标准制定,环境药品监管和风险评估提供实验基础。
马瑞[4]（2019）在《水溶性聚合物改性氯硝柳胺的制备及性能》文中进行了进一步梳理氯硝柳胺是经FDA批准的临床抗寄生虫药,可通过抑制或调节Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB和Notch信号通路治疗癌症、心血管疾病和糖尿病等多种疾病。但是,氯硝柳胺在水中溶解度极低,口服生物利用度差,限制了氯硝柳胺的应用。聚合物前药技术具有增加疏水性药物的水溶性、提高药物的生物利用度和改善药物动力学特征等特点,因此,基于聚合物前药技术,通过水溶性聚合物改性氯硝柳胺有望提高氯硝柳胺的水溶性和生物利用度,是氯硝柳胺药物开发的重要研究方向。本文通过酯化反应制备了氯硝柳胺丙烯酸酯和氯硝柳胺甲基丙烯酸酯单体,采用自由基聚合法制备了三种水溶性聚合物改性氯硝柳胺,以聚乙二醇氯硝柳胺为载体制备了负载单体氯硝柳胺的胶束;研究了三种水溶性聚合物改性氯硝柳胺和载药胶束的化学结构、溶解性、药物释放性能以及生物学活性,分析了不同水溶性聚合物改性氯硝柳胺和胶束的增溶及药物释放机理。对于聚甲基丙烯酸改性氯硝柳胺（PMAN）的研究结果表明,本文中合成的PMAN分子量为5318Da,PDI为1.19,载药率为6.3%,使氯硝柳胺在水中的溶解度提高8万倍以上。在苯肾上腺素（PE）和高K+（KPSS）诱导的血管收缩模型中,PMAN对内皮完整或去内皮的大鼠肠系膜动脉均有剂量依赖性的血管舒张作用。对于聚N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺改性氯硝柳胺（pHPMA-Nic）的研究结果表明,本文合成的pHPMA-Nic载药率分别为6.7%、10.1%和17.3%;载药率为6.7%时,随着pHPMA-Nic在水中浓度增加,pHPMA-Nic从球形逐渐通过亲水链段缠结缔结成网络,氯硝柳胺疏水链段趋于形成细小的疏水内核均匀分布在网络中,而不发生疏水基团团聚。pHPMA-Nic可使氯硝柳胺在水中溶解度提高10万倍以上,且溶解度随着载药率增加而降低。载药率超过10%时,pHPMA-Nic的疏水链段倾向发生团聚,随着pHPMA-Nic浓度增加疏水核区直径增大,最终导致聚合物析出;pHPMA-Nic对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。对聚乙二醇改性氯硝柳胺（mPEG-Nic）的研究结果表明,本文成功合成可以灵活调控载药率的系列mPEG-Nic。mPEG-Nic可将氯硝柳胺溶解性提高9000倍以上,且聚合物前药在水中溶解度随着载药率增加而降低。mPEG-Nic胶束直径在25nm-400nm之间,胶束粒径随着载药率增加而增加;mPEG-Nic体外药物释放对一级药物释放模型具有更高的拟合优度,随着载药率增加药物释放速度降低。mPEG-Nic通过小鼠腹腔注射给药能够抑制STAT3信号的活性,抑制体内肿瘤生长,并无显着体内毒性。对于以mPEG-Nic为载体的氯硝柳胺载药胶束Nic@mPEG-Nic的研究结果表明,mPEG-Nic能够有效的负载氯硝柳胺单体药物,随着mPEG-Nic加入量增加,包封率增加,载药率下降。包封率最高可达58.2%,载药率最高可达16.6%。随着载药率增加,胶束粒径减小,粒径分布变均一,粒径范围在100nm-350nm之间。Nic@mPEG-Nic胶束的药物释放符合一级药物释放模型,药物释放速率随着载体含量增加而增加。此外,Nic@mPEG-Nic胶束孵育48 h对HCT-116肿瘤细胞表现明显的抑制作用。
胡怡[5]（2018）在《系列褐藻胶寡糖通过调控sGC表达对大鼠肺动脉高压影响的研究》文中研究指明目的:肺动脉高压（PAH）是由多种原因引起的肺动脉压力异常升高的病理生理状态,是存在于多种临床疾病中的一种血流动力学障碍,其病理生理学特点是在缺氧、炎性反应、血流异常剪切力等诱发下,异常产生的血管活性物质和细胞因子,作用于血管内皮和血管平滑肌等靶细胞,导致肺血管异常收缩、生长、重构及细胞外基质堆积等,最终形成肺动脉高压。肺动脉高压的临床表现缺乏特异性,很难做到早期发现和早期诊断、治疗,其临床特征是肺血管阻力逐渐上升,导致右心衰竭,最终引起全身静脉充血和器官灌注受损。肺动脉高压患者预后差,致死率及致残率极高。肺动脉高压严重影响患者生活质量,威胁患者生命健康,目前仍然是一个慢性不可治愈的疾病,其导致的肺源性心脏病是人类死亡的常见原因。迄今为止针对肺动脉高压研发出不同机制的多种药物,尽管取得一些研究成果,但目前临床仍缺乏有效治疗尤其是药物治疗手段,已上市药物种类少、价格昂贵、副作用多、疗效欠佳,未上市的药物处于实验研发及临床试验阶段,尚未临床应用。因此开发安全、有效、质优、价廉的降低肺动脉高压的药物对广大饱受疾病痛苦、经济负担折磨的肺动脉高压患者具有重要意义。海洋多糖来源丰富,海洋动物、海洋植物、海洋微生物都能合成出不同于陆地植物的带有大量电荷的多糖。海洋多糖具有如抗凝、抗血栓、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性,但因其存在凝胶性强、黏度大、水溶性差、不易被吸收等缺点,因而限制了多糖在生物医药等领域的应用。近年来随着海洋科学研究的发展深入,具有多种生物活性的多糖降解产物-寡糖逐渐进入人们的视野。褐藻胶寡糖（AOS）,是由海藻酸钠降解而成的一种寡聚物,由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过1-4糖苷键连接形成的线型嵌段化合物,具有促进植物生长和诱导抗逆性、抗凝血、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、神经保护、诱导细胞因子的产生、免疫调节等生物学活性,且褐藻胶寡糖的寡糖组成、分子量（聚合度）、端基糖环结构对褐藻胶寡糖的抗氧化活性的影响不同。可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）是一个以原卟啉IX型血红素为辅基,α、β两个亚基组成的异源二聚体,每种亚基又有2种异构体,分别命名为α1、α2和β1、β2,在肺组织中sGC主要以α1、β1亚基形式存在。一氧化氮（NO）作为一种内皮源性舒张因子在调控血管张力、细胞增殖、迁移和凋亡中起着重要作用。sGC是NO的细胞内唯一受体,催化三磷酸鸟苷产生细胞内第二信使分子环鸟苷酸,参与平滑肌收缩舒张、抑制血小板聚集、调控细胞增殖及凋亡、神经突触的信号传递等。在机体中,除了经典的内皮依赖的NO激活sGC通路（NO-sGC通路）对维持肺动脉低阻力起着重要作用外,还存在一条内皮不依赖的、与活性氧代谢产物有关的sGC激活通路,即H2O2-sGC通路,它们一起参与血管张力和器官血流状态的调节。基于上述原因,本研究初步探索是否可以利用褐藻胶寡糖抗氧化、清除氧自由基等生物学活性,通过调控sGC靶点,激活H2O2-sGC通路,从而改善大鼠肺动脉高压,进而对系列褐藻胶寡糖构效与量效进行对比研究,筛选拟应用于肺动脉高压防治的最佳药物,为肺动脉高压临床治疗提供更安全、更有效的方法。方法:1.采用一次性腹腔注射野百合碱（MCT）60 mg/kg,制备大鼠肺动脉高压模型,5周后,应用Vevo2100型超高分辨率小动物超声实时分子影像系统测量大鼠肺动脉加速时间（PAT）、肺动脉射血时间（ET）、肺动脉内径（PAD）、舒张末期右心室内径（RVIDd）、收缩末期右心室内径（RVIDs）,计算PAT/ET,取平均值,并应用右心导管法对大鼠进行血流动力学检测,评估造模情况。2.首先检测不同结构褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压的影响,将大鼠随机分组:PAH组（与PAH+M-3K-H组等量生理盐水）、PAH+PGE1组(前列地尔5ug·kg-1·d-1)、PAH+M-3K-H group(M-3K 20mg·kg-1·d-1)、PAH+M-6K-H group(M-6K20mg·kg-1·d-1)、PAH+G-3K-H group(G-3K 20mg·kg-1·d-1)、PAH+G-6K-H group(G-6K 20mg·kg-1·d-1)和Control组(生理盐水1ml·只-1·d-1),其次检测不同剂量褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压的影响,将大鼠随机分组:PAH组（与PAH+M-3K-H组等量生理盐水）、PAH+PGE1组(前列地尔5ug·kg-1·d-1)、PAH+M-3K-L group(M-3K 5mg·kg-1·d-1)、PAH+M-3K-M group(M-3K 10mg·kg-1·d-1)、PAH+M-3K-H group(M-3K 20mg·kg-1·d-1)和Control组(生理盐水1ml·只-1·d-1),通过检测各组大鼠右心室肥厚指数、大鼠心脏超声指标,HE染色法、透射电镜观察肺组织和肺动脉超微结构,并通过Masson染色、Van Gieson染色、弹力纤维染色观察肺组织及肺动脉血管重构状况,对各组指标进行统计学比较,评价褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压的影响,并观察不同结构、不同剂量的褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压有何不同的影响。3.采用免疫组化、原位杂交、Westernblot、ELISA等方法,分别研究不同结构、不同剂量褐藻胶寡糖是否可以通过调控sGC靶点改善大鼠肺动脉高压,并观察其对sGC靶点的激活有何不同。结果:1.腹腔注射野百合碱5周后,大鼠出现喘息、口唇紫绀、呼吸声粗、活动耐力下降等症状。心脏超声结果显示,与Control组相比,MCT组中PAT、PAT/ET明显降低,差异有统计学意义(**P<0.01),MCT组中RVIDd、RVIDs、PAD明显升高,差异有统计学意义(**P<0.01、*P<0.05)。右心导管实验结果显示,Control组右心室收缩压（RVSP）是14.64±1.096 mmHg,MCT组RVSP是56.30±1.243 mmHg,与Control组相比,MCT组RVSP明显升高,差异有统计学意义(**P<0.01)。2.右心室肥厚指数检测结果显示,与Control组相比较,PAH组右心室肥厚指数（RVHI）明显升高,**P<0.01,与PAH组相比较,各给药组RVHI不同程度地降低,##P<0.01,其中,以PAH+M-3K-H组RVHI降低最为明显。心脏超声指标比较结果显示,与Control组相比较,PAH组PAD、RVIDd、RVIDs明显升高,**P<0.01或*P<0.05,PAT、PAT/ET明显降低,**P<0.01,与PAH组相比较,各给药组上述指标均有不同程度地改善,其中,以PAH+M-3K-H组改善最为明显。组织学观察结果显示,褐藻胶寡糖可以改善肺动脉高压大鼠肺组织和肺动脉的结构紊乱,降低肺动脉血管壁厚度,使血管腔扩大,减少原位血栓形成,减轻炎性细胞浸润及胶原纤维增生,降低血管重构程度,且该作用与寡糖组分和分子量有关系,M组分效果优于G组分,分子量3K效果优于分子量6K。3.免疫组化、原位杂交实验结果显示,与Control组相比较,PAH组sGCα1、sGCβ1蛋白表达明显降低,**P<0.01,与PAH组相比较,各给药组sGCα1、sGCβ1蛋白表达不同程度地升高,##P<0.01或#P<0.05,其中,以PAH+M-3K-H组升高最为显着。Westernblot、ELISA等实验结果显示,与Control组相比较,PAH组SOD水平、CAT水平、sGCα1及sGCβ1蛋白表达、cGMP含量明显降低,**P<0.01,与PAH组相比较,各给药组SOD水平、CAT水平、sGCα1及sGCβ1蛋白表达、cGMP含量不同程度地增加,##P<0.01或#P<0.05,其中,以PAH+M-3K-H组增加最为显着,且该作用与寡糖组分和分子量有关系,M组分效果优于G组分,分子量3K效果优于分子量6K。结论:1.褐藻胶寡糖可以改善肺动脉高压大鼠肺组织的结构紊乱、肺动脉血管重构,进而降低肺动脉压力,降低右心负荷,改善右心室重构。2.褐藻胶寡糖通过发挥清除氧自由基、抗氧化的生物学活性,可以增加肺组织SOD、CAT含量,进而激活sGC靶点及H2O2-sGC-cGMP通路,使肺泡血管平滑肌松弛,降低肺动脉压力,改善肺泡通气/血流比,从而缓解肺动脉高压症状。3.褐藻胶寡糖的作用效果与寡糖组分和分子量有关系,M组分效果优于G组分,分子量3K效果优于分子量6K。
黄贝贝[6]（2018）在《吗啡对小鼠体内氯吡格雷代谢活化和抗血小板作用的影响》文中研究表明背景:氯吡格雷（clopidogrel,CLP）是一种口服的抗血小板药物。目前,CLP是预防急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）或经皮冠脉介入术（percutaneous coronary intervention,PCI）植入支架患者血栓形成的主要药物之一。已有的临床报道显示,急性心肌梗死患者被联合给予CLP和吗啡时,CLP的抗血小板作用减弱,但一般认为这是由于吗啡抑制胃肠道蠕动而影响了CLP的肠道吸收所致。目的:检测CLP合用吗啡或CLP单独使用时,CLP在小鼠体内的药物代谢动力学的改变,以及不同剂量的吗啡对CLP在小鼠体内抗血小板作用的影响的差异,探讨吗啡对CLP代谢过程和抗血小板作用的影响及其可能机制。方法:（1）雄性C57BL/6小鼠皮下注射不同剂量吗啡（0、2.5、5、10 mg/kg）后,灌胃给予单剂量CLP（10 mg/kg）分别于0.083、0.25、0.5、0.75、1.25、2、3、5、8、12、24、36、48 h收集血样,采用超高效液相色谱-质谱联用（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）法检测CLP及其各主要代谢产物的血浓度,并计算其相应的药代动力学参数。（2）雄性C57BL/6小鼠皮下注射单剂量吗啡（5 mg/kg）后,灌胃给予单剂量CLP（10 mg/kg）分别于1、1.5、2 h后采集血样,以10μM腺苷二磷酸（adenosine diphosphate,ADP）为血小板聚集诱导剂,采用全血电阻法检测血小板聚集率,并据此计算CLP对血小板聚集的抑制率。（3）雄性C57BL/6小鼠皮下注射不同剂量吗啡（0、2.5、5、10 mg/kg）后,灌胃给予单剂量CLP（10 mg/kg）于1h后采集血样,以10μM ADP为血小板聚集诱导剂,采用全血电阻法检测血小板聚集率,并据此计算CLP对血小板聚集的抑制率。（4）选用人肝微粒体（human liver microsome,HLM）和7种人重组rUGT（recombinant uridine diphosphate glucuronosyltransferase,rUGT）亚型,以胸苷叠氮、吉非贝齐、丙泊酚、氟康唑分别鉴定HLM中参与氯吡格雷羧酸代谢物（clopidogrel carboxylate,CLP-C）葡萄糖醛酸化的主要同工酶亚型及其贡献率。结果:（1）与单独使用CLP组相比,预先给予2.5、5、10 mg/kg吗啡后,CLP的血浆药物浓度-时间曲线下面积（area under the plasma drug concentration-time cure,AUC）分别减少了57.9%、35.8%和44.3%;峰值浓度(maximum plasma drug concentration,Cmax)降低了73.5%、64.4%和72.7%;而Tmax仅在联合给予5 mg/kg吗啡时延迟了333.7%,在其他剂量组间无显着变化,其血浆清除率（clearance,CL）在联合给予2.5 mg/kg吗啡时加快了124.4%。相应地,CLP活性代谢产物（clopidogrel active metabolite derivative,CAMD）的Cmax均显着下降了32.7%、60.8%和65.4%。氯吡格雷葡萄糖醛酸结合物（clopidogrel acyl glucuronide,CLP-G）的AUC分别增加了44.3%、43.3%和48.8%。（2）和对照组相比,合用单剂量吗啡可显着地抑制CLP的抗血小板作用（同血小板聚集率由80.7%下降至54.0%）,但无显着时间依赖性。（3）在给予3个不同剂量的吗啡后,CLP抗血小板作用分别降低了25.3%、35.2%和51.9%,低剂量和中剂量之间的抗血小板作用无显着差异,但低剂量和高剂量之间具有显着差异。（4）7种UGT中,UGT2B7是参与CLP-C葡萄糖糖醛酸的主要UGT亚型,其相对贡献率为58.6%。UGT1A9贡献率少（约为3%）,其他亚型贡献小。结论:CLP与吗啡合用后,CLP的系统生物利用度显着降低,其活性代谢产物CAMD的生成显着降低,而其葡萄糖醛酸结合物CLP-G的生成显着增加。两药合用后,CLP的抗血小板作用显着降低。
张雪[7]（2018）在《盐酸戊乙奎醚注射液在急性有机磷农药中毒救治中应用剂量与安全性研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨PHC在AOPP救治中的应用剂量,分析其安全性。方法:选取从2015年12月到2017年12月,于我院急诊及EICU住院的AOPP患者123例,随机分为标准剂量组和观察剂量组,两组均联合氯解磷定治疗。观察剂量组根据中毒程度轻、中、重度,分别给予肌注PHC首剂量0.51mg、1mg、12mg,达戊乙奎醚化后,分别给予PHC 0.5mg（q8-12h）,1mg（q6-8h）,1mg（q6-8h）维持治疗;标准剂量组根据中毒程度轻、中、重度,分别给予肌注PHC首剂量12mg、24mg、46mg,达戊乙奎醚化后,再给予PHC 12mg,每812小时1次维持治疗。两组均尽早联合氯解磷定治疗。观察两组患者的用药情况、中毒症状消失时间、ChE活性恢复情况、呼吸机上机时间、平均住院天数及不良反应情况。结果:观察剂量组与标准剂量组相比,呼吸及上机时间、平均住院天数、中毒症状消失时间、胆碱酯酶活力恢复情况、反跳、IMS的发生,差异均无统计学意义（P>0.05）。观察剂量组首次给药量、总给药量较标准剂量组少,差异均有统计学意义（P<0.05）,不良反应方面,谵妄、心动过速、高热、长托宁依赖的发生率较标准剂量组低,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论标准剂量组与观察剂量组治疗AOPP方案相比,不良反应少,临床效果不变。
解春花,丑凯平,刘洋,金宏伟[8]（2017）在《毛果芸香碱对心律失常保护作用的研究》文中提出目的观察毛果芸香碱对动物心律失常模型的作用。方法分别以乌头碱和氯化钡制造动物心律失常模型,观察毛果芸香碱（0.2mg/kg）对心律失常的影响。结果毛果芸香碱可明显延迟乌头碱引起的大鼠室性心律失常的出现（P<0.05）;延长大鼠出现心律失常后的存活时间（P<0.05）;毛果芸香碱可明显延迟氯化钡引起的大鼠双向室性心律失常的出现（P<0.05）、缩短大鼠心律失常的持续时间（P<0.05）。4-DAMP可完全拮抗毛果芸香碱诱导的心律失常。结论毛果芸香碱通过激动大鼠心肌M3受体而产生对抗乌头碱和氯化钡诱发大鼠心律失常的作用。
陈晓文[9]（2017）在《基于多靶点新型抗精神分裂候选药物的发现与研究》文中指出精神分裂症是精神性疾病中最严重、危害最大的一种,被称为精神类疾病中的“肿瘤”。该病病因复杂,病程长,致残率高,为家庭及社会带来沉重的经济和社会负担。非经典抗精神分裂症药对阳性、阴性症状有效,但对认知障碍几无改善作用,难以满足临床。此外,该类药物引起体重增加等多种副作用,降低患者顺应性。因此需开发结构新颖、副作用小、广谱的新型抗精神分裂症药,满足临床需求。目前,作用于多巴胺和5-HT系统的多靶点抗精神分裂症药物研究为该领域的重要方向。本文进行作用于D2/D3/5-HT1A/5-HT2A受体、兼具D2/D3受体亚型选择性（优选结合D3）类化合物的设计合成和体内外活性研究工作,寻找体内外活性明确、安全性高并具自主知识产权的新型抗精神分裂症活性分子。通过对优选化合物体内外活性、药代特性及安全性评价等成药性比较研究,发现了候选新药SIPI6398。本文研究内容及成果主要为以下五个方面:1、基于多靶点特征的新化合物设计以D2/D3/5-HT1A/5-HT2A受体为作用靶标通过先导化合物的发现和结构优化,设计AH八类共90个新化合物。首先以课题组前期发现的先导结构SIPI6390为基本骨架,经酰胺、连接链、芳基哌嗪三部分结构衍生化,设计环己基胺类（A类）化合物;以A类活性化合物SIPI6414为先导结构,考察刚性的酰胺基团对受体亲和力的影响,设计芳基恶唑烷酮类（B类）化合物;以A类活性化合物SIPI6398为先导结构,引入哌啶环或哌啶氨基,以提高水溶性、避免生成顺反异构体,定向设计哌啶类（C类）化合物;基于C类化合物研究结果,引入联胺结构,定向设计联胺类（D类）化合物;以丁基胺为基本骨架,采用药效团变换的方式,引入具5-HT受体作用药效团,设计丁基胺基类（E类）化合物;以课题组前期发现的候选新药SIPI6360为先导结构,引入刚性基团,设计二氢喹啉酮类（F类）化合物;基于F类化合物研究结果,结合计算机虚拟筛选,设计环丙基胺类（G类）和双芳基哌嗪类（H类）化合物。2、新化合物体外受体亲和力及构效关系分析（1）A类化合物对四个受体亲和力均为纳摩尔级,大部分化合物对5-HT2A亲和力为亚纳摩尔级,显着强于阳性药卡利拉嗪(5-HT2A,Ki=23.00 nM)。同时,部分化合物D2/D3受体亚型选择性为1030倍、5-HT2A亲和力强于D2（Ki ratio=1.3-12.6）,符合非经典抗精神分裂症药受体药理学特征,达到设计思想的要求。构效关系表明:a)酰胺部分引入芳基脲、氨基甲酸酯或芳基甲酰基,有利于D2、D3亲和力及D2/D3受体亚型选择性的提高;b)酰胺氮原子甲基化对D3亲和力、D2/D3受体亚型选择性无明显影响;c)酰胺羰基与“NH”间插入碳原子,D2、D3、5-HT1A亲和力及D2/D3受体亚型选择性均降低;d)环己基反式构型有利于D2、D3亲和力及D2/D3受体亚型选择性的提高;e)芳基哌嗪结构中苯并异噻唑基6位取代降低5-HT1A亲和力。（2）B类化合物体外受体亲和力结果与A类化合物相似。其酰胺基团及酰胺氮原子环化后降低与D3亲和力及对D2/D3受体亚型选择性;酰胺羰基芳构化有利于提高与D3亲和力及对D2/D3受体亚型选择性。（3）C、E、H三类化合物对四个受体亲和力较弱;D类化合物SIPI7710受体药理学特征与SIPI6398相似,具进一步研究价值。（4）F类化合物SIPI7697和部分G类化合物对D2、D3受体具强或中等强度亲和力,同时具一定的D2/D3受体亚型选择性（Ki ratio,58）,具进一步研究价值。3、优选化合物成药性比较试验及候选新药SIPI6398的深入研究基于体外受体亲和力研究结果,首先选择A类化合物SIPI6398、SIPI6414、SIPI6427、SIPI6441进行成药性比较研究。实验结果表明,SIPI6398靶点选择性良好,为D2/D3/5-HT1A/5-HT2A受体拮抗剂,亚急性毒性低,体内无蓄积,无致突变性,潜在心脏毒性低,体内抗精神分裂症阳性、阴性症状活性显着,尤其在多个模型下对认知障碍改善明显,脑靶向性强,镇静副作用弱于卡利拉嗪,镇静剂量与药效剂量分离,锥体外系副作用低于上市药利培酮,具有作为新型抗精神分裂症候选药物深入开发的价值。4、梯队活性化合物的发现选择B类化合物SIPI6437、SIPI7685、SIPI7686、SIPI7693和D类化合物SIPI7710进行比较性研究,发现SIPI7686体外代谢稳定性良好、hERG钾离子通道亲和力低,SIPI7710口服吸收良好、脑靶向性强,hERG钾离子通道亲和力低,具有作为SIPI6398梯队活性化合物深入研究的价值。5、新化合物的合成研究设计全新路线合成A类化合物,并用于制备阳性药卡利拉嗪,未见文献报道。经单晶结构分析,确证A类化合物及卡利拉嗪为反式构型。参考A类化合物合成方法合成B类、C类化合物。对D类化合物中间体D-3亚硝基还原条件进行了优化,确定Zn/40%醋酸水溶液为最优条件;分别以γ-氨基丁酸、trans-环己基-1,4-二甲酸、环丙基-1,1-二甲酸二甲酯为原料,制备E、F、G、H类化合物。所合成新化合物结构经MS、1H NMR确证。优化了SIPI6398的合成路线,制备百克级样品,纯度>99.8%,单杂<0.1%,为制备临床前系统研究用公斤级样品奠定了基础。综上所述,通过本论文的研究工作,发现抗精神分裂症候选新药SIPI6398、初步确定梯队活性化合物SIPI7686、SIPI7710;相关化合物的构效关系分析、药理筛选及合成方法的探索为后续活性化合物的发现及深入研究奠定了基础;本论文的成败经验,亦为该研究方向的继续深化提供了科学依据和实践借鉴。
许自豪[10]（2016）在《基于CFD的搏动血泵血液破坏性的预测与优化研究》文中研究指明心脏移植目前仍是治疗终末期心衰的金标准,但是所需心脏供体严重不足,因此用于部分或完全替代自然心室功能的各种血泵在过去五十多年中不断被开发出来。血泵在运行过程中产生的非生理性流动,如高剪切应力、很长的暴露时间、再循环和潴留,会导致对血液各种成分的破坏,包括对红细胞的破坏（即溶血）或对其机械特性的改变、对血小板和白细胞的激活、炎症介质浓度的增加、血栓栓塞和装置血栓等,这些破坏会导致各种并发症进而危及患者的生命。因此,通过优化血泵的内流场设计降低血泵的血液破坏性,进而降低相关并发症和提高患者生存率,成为血泵设计过程中需要考虑的最重要的问题之一。但是,目前对于血泵血液破坏性的研究只集中于溶血或血栓,且大部分都是对血泵的改进而非自动优化。而且,由于搏动血泵流场仿真的复杂性,利用CFD（computational fluid dynamics,计算流体力学）仿真进行的搏动血泵血液破坏性研究较少。血泵工作参数也会影响血泵的血液破坏性,所以也需要全面研究不同工作参数对血液破坏性的影响。本文针对搏动血泵血液破坏性研究待解决的问题,应用流固耦合实现搏动血泵的全流场仿真,并基于仿真结果预测出血泵的血液破坏性;对血泵血室的几何参数进行优化,以降低血泵的血液破坏性;研究不同的工作参数对搏动血泵血液破坏性的影响,找出有利于降低血液破坏性的工作参数取值;建立一个预测模型,使之利用搏动血泵的驱动参数对血泵的输出参数和此时的血液破坏性指标进行无传感器预测。本文的主要工作如下:1.基于流固耦合实现了搏动血泵的全流场仿真,不但对超声致动搏动血泵的血袋运动和变形利用流固耦合进行了仿真,还对进出口处的机械瓣膜旋转运动进行了仿真。对比了三种不同的瓣膜处理仿真方案（无瓣膜、固定瓣膜和旋转瓣膜）,通过与粒子图像测速（PIV）实验数据的对比分析了各个仿真方案的适用场合。基于流固耦合仿真结果对血泵的溶血指标和血栓指标（包括血小板激活指标和血小板沉积指标）进行了预测,并利用体外溶血实验对溶血指标进行了实验验证,这为搏动血泵的优化提供了基础。2.提出了一种整合流固耦合仿真、响应曲面和NSGA-II算法的多目标优化框架,以三个血液破坏性指标为目标函数,优化了超声致动搏动血泵三种血室模型（Model I、Model II和Model III）的几何参数,并分析了三种模型优化结果的适用场合。3.研究了不同的工作参数（包括推板运动曲线、搏动率、每博量和辅助模式）对搏动血泵血液破坏性（包括溶血、血小板激活和血小板沉积）的影响。结果表明,不同的工作参数会显着地影响搏动血泵的血液破坏性,余弦运动曲线（相对于正弦和多项式曲线）、更大的每博量（射血分数）、更高的搏动率和反搏辅助模式（相对于同搏）可以降低血小板沉积的可能性而增加溶血和血小板激活的可能性,反之亦然。另外三个血液破坏性指标是相互冲突的,即无法通过改变同一工作参数同时降低三个指标。4.实现了一种基于神经网络的搏动血泵输出参数的无传感器预测方法,该方法利用搏动血泵的驱动参数如电机驱动频率、平均驱动电流和搏动率作为神经网络的输入参数,对血泵的输出平均压力、平均流量和此时对应的三个血液破坏性指标（IH、Dpl和Total TSP）进行无传感器预测,并利用体外模拟循环系统进行了验证。其中输出压力和流量的平均百分比预测误差均低于目前已有文献报道的预测方法的平均百分比预测误差,而利用神经网络对血液破坏性指标进行预测则是本文首次报道。
二、HEMODYNAMIC EFFECTS OF M_3 RECEPTOR ON ANIMAL HEARTS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HEMODYNAMIC EFFECTS OF M_3 RECEPTOR ON ANIMAL HEARTS（论文提纲范文）
（1）E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分: E3泛素连接酶TRIM31调控高血压肾病发生的实验研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: E3泛素连接酶TRIM31改善高血压肾病的分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（2）鸭舍环境微生物气溶胶监测及其对小鼠肺损伤与BEAS-2B细胞毒理机制的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 微生物气溶胶的概述 |
| 1.1.1 微生物气溶胶的概念 |
| 1.1.2 微生物气溶胶的来源 |
| 1.1.2.1 土壤 |
| 1.1.2.2 水源 |
| 1.1.2.3 动物 |
| 1.1.2.4 植物 |
| 1.1.2.5 人类以及其生产活动 |
| 1.1.3 微生物气溶胶的收集方法 |
| 1.1.3.1 惯性撞击类 |
| 1.1.3.2 过滤阻留类 |
| 1.1.3.3 静电法 |
| 1.1.3.4 温差迫降法 |
| 1.1.3.5 实时检测法 |
| 1.1.4 微生物气溶胶的危害 |
| 1.1.5 国内外微生物气溶胶的研究现状 |
| 1.1.5.1 国外微生物气溶胶的研究情况 |
| 1.1.5.2 本实验室微生物气溶胶的研究情况 |
| 1.2 大气颗粒物的污染现状和对健康的影响 |
| 1.2.1 大气颗粒物的概述 |
| 1.2.1.1 大气颗粒物的概念 |
| 1.2.1.2 大气颗粒物的来源 |
| 1.2.2 大气颗粒物的污染现状 |
| 1.2.3 PM2.5 对健康的影响 |
| 1.2.3.1 PM2.5 对心血管系统的影响 |
| 1.2.3.2 PM2.5 对呼吸系统的影响 |
| 1.2.3.3 PM2.5 对氧化应激以及细胞凋亡的影响 |
| 1.2.3.4 PM2.5 致机体呼吸系统炎症反应以及细胞因子的影响 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 高通量测序技术的发展历史和现状 |
| 1.3.2 高通量测序技术的类型 |
| 1.3.2.1 Roche454 测序技术 |
| 1.3.2.2 SOLi D测序技术 |
| 1.3.2.3 Solexa测序技术 |
| 1.3.3 高通量测序技术的应用 |
| 1.3.3.1 高通量测序技术在土壤微生物领域的应用 |
| 1.3.3.2 高通量测序技术在水体微生物领域的应用 |
| 1.3.3.3 高通量测序技术在肠道菌群方面的应用 |
| 1.3.3.4 高通量测序技术在空气微生物研究方面的应用 |
| 1.4 PM2.5 对机体的毒性作用与自噬的发生 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 采样鸭场的情况 |
| 2.1.2 实验动物及细胞 |
| 2.1.3 干扰RNA与慢病毒表达载体 |
| 2.1.4 实验所用主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 主要实验试剂的配置 |
| 2.1.5.13 -MA的配制 |
| 2.1.5.2 NAC的配制 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸭舍环境PM2.5 中细菌和真菌的多样性研究 |
| 2.2.1.1 样品的采集 |
| 2.2.1.2 样品DNA的抽提与检测 |
| 2.2.1.3 PCR扩增 |
| 2.2.1.4 构建PE文库及Illumina测序 |
| 2.2.1.5 数据信息分析流程 |
| 2.2.2 PM2.5(PM-2.5, PM+2.5)单一和或重复暴露 BALB/c 小鼠后免疫相关因子的表达及肺部损伤的相关研究 |
| 2.2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2.2 PM2.5 的收集 |
| 2.2.2.3 PM2.5 的处理 |
| 2.2.2.4 动物暴露实验 |
| 2.2.2.5 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠的肺部病理切片 |
| 2.2.2.6 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一暴露和重复暴露BALB/c小鼠的肺部Masson染色 |
| 2.2.2.7 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)重复暴露BALB/c小鼠的肺部E-cadherin和 Vimentin双重免疫荧光 |
| 2.2.2.8 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠肺部相关免疫因子的检测 |
| 2.2.3 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠引起的肺部氧化应激和细胞凋亡的研究 |
| 2.2.3.1 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠对肺部氧化应激的检测 |
| 2.2.3.2 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠引起的肺部细胞凋亡的检测 |
| 2.2.4 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞存活率的研究 |
| 2.2.4.1 细胞培养 |
| 2.2.4.2 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞活力的浓度依赖性检测 |
| 2.2.4.3 PM2.5 暴露对Beas-2B细胞细胞活力的时间依赖性检测 |
| 2.2.4.4 PM2.5 暴露对Beas-2B细胞内ROS产生的测定 |
| 2.2.4.5 NAC在 PM2.5 暴露对Beas-2B细胞存活率的检测 |
| 2.2.5 PM2.5 暴露对Beas-2B细胞细胞自噬及相关信号通路的研究 |
| 2.2.5.1 PM2.5 暴露对Beas-2B细胞自噬的研究 |
| 2.2.5.2 PM2.5 诱导BEAS-2B细胞自噬相关信号通路的研究 |
| 2.2.5.3 蛋白质免疫印迹试验 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3.结果及分析 |
| 3.1 鸭舍环境PM2.5 中细菌和真菌的多样性分析 |
| 3.1.1 鸭舍环境PM2.5 的浓度 |
| 3.1.2 鸭舍环境PM2.5 中细菌的多样性分析 |
| 3.1.2.1 OTUs比较分析 |
| 3.1.2.2 细菌门水平上相对丰度情况 |
| 3.1.2.3 细菌属水平上相对丰度情况 |
| 3.1.2.4 细菌样品复杂度分析(Alpha Diversity) |
| 3.1.2.5 细菌样品间比较分析(Beta Diversity) |
| 3.1.3 鸭舍环境PM2.5 中真菌的多样性分析 |
| 3.1.3.1 OTUs比较分析 |
| 3.1.3.2 真菌门水平上相对丰度情况 |
| 3.1.3.3 真菌属水平上相对丰度情况 |
| 3.1.3.4 真菌样品复杂度分析(Alpha Diversity) |
| 3.1.3.5 真菌样品间比较分析(Beta Diversity) |
| 3.2 PM2.5(PM-2.5, PM+2.5) 单一和重复暴露 BALB/c 小鼠后免疫相关因子的表达及肺部损伤的研究 |
| 3.2.1 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠的肺部病理组织学结果 |
| 3.2.2 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠对肺部纤维化的影响 |
| 3.2.2.1 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠Masson染色结果 |
| 3.2.2.2 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)重复暴露BALB/c小鼠的肺部E-cadherin和 Vimentin双重免疫荧光 |
| 3.2.3 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠肺部相关免疫因子的检测 |
| 3.2.3.1 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠肺部TLRs受体的表达 |
| 3.2.3.2 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠肺部细胞因子的表达 |
| 3.3 PM2.5 (PM-2.5, PM+2.5)单一和重复暴露 BALB/c 小鼠引起的肺部氧化应激和细胞凋亡的研究 |
| 3.3.1 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠对肺部氧化应激的影响 |
| 3.3.2 PM2.5(PM_(2.5)~-, PM_(2.5)~+)单一和重复暴露BALB/c小鼠对肺部细胞凋亡的影响 |
| 3.4 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞存活率的研究 |
| 3.4.1 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞活力的浓度依赖性检测 |
| 3.4.2 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞活力的时间依赖性检测 |
| 3.4.3 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞内ROS产生的测定 |
| 3.4.4 NAC在 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞存活率的作用 |
| 3.5 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞自噬及相关信号通路的研究 |
| 3.5.1 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞自噬的研究 |
| 3.5.1.1 透视电镜下观察PM2.5 诱导自噬的发生 |
| 3.5.1.2 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞自噬流影响 |
| 3.5.2 PM2.5 诱导BEAS-2B细胞自噬相关信号通路的研究 |
| 3.5.2.1 不同浓度PM2.5 诱导BEAS-2B细胞中SRC/STAT3 的表达 |
| 3.5.2.2 自噬在PM2.5 诱导BEAS-2B细胞中SRC/STAT3 的表达中的作用 |
| 3.5.2.3 ROS在 PM2.5 诱导BEAS-2B细胞自噬中的作用 |
| 4.讨论 |
| 4.1 鸭舍环境PM2.5中细菌和真菌的多样性分析 |
| 4.2 PM2.5(PM-2.5, PM+2.5) 单一和重复暴露 BALB/c 小鼠后免疫相关因子的表达及肺部损伤的相关研究 |
| 4.3 PM2.5 (PM-2.5, PM+2.5)单一和重复暴露 BALB/c 小鼠引起的肺部氧化应激和细胞凋亡的研究 |
| 4.4 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞存活率的研究 |
| 4.5 PM2.5 暴露对BEAS-2B细胞细胞自噬及相关信号通路的研究 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.附录 |
| 8.致谢 |
| 9.攻读学位期间发表文章目录 |
（3）三种氟喹诺酮药物的生物毒性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 FQs抗生素的毒性 |
| 1.2 FQs抗生素环境污染问题 |
| 1.3 FQs致毒机理研究 |
| 1.3.1 FQs的跨膜过程 |
| 1.3.2 FQs与生物大分子作用 |
| 1.3.3 FQs与动物模型暴露 |
| 1.3.4 FQs心血管毒性评价 |
| 1.4 研究目的、意义与研究内容 |
| 1.4.1 研究目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 创新点 |
| 1.4.4 技术方案与路线 |
| 2 CPFX/GTFX/PFLX与胚胎膜相互作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要溶液 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 FQs及其暴露对象 |
| 2.3.2 CPFX/GTFX/PFLX测定分析 |
| 2.3.3 CPFX/GTFX/PFLX-胚胎膜相互作用 |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 CPFX/GTFX/PFLX检测方法建立 |
| 2.4.2 CPFX/GTFX/PFLX与胚胎作用平衡与动力学分析 |
| 2.4.3 CPFX/GTFX/PFLX暴露对胚胎膜的影响 |
| 2.4.4 温度对CPFX/GTFX/PFLX与胚胎作用的影响 |
| 2.4.5 胚胎膜形貌变化分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 CPFX/GTFX/PFLX与生物大分子相互作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器和试剂 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要溶液 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 荧光光谱测定 |
| 3.3.2 计算模拟 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 CPFX/GTFX/PFLX与 HSA相互作用 |
| 3.4.2 CPFX/GTFX/PFLX与 DNA相互作用 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 CPFX/GTFX/PFLX对斑马鱼胚胎和仔鱼的致毒作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶液配制 |
| 4.3.2 暴露条件筛选 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 CPFX/GTFX/PFLX对胚胎自主运动的影响 |
| 4.4.2 CPFX/GTFX/PFLX暴露对胚胎孵化率影响 |
| 4.4.3 CPFX/GTFX/PFLX暴露对胚胎和仔鱼存活率的影响 |
| 4.4.4 CPFX/GTFX/PFLX对胚胎和仔鱼心率影响 |
| 4.4.5 CPFX/GTFX/PFLX对胚胎和仔鱼的致畸作用 |
| 4.4.6 CPFX/GTFX/PFLX的膜作用和致毒效应的相关性分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 CPFX/GTFX对斑马鱼的心血管毒性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 斑马鱼培养 |
| 5.3.2 CPFX/GTFX暴露及最大非致死浓度(MNLC)和LC10测定 |
| 5.3.3 CPFX/GTFX心血管毒性分析 |
| 5.3.4 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 最大非致死浓度(MNLC)和LC10 分析 |
| 5.4.2 CPFX/GTFX对斑马鱼心血管系统的形态影响 |
| 5.4.3 CPFX/GTFX对斑马鱼心血管系统的功能影响 |
| 5.4.4 CPFX/GTFX对斑马鱼钙信号通路和心肌收缩相关基因表达影响 |
| 5.4.5 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表文章目录 |
| B.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（4）水溶性聚合物改性氯硝柳胺的制备及性能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 氯硝柳胺的概述 |
| 1.1.1 氯硝柳胺的应用 |
| 1.1.2 氯硝柳胺亲水改性的研究现状 |
| 1.2 难溶药物的亲水改性方法 |
| 1.2.1 物理方法 |
| 1.2.2 化学方法 |
| 1.3 聚合物前药的简介 |
| 1.3.1 聚合物前药的发展 |
| 1.3.2 聚合物前药的特点 |
| 1.3.3 聚合物前药的载体材料 |
| 1.4 聚合物前药的应用 |
| 1.4.1 聚合物前药在癌症治疗中的应用 |
| 1.4.2 聚合物前药在治疗非肿瘤疾病的应用 |
| 1.5 本文的选题意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 选题意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第2章 试验材料及试验方法 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 产物化学结构表征 |
| 2.2.2 载药率的测定 |
| 2.2.3 粒径形貌及分布 |
| 2.2.4 临界胶束浓度测定 |
| 2.2.5 溶解性测试 |
| 2.2.6 体外药物释放 |
| 2.2.7 肠系膜动脉舒张作用测试 |
| 2.2.8 血管平滑肌细胞线粒体膜电位检测 |
| 2.2.9 体外细胞毒性 |
| 2.2.10 半数致死量(LD_(50))测试 |
| 2.2.11 体内血压及心率测试 |
| 2.2.12 体内用药对心、肺、肝STAT3活性的影响 |
| 2.2.13 体内抗肿瘤作用 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 水溶性聚合物改性氯硝柳胺与载药胶束的制备 |
| 3.1 聚甲基丙烯酸改性氯硝柳胺的制备 |
| 3.1.1 氯硝柳胺丙烯酸酯单体的制备 |
| 3.1.2 聚甲基丙烯酸氯硝柳胺共聚物的制备 |
| 3.1.3 聚甲基丙烯酸均聚物的制备 |
| 3.2 聚N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺改性氯硝柳胺的制备 |
| 3.2.1 氯硝柳胺甲基丙烯酸酯单体的制备 |
| 3.2.2 N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺的制备 |
| 3.2.3 聚N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺氯硝柳胺共聚物的制备 |
| 3.2.4 N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺均聚物的制备 |
| 3.2.5 氯硝柳胺甲基丙烯酸酯均聚物的制备 |
| 3.2.6 聚N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺氯硝柳胺胶束的制备 |
| 3.3 聚乙二醇化氯硝柳胺的制备 |
| 3.3.1 聚乙二醇二硫酯的制备 |
| 3.3.2 聚乙二醇化氯硝柳胺共聚物的制备 |
| 3.3.3 聚乙二醇化氯硝柳胺载药胶束的制备 |
| 3.4 聚乙二醇化氯硝柳胺载药胶束的制备 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 聚甲基丙烯酸改性氯硝柳胺的制备及性能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 聚合物的制备与表征 |
| 4.2.1 氯硝柳胺丙烯酸酯的制备与表征 |
| 4.2.2 聚甲基丙烯酸改性氯硝柳胺的制备与表征 |
| 4.3 聚合物的溶解性及氯硝柳胺的增溶机理分析 |
| 4.4 体外生物学活性 |
| 4.4.1 PMAN对肠系膜动脉收缩功能的作用 |
| 4.4.2 细胞毒性 |
| 4.4.3 线粒体膜电位 |
| 4.5 体内生物学活性 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 聚N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺改性氯硝柳胺的制备及性能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 聚合物的制备与表征 |
| 5.2.1 单体的制备与表征 |
| 5.2.2 聚N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺改性氯硝柳胺的制备与表征 |
| 5.2.3 载药率 |
| 5.3 溶解性及增溶机理分析 |
| 5.3.1 溶解性 |
| 5.3.2 紫外吸收光谱 |
| 5.3.3 临界胶束浓度 |
| 5.3.4 胶束的粒径与形貌 |
| 5.3.5 聚合物水溶液的红外光谱 |
| 5.3.6 聚合物水溶液的核磁氢谱 |
| 5.3.7 不同载药率聚合物的增溶机理分析 |
| 5.4 体外药物释放性能及释放机理分析 |
| 5.4.1 体外药物释放性能 |
| 5.4.2 体外药物释放机理研究 |
| 5.5 体外生物性能研究 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 聚乙二醇化氯硝柳胺的制备及性能 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 聚合物的制备与表征 |
| 6.2.1 RAFT链转移剂的制备与表征 |
| 6.2.2 聚乙二醇化氯硝柳胺的制备与表征 |
| 6.2.3 载药率 |
| 6.3 溶解性及增溶机理分析 |
| 6.3.1 溶解性 |
| 6.3.2 聚合物水溶液的紫外吸收光谱 |
| 6.3.3 临界胶束浓度 |
| 6.3.4 形貌及粒径分布 |
| 6.3.5 聚合物水溶液的核磁共振氢谱表征 |
| 6.3.6 聚合物增溶机理的对比分析 |
| 6.4 体外药物释放性能及释放机理分析 |
| 6.4.1 体外药物释放性能 |
| 6.4.2 药物释放机理的分析 |
| 6.5 体外生物效应 |
| 6.6 体内生物效应 |
| 6.6.1 急性毒性研究 |
| 6.6.2 体内STAT3活性研究 |
| 6.6.3 体内抗肿瘤活性研究 |
| 6.7 本章小结 |
| 第7章 聚乙二醇化氯硝柳胺物理包覆氯硝柳胺胶束的制备及性能 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 载药率和包封率 |
| 7.3 载药胶束的红外光谱 |
| 7.4 溶解性及增溶机理分析 |
| 7.4.1 溶解性 |
| 7.4.2 胶束溶液的TEM图与粒径分布 |
| 7.4.3 增溶机理的分析 |
| 7.5 体外药物释放性能及释放机理分析 |
| 7.5.1 体外药物释放性能 |
| 7.5.2 载药胶束的药物释放机理的分析 |
| 7.6 体外抗肿瘤活性 |
| 7.7 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文和取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）系列褐藻胶寡糖通过调控sGC表达对大鼠肺动脉高压影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠肺动脉高压模型的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物造模 |
| 2.2 大鼠心脏超声检测 |
| 2.3 大鼠血流动力学检测 |
| 2.3.1 右心导管的制备 |
| 2.3.2 插管步骤 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 造模情况 |
| 3.2 大鼠心脏超声检测结果 |
| 3.3 大鼠血流动力学检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 系列褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压的影响研究 |
| 1 不同结构褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压的影响研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 2 不同剂量褐藻胶寡糖对大鼠肺动脉高压的影响研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 系列褐藻胶寡糖改善大鼠肺动脉高压的机制研究 |
| 1 不同结构褐藻胶寡糖改善大鼠肺动脉高压的机制研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 2 不同剂量褐藻胶寡糖改善大鼠肺动脉高压的机制研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论与创新点 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（6）吗啡对小鼠体内氯吡格雷代谢活化和抗血小板作用的影响（论文提纲范文）
| 中文和英文术语缩写对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 吗啡对CLP单次给药小鼠体内药代动力学的影响 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 药品和试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 方法学验证 |
| 2.2 动物分组与给药 |
| 2.3 样品采集与处理 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 方法专属性 |
| 3.2 标准曲线与线性范围 |
| 3.3 提取回收率(R)与基质效应(ME) |
| 3.4 精密度(RSD)与准确度(RE) |
| 3.5 吗啡对小鼠体内单剂量CLP药代动力学的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 吗啡对单剂量CLP抗血小板作用的影响 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 药品和试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 单剂量吗啡对单剂量CLP抗血小板作用的影响 |
| 2.3 多剂量吗啡对单剂量CLP抗血小板作用的影响 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 单个剂量吗啡抑制氯吡格雷的抗血小板作用 |
| 3.2 多个剂量吗啡减弱CLP的抗血小板作用 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 参与CLPⅡ相代谢的葡萄糖醛酸基转移酶UGT亚型的鉴定 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 药品和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 色谱和质谱条件 |
| 2.2 HLM和rUGT亚型的葡萄糖醛酸化反应 |
| 2.3 AZT、吉非贝齐和氟康唑对CLP-C葡萄糖醛酸化的影响 |
| 2.4 酶促动力学数据分析 |
| 2.5 UGT1A9和UGT2B7分别催化CLP-C生成CLP-G的相对贡献 |
| 3 结果 |
| 3.1 HLM中AZT和CLP-C葡萄糖醛酸化的酶促动力学特征 |
| 3.2 rUGT中CLP-C葡萄糖醛酸化反应 |
| 3.3 rUGT1A6、rUGT1A9、rUGT2B4和rUGT2B7中的酶促动力学特征 |
| 3.4 AZT、氟康唑和吉非贝齐抑制CLP-G的生成 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）盐酸戊乙奎醚注射液在急性有机磷农药中毒救治中应用剂量与安全性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）毛果芸香碱对心律失常保护作用的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物分组与处理 |
| 1.4.1 毛果芸香碱对乌头碱诱发Wistar大鼠心律失常的作用 |
| 1.4.2 毛果芸香碱对氯化钡诱发Wistar大鼠心律失常的作用 |
| 1.5 观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 毛果芸香碱对乌头碱诱发大鼠心律失常的作用 |
| 2.2 毛果芸香碱对氯化钡诱发大鼠心律失常的作用 |
| 3 讨论 |
（9）基于多靶点新型抗精神分裂候选药物的发现与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精神分裂症及其危害 |
| 1.2 精神分裂症病理机制研究 |
| 1.2.1 宏观病理学研究 |
| 1.2.2 组织病理学研究 |
| 1.2.3 神经化学病理学研究 |
| 1.2.4 基因表达研究 |
| 1.3 现有抗精神分裂症药物 |
| 1.3.1 经典抗精神分裂症药(TA) |
| 1.3.2 非经典抗精神分裂症药(AT) |
| 1.3.3 非经典抗精神分裂症药研究进展 |
| 1.3.4 现有抗精神分裂症药物的缺点和不足 |
| 1.4 抗精神分裂症药物市场 |
| 1.4.1 国际市场情况 |
| 1.4.2 国内市场情况 |
| 1.5 新型抗精神分裂症药物研发趋势 |
| 1.5.1 D_2/5-HT_(2A)受体双重拮抗剂 |
| 1.5.2 D_2/D_3/5-HT_(2A)受体拮抗剂 |
| 1.5.3 D_2/D_3/D_4/5-HT_(1A)/5-HT_(2A)受体部分激动/5-HT_6/5-HT_7 受体拮抗剂 |
| 1.5.4 作用于5-HT受体亚型的药物 |
| 1.5.5 作用于谷氨酸系统的药物 |
| 1.5.6 烟碱型受体(部分)激动剂 |
| 1.5.7 磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)抑制剂 |
| 1.5.8 大麻素(Cannabinoid)受体拮抗剂 |
| 1.5.9 长效制剂 |
| 1.5.10 治疗精神分裂症认知障碍药物研究进展 |
| 1.6 具认知功能改善作用的多靶点抗精神分裂症药物研究 |
| 1.6.1 D_2、D_3、5-HT_(1A)受体部分激动、5-H_(2A)受体拮抗剂 |
| 1.6.2 D_2、D_3 受体拮抗、5-HT_(1A)受体拮抗或部分激动、5-H_(2A)受体拮抗剂 |
| 1.7 本论文主要研究内容及意义 |
| 1.7.1 主要研究内容 |
| 1.7.2 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 新化合物设计、体外活性评价及构效关系分析 |
| 2.1 研究目标与关键问题 |
| 2.2 作用于D_2、D_3、5-HT_(1A)、5-HT_(2A)受体的新化合物设计 |
| 2.2.1 优先结合D_3的D_2/D_3 受体拮抗剂受体药理学特征 |
| 2.2.2 D_2/5-HT2 受体双重拮抗剂受体药理学特征 |
| 2.2.3 5 -HT_(1A)拮抗或部分激动剂受体药理学特征 |
| 2.2.4 本课题设计化合物的受体药理学特征 |
| 2.2.5 作用于D_2、D_3、5-HT_(1A)、5-HT_(2A)受体的配体结构特征 |
| 2.2.6 本课题化合物总体设计思想 |
| 2.3 环己基胺类(A类)化合物的设计、体外活性及构效关系 |
| 2.3.1 本课题组前期发现的活性化合物 |
| 2.3.2 A类化合物的设计、体外活性与构效关系 |
| 2.3.3 小结 |
| 2.4 芳基恶唑烷酮类(B类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.4.1 B类化合物母核结构及设计思想 |
| 2.4.2 B类化合物体外试验结果 |
| 2.5 哌啶类(C类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.5.1 C类化合物母核结构及设计 |
| 2.5.2 C类化合物体外试验结果 |
| 2.5.3 两个化合物与D_3 结合模式研究 |
| 2.6 联胺类(D类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.6.1 D类化合物母核结构及设计 |
| 2.6.2 化合物与D_3 结合模式考察 |
| 2.6.3 D类化合物体外试验结果 |
| 2.7 丁基胺基类(E类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.7.1 E类化合物母核结构及设计 |
| 2.7.2 E类化合物体外试验结果 |
| 2.8 二氢喹啉酮类(F类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.8.1 F类化合物母核结构及设计 |
| 2.8.2 F类化合物体外试验结果 |
| 2.9 环丙基胺类(G类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.9.1 G类化合物母核结构及设计 |
| 2.9.2 G类化合物体外试验结果 |
| 2.10 双芳基哌嗪类(H类)新化合物的设计与体外活性 |
| 2.10.1 H类化合物母核结构及设计 |
| 2.10.2 H类化合物体外试验结果 |
| 2.11 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 优选化合物成药性比较研究 |
| 3.1 A类优选化合物的成药性比较研究 |
| 3.1.1 SIPI6398 等四个化合物结构及体外受体亲和力数据 |
| 3.1.2 SIPI6398 等四个化合物体内药效学比较研究 |
| 3.1.3 SIPI6398、SIPI6414 药代特性比较研究 |
| 3.1.4 SIPI6398、SIPI6414 初步安全性比较研究 |
| 3.2 优选化合物SIPI6398 的深入研究 |
| 3.2.1 体外靶点选择性及作用机制研究 |
| 3.2.2 SIPI6398 系统体内药效学研究 |
| 3.2.3 SIPI6398 深入安全性评价实验 |
| 3.2.4 常见副作用考察 |
| 3.2.5 SIPI6398 研究结果小结 |
| 3.3 B、D类梯队活性化合物研究 |
| 3.3.1 B类优选化合物的进一步研究 |
| 3.3.2 D类优选化合物的进一步研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 新化合物的合成与化学研究 |
| 4.1 新化合物的合成 |
| 4.1.1 环己基胺类(A类)化合物的合成 |
| 4.1.2 阳性药卡利拉嗪(Cariprazine)的合成 |
| 4.1.3 芳基恶唑烷酮类(B类)化合物的合成 |
| 4.1.4 哌啶类(C类)化合物的合成 |
| 4.1.5 联胺类(D类)化合物的合成 |
| 4.1.6 丁基胺基类(E类)化合物的合成 |
| 4.1.7 二氢喹啉酮类(F类)化合物的合成 |
| 4.1.8 环丙基胺类(G类)化合物的合成 |
| 4.1.9 双芳基哌嗪类(H类)化合物的合成 |
| 4.2 重要中间体的化学研究 |
| 4.2.1 2 -(trans-4-N-保护环己基)乙酸(12)的合成 |
| 4.2.2 6 位取代的3-(哌嗪-1-基)苯并[d]异噻唑(A-4-2)的合成 |
| 4.3 SIPI6398 的放大制备 |
| 4.3.1 合成路线 |
| 4.3.2 中间体11a和14a的合成优化 |
| 4.3.3 SIPI6398 的制备 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 实验部分 |
| 5.1 化学合成 |
| 5.1.1 仪器 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 实验条件 |
| 5.1.4 化合物合成 |
| 5.2 X-单晶衍射实验 |
| 5.2.1 衍射实验 |
| 5.2.2 结构解析 |
| 5.3 药理实验 |
| 5.3.1 体外受体亲和力实验 |
| 5.3.2 h ERG钾通道亲和力 |
| 5.3.3 体外受体功能实验 |
| 5.3.4 实时心肌细胞实验 |
| 5.3.5 Ames实验 |
| 5.3.6 大鼠和人肝微粒体代谢稳定性实验 |
| 5.3.7 动物药效学行为实验 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新性分析 |
| 对进一步研究工作的设想和建议 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文、专利申请 |
| 附录 |
（10）基于CFD的搏动血泵血液破坏性的预测与优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.1.1 人工心脏的研究背景 |
| 1.1.2 心室辅助装置的研究历史 |
| 1.1.3 血泵的分类 |
| 1.1.4 搏动血泵相对于平流式血泵的优势 |
| 1.1.5 血泵血液破坏性及其危害 |
| 1.1.6 基于CFD预测血泵血液破坏性的意义 |
| 1.2 血泵血液破坏性的研究现状 |
| 1.2.1 搏动血泵的流场仿真 |
| 1.2.2 基于CFD的血液破坏性预测 |
| 1.2.3 血泵血液破坏性的改进和优化 |
| 1.2.4 血泵工作参数对血液破坏性的影响 |
| 1.2.5 血泵输出参数的间接测量 |
| 1.3 本文的关键问题和主要研究内容 |
| 第二章 血泵的血液破坏性机制和计算模型 |
| 2.1 血液的基本生理特性 |
| 2.1.1 血液 |
| 2.1.2 红细胞 |
| 2.1.3 血小板 |
| 2.1.4 白细胞 |
| 2.2 血泵的血液破坏性机制 |
| 2.2.1 溶血产生的机制 |
| 2.2.2 血栓形成的机制 |
| 2.3 基于CFD的血泵血液破坏性的计算模型 |
| 2.3.1 CFD原理、控制方程和相关软件 |
| 2.3.2 血泵的溶血预测模型 |
| 2.3.3 血泵的血小板激活模型 |
| 2.3.4 血泵的血小板沉积模型 |
| 2.3.5 其他血栓预测模型 |
| 2.4 本文的研究对象及选择的血液破坏性计算模型 |
| 2.4.1 超声致动搏动血泵 |
| 2.4.2 本文选择的血液破坏性计算模型 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 搏动血泵的内流场数值仿真和血液破坏性的预测 |
| 3.1 流固耦合仿真 |
| 3.2 搏动血泵的全流场数值模拟 |
| 3.2.1 计算域的三维建模 |
| 3.2.2 边界条件设置 |
| 3.2.3 网格划分与网格独立性检验 |
| 3.2.4 湍流模型 |
| 3.2.5 求解 |
| 3.2.6 仿真结果与分析 |
| 3.3 三种仿真方案与PIV实验结果的对比 |
| 3.4 搏动血泵的血液破坏性的预测和体外溶血实验 |
| 3.4.1 血液破坏性指标 |
| 3.4.2 流固耦合仿真 |
| 3.4.3 体外溶血实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于响应曲面和多目标优化算法的搏动血泵血液破坏性优化 |
| 4.1 搏动血泵血室的参数化 |
| 4.2 目标函数 |
| 4.3 优化过程 |
| 4.3.1 试验设计 |
| 4.3.2 响应曲面设计 |
| 4.3.3 基于NSGA-II的多目标优化 |
| 4.3.4 最佳均衡解 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 响应曲面 |
| 4.4.2 多目标优化和最佳均衡解 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 工作参数对搏动血泵血液破坏性的影响 |
| 5.1 搏动血泵的血室模型 |
| 5.2 工作参数 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 基于神经网络的搏动血泵流量压力和血液破坏性的无传感器预测 |
| 6.1 搏动血泵及模拟循环系统 |
| 6.2 预测模型的选择 |
| 6.3 神经网络输入输出参数的采集 |
| 6.3.1 输入参数的选择和采集 |
| 6.3.2 输出参数的采集 |
| 6.4 BP神经网络的结构 |
| 6.5 神经网络的训练 |
| 6.6 结果与分析 |
| 6.7 讨论 |
| 6.8 本章小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间申请的专利 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
四、HEMODYNAMIC EFFECTS OF M_3 RECEPTOR ON ANIMAL HEARTS（论文参考文献）
- [1]E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究[D]. 张杰. 山东大学, 2021
- [2]鸭舍环境微生物气溶胶监测及其对小鼠肺损伤与BEAS-2B细胞毒理机制的研究[D]. 武博. 山东农业大学, 2020(08)
- [3]三种氟喹诺酮药物的生物毒性研究[D]. 沈荣. 重庆大学, 2019(01)
- [4]水溶性聚合物改性氯硝柳胺的制备及性能[D]. 马瑞. 哈尔滨工程大学, 2019(04)
- [5]系列褐藻胶寡糖通过调控sGC表达对大鼠肺动脉高压影响的研究[D]. 胡怡. 青岛大学, 2018(07)
- [6]吗啡对小鼠体内氯吡格雷代谢活化和抗血小板作用的影响[D]. 黄贝贝. 南京医科大学, 2018(01)
- [7]盐酸戊乙奎醚注射液在急性有机磷农药中毒救治中应用剂量与安全性研究[D]. 张雪. 泰山医学院, 2018(06)
- [8]毛果芸香碱对心律失常保护作用的研究[J]. 解春花,丑凯平,刘洋,金宏伟. 中国医药科学, 2017(03)
- [9]基于多靶点新型抗精神分裂候选药物的发现与研究[D]. 陈晓文. 上海交通大学, 2017
- [10]基于CFD的搏动血泵血液破坏性的预测与优化研究[D]. 许自豪. 上海交通大学, 2016